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University of Naples Federico II

Angela Crimi e Anna Pascucci

Universit degli Studi di Napoli Federico II

Ourio-do-mar
Utilizao didctica do ourio-do-mar para o estudo de
fenmenos biolgicos fundamentais

Objectivo
Graas s caractersticas biolgicas do ourio-do-mar possvel, na escola,
com alguns instrumentos, percorrer o caminho do desenvolvimento histrico
do conhecimento cientfico e experimentar descobrir um fenmeno biolgico
perfeito e fascinante: a desova e a observao de gmetas, a interaco
entre os gmetas, a inseminao artificial, o desenvolvimento do embrio
e o processo de hibridao.

Introduo
Os ourios-do-mar tm sido utilizados como o organismo modelo para o
estudo da embriologia desde o final do sculo XIX: Oscar Hertwig e Ernst H.
Haechel foram os primeiros a observar o fenmeno da fecundao, a fuso
do espermatozide com o vulo, para formar uma clula do novo organismo.
Theodor Boveri estudou duas espcies de ourio-do-mar e concluiu
que todos os cromossomas foram necessrios para o desenvolvimento
embrionrio normal. Hans Driesch, da Stazione Zoologica de Npoles,
executou a primeira experincia na qual demonstrou a totipotencia das
clulas estaminais primitivas: ele separou os primeiros dois blastmeros do
ourio-do-mar e observou a formao de duas larvas completas

A utilizao do Ourio-do-mar na escola

Para a actividade didctica utilizamos duas espcies diferentes de ouriodo-mar: Paracentrotus lividus e Arbacia lixula.

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Filo

Echinodermi

Filo

Echinodermi

Classe

Echinoidei

Classe

Echinoidei

Ordem

Diadematoidi

Ordem

Diadematoidi

Famlia

Echinidi

Famlia

Echinidi

Gnero

Paracentrotus

Gnero

Arbacia

Espcie

Paracentrotus lividus

Espcie

Arbacia lixula

A superfcie dura e o esqueleto rijo, formado por placas de calcrio e

denominado de teca. O corpo coberto de espinhos. O Paracentrotus lividus
tem espinhos fortes, aguados e finos, o Arbacia lixula tem espinhos longos
e grossos.
O corpo tem uma simetria pentarradiada e tem pequenos ps ambulacrrios
com ventosas, que funcionam atravs de presso hidrulica e que facilitam
a locomoo, a captura de alimentos e a fixao ao fundo do mar. O orifcio
anal e o genital esto localizados na parte de cima do ourio-do-mar. A
boca assemelha-se a uma garra e est localizada na parte inferior; tem 5
lminas que se assemelham a dentes virados para dentro e denominados de
lanterna de Aristteles. Os ourios-do-mar comem plantas e matria animal.
Os vulos ou esperma so libertados por cinco gonporos.
A fecundao externa. Os sexos so separados e no existe dimorfismo
sexual. A espcie Paracentrotus lividus habita o Mediterrneo e o Atlntico
oriental da Esccia s Canrias.
Os Arbacia lixula habitam o Mediterrneo e o Atlntico oriental ao longo
da costa portuguesa.

Equipamento e materiais necessrios para cada pessoa ou

grupo
Instrumentos

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Microscpio estereoscpicocom sistema de iluminao

integrado para luz incidente e transmitida
Microscpio
Pipetas de Pasteur de vidro e de plstico
Seringa
Luvas

Materiais

KCl (cloreto de potssio) O.5 M

lminas com uma cavidade
lminas com duas cavidades
lamelas
4 erlenmeyers (100 ml)
4 erlenmeyers (50 ml)
4 erlenmeyers (10 ml)
tubos de ensaio
varetas de vidro
aqurio ou tanque com filtro
gua do mar ou soluo de sal do mar
ventilador individual
10 Paracentrotus lividus
10 Arbacia lixula

Antes de comear
Sempre que trabalhar com ourios-do-mar utilize luvas.

Conselhos para o transporte e preservao

Os ourios-do-mar podem ser transportados num saco trmico ou numa
caixa de poliestireno com gelo seco para que a temperatura dentro do
recipiente esteja sempre baixa (4 C). possvel deix-los durante um dia
num frigorfico sem gua. Aps esse perodo devem de ser colocados num
aqurio para fauna martima ou num recipiente com ventilao, sendo
necessrio mudar a gua todos os dias.

Actividades de ensino
Actividade 1: Induzir a desova dos gmetas
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No perodo de mxima maturidade dos gmetas possvel conseguir

a desova dos gmetas simplesmente abanando os ourios-do-mar
algumas vezes. Se esta operao no resultar, pode experimentar
injeces de cloreto de potssio (KCl) at cerca de 1ml no celoma
do ourio-do-mar. necessrio ter cuidado para inserir a agulha da
seringa nas partes laterais da boca da lanterna de Aristteles. Abane
ligeiramente os animais e passado alguns minutos ser possvel
observar a cor dos gmetas que se libertam. O cloreto de potssio
causa a contraco dos msculos das gnadas e, por consequncia, a
desova dos gmetas.

Se os gmetas forem cor de laranja e cor-de-rosa (Paracentrotus

lividus) ou de uma cor castanha avermelhada (Arbacia lixula)
so vulos e devem ser recolhidos num erlenmeyer com cerca
de 100 ml de gua do mar. Para tal, deve colocar os ouriosdo-mar ao contrrio (o nus deve estar virado para baixo).
Se os gmetas forem de cor branco-sujo (Paracentrotus lividus) ou bege

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(Arbacia lixula) so espermatozides que devem ser recolhidos com um

conta-gotas de vidro e colocados num tubo de ensaio em gelo. Este
smen "seco e no activo" pode ser conservado no frigorfico durante
alguns dias temperatura de 4C. Assim que a desova dos gmetas
tiver terminado, pode colocar os ourios-do-mar num aqurio.

Actividade 2: Observao dos gmetas

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Os vulos submersos na soluo de gua do mar iro flutuar at ao

fundo. Mexa levemente a suspenso e retire algumas gotas com a
pipeta de plstico ( possvel reconhecer os vulos ao olho nu). Neste
momento, pode colocar os vulos numa pequena placa de Petri e
pode observ-los ao microscpio. Desta forma, poder verificar o seu
tamanho e forma.

De seguida, poder estud-los mais aprofundadamente: coloque uma

gota da suspenso na cavidade da lmina e cubra com uma lamela. De
seguida, pode observar os vulos com o microscpio ptico. Aconselhase que os observe primeiro com uma ampliao menor. Depois pode
colocar no campo de viso o objecto que pretende pesquisar e alternar
as lentes para uma ampliao muito maior. Com uma ampliao de
400x pode ver o crtex com os grnulos corticais do ncleo do vulo.
Alm disso, pode distinguir, graas s grandes dimenses do ncleo,
os vulos imaturos (ocitos primrios) dos vulos maduros prontos
para a fertilizao.

Para observar os gmetas masculinos, coloque uma gota de suspenso

na cavidade da lmina de vidro e dilua uma pequena quantidade de
esperma com 1 a 2 ml de gua do mar. De seguida, coloque a lamela e
observe ao microscpio ptico: com uma ampliao de 10 vezes comea
a ver a forma que se assemelha a uma semente e o movimento espiral
dos espermatozides. Ao aumentar a ampliao, pode reconhecer
melhor as suas partes: a cabea e a cauda.

ATENO: Para evitar a contaminao, necessrio etiquetar e utilizar

um conta-gotas diferente para fazer a suspenso dos vulos e dos
espermatozides.

Actividade 3: Fecundao, observao da interaco vuloespermatozides

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Prepare a suspenso de espermatozides, adequada para a fecundao,

diluindo uma pequena gota de esperma com cerca de 5ml de gua
do mar (a cor deve ser quase branco-sujo). Esse esperma no pode
ser guardado e deve utiliz-lo rapidamente j que a capacidade de
fecundao diminui com o passar do tempo. Para que a experincia seja
bem sucedida, aconselhamos a utilizao de uma baixa concentrao
de esperma para reduzir a possibilidade de polispermia.

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Agite a suspenso de vulos, que tm tendncia de ficar no fundo do

copo, recolha uma gota com a pipeta de Pasteur de plstico e coloque-a
na cavidade da lmina de vidro.

Adicione lateralmente, na extremidade da lmina de vidro, uma gota

de suspenso de esperma (pipeta de vidro).

10 A fecundao desencadeia imediatamente um conjunto de eventos,

sendo o mais significante a formao da membrana de fecundao.
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possvel seguir este interessante fenmeno. De facto, aps alguns

segundos, com uma ampliao pequena do microscpio, ser fcil
reconhecer os vulos fecundados: esto rodeados por uma espcie
de aurola. Com uma maior ampliao ser possvel acompanhar a
interaco dos gmetas: os pequenos espermatozides com uma
actividade frentica dirigem-se rapidamente na direco do vulo e
competem pelo grande vulo.

Actividade 4: observao do desenvolvimento embrionrio

de Paracentrotus lividus

12 Para esta actividade prefervel utilizar o Paracentrotus lividus, j que

o seu vulo mais transparente do que o vulo do Arbacia lixula e,
portanto, mais fcil visualizar o desenvolvimento do embrio.
13 Transfira 40ml da soluo de vulos e 1ml da suspenso de
espermatozides para o erlenmeyer de 50ml, abane cuidadosamente
para ajudar ao contacto entre os gmetas. Retire uma gota da suspenso
em intervalos regulares e coloque-a delicadamente na cavidade de vidro
para a observao ao microscpio.

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14 Para uma oxigenao suficiente dos embries necessrio, de vez em

quando, substituir a soluo de gua do mar e abanar a suspenso para
evitar a falta de oxignio aos vulos fertilizados(ou, alternativamente,
coloque dentro do copo uma pequena pedra porosa usada na
oxigenao de aqurios). A durao da segmentao e, em geral, do
desenvolvimento do embrio, depende da temperatura da gua que
deve estar entre 10 C e 15 C.
0 a 30 segundos aps a inseminao: os
espermatozides ligam-se aos vulos
Aps 30 a 60 segundos: pode observar a
formao da membrana de fecundao.
Aps 30 a 50 minutos: pode observar a formao
dos dois primeiros blastmeros.
Aps cerca de 3 horas e meia: o embrio tem cerca de 64 clulas
Depois de cerca de 10 horas: a blstula tem cerca de 600 clulas
Depois de cerca de 20 horas: ocorre a fase de
gstrula com a formao de arquntero.
48 horas depois: pode observar a larva, denominada de plteo.

Actividade 5: Cruzamento entre duas espcies diferentes

Para esta experincia utilize uma lmina com duas cavidades:
Coloque uma gota da suspenso de vulos de Arbacia lixula numa
concavidade, e na outra coloque uma gota de suspenso de vulos de
Paracentrotus lividus.
Adicione uma pequena gota de suspenso de esperma da espcie oposta
em ambas as cavidades; Ser possvel observar que:
Os espermatozides de Paracentrotus lividus no conseguem fecundar os
vulos de Arbacia lixula.
Os espermatozides de Arbacia lixula conseguem fecundar os vulos de
Paracentrotus lividus.
Misture uma gota de suspenso de vulos de Arbacia lixula e uma gota
de suspenso de vulos de Paracentrotus lividus numa cavidade da lmina
Adicione a suspenso de espermatozides de Arbacia lixula.

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Ser possvel observar o seguinte:

Os espermatozides de Arbacia lixula conseguem rapidamente fertilizar

os vulos de ambas as espcies

Num erlenmeyer de 50ml misture metade da suspenso de vulos de

Arbacia lixula e metade da suspenso de vulos de Paracentrotus lividus.
De seguida adicione a suspenso de espermatozides de Arbacia lixula.
Poder observar que os vulos fecundados de Paracentrotus lividus no
conseguem completar o desenvolvimento embrionrio; em especial ir
notar que quase todos iro abortar na primeira fase do desenvolvimento.

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Tempo
Estas actividades demoram cerca de 3 horas ou mais.

Referncias bibliogrficas
http://www.stanford.edu/group/Urchin/contents.html
http://raven.zoology.washington.edu/celldynamics/downloads/urchinlab.html
http://www.marymt.edu/~hoegler/biolab/devbio/seaurch.html

Agradecimentos
Este protocolo prtico foi adaptado para o projecto Volvox, financiado
ao abrigo do 6 Programa-Quadro da Comisso Europeia.

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