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FACULDADE DE AGRONOMIA ELISEU MACIEL

DEPARTAMENTO DE FITOSSANIDADE.
DISCIPLINA DE FITOPATOLOGIA
270077994.doc

MICROSCOPIA

NLG.

Introduo: A histria do microscpio ptico comea na antiguidade clssica


com a lente de aumento simples, e apresenta um renascimento no sculo XVII.
Desde ento sua tecnologia foi aperfeioada at atingir, no comeo do sculo
XX, as limitaes impostas pela luz visvel.
O microscpio o instrumento bsico para o estudo da clula. A inveno
do microscpio atribuda a Antoine Leeuwenhoek e Robert Hooke no sc.
XVII.
J no sculo XIX, Schleiden e Schwann, com base nas observaes
microscpicas at a efetuadas, elaboram a teoria segundo a qual todos os
seres vivos so constitudos por clulas. Desde ento sua tecnologia foi
aperfeioada at atingir, no comeo do sculo XX, as limitaes impostas pela
luz visvel.
Atualmente existem tcnicas de microscopia que no utilizam a luz visvel
(Ultravioleta, raios X, microscpio eletrnico, microscpio acstico, microscpio
de tunelamento e de fora atmica) e que permitem em alguns casos atingir
resolues da ordem atmica.

Fig.1. Microscpio simples ou lente de aumento usada por Antoine von Leeuwenhoek

Apostila de Microscopia

03/2005

Fig. 2. Microscpio inventado pelo britnico Robert Hooke por volta de 1670.

Fig. 3. Microscpios compostos desenvolvidos durante os sculos XVII e XVIII.

Fig. 4. Microscpios do final do sculo XIX

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Fig. 5. Microscpio moderno.

Atualmente existem tcnicas de microscopia que no utilizam a luz


visvel, como a luz ultravioleta, raios X, microscpio eletrnico (MET e MEV),
microscpio acstico, microscpio de tunelamento e de fora atmica que
permitem em alguns casos atingir resolues da ordem atmica; no entanto, o
microscpio ptico continua sendo o instrumento mais prtico e simples para
observaes de estruturas na faixa entre 1 cm e 1 micron, faixa de grande
interesse na biologia, mineralogia, microeletrnica e outros campos.
O microscpio ao mesmo tempo, um instrumento mecnico e ptico de
preciso. Cuidados e manutenes constantes so necessrias para o mximo
de eficincia e confiabilidade seja alcanada.
As unidades de medida utilizadas em microscopia so o micrometro (m),
para a microscopia ptica, e o nanmetro (m) e o angstrom (), para a
microscopia eletrnica. A sua relao com a unidade fundamental do sistema
mtrico, o metro (m) e com o milmetro (mm) a seguinte:

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1 m = 10-3 mm (0,001 mm) = 10-6 m


1 m = 10-3 m = 10-6 mm (0,000001 mm) = 10-9 m
1 = 10-1 m = 10-4 m = 10-7 mm (0,0000001 mm) = 10-10

Fig. 6. Tamanho relativo de clulas e de outros componentes.

Tabela 1. Poder de resoluo: Tamanho de clulas e de seus componentes, desenhados em


escala logartmica, indicando a faixa de objetos que podem ser propriamente visualizados a
olho nu e atravs de microscpios ptico e eletrnico.
tomo Molculas Protenas Vrus/Ribossomo
0.1nm

1nm

10nm

Bactria

Cl
Animal
10um

100nm
1um
Microscpio Eletrnico
Microscpioptico

Cl Vegetal
100um

1mm

1cm

Olho Nu

Conceitos e Fundamentos:
A menor dimenso percebida pelo olho humano a vista desarmada de
10-2 mm. Os microscpios pticos so divididos em simples e composto.
Microscpio simples: Composto de uma lente biconvexa com distncia focal
muito curta, mantida prxima do olho. A capacidade de ampliao de 300 X.
Microscpio composto: um instrumento ptico no qual se v dupla
ampliao. Uma lente da primeira imagem ampliada do objeto, a qual
vista e novamente ampliada por uma segunda lente.

Di
st
n
ci
a

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focal: distncia que separa o foco do centro da lente. A distncia focal


depende de seu raio de curvatura e de seu ndice de
refrao (n).

Foco: o ponto onde convergem os raios paralelos a um eixo, aps


atravessarem uma lente.

ndice de refrao n: definido como a razo entre a velocidade da luz


no vcuo e a no meio em questo. Quanto mais diferentes os ndices de
refrao dentro e fora da lente, maior o desvio da luz.

Os microscpios pticos pertencem a duas classes fundamentalmente, em


relao posio do feixe luminoso:
1. Microscpio de luz transmitida ou transparncia: Em que o feixe luminoso
atravessa o objeto para depois alcanar a objetiva
2. Microscpio de luz transferencial: Em que os feixes luminosos incidem
sobre o objeto sendo por este refletido para depois ento atingir a objetiva.

Partes do microscpio:

a) Mecnica :
Base ou p - estativo - canho ou tubo - controle macro e micromtrico revlver ou tambor - charriot - platina ou mesa.
b) tica:
Primas - refletores - filtros - diafragma - condensador polarizadores - espelhos.

objetivas - oculares -

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Condensador

Tipos de objetivas:

Acromticas / Plan-acromtica / Apocromticas / Semi--apocromticas / Plan apocromticas / Monocromticas.


As objetivas Plan-apocromticas so as mais altas classes de objetiva de
pesquisa e fotomicrografia.
40 = aumento da objetiva 0.65 = abertura numrica
160 = comprimento do tubo
0.17 = espessura da
lamnula

Aberraes: As aberraes pticas so defeitos na imagens causadas pela


diferena entre o comportamento de uma lente real e uma lente ideal. A lente
ideal tem pontos focais bem definidos; ao incidir um feixe de luz com raios
paralelos ao eixo ptico, estes raios sero todos desviados para um mesmo
ponto, conhecido como ponto focal, independente da cor do raio ou da altura.

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Lente ideal
As Aberraes so refraes desiguais que sofrem os raios luminosos
que atravessam um sistema de lentes. Quanto mais acentuadas forem as
superfcies curvas das lentes, maiores sero as aberraes. Os instrumentos de
alta qualidade como o microscpio costuma ser projetados de forma a minimizar
estas aberraes. No entanto, erros na montagem, m regulagem ou
combinaes de objetiva e ocular incompatveis podem gerar aberraes.
Aberrao cromtica - Ocorre quando o ndice de refrao do material no o
mesmo para todas as cores. Isto faz com que o raio de luz azul seja desviado
em um ngulo diferente do que o raio de luz vermelho, logo a distncia focal
depender da cor. Um instrumento com Aberrao cromtica, produzir imagem
com cores borradas e as bordas coloridas. Acromatismo o nome dado para o
processo de correo desta aberrao.

Aberrao de esfrica - a diferena entre os raios de luz que entram com


alturas (ngulos) diferentes na lente. A luz que entra pelo centro da lente
focalizada no foco paraxial (prximo do eixo), mas luz que entra pela borda
no faz foco neste ponto, produzindo um halo que faz com que a imagem
perca nitidez. O nome Aberrao esfrica imprprio, pois esta aberrao
pode ocorrer em lentes que no tenham superfcies esfricas. Este o motivo
pelo as objetivas de maior aumento tm a especificada a espessura da
lamnula com a qual devem trabalhar: a aberrao causada pela lamnula
compensada no projeto da objetiva. A correo da Aberrao de esfericidade
denominada de Aplanetismo.

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Aberrao de Curvatura de campo A imagem de um objeto que fica em


um plano (p.ex., lamnula) deveria ficar tambm em um plano, mas nem sempre
isto ocorre. Muitas vezes a superfcie da imagem curva, e como esperamos
uma superfcie plana o resultado que apenas obtemos o foco no centro do
campo. Em microfotografia muito importante que o campo esteja perfeitamente
plano.

Curvatura de campo
Aberrao de distoro Uma imagem perfeita o aumento uniforme em
todo campo. Se uma regio na borda do campo de viso tem uma ampliao
diferente da do centro, isto causa uma distoro na imagem. O termo distoro
refere-se troca da representao geomtrica de um objeto no plano da
imagem. Por exemplo, um retngulo pode aparecer como uma figura geomtrica
curvada para dentro (almofadinha) ou curvada para fora (barril).

Aberrao de distoro

Tipos de oculares

Ramsdem - Formadas por duas lentes plano-convexas, cujas faces


convexas esto voltadas uma contra a outra denominada de oculares
positivas.

Hyugens - Formadas por duas lentes plano-convexas, cujas convexidades


esto voltadas para o lado da objetiva ou, as partes planas voltadas para o
olho do observador (oculares negativas).
As oculares so especificadas por:

Letra especificando o tipo , seguido de

Aumento

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Dimetro do campo de viso

O dimetro costuma ser representado pelo "Nmero de Campo" , que o


produto do campo de viso pelo aumento da objetiva , e representa o dimetro
da imagem do campo visto (em mm).
Por exemplo:
P10x 13,4 uma Plan-acromtica (P) de 10x e nmero de campo 13,4 .
De acordo com a posio da ocular em funo da imagem intermediria , a
ocular pode ser:

Positiva: a imagem intermediria formada FORA da ocular.

A ocular positiva permite o uso de acessrios no plano da imagem intermediria


como gratculos ( escala graduada para medir dimenses no objeto )

Negativa : a imagem formada DENTRO da ocular

Compensao - Destina - se a compensar desigualdades de aumento para


as diversas cores.

Condensador - A funo do condensador a de fornecer luz. provido de


um sistema de lentes que concentram os raios e joga o maior nmero
possvel de feixes luminosos pela lente frontal da objetiva.

Tipos de condensadores. Os mais usados so: condensador de campo


claro e de campo escuro.
Tipos de microscopias

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Microscopia de campo claro - Permite iluminar rapidamente grandes


campos claros, quando os trabalhos so executados com aumentos
pequenos.

Microscopia de campo escuro - Os objetos aparecem luminosos em


fundo escuro. O microscpio de fundo escuro baseia-se no princpio de que
a luz dispersa pela superfcie dos materiais que possuem diferentes
ndices de refrao. Consiste num microscpio comum cujo condensador
substitudo por outro que apenas ilumina o objeto obliquamente.
Graas ao efeito de Tyndall, os objeto aparecem brilhantes em
conseqncia da disperso da luz, enquanto que o fundo permanece escuro.

Microscopia de campo claro

Microscopia de campo escuro

Microscopia de Contraste fase - Empregada para objetos no corados, que


tenham ndice de refrao ligeiramente diferente daquele do fundo em que se
encontram.
Microscopia de contraste de fase: o microscpio tico modificado, permitindo
maior contraste entre materiais de espessuras ou densidades diferentes. Um
condensador especial e a objetiva controlam a iluminao de maneira que essas
diferenas sejam acentuadas, pela incidncia da luz atravs de vrias direes,
e em diferentes partes da clula. O resultado, uma imagem com graus
variveis de luminosidade, coletivamente chamados contrastes. Por este
mtodo, os materiais mais densos aparecem claros, enquanto partes das
clulas que tm densidade prxima da gua aparecem escuras. A vantagem
de poder mostra estruturas celulares sem matar a clula.

Microscopia de contraste fase

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Microscopia Interferencial Nomarsky - Os objetos aparecem


sem halo, transparentes e de aspectos tridimensional. A vantagem sobre
o contraste fase o de poder utilizar objetos mais grossos, como
exemplo: nematide.

Microscopia Interferencial Nomarsky

Microscopia de Fluorescncia - Os objetos corados aparecem


luminosos com iluminao U.V. (objetos tais como lquidos e slidos
absorvem a U.V).
A Microscopia de fluorescncia usa a tcnica na qual um espcime
corado com corante fluorescente, que absorve a energia da luz com
comprimentos de onda curtos, como aqueles da luz azul. O corante ento libera
ou emite luz de um comprimento de onda maior, como da luz verde. Um
procedimento laboratorial comum, usando este princpio, chamado de tcnica
do anticorpo fluorescente ou imunofluorescncia. Para o teste de anticorpo
fluorescente, o corante fluorescente ligado a um anticorpo conhecido que
reage especificamente com certos microrganismos. Este complexo anticorpocorante misturado com microrganismos desconhecidos e examinado por meio
de um microscpio. Se o anticorpo se ligar a quaisquer microrganismos na
amostra, estes ficaro fluorescentes, e assim, sero identificados.

Microscopia de fluorescncia

Microscopia Ultravioleta - Produz aumentos 2 X superior. As imagens so


visualizadas numa emulso fotogrfica em tela de TV.

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Microscopia Ultravioleta.

Microscopia eletrnica de varredura (MEV) fornece viso tridimensional da


superfcie celular, pois o feixe de eltrons estreito se move para frente e para
trs da superfcie dos microrganismos, que esto cobertos com um filme de
metal. Os padres de eltrons so detectados por um dispositivo similar a uma
cmera de televiso.

Microscopia eletrnica de varredura

Microscopia eletrnica transmisso (MET): para visualizar vrus e


estruturas diminutas. Existem vrios mtodos de colorao que utilizam metais
pesados e radioativos. O mtodo a ser utilizado depende em parte do tipo de
microscpio eletrnico disponvel, bem como da finalidade do exame.
As tcnicas que utilizam corantes, ou aquelas que cortam os
microorganismos em sees finas, so aplicveis microscopia eletrnica de
transmisso. Os feixes de eltrons atravessam o espcime e a transmisso
destes feixes forma uma imagem como aquelas descritas anteriormente. Os
metais pesados podem ser usados como corantes, fazendo com que algumas
partes das clulas apaream escuras porque os eltrons no podem atravesslas. O microscpio eletrnico Instrumento eltrico que utiliza eltrons para
iluminar um objeto. Como os eltrons tm um comprimento de onda muito menor
do que da luz, podemos mostrar objetos muito menores. O comprimento de
onda de cerca de 100.000 X menor que as ondas luminosas dos microscpios
ticos. A resoluo de 1:40.000.

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Microscopia de transmisso eletrnica

ndice de refrao ar = 1.0


lcool = 1.323
gua = 1.333
leo = 1.470
leo de imerso = 1.52 - 1.56
Comprimento de onda de luz - (nm)
Infravermelho
Vermelho
Alaranjado
Amarelo
Verde
Azul
Violeta
Ultravioleta

650
620
589
550
517
467
423
390

Poder de ampliao (Magnitude) - Representa apenas o aumento que um


microscpio proporciona, sem levar em considerao o seu poder de resoluo
(P.R) e a sua abertura numrica (NA), isto , apenas os aumentos multiplicados
da objetiva pela ocular.
P.A = Ocular X Objetiva Ex. 10 Oc X 20 Ob = 200 X
Aumento til - O aumento til de um microscpio o aumento do objeto at
que no se perca o objeto em si.
AU = NA X 1000
Abertura Numrica ( NA ) - o ngulo formado com eixo e os raios mais
externos, ainda cobertos pela objetiva. Representa a metade do cone de luz que
entra na objetiva. A grandeza desse ngulo expressa pelos valores de seno
da metade da NA, multiplicado pelo ndice de refrao (n), do meio que
preenche o espao existente entre a lente frontal e a lamnula.
A Abertura Numrica influncia:

Resoluo: melhora com aumento de NA

Profundidade de campo: diminui com aumento de NA

Brilho da imagem: aumenta com NA.

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Como o seno de qualquer ngulo no pode ser maior que 1 , um valor de


NA maior que 1 s pode ser obtido com objetivas de imerso , onde o leo
possui ndice de refrao comparvel ao do vidro (em torno de 1,5). Para
objetivas a seco o NA menor que 1. Para objetivas de imerso o valor
ligeiramente maior que 1, entre 1.2 e 1.5.

.
NA = n. sen (u)

Poder de Resoluo - a capacidade de um microscpio distinguir distinta e


separadamente dois pontos adjacentes. a medida do tamanho do menor
objeto que pode ser visto ao microscpio. Na prtica o poder de resoluo
expresso pelo limite de resoluo que a menor distncia que pode existir entre
dois pontos, para que apaream individualizados. Em conseqncia, quanto
menor for o limite de resoluo da objetiva, maior ser o respectivo poder de
resoluo.
Os fatores que governam o (PR) so:
1. Propriedade das lentes (NA).
2. O comprimento de onda de luz usada pela iluminao ().

PR =

05 .
PR =

____________

2.NA

_____________

NA

Exemplo:
a) Calcular o PR de um microscpio que apresenta as seguintes caratersticas:
objetiva = 40X, NA = 0.75, ocular = 6X, comprimento de onda de luz 540nm
(entre o espectro do o verde e amarelo). O que significa o resultado?
0.5 .
Pr =

_______________

NA

0.5 . 540
=

_________________

= 360nm ou 0.36

0.75

O resultado significa que 0.36 a menor distncia entre dois pontos que o
microscpio consegue distinguir.

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b) Dispondo de filtros azul (430 nm), verde (540 nm), vermelho (620 nm ) qual
filtro usaria para obter o melhor PR ?
0.5 . 430
PR = __________________ =
0.75

0.5 . 430
___________________

= 0.28

0.75

Usaria o azul, haja vista que o PR inversamente proporcional ao


comprimento de onda de luz.
c) Dispondo de oculares 6X, 8X, 10X, 15X e 20x. Qual ocular daria o maior
aumento til ?
MAGNITUDE = OBJETIVA X OCULAR
MAGNITUDE = 800 X. Que significa apenas multiplicar o valor da objetiva em
questo (40X) pela ocular de maior aumento (20X).
AUMENTO TIL = NA X 1000
AU = 0.75 . 1000 = 750X
6X
8X
10X
15X
20X

.
.
.
.
.

40
40
40
40
40

=
=
=
=
=

se:

240
320
400
600
800

Escolheria a ocular de 15X, porque o mximo de aumento da objetiva de


40X dado pelo valor da sua abertura numrica, que igual a 0.75, que
corresponde a um aumento til de 750X, por isso no adianta colocar ocular de
20X.
Cuidados e manuteno no trabalho dirio:

Guardar objetivas nas cpsulas quando no em uso;

Cobrir o microscpio.

Proteger o microscpio da umidade : Cuidado com os FUNGOS !

Evitar tocar nas roscas e junes : o suor pode corroer e comprometer as


junes .

No tocar nas superfcies pticas!

Evitar mudanas bruscas de temperatura/umidade do ar ( como quando


mudando o microscpio de sala) . Estas mudanas podem provocar
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condensao de umidade no interior do aparelho , em regies difceis de


desmontar.
Ao guardar o microscpio por perodos longos:

Guardar em local claro, seco e arejado ;

Preparar um carto embebido com fungicida ;

Guardar componentes delicados (objetivas , oculares , etc) em armrios


secadores ;

Antes de guardar , certificar-se da limpeza do aparelho.

Limpeza:
Componentes pticos:

Tirar p com pincel de pelo fino, seco e desengordurado;

Evitar impresses digitais; limpar com camura ou seda;

Objetivas: limpar apenas superfcies expostas . A desmontagem de uma


objetiva pode causar seu desalinhamento , e deve ser feita apenas em
caso de necessidade;

lente posterior : pincel;

lente frontal: pano ou celulose e soluo de limpeza;

leo de imerso: usar solvente como ter , benzol ou Xilol (Ateno! O


Xilol apresenta toxicidade!);

NO usar lcool etlico! Ataca a pelcula protetora;

Componentes mecnicos:

Graxas livres de cido (vaselina) e leo ;

Evitar p , vapores e substncias agressivas

Cuidados ao desmontar o microscpio para reparos:

DESLIGAR O APARELHO DA REDE ELTRICA .

Remover peas que no sejam necessrias ao reparo. Cuidado com


peas soltas (p. ex. oculares) ao virar o microscpio.

Todo o trabalho de desmontagem , limpeza e remontagem deve ser feito


sob uma bancada ( e no na mo ) , com todo o cuidado para evitar a
queda de peas. Pode ser usada uma "toalha" de borracha ou outro
material antiderrapante . A bancada deve estar limpa e livre de quaisquer
objetos que no os necessrios para o trabalho.
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O microscpio no deve ser deitado de forma que o peso force os


componentes como ajustes de foco ou charriot. Cuidado com posies de
equilbrio instvel!

Devem ser usadas SEMPRE as ferramentas adequadas. Uma chave de


fenda inadequada , por exemplo , pode danificar a fenda do parafuso
impedindo sua retirada.

A seqncia de desmontagem deve ser guardada. Sempre que possvel ,


retorne os parafusos aos seus orifcios originais logo aps a
desmontagem de algum conjunto , para marcar a posio correta destes.
As orientaes das lentes NUNCA devem ser invertidas.

Mantenha sempre o mnimo possvel desmontado em cada instante. As


peas soltas de um conjunto que no precisaria estar desmontado
apenas ajudam a gerar confuso.

Os componentes pticos (lentes , espelhos , prismas) devem ser tratados


com o mximo cuidado. Uma vez retirados do conjunto , devem ser
colocados sobre uma superfcie macia , longe de ferramentas ou peas
que acidentalmente possam risca-los. Evite tocar com os dedos ou
ferramentas nas superfcies destes componentes.

Ao trocar a lmpada , NUNCA tocar o bulbo com os dedos . O suor reage


com o material do bulbo das lmpadas halgenas.

Anexos:

Caminho da luz atravs do microscpio ptico

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Microscopia Contraste de fase

diatomceas

As diatomceas constituem um importante grupo de


protistas fitoplantnicos pertencentes classe de algas
designada como Bacillariophyceae (bacilariofceos). As
diatomceas so organismos unicelulares, com uma teca: uma
carapaa ou parede slicatada disposta em vesculas abaixo da
membrana plasmtica, e que pode facilmente fossilizar. Existem,
contudo, algumas espcies formam cadeias ou colnias simples
que podero levar um observador incauto a consider-las como
pluricelulares.

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Apostila de Microscopia

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Microscpio eletrnico de transmisso.

Microscpio eletrnico de varredura.

Bibliografia Recomendada

ptica Geral:

Meyer-Arendt , J.R. Introduction to Classical & Modern Optics


Prentice-Hall 1989 (3a ed.)
Um livro bsico sobre ptica , com informaes prticas e um enfoque
moderno.
Strong, J. Concepts of Classical Optics. W.H.Freeman & Co.San Francisco-1958
Enfoque mais aprofundado na prtica.
O'Shea , D. Elements of Modern Optical Design. John Wiley & Sons - NY -1985
Tratado compreensivo e compreensvel sobre como projetar sistemas
pticos, com vrios exemplos.
Bureau of Naval Personal Basic Optics and Optical Instruments Dover NY 1969

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Livro de treinamento em ptica da Marinha Americana ; embora no trate de


microscpios , traz muita informao desde ptica bsica at instrumentos e
fabricao de componentes , de forma simples.
Twyman , F. Prism and Lens Making.

Adam Hilger - Bristol - 1988 ( 2 a ed.)

Microscopia:
Olliver, C.W. The intelligent use of the Microscope.
London - 1951

Chapman & Hall Ltd -

Teoria ptica do Microscpio explicada de modo simples, voltado para uso.


Altamente recomendado.
Payne, B. O . Microscope Design and Construction.
Simms , LTD. York,England 1954

Cooke,Troughton &

Stephanides, T. The Microscope -and the practical principles of observation


Faber & Faber LTD London 1947

Orientado s tcnicas de observao.

Benford, J. R. ; Rosenberger, H. E. Microscopes in


Kingslake, R. (ed)
Applied Optics and Optical Engineering vol IV. Academic Press - NY - 1967

A coleo "Applied Optics..." uma um marco de referncia na rea.


TRAJETRIA DA LUZ SEGUNDO TIPOS DE MICROSCOPIAS

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