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cido desoxirribonucleico
(desoxirribose)
Uracilo
Timina
Cadeia simples
Cadeia dupla
O DNA tem estabilidade muito maior, devido ao excesso de cargas negativas em
torno do carbono 2 do RNA que pode quebrar a ligao fosfodister. O tempo de
vida do RNA pode ser muito curto, ao contrrio do DNA.
Caractersticas do RNA
Expresso Gentica
Tipos de RNA
Todos os RNA so produzidos por transcrio de genes.
RNA codificante
RNA no codificante
Riboswitches
Ribozimas
Molculas com propriedades enzimticas (catalticas) com RNA (em vez de DNA).
O gene e o mRNA
A cadeia a partir da qual se faz a transcrio anti-sense. A outra sense, uma vez
que igual do RNA mensageiro formado.
O fim e o incio da transcrio e traduo so diferentes.
Controlo da transcrio
Mudanas ambientais
Genes on/off (capacidade de ligar e desligar)
Protenas que se adaptam a um novo ambiente (normalmente atravs da
transcrio)
o Muito importante para:
Expressar novos genes quando necessrio
Represso de genes quando no so necessrios
Conservar recursos de energia
Expresso Gentica
Procariotas
Genes relacionados so colocados linearmente e sequencialmente no DNA: operes
(lactose, triptofano). Uma molcula de mRNA linear sintetizada contendo
informao para a sntese de todas as protenas (policistrnico).
Eucariotas
Genes relacionados podem estar afastados ou em diferentes cromossomas. O
mRNA contm informao para uma nica protena (monicistrnico).
A informao de cada gene fragmentada em exes e separada por intres.
O RNA aps a transcrio possui intres e exes, mas aps o processamento para
mRNA s possui exes.
Opero lac
Genes estruturais: lacZ, lacY, lacA (esto a ser regulados regies reguladoras).
Regulador: d origem a uma protena que interfere na transcrio dos operes.
Enzimas induzidas na presena da lactose so codificadas pelo opero lac.
Lac I est fora do opero: produz o repressor.
H medida que a transcrio ocorre, d-se a produo de permeases que permeiam
a entrada de mais lactose, originando mais transcrio. Isto ocorre at que a
presena de grandes quantidades de -galactosidase faa com que toda a lactose
seja degradada, e o repressor volta a impedir a transcrio.
um sistema de regulao negativa, pois est dependente de uma protena
repressora (quando ativa reprime o sistema de transcrio).
Se ocorrerem mutaes no lacI, as protenas formadas no vo ser funcionais e o
repressor no funciona: expresso constitutiva.
A lactose o indutor e o substrato das enzimas (permease e -galactosidase).
Enquanto que o X-gal apenas substrato, que quando degradado d origem a um
composto azul.
Expresso Gentica
Expresso
Constitutiva: o gene est constantemente a ser transcrito.
Indutvel: o gene s transcrito na presena de um indutor. Em muitos casos, o
indutor o substrato das enzimas codificadas pelo opero (ex: lactose).
Repressvel: o gene est a ser transcrito at que uma molcula inibitria se liga.
Geralmente, o repressor o produto final da atividade de enzimas codificadas pelo
opero.
Promotor procaritico
Importncia das mutaes
Mutaes up: aumenta o nvel de expresso do gene (transcrio). Correspondem
a mutaes que aumentam a homologia do promotor com a sequncia consenso ou
diminuem a distncia entre as regies -10 e -35 para 17bp.
Mutaes down: diminuem o nvel de transcrio dos genes. Correspondem a
mutaes que diminuem a homologia da sequncia do promotor com a sequncia
consenso ou aumentam a distncia entre as regies -10 e -35 para mais de 17bp.
Na regio -35
A RNA polimerase tem menor afinidade, mas quando se liga efetua a transcrio.
Mutaes down na regio -35 dificultam a ligao da RNA polimerase.
Expresso Gentica
Na regio -10
No afeta a formao do complexo RNA polimerase DNA mas dificulta o incio da
transcrio.
A afinidade da RNA polimerase para o promotor pode definir a frequncia de incio
da transcrio.
Promotores fortes: fazem com que sejam produzidas grandes quantidades de
RNA mensageiro por transcrio; h grande expresso do gene.
A sequncia consenso apenas terica, nos promotores procariticos, as
sequncias no so iguais s sequncias consenso.
A ligao in vitro de RNA polimerase a fragmentos de DNA como promotores
permitiram a caracterizao das suas sequncias: adiciona-se RNA polimerase a um
meio com DNA, ao qual se adiciona DNAse e verifica-se que apenas h corte nos
locais onde no h ligao entre o DNA e RNA polimerase.
DNase I footprinting
Aumentando-se a concentrao de RNA polimerase h cada vez menos cortes, logo
a pegada cada vez maior.
Promotor procaritico
Recuperao de um fragmento de 44 bp (-20 a +20).
Capacidade de sntese de RNA ~20 bp: fragmentos contendo a sequncia
envolvida na iniciao da transcrio.
Incapacidade de religar a RNA polimerase: fragmentos no contem a
sequncia reconhecida responsvel pela iniciao da ligao.
Mobilidade eletrofortica
Mobilidade eletrofortica alterada com a ligao a protenas: o DNA ligado a
protenas migra menos pois tem maior massa.
Podemos produzir anticorpos especficos que se ligam a uma protena, podendo
assim saber qual a protena que se ligou ao DNA. Com estes 3 componentes h
ainda menor mobilidade.
RNA polimerase
Muitas protenas envolvidas na incorporao de nucletidos no RNA, usam DNA
como template.
Iniciao e terminao da sntese de RNA requer protenas adicionais.
Eucariotas
Expresso Gentica
Subunidades (155 KDa codificada por rpoB) e (160 KDa codificada por
rpoC)
Complexo 2
Transcrio
Iniciao
A holoenzima liga-se ao DNA formando o complexo closed. De seguida, ocorre a
desnaturao do DNA complexo open. Por vezes ocorre a iniciao abortiva
porque a DNA polimerase tem afinidade para o promotor e no se desliga,
sintetizando pequenas quantidades de DNA (tem de ocorrer o clearance do
promotor desligar).
Ao fim de 9 nucletidos sintetizados, o fator sigma liberta-se.
Alongamento
A bolha de transcrio move-se com a RNA polimerase.
Deslocando-se a bolha de transcrio formam-se superenrolamentos a montante
negativos (resolvidos pela topoisomerase) e a jusante positivos (resolvidos pela
girase).
A reao de alongamento ocorre dentro do stio cataltico da RNA polimerase (40
bp/segundo).
D-se um ataque nucleoflico pelo 3 OH da nova molcula de RNA formado para
com o -fosfato do nucletido-3-fosfatado. De seguida, a ligao fosfodister formase e o grupo pirofosfato libertado.
A sequncia de incorporao do nucletido trifosfatado ditada pelo template de
DNA.
Terminao
Ocorre quando a RNA polimerase encontra uma sequncia terminadora.
A incorporao de nucletidos termina.
Novo RNA formado liberta-se da RNA polimerase e do template de DNA
As cadeias reemparelham.
Expresso Gentica
Expresso por controlo negativo, pois quando a protena est ativa faz a
represso da transcrio.
Expresso induzida pela lactose (indutor e substrato) ou pelo IPTG (apenas
indutor) sistema induzvel.
Expresso Gentica
Regulao da iniciao
A RNA polimerase reconhece uma ampla variedade de promotores pela associao
com diferentes fatores . Por exemplo:
28 orienta a DNA polimerase para se adaptar a uma determinada condio
32 genes induzidos por choque trmico so transcritos
38 orienta a DNA polimerase para genes envolvidos na resposta a
condies de stress
Fator muda durante:
Esporulao
Condies de stress
Mediante um sbito aumento da temperatura:
Alguns genes diminuem a taxa de transcrio, uma vez que as protenas
desnaturam
Alguns genes aumentam a taxa de transcrio: genes de choque trmico.
Expresso Gentica
Antiterminao
Impedimento da terminao
A RNA polimerase insensvel a sinais de terminao
Dependncia de uma fator de antiterminao: controlo positivo.
Expresso Gentica
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Transcrio em eucariotas
Caractersticas comuns com os procariotas:
Reao de polimerizao catalisada por uma RNA polimerase
Regies do promotor controlam a expresso
Elementos cis-acting e trans-acting
H alguns aspetos que tornam a transcrio em eucariotas mais complexa.
Localizao
Ncleo
Nucleoplasma
Nucleoplasma
Sntese
Precursor de rRNA (28S,5.8S e 18S)
Precursor de todos os mRNA
RNAs pequenos (tRNA, miRNA,
5SRNA)
Todas as RNA polimerases contm duas grandes subunidades e 12 a 15
subunidades pequenas, que no so comuns a todas.
Anlise de promotores
Promotor basal: TATA box + Inr
Mutaes pontuais na TATA box alteram o nvel de transcrio
Alguns promotores contem um elemento denominado iniciador (Inr), sem
uma sequncia consenso definida
A RNA polimerase II no reconhece todos os elementos encontrados nos
promotores. Outras protenas esto envolvidas no reconhecimento: fatores de
transcrio.
Os genes so transcritos apenas se existirem os fatores de transcrio gerais, mas
no de forma totalmente correta: s na presena de fatores de transcrio
reguladores.
A RNA polimerase liga-se ao promotor basal com a participao dos fatores de
transcrio gerais.
Fatores de transcrio reguladores ligam-se a elementos de controlo proximais no
promotor.
Os fatores de transcrio reguladores tambm podem ligar-se a elementos de
controlo distais no promotor (potenciadores ou silenciadores).
Expresso Gentica
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Transcrio em eucariotas
1. TBP (TATA binding protein) que reconhece a TATA box, liga-se ao promotor e
dobra o DNA
2. TFIIB (fator de transcrio) liga-se TBP ficando na posio +1 do incio da
transcrio, ficando a RNA polimerase II no local da transcrio.
3. TFIIF e TFIIE so recrutadores do TFIIH (mais ativo), permitindo a ligao
deste, formando o complexo de iniciao da transcrio.
4. A extremidade CTD (C-terminal domain) fica fosforilada. Se esta extremidade
for removida, a RNA polimerase no atua.
TFII codificam para RNA polimerases
Fatores de transcrio gerais
Participam na montagem do complexo de iniciao
Reconhecimento do promotor (papel fundamental neste reconhecimento)
TFIID contem a subunidade TBP que reconhece a TATA box.
TBP
Iniciao da transcrio
Expresso Gentica
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Monomrica
No regulada
Promotores contem o local de iniciao
Expresso Gentica
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Regulao da transcrio
A transcrio de genes eucariticos regulada a dois nveis
Iniciao da transcrio
Ativao estrutural de genes
Iniciao da transcrio
Ligao do DNA
Usualmente hlices ligam a maior poro de DNA com ligaes de hidrognio e
interaes Van der Waals.