Yerba Mate Orgánica, Composición, Brasil PDF

UNfVERSIDADE-FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE QUMICA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA
CARACTERIZAO QUMICA DA ERVA MATE (1lex
paraguariensis): APLICAO DE DIFERENTES

PROCESSOS DE EXTRAO E INFLUNCIA DAS
CONDiES DE PLANTIO SOBRE A COMPOSiO
QUMICA
ROSNGELA ASSIS JACQUES

Tese de Doutorado
PORTO ALEGRE
OUTUBRO 2005
-UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

lNSTITUTO DE QUMICA
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA
CARACTERIZAO QUMICA DA ERVA MATE (1lex
paraguariensis): APLICAO DE DIFERENTES

-PROCESSOS DE EXTRAO E INFLUNCIA DAS
CONDiES DE PLANTIO SOBRE A COMPOSiO
QUMICA
ROSNGELA ASSIS JACQUES
Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Quimica.da UFRGS como

parte dos requisitos para a obteno do ttulo de Doutor em Qumica.
PORTO ALEGRE
OUTUBRO 2005
PPGQ - UFRGS - TESE DE DOUTORADO
DECLARAO DE AUTORIA
Este trabalho foi realizado pela autora, orientado pela ProF Ora. Elina
Bastos Caramo e co-orientado pelo Prof. Dr. Jos Vladimir de Oliveira. Todo o
trabalho foi desenvolvido no Laboratrio de Pesquisa E-202 e Central Analtica,
do Instituto de Qumica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul e nos
Laboratrios de Termodinmica Aplicada e Central Analtica do Departamento
de Engenharia de Alimentos da Universidade Regional Integrada do Alto
Uruguai e Misses-Campus de Erechim.
Rosngela Assis Jacques
Esta tese foi julgada adequada para a obteno do ttulo de Doutor em

Qumica e aprovada em sua forma final, pela orientadora e pela banca
examinadora do Programa de Ps-Graduao em Qumica.
Banca Examinadora:
Pro a. Dra. Martha Bohrer Adaime (UFSM/Santa Maria)
ylJM'0-
iCJ~ ~~.
Profa. Dra. Slvia Sargenti (UFSM/Santa Maria)
r6au~ 'Oa~
Prof. Dr. Slvio Luiz Pereira Dias (IQ-UFRGS/Porto Alegre)
Prof. Dr. Adriano Lisboa Monteiro

Coordenador do Curso de Ps-Graduao em Qumica
CHIMARRO
Amargo doce que sorvo
num beijo em lbios de prata.
Tens o perfume da mata,
molhada pelo sereno.
E a cuia, seio moreno,
que passa de mo em mo,
traduz o meu chimarro
na sua simplicidade
a velha hospitalidade,
da gente do meu rinco.
(Glauco Saraiva)
11l
DEDICATRIA
Aos meus amados pais Terezinha e Manoel, pela infinita pacincia e

suporte a todo este trabalho e, simplesmente, por serem super pais.
Ao Edilson De Toni, pelo infinito amor, dedicao e, principalmente pela

pacincia e companheirismo dirio.
IV
AGRADECIMENTOS
professora Ora. Elina Bastos Caramo pela amizade, orientao, dedicao

e incentivo especialmente nos momentos mais difceis deste trabalho.
Aos professores Or. Jos Vladimir de Oliveira e Or. Cludio Oariva,

supervisores do trabalho desenvolvido na Universidade Regional Integrada do
Alto Uruguai e Misses, Campus de Erechim, pela amizade, incentivo,
dedicao e valiosas contribuies.
Aos colegas e amigos do Curso, em especial a Ins, Valria, Ceclia e

Fernanda pelo companheirismo e pelas sugestes e observaes valiosas.
Anelise Schmidt e Flvio Pavan pela amizade.
Aos bolsistas de iniciao cientfica Ana Paula, Rafael, Jonathan, Bruna e

Camila que realizaram um trabalho srio e responsvel, pela amizade e
companheirismo.
Aos demais alunos do Laboratrio E-202 pela colaborao e amizade.
Aos demais professores e funcionrios do Instituto de Qumica da UFRGS, pelo

apoio tcnico.
Ao Or. Srgio do Amaral professor da URI-campus de Erechim, pela

contribuio na discusso das variveis agronmicas da erva-mate.
Eunice Valduga pela prestatividade, amizade e profissionalismo.

Rositnia, funcionria da URI-campus de Erechim, pela amizade, incentivo, e
apoio tcnico.
toda a famlia da prof. Elina que me acolheu carinhosa e cuidadosamente,

com verdadeira amizade, durante a execuo da parte escrita deste trabalho.
Ervateira Baro pelo plantio da erva-mate e cuidados com a colheita das

plantas utilizadas neste estudo.
Aos amigos do Instituto de Qumica da UPRGS e a todos aqueles que de uma

forma ou de outra contriburam para a realizao deste trabalho.
VI
NDICE GERAL
ndice Geral............................................................................................................................
Lista de Figuras............................................................................................................ ..........
Lista de Tabelas............. .............................................. ................... .......... ....... ..... .... .............
Lista de Abreviaturas e Siglas.. .... ............................................................... .... ......... ... ...........
Resumo..................................................................................................................................
Abstract.................................................................................................................................
CAPTULO 1: INTRODUO................................................................................................
CAPTULO 2: REVISO DA LlTERATURA...........................................................................
1.0 ERVA-MATE................................................................................................................
1.1 Classificao taxonmica..................................................................... ...... ..............
1.2 Biologia reprodutiva................. ................................ ..................... ................ ..... .......
1.3 Habitat e distribuio geogrfica....................................... ... .... .............. .............. ....
1.4 Importncia da erva-mate.........................................................................................
1.5 Composio qumica da erva-mate............ .................. ......................... .... ................
2.0 TCNICAS DE EXTRAO APLICVEIS APLANTAS...........................................
2.1 Extrao por macerao............................................................................ ............. .
2.2 Extrao com ultra-som............... ................... ..........................................................
2.3 Extrao com liquido pressurizado (PLE).............................................................
2.3.1 Vantagens e desvantagens da extrao com liquido pressurizado..... ......... .........
2.4 Extrao com fluido supercrtico.................. .............................................................
2.4.1 Dixido de carbono como solvente...... .................................. ................ ................
2.4.2 Tcnica de extrao supercrtica...........................................................................
2.4.3 Equipamento tpico da extrao supercrtica....... ............................................ ......
2.5 Comparao das tcnicas de extrao.................................. ........... .... ... .................
3.0 PLANEJAMENTO ESTATSTICO DE EXPERIMENTOS.............................................
4.0 ANLISE INSTRUMENTAL.........................................................................................
4.1 Cromatografia gasosa (GC)................................................................... ...................
4.2 Espectroscopia de absoro atmica (FAAS)..........................................................
CAPTULO 3: DETERMINAO DOS MINERAIS DAS FOLHAS DE ERVA-MATE SOB
DIFERENTES CONDIOES AGRONOMICAS..............................................
1.0 EXPERIMENTAL..........................................................................................................
1.1 Detalhamento expenmental de campo..................................... ................ .................
1.2 Amostras................................................................. ..................................................
1.2.1 Digesto das amostras............................... ........................... ................ ................
1.3 Procedimento para determinao dos minerais........................................................
2.0 RESULTADOS E DiSCUSSO....................................................................................
2.1 Influncia das condies agronmicas sobre o teor de minerais nas folhas de
erva-mate................................................... ............ ....... ......... ............ .............................
3.0 CONCLUSOES PARCiAiS...........................................................................................
CAPTULO 4: APLICAO DO C02 AALTAS PRESSOES NA EXTRAO DE
COMPOSTOS ORGNICOS DA ERVA-MATE.............................................
1.0 EXPERIMENTAL.........................................................................................................
1.1 Reagentes e solventes............................. ............................................ ......... ............
1.2 Extrao com C02 supercrtico.................................................................................
1.3 Variveis de extrao................................................................................................
vii
x
xii
xiv
xvi
xvii
1
6
7
7
8
8
9
11
15
16
16
20
23
25
26
27 .
28
29
30
32
32
34
35
36
36
37
38
38
40
40
48
49
50
.50
51
51
Vl1
1.4 Cromatografia lquida preparativa em slica gel.................... ....................................

1.5 Cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massas (GCIMS) .........
1.5.1 Derivatizao................................................. ........................................................
2.1 Efeito das variveis de extrao (P x T).......................................................... ..........
2.2 Fracionamento dos extratos......................................................................................
2.2.1 Anlise cromatogrfica (GCIMS) dos extratos obtidos no fracionamento
cromatogrfico em slica gel........................................ ..................................... ...............
2.3 Efeito das variveis agronmicas sobre o rendimento da SFE............................ .....
2.3.1 Efeito da adubao e sombreamento.................................... ...............................
2.3.2 Efeito da idade de poda.................................... ................................ ....................
2.4 Anlise quantitativa dos compostos da erva-mate....................................................
3.0 CONClUSOES PARCiAiS...........................................................................................
CAPTULO 5: APLICAO DO ULTRA-SOM NA EXTRAO DE COMPOSTOS
ORGNICOS DA ERVA-MATE......................................................................
1.0 EXPERIMENTAL..........................................................................................................
1.1 Extrao por ultra-som.... ...... ....................................................................................
1.2 Cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massas (GCIMS)..........
2.1 Variveis de extrao.................................................. ............ ................... ...............
2.2 Caracterizao qumica dos extratos...................... .................................. ................
3.0 CONClUSOES PARCiAiS...........................................................................................
CAPTULO 6: APLICAO DA EXTRAO COM LQUIDO PRESSURIZADO NA
ANLISE DOS COMPOSTOS ORGNICOS DE ERVA-MATE.....................
1.0 EXPERIMENTAL..........................................................................................................
1.1 Amostras, reagentes e solventes.............................................. ................ ................
1.2 Extrao com lquido pressurizado (PlE) ou extrao acelerada com solventes
ASE).........................................................................................................................
1.3 Cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massas (GC/MS)..........
2.0 ESUlTADOS E DiSCUSSO......................................................................................
2.1 Variveis de extrao........................... ....................... ....... ......... ........... ...................
2.2 Caracterizao qumica dos extratos................ ...... ..................................................
3.0 CONClUSOES PARCiAiS.......................................................................................
CAPTULO 7: COMPARAO DE TCNICAS DE EXTRAO DE COMPOSTOS
ORGNICOS DA ERVA -MATE USANDO SOLVENTES ORGNICOS..
1.0 EXPERIMENTAL..........................................................................................................
1.1 Amostras, reagentes e solventes..............................................................................
1.2 Tcnicas de extrao utilizadas................................................ ................ ................
1.2.1 Procedimento para a extrao por macerao...... ...............................................
1.2.2 Procedimento para a extrao por ultra-som................ ........................................
1.2.3 Procedimento para a extrao com lquido pressurizado.....................................
1.3 Anlise cromatogrfica dos extratos (GC/MS)...................................... .................. .
2.0 RESULTADOS E DiSCUSSO..............;.....................................................................
2.1 Anlise do rendimento dos extratos de erva-mate.. ................................ ..................
2.2 Anlise dos extratos de erva-mate por GCIMS........................................................
2.2.1 Extrao por macerao...... ........................................................ ........................
2.2.2 Extrao por ultra-som........................ ............. ............. ......... ........... .....................
53
53
55
56
56
58
59
65
65
66
67
71
73
74
74
75
77
77
80
83
85
86
86
86
88
89
89
92
95
97
98
98
98
99
99
100
100
101
101
102
102
105
Vlll
2.2.3 Extrao com lquido pressurizado................................................... ....................

2.2.4. Anlise quantitativa comparativa dos extratos de erva-mate...............................
3.0 CONClUSOES PARCiAiS..........................................................................................
CAPTULO 8: CONClUSOES...............................................................................................
CAPTULO 9: REFERNCIAS BIBLIOGRFiCAS................................................................
CAPTULO 10: SUGESTO PARA TRABALHOS FUTUROS...............................................
CAPTULO 11: PRODUO CIENTFICA GERADA.............................................................
CAPTULO 12: ANEXOS........................................................................................................
108
111
114
115
120
132
134
137
IX
LISTA DE FIGURAS
Figura 1:
Figura 2:
Figura 3:
Figura 4:
Figura 5:
Figura 6:
Figura 7:
Figura 8:
Figura 9:
Figura 10:
Figura 11:
Figura 12:
Figura 13:
Figura 14:
Figura 15:
Figura 16:
Figura 17:
Figura 18:
Figura 19:
Figura 20:
Figura 21:
Figura 22:
Figura 23:
Figura 24:
Foto ilustrativa da planta de erva-mate... .......................................... ........ ........

Distribuio da erva-mate plantada no Brasil [3]..............................................
Esquema geral de sistemas de aplicao de ondas ultra-sonoras no campo
da qumica: (a) banho indireto, (b) banho direto e (c) sonda............................
(A) Esquema geral do equipamento e (B) Etapas da extrao com lquido
pressurizado no sistema ASE...........................................................................
Esquema representativo de um processo de extrao supercrtica.... .............
Foto ilustrativa do experimento de campo: (a) rea a pleno sol e (b) rea
sombreada.............................................................................. ............ ..............
Foto das folhas da erva mate com idade de 18 meses, sem adubao e
cultivada sob sol (a) e sombra (b).....................................................................
Esquema representativo de um sistema de extrao a altas presses............
Fotografia com vista parcial da unidade de extrao com dixido de carbono
pressurizado....................................................................................... .... ..........
Esquema do fracionamento aplicado mistura dos extratos obtidos por
SFE...................................................................................................................
Curvas de extrao obtidas para erva-mate usando C02 a altas presses.....
Cromatograma do on total da mistura dos extratos de erva-mate obtido via
extrao supercrtica com C02.........................................................................
Cromatograma do on total das fraes do extrato fracionado dos extratos
de erva-mate obtido por C2 a altas presses.................................................
Cintica da extrao da erva-mate de 12 meses de poda, sob diferentes
intensidades de luz e adubao....... ................. ....................... ...... ..................
Cintica da extrao da erva-mate sob diferentes idades de poda, plantadas
a pleno sol e adubadas com nitrognio............................................ ................
Equipamento utilizado para extrao com ultra-som das folhas de ervamate..................................................................................................................
Correlao entre os rendimentos obtidos experimentalmente e aqueles
calculados pelo modelo emprico do planejamento fatorial fracionrio
25-1....................................................................................................................
Cromatogramas do on total dos extratos obtidos por ultra-som com hexano
(A) e metanol (B), das amostras de erva-mate com idade de poda de 18
meses, cultivada a pleno sol e adubadas com fonte de nitrognio..................
Foto ilustrativa do aparelho de Extrao Acelerada com Solventes... ...... ........
Comparao dos rendimentos do modelo emprico e dos valores obtidos
experimentalmente de um planejamento fatorial fracionrio 26-2 para a
extrao acelerada com solventes............................................... .... ... ....... .....
Cromatogramas do on total dos extratos obtidos por extrao com lquido
pressurizado (PLE) com hexano (A) e metanol (B), das amostras de ervamate com idade de poda de 18 meses, cultivada a pleno sol e adubada com
fonte de nitrognio............ ..... ... ............................. ............ ............ .... ..............
Desenho esquemtico do equipamento usado para macerao..... .... ............
Cromatogramas do on total dos extratos das folhas de erva-mate obtidos
por macerao com hexano (A), tolueno(B), diclorometano(C), acetato de
etila(D), acetona(E) e metanol (F)....................................................................
Cromatogramas do on total dos extratos das folhas de erva-mate obtidos
por extrao com ultra-som com hexano (A), tolueno(B), diclorometano(C),
acetato de etila(D), acetona(E) e metanol (F)..................................................
7
9
18
22
29
37
40
51
52
54
57
60
62
65
66
75
79
81
87
92
93
99
103
106
x
Figura 25: Cromatogramas do on total dos extratos das folhas de erva-mate obtidos
por extrao com lquido pressurizado (PLE) com hexano (A), tolueno(B),
diclorometano(C), acetato de etila (O), acetona(E) e metanol
(F).....................................................................................................................
109
Xl
LISTA DE TABELAS
Tabela I:
Distribuio dos teores de nutrientes nos diferentes tecidos de ervamate (g/1 00 g) ............................................................................................
Tabela 11:
Reviso da literatura sobre aplicao de ultra-som na extrao de
plantas .......................................................................................................
Tabela 111:
Reviso da literatura sobre aplicao da extrao com lquido
pressurizado (PLE) na extrao de plantas ............................................. ..
Tabela IV:
Propriedades termodinmicas dos fluidos .................................................
Tabela V:
Aplicaes da extrao com fludo supercrtico em plantas .................... .
Tabela VI:
Comparao entre mtodos de extrao utilizados em plantas ............... .
Tabela VII:
Parmetros instrumentais utilizados no FAAS ..........................................
Tabela VIII:
Teor de cinzas [g/100g base seca] das amostras de erva-mate.................. ..
Tabela IX:
Contedo de macronutrientes das folhas de erva-mate em funo da
idade da folha, incidncia de luz e adubao ............................................
Tabela X:
Contedo de micronutrientes das folhas de erva-mate em funo da
idade da folha, incidncia de luz e adubao ............................................
Tabela XI:
Anlise estatstica (ANOVA com teste de Tukey a 5%) dos contedos
dos minerais das folhas de erva-mate,sob diferentes condies
agronmicas ...............................................................................................
Tabela XII:
Condies cromatogrficas utilizadas na anlise dos extratos obtidos
com C02 a altas presses por GCIMS.......................................................
Tabela XIII:
Condies experimentais e rendimentos obtidos nas extraes de ervamate com C02 a altas presses. Erva-mate com idade de poda de 12
meses cultivada a pleno sol e sem adubao.......................................... ..
Tabela XIV:
Rendimentos dos extratos (misturas dos extratos da Tabela XIII) obtidos
por cromatografia lquida preparativa (fracionamento), expressos em
9 (extrato) por 100 9 de amostra...............................................................
Tabela XV:
Compostos identificados na mistura dos extratos da Tabela XIII e das
fraes do extrato fracionado de erva-mate com idade de poda de 12
meses, cultivada a pleno sol e sem adubao, obtido por SFE............... .
Tabela XVI:
Compostos das folhas de erva-mate com idade de 18 meses de poda,
quantificados em funo do tipo de fertilizao e incidncia de luz.......... .
Tabela XVII: Anlise estatstica (ANOVA com teste de Tukey a 5%): Efeito da
intensidade de luz e do tipo de adubao sobre a concentrao (mg!kg
de amostra) de compostos selecionados do extrato de folhas de ervamate com 18 meses de idade, obtidos por SFE........................................
Tabela XVIII: Variveis e resultados de um planejamento fatorial fracionrio 25-1 do
processo de extrao por ultra-som, das folhas de erva-mate................ ..
Tabela XIX:
Principais compostos identificados nos extratos por ultra-som com
hexano e metanol, das amostras de erva-mate com idade de poda de
18 meses, plantada a pleno sol e adubadas com fonte de nitrognio.......
Tabela XX:
Variveis e resultados de um planejamento fatorial fracionrio 26-2,
utilizados na extrao com lquido pressurizado ..................................... .
Tabela XXI:
Principais compostos identificados nos extratos por extrao com
lquido pressurizado com hexano e metanol, nas amostras de erva-mate
com idade de poda de 18 meses, cultivada a pleno sol e adubada com
fonte de nitrognio ......................................................................................
14
20
24
25
28
30
39
44
45
46
47
54
56
59
63
68
69
78
82
90
94
X1l
Tabela XXII:
Tabela XXIII:
Tabela XXIV:
Tabela XXV:
Tabela XXVI:
Tabela XXVII:
Tabela XXVIII:
Rendimento das extraes por macerao, ultra-som e extrao

acelerada por solvente, obtido para as amostras de erva-mate,
expresso em gramas de (extrato) por 100 g de amostra........................
Anlise estatstica (ANOVA com teste de Tukey a 5%). Efeito das
tcnicas de extrao e o tipo de solvente considerado sobre o
rendimento de extrato das folhas de erva-mate........................ .............
Principais compostos identificados nos extratos obtidos por
macerao com hexano (H), tolueno(T), diclorometano(D), acetato de
etila(AE), acetona(A) e metanol (M) nas amostras de erva-mate com
idade de poda de 18 meses, cultivada a pleno sol e adubada com
fonte de nitrognio..................................................................................
Principais compostos identificados nos extratos por extrao com
ultra-som com hexano (H), tolueno(T), diclorometano(D), acetato de
etila(AE), acetona(A) e metanol (M) nas amostras de erva-mate com
idade de poda de 18 meses, cultivada a pleno sol e adubada com
fonte de nitrognio. ..... ...................................... ..... ...................... ...........
Principais compostos identificados nos extratos por extrao por
lquido pressurizado com hexano (A), tolueno(B), diclorometano(C),
acetato de etila(D), acetona(E) e metanol (F) nas amostras de ervamate com idade de poda de 18 meses, cultivada a pleno sol e
adubada com fonte de nitrognio...........................................................
Concentrao dos compostos quantificados nos extratos obtidos nas
diferentes tcnicas de extrao (macerao, ultra-som e extrao com
lquido pressurizado) das folhas de erva-mate com idade de poda de
18 meses, cultivada a pleno sol e adubada com fonte de nitrognio,
expressos em mglkg........................
Anlise estatstica (ANOVA com teste de Tukey a 5%) referente
concentrao dos compostos das folhas de erva-mate com idade de
poda de 18 meses, cultivada a pleno sol e adubada com fonte de
nitrognio (mglkg de amostra) obtidos por macerao, ultra-som e
extrao com lquido pressurizado.........................................................
101
102
104
107
110
112
112
X1ll
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ASE - extrao acelerada por solvente

BSTFA - (N,O-bis(trimetilsil)trifluoroacetamida)
CTC-capacidade de troca de ctions
C18 - fase estacionria octadecil- silano
EI - impacto por eltrons
FMS - espectroscopia de absoro atmica
FM - fase mvel
GC/MS - cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas
IAL- Instituto Adolfo Lutz
LC/MS - cromatografia lquida acoplada espectrometria de massas
MAE - extrao assistida por microondas
MIC - cromatograma por monitoramento de ons
MS - espectrometria de massas
OV-5 - fase estacionria de metil silicone com 5 % de grupos fenila
p - densidade
Pc - presso crtica
PLE - extrao com lquido pressurizado
PM - peso molecular
p/p - peso/ peso
P - presso
p/v - peso/volume
XlV
PPGQ - UFRGS - TESE DE DOurORADO
SCAN - modo de operao na espectrometria de massas por varredura de

ons
SFE - extrao com fluido supercrtico
SIM - monitoramento de ons simples
SPE - extrao em fase slida
SPME - micro - extrao em fase slida
T - temperatura
TIC - cromatograma de on total
TMS - trimetilclorossilano
tR - tempo de reteno
US - ultra-som
v/v - volume/volume
xv
RESUMO
o objetivo deste trabalho foi estudar a composio qumica das folhas de ervamate, sob diferentes condies agronmicas e tcnicas de extrao. Os
mtodos de extrao usados foram macerao, ultra-som, extrao com lquido
pressurizado e extrao com fludo supercrtico. Foram investigadas as
variveis que podem influenciar no processo de extrao, tais como
temperatura, presso, polaridade do solvente, tempo de extrao, massa de
amostra, entre outras. A identificao dos compostos foi realizada por
cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas. Todos os
mtodos de extrao utilizados mostraram-se eficientes para a obteno dos
extratos, com as diferenas sendo mais quantitativas do que qualitativas. Entre
os mtodos de extrao que utilizam solventes orgnicos, a extrao com
lquido pressurizado mostrou-se mais eficiente, produzindo maior rendimento
em massa de extrato e maior concentrao de alguns dos compostos de
interesse, com as vantagens de reduo de solvente e tempo de extrao. A
composio qumica da erva-mate influenciada pelas condies agronmicas
de plantio, bem como pelas condies de extrao de suas folhas. A melhor
condio agronmica avaliada, ou seja, aquela que produziu maior quantidade
de extrato, foi o cultivo das plantas a pleno sol, adubadas com nitrognio e com
idade de poda de 18 meses. A varivel mais importante das tcnicas de
extrao utilizadas foi a polaridade do solvente. Solventes de maior polaridade
produziram maior rendimento em extrato. A anlise cromatogrfica dos extratos
obtidos permitiu identificar cerca de 50 compostos qualitativamente e 6
quantitativamente, destacando-se a cafena, fitol, cido palmtico, cido
esterico, esqualeno e vitamina E.
XVI
ABSTRACT
The main objective of this work was to study the chemical composition of the
extracts of mate leaves cultivated under different agronomic conditions obtained
from different extraction techniques. The extraction methods used were
maceration, sonication, pressurized liquid extraction and supercritical fluid
extraction. It was investigated the influence of temperature, pressure, solvent
polarity, extraction time, sample amount, etc., on the extraction processo The
identification of the compounds was accomplished by gas chromatography
coupled to mass spectrometry detector (GC/MS). Results showed that ali the
extraction methods were efficient, with more quantitative differences than
qualitative. Among the extraction methods using organic solvents, the
pressurized liquid extraction showed to be more efficient, producing larger mass
yields and larger concentration of some of the present compounds in the mate
leaves, with the advantages of solvent consumption and time reduction. It was
verified that the chemical composition of the mate is influenced by the
agronomic conditions, as well as the extraction conditions of the mate leaves.
The best-evaluated agronomic condition, i.e., that produced the greatest
amount of extract was the fertilization with nitrogen and the complete exposure
to sunlight.
Solvent polarity demonstrated to be the most important variable in
the extraction procedure. Thus, solvents of greater polarity produced larger

mass yields. The chromatographic analysis of the extracts allowed the
qualitative identification of 50 compounds and 6 quantitative determined
(caffeine, phytol, palmitic aCid, stearic acid, squalene and vitamin E).
XV11
CAPTULO 1:
INTRODUO
~-
A erva-mate (lIex paraguarienss St. HiIL) uma espcie nativa da regio

sul do Brasil e tem importncia histrica na cultura e na economia dessa regio
e de pases limtrofes, como Argentina, Uruguai e Paraguai.
Por um longo perodo, a erva-mate tem sido um importante produto das
exportaes brasileiras e a sua produo ainda se constitui em uma grande
fonte de renda e emprego, especialmente para os pequenos e mdios
produtores da regio de ocorrncia da espcie [1,2].
O setor ervateiro retomou seu crescimento a partir de 1993 com uma
produo de 529 mil toneladas nos estados do Paran, Santa Catarina e Rio
Grande do Sul [1], atingindo cerca de 670 mil toneladas nos trs estados em
2000[2].
No estado do Rio Grande do Sul, a cultura compreende cerca de 250
municpios, onde esto direta ou indiretamente envolvidas 39.000 pequenas
propriedades e empresas, gerando cerca de 165.000 empregos diretos [3], o
que refora a importncia do setor ervateiro para a regio.
O setor ervateiro, na microrregio de Erechim, compreende 9.363
famlias de produtores rurais, que tm na atividade ervateira uma importante
fonte de renda e 42 empresas agroindustriais que produzem e comercializam
erva-mate para diversas regies do Brasil e tambm para exportao [3].
Atualmente, a erva-mate recupera seu "status" na economia, no pelo
desbravamento fsico de fronteiras, mas pela conquista de novos mercados
face ao desenvolvimento de produtos no setor de bebidas, cosmticos,
medicamentos e higiene, alm do desenvolvimento de estudos fitoqumicos
que objetivam explorar seu potencial.
A forma mais difundida de consumo da erva-mate o chimarro (infuso
de erva-mate) em cuias de madeira ou porongo [5,6]. O mate uma bebida
estimulante: elimina a fadiga, estimula a atividade fsica e mental, atuando
beneficamente sobre os nervos e msculos e favorecendo o trabalho
intelectual. Por possuir vitaminas do complexo B, o mate participa do
aproveitamento do acar nos msculos, nervos e atividade cerebral. Com a
presena das vitaminas C e E, age como defesa orgnica e apresenta
benefcios sobre os tecidos do organismo. A presena de sais minerais,
juntamente com a cafena, estimula o trabalho cardaco ajudando na circulao

do sangue e diminuindo a tenso arterial, pois a cafena atua como vaso
dilatador [7].
O mate favorece a diurese e atua tambm sobre o tubo digestivo: ativa os
movimentos peristlticos, facilita a digesto, suaviza os embaraos gstricos,
favorecendo a evacuao e a mico. A ao estimulante do mate mais
prolongada que a do caf, no deixando, porm, os efeitos colaterais ou
residuais como irritabilidade e insnia [7].
Alm de alimento, a erva-mate h muito tempo vem sendo considerada
como tendo valor teraputico, sendo recomendada como anti inflamatrio, antireumtico, tnico, estimulante, diurtico, etc. Dada a sua utilizao medicinal
foi incorporada em vrias Farmacopias, podendo-se citar a argentina de 1898,
a brasileira de 1929, as francesas de 1866 e 1844, as mexicanas de 1904,
1925 e 1952, a paraguaia de 1944, a portuguesa de 1876 e as venezuelanas
de 1898, 1919, 1927 e 1939. Junto ao Ministrio da Sade Brasileiro esto
registradas 14 preparaes derivadas de lIex paraguariensis St. Hil. A ervamate tambm comercializada no exterior, por exemplo, na Alemanha onde h
6 preparaes homeopticas e 452 outras preparaes comerciais [4].
No mercado h uma demanda por produtos orgnicos de uma forma
geral, e esta tendncia configura um diferencial no valor agregado quando a
matria-prima
(erva-mate) proveniente de ervais nativos ou ervais
submetidos a condies agronmicas, que obedecem a princpios de

sustentabilidade.
Alm de garantir o suprimento das exigncias da cultura atravs da
adubao, outros fatores so determinantes para manter as propriedades
originais da planta.
Salienta-se, tambm, que hoje h uma grande oferta desse produto (ervamate), o que tem incentivado a busca no apenas de melhorias na qualidade
dos
produtos
em
explorao,
como
tambm
de
novas
formas
de
aproveitamento [3,4].
O conhecimento cientfico sobre a taxonomia do gnero, a composio
qumica e as propriedades farmacolgicas da espcie lIex paraguariensis e do
produto erva-mate so ainda incipientes.
o desenvolvimento de tcnicas
modernas de preparao de amostras
com significantes vantagens sobre os mtodos convencionais, tambm

chamados oficiais (descritos em farmacopias de diversos pases), assume um
papel importante em garantir a alta qualidade e certificao dos produtos
provenientes de plantas, como por exemplo, a erva-mate.
A extrao consiste na primeira etapa para que ocorra uma anlise
qualitativa ou quantitativa de uma planta, pois a extrao separa os compostos
da matriz celular para serem posteriormente analisados. As tcnicas
convencionais que podem ser empregados para extrao de compostos da
erva-mate compreendem extrao com solvente orgnico, por macerao e
ultra-som. No entanto, pouco tem sido apresentado na literatura com relao
identificao de compostos presentes na erva-mate obtidos por extrao com
solventes orgnicos. Esta justificativa, aliada ao interesse na utilizao das
tcnicas modernas de extrao, como extrao com fluido supercrtico (SFE) e
extrao com lquido pressurizado (PLE), mostra a relevncia do presente
trabalho.
Objetivos:
Dentro deste contexto, o presente trabalho teve como objetivo geral

desenvolver elou adaptar mtodos para extrao, separao e anlise dos
compostos qumicos das folhas de erva-mate.
Podemos ainda citar os seguintes objetivos especficos:
-+
Determinar a condio tima de extrao dos compostos da erva-mate
atravs da tcnica de extrao por fluido supercrtico, utilizando um

planejamento de experimentos.
-+
Extrair os compostos da erva-mate empregando a tcnica de extrao com
fluido
supercrtico,
levando em considerao
o efeito
das variveis
agronmicas (intensidade de luz, idade de poda das folhas e fertrfizao).
-+Oeterminar a composio mineral da erva-mate e verificar a influncia das

variveis agronmicas de plantio (intensidade de luz, idade de poda das folhas
e fertilizao) sobre sua composio.
-+ Estudar as tcnicas de ultra-som e extrao com lquido pressurizado
atravs de planejamentos experimentais para a obteno da melhor condio
de extrao dos compostos orgnicos da erva-mate.
-+Comparar as tcnicas de extrao utilizando solventes orgnicos, na
condio tima de extrao, para anlise qualitativa e quantitativa das folhas
de erva-mate.
-+ Identificar compostos ou classes de compostos de alto valor agregado em
diferentes condies agronmicas (idade de folha, sombreamento e adubao).
CAPITULO 2:
REVISO DA LITERATURA
1.0 ERVA-MATE
1.1 Classificao taxonmica
A erva-mate (lIex paraguariensis St. HiII) originria da Amrica do

Sul. A classificao botnica da erva-mate, segundo o naturalista francs
August de Saint Hillaire [5], a seguinte:
Diviso: Angiosperma
Classe: Dicotilednea
Sub-classe: Archichlamydeae
Famlia: Aquifoliaceae
Gnero: lIex
Espcie: lIex paraguariensis A. St. HiII
Figura 1: Foto ilustrativa da planta de erva-mate
o gnero
lIex pertence famlia Aquifoliaceae e possui cerca de 500
espcies. A rea de disperso inclui as Amricas, sia, Europa e o sul da

frica. O maior nmero de espcies est na regio tropical da sia e das
Amricas [5, 6].
Algumas
espcies de lIex so
bastante populares no mundo,
destacando-se I. aquifolium L. (Europa), I. Opaca Ait (Amrica do norte) e

I.comuta Lindley (sia), das quais os ramos com frutos tornaram-se smbolo de
festividades importantes, como o Natal.
1.2 Biologia reprodutiva:
A erva-mate uma espcie diica, cuja florao ocorre de setembro a

dezembro. Quanto frutificao, ocorrem frutos maduros de dezembro at
abril. A florao e frutificao iniciam gradativamente, aos 2 anos em rvores
oriundas de propagao vegetativa e aos 5 anos em rvores provenientes de
sementes, em stios adequados. A disperso das sementes realizada por
pssaros, principalmente sabis [9].
1.3 Habitat e distribuio geogrfica
A especle possui grande ocorrncia, atingindo aproximadamente

540.000 Km 2 . A erva-mate ocorre no nordeste da Argentina, leste do Paraguai,
noroeste do Uruguai e Brasil [7].
No Brasil, ela pode ser encontrada nos estados do Mato Grosso do Sul,
Paran, Rio Grande do Sul e Santa Catarina. Sua rea de ocorrncia natural
de, aproximadamente, 450.000 Km 2 , o que equivale a quase 5% do territrio
brasileiro [8]. Estes dados esto apresentados na Figura 2.
A regio sul a maior produtora, onde 596 municpios desenvolvem a

atividade ervateira, envolvendo um contingente de 710.000 pessoas, para uma
produo anual aproximada de 650.000 toneladas de folhas.
Paraguai
?
Quantidade produzida
De
2
410
Uruguai
(t)
At
339
1.531_
1.759
4.460
4.750
13.227
12.1
62.440_
Figura 2: Distribuio da erva-mate plantada no Brasil [3].
1.4 Importncia da erva-mate
No Brasil, so relatadas 68 espcies deste gnero [6,10]. Destas, lIex

paraguariensis, popularmente conhecida como erva-mate, de importncia
histrica incontestvel na regio sul do Brasil e em pases limtrofes, como

Argentina, Paraguai e Uruguai. O consumo de erva-mate como chimarro um
hbito fortemente incorporado pelas populaes sul-brasileiras, em especial no
Rio Grande do Sul, maior consumidor do pas, fazendo parte do perfil

comportamental gacho.
As folhas da erva-mate so utilizadas tanto para o chimarro como para
o terer, o mate solvel e o ch mate [8,9]. A regio sul a que mais utiliza o
chimarro, consumindo em mdia, mais de 90% da produo. Os outros 10%
so utilizados para produtos como chs, mate solvel, entre outros.
O processamento bsico para o beneficiamento da erva-mate para
chimarro constitui-se das etapas da colheita, recepo, sapeco, secagem,
triturao, classificao, armazenagem, moagem, mistura, embalagem e
expedio [7]. A indstria da erva-mate evoluiu consideravelmente nos ltimos
anos, e hoje utiliza modernos soques ervateiros e mquinas movidas a energia
eltrica.
O sapeco utilizado para evitar que as folhas da erva-mate escuream.
O escurecimento ocorre pela presena das enzimas polifenoloxidase (PFO) e
peroxidase (POD) que, em 1928, foram identificadas por Senglet como as
responsveis pela oxidao dos compostos fenlicos quando as folhas s.o
retiradas da planta e expostas ao ar. O sapeco, que tem por finalidade a
inativao destas enzimas, consiste na passagem rpida dos ramos com
folhas sobre as chamas do sapecador [7].
Alm das tradicionais bebidas, a erva-mate tambm utilizada em
preparaes farmacuticas, tendo sido incorporada a vrias farmacopias. No
Ministrio da Sade brasileiro esto registradas 14 preparaes derivadas de
lIex paraguariensis,
em funo das propriedades teraputicas,
sendo
recomendada como estimulante, anti inflamatrio, anti-reumtico, tnico e

diurtico [7,11].
Da erva-mate podem ser obtidos corantes e detergentes, especialmente
para uso hospitalar. No Brasil, esses produtos esto sendo pesquisados em
nvel laboratorial. No exterior, especialmente nos pases do hemisfrio norte,
essa planta j tem mercado em funo das amplas possibilidades de
aproveitamento [12].
10
1.5 Composio qumica da erva-mate
Alguns trabalhos [8,13-15] mostram que a composio qumica da ervamate muito complexa, apresentando metilxantinas, saponinas, taninos,
vitaminas, componentes minerais, substncias aromticas, cidos graxos,
terpenos, lcoois, cetonas, aldedos, fenis, entre outros.
A presena de saponinas em folhas de lIex paraguariensis foi
estabelecida atravs de trabalhos realizados por Gosmann [4] e Montanha [16].
Gosmann e colaboradores [17] e Kraemer [18] descreveram a presena
de 11 glicosdeos, como agliconas, cido urslico e cido oleanlico e os
acares arabinose, glicose e ramnose. Com o objetivo de conhecer mais
detalhadamente a composio, em termos de saponinas, de outros rgos
alm de folhas, Kraemer [19] analisou atravs de cromatografia em camada
delgada, amostras de erva-mate (ramos, razes, frutos verdes e maduros),
alm da cultura de clulas de lIex paraguariensis. Athayde [14] estudou as
saponinas presentes em folhas e frutos de rvores de lIex paraguariensis
nativas nos estados de Mato Grosso do Sul, Santa Catarina e Rio Grande do
Sul.
Desde a descoberta da presena da cafena por Stenhouse em 1843 e
da teobromina por Oehrli em 1927 em lIex paraguariensis [20], muitos trabalhos
tm sido publicados a respeito dos teores destas metilxantinas, tanto nas
folhas, talos ou frutos, como no produto erva-mate [9,14,21-28]. Alguns autores
fazem referncia presena de teofilina nas folhas e em produtos comerciais
da erva-mate [21-22].
Cafena, teofilina e teobromina so trs alcalides estreitamente
relacionados, presentes na erva-mate, e, nesta planta, so os compostos mais
interessantes sob o ponto de vista farmacolgico e teraputico. Os alcalides
so responsveis pelas propriedades estimulantes do mate. A cafena tem
efeito sobre o sistema nervoso central, acelera a entrada de oxignio nos
pulmes, aumenta a velocidade do metabolismo e acelera o batimento
11
cardaco [29]. As estruturas qumicas destes compostos esto apresentadas no

Anexo 1.
Diversas
metodologias
para
a extrao
e a
quantificao de
metilxantinas em produtos vegetais tm sido propostas ao longo do tempo,

comparando diversos mtodos de extrao e anlise.
Gosmann, em 1989 analisou por cromatografia em camada delgada as
metilxantinas nos extratos dos talos e folhas de lIex paraguariensis de
procedncia do Rio Grande do Sul [4].
Clifford & Martinez [23] analisaram amostras comerciais de erva-mate
quanto ao teor de cafena, teobromina e teofilina, atravs da tcnica de
cromatografia lquida de alta eficincia com fase reversa, utilizando uma coluna
C18 com deteco a 276 nm.
Lacerda e colaboradores [24] realizaram uma avaliao dos teores de
metilxantinas (cafena, teobromina e teofilina) em amostras de ch preto e ch
mate, utilizando como tcnicas de extrao a decoco, extrao com ultrasom e microondas. Para a quantificao dos compostos foi utilizada a tcnica
de cromatografia lquida de alta eficincia com fase reversa.
Alm das tcnicas convencionais de extrao (decoco ou macerao)
e de tcnicas no convencionais como ultra-som e microondas, tem sido
utilizada a extrao com fludo supercrtico para a extrao das metilxantinas
de amostras de erva-mate, verificando a influncia dos parmetros temperatura
e presso [25-28].
Kawakami & Kobayashi [30] identificaram os componentes volteis de
erva-mate comercial (mate cancheado argentino, mate tostado brasileiro) pela
tcnica de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas
(GC/MS). Um total de 196 compostos foram identificados no leo voltil,

incluindo 23 lcoois alifticos, 24 aldedos, 29 cetonas, 15 cidos, 8 lactonas, 9
terpenos, 11 lcoois terpnicos, 25 alicclicos, 11 fenis, 7 aromticos, 13
furanonas, 6 pirazidas e 2 pirris.
12
Valduga [7] analisou por cromatografia gasosa o leo essencial obtido

por destilao a vapor das folhas de erva-mate e identificou os seguintes
compostos: linalool, geraniol, benzaldedo, 2,4 hexadienal, 2-hexenal, 2pentenol. A atividade antibactericida dos compostos linalool, f3-ionona, aterpineol, geraniol, 1-octanol, cido octanico, nerolidol e eugenol presentes no
ch-mate foi estudada por Kubo e colaboradores [31], contra o Streptococcus
mutans, que uma das bactrias responsveis pelas cries dentrias. Todos
os compostos exibiram alguma atividade contra esta bactria cariognica.

A erva-mate rica em polifenis hidrossolveis, tais como cido
isoclorognico, cido cafico e cido clorognico, os quais apresentam alta
capacidade antioxidante e podem conferir para suas infuses um papel
hepatoprotetor (funo de auxlio ao fgado) e reforar a defesa antioxidante do
organismo humano [32-36].
Chandra & Mejia [37] determinaram e compararam os teores de
polifenis e a capacidade antioxidante de Ardisia compressa, Camlia sinensis
e lIex paraguariensis. As folhas de erva-mate apresentaram uma capacidade
antioxidante elevada frente ao cido glico em comparao com as outras
plantas.
Segundo alguns trabalhos, os flavonides e as substncias lipoflicas
presentes nas folhas de lIex paraguariensis St.
HiII causam efeitos
farmacolgicos, destacando-se a reduo do apetite [38]. Estes compostos

tambm apresentam propriedades anticarcinognicas e antimutagnicas [3940]. Entre os flavonides presentes na erva-mate, podemos citar a rutina,
quercetina e o canferol-3-o-rutinosdeo.
Pesquisas confirmam que a erva-mate responde pela presena de
aminocidos essenciais ao organismo humano, alm de acar assimilvel (em
forma de glicose). A vitamina E, presente na erva-mate benfica aos diversos
tipos de tecidos do organismo humano, enquanto a vitamina C participa da
circulao sangunea, agindo como defesa orgnica. Com as vitaminas do
complexo B, participa do aproveitamento do acar pelos msculos e nervos e
pela atividade cerebral. Entre as enzimas, foi identificada a oxidase, que junto
com a cafena, exerce a funo de nutrio do organismo humano [12].
13
Os carboidratos (acares) nas folhas de erva-mate foram analisados

por Paredes e colaboradores [41] tendo-se verificado teores de 2,85 %, 0,64%
e 0,35% de sacarose, glicose e frutose, respectivamente.
Alm destes compostos, a erva-mate contm quantidades significativas
de minerais como clcio, potssio, magnsio e mangans [7].
Alguns pesquisadores tm determinado o teor de macronutrientes (K,
Ca, Mg e Na) e micronutrientes (Mn, Fe, Zn e Cu) nas folhas da erva-mate, no
ch mate processado e suas infuses por digesto cida e posterior anlise
pela tcnica de espectroscopia atmica. Os elementos que apresentam as
maiores concentraes nas infuses so K, Ca e Mg [42-44].
Reismann e colaboradores [22, 45] investigaram os nveis de nutrientes
nos diferentes tecidos de erva-mate em ervais nativos, para avaliao das
migraes de macronutrientes que ocorrem por ocasio da safra. Na Tabela I
so apresentados os resultados obtidos com as anlises, em duas pocas
distintas: julho, quando o nvel dos nutrientes relativamente estvel e baixo, e
em outubro, perodo de franco desenvolvimento que culmina na florao.
Tabela I: Distribuio dos teores de nutrientes nos diferentes tecidos de ervamate (g/100 g) de acordo com Reismann et aI [45].
Elemento
N (%)
P (%)
K(%)
Ca (%)
Mg (%)
Folhas
1,92
0,17
1,59
0,61
0,42
Julho
Ramos
1,01
0,057
0,98
0,88
0,34
Folhas
2,20
0,12
1,86
0,43
0,33
Outubro
Ramos
1,21
0,10
1,70
1,19
0,23
Flores
2,67
0,20
3,71
0,70
0,37
Os resultados apresentados nesta Tabela so importantes quando se

associa a eles o fato do cultivo comercial da erva-mate apresentar duas pocas
de colheita, inverno e vero, chamadas respectivamente de safra e safrinha.
Verificou-se um aumento considervel dos nutrientes fsforo, nitrognio
e potssio at o ms de outubro (final da safra), enquanto que para o clcio e
magnsio h maior quantidade na safra de julho (meio da safra).
14
As concentraes de minerais so especficas, no somente para a

espcie, idade e tecido, como tambm dependem do ambiente. Diversos
fatores controlam o teor de minerais nos vegetais, principalmente o gentico
[20,46].
Os nutrientes nas rvores podem ser armazenados nos seus diferentes

compartimentos em funo das necessidades fisiolgicas imediatas, ou como
reserva para uso posterior, em outros rgos [21, 47].
Zampier [23] analisou os teores de macro e micronutrientes por
espectrometria de absoro atmica (FAAS) em folhas de 1 ano de idade de
rvores nativas de erva-mate submetidas adubao com matria orgnica,
sulfato de amnio, superfosfato simples e cloreto de potssio. Segundo esta
pesquisadora, os teores de K, Ca, Mg, Mn e Cu foram significativamente
maiores nos tratamentos submetidos adubao orgnica.
Bertoni e colaboradores [12] ressaltam que o tipo de solo, idade da
planta,
data
de
coleta
caractersticas
climticas,
influenciam
significativamente na composio qumica da erva-mate.
2.0 TcNICAS DE EXTRAO APLICVEIS A PLANTAS
O preparo da amostra uma etapa importante na anlise de materiais

de plantas, pois necessrio extrair os compostos qumicos para posterior
separao e caracterizao [48].
Um extrato de planta pode ser definido como um composto ou mistura
de compostos obtidos de plantas frescas ou secas, ou parte das plantas (flores,
folhas,
semente, raiz e casca), por diferentes mtodos de extrao.
Caracteristicamente, os compostos ativos so obtidos juntamente com outros

materiais presentes na massa vegetal (extrato) [49].
O desenvolvimento de tcnicas modernas de preparao de amostras
com significantes vantagens sobre os mtodos convencionais, tambm
15
chamados oficiais (descritos em farmacopias de diversos pases), assume um

papel importante em garantir a alta qualidade dos produtos provenientes de
plantas.
Surgiram nos ltimos anos uma srie de novas tcnicas de extrao,
como a micro-extrao em fase slida (SPME), extrao em fase slida (SPE),
extrao assistida por microondas (MAE), extrao por fluido supercrtico (SFE)
e extrao com lquidos pressurizados (PLE) (conhecida tambm como
extrao por fluido pressurizado - PFE, ou extrao acelerada com solventes ASE). Estas tcnicas so mais rpidas, utilizam menos solventes, diminuem a
degradao da amostra, podem eliminar a etapa de "clean-up" da amostra,
eliminam etapas de concentrao antes das anlises cromatogrficas,
melhoram a eficincia de extrao, seletividade elou cintica, e so de fcil
automao [50-55].
2.1 Extrao por macerao
A macerao uma tcnica na qual a extrao da planta realizada em

um recipiente fechado, em temperatura ambiente, durante um longo perodo
(horas ou dias), sob agitao ocasional e tambm sem renovao do solvente
extrator. Esta tcnica utiliza os solventes orgnicos em funo da polaridade.
Pela sua natureza, no conduz ao esgotamento da matria-prima vegetal, seja
devido saturao do lquido extrator ou ao estabelecimento de um equilbrio
difusional entre o meio extrator e o interior da clula [56].
2.2 Extrao com ultra-som
o ultra-som um processo que utiliza a energia das ondas sonoras que

so transmitidas em freqncia superior da capacidade auditiva humana. O
16
ultra-som definido com freqncias acima de 20,0 kHz. Estas ondas sonoras
criam uma variao de presso no lquido gerando a cavitao [57].
Os principais efeitos do ultra-som na extrao de plantas so: aumento
da permeabilidade das paredes celulares, produo de cavitaes (formao
espontnea de bolhas em um lquido abaixo do seu ponto de ebulio,
resultando num forte estresse dinmico) e aumento do estresse mecnico das
clulas, o que tambm chamado de frico interfacial [49].
Algumas clulas das plantas ocorrem na forma de glndulas (externas
ou internas) preenchidas com o leo essencial. Uma caracterstica das
glndulas externas que a membrana muito fina e pode ser facilmente
destruda pelo colapso das bolhas de cavitao prximo a parede das clulas.
Assim, facilita a penetrao dos solventes nas clulas e a liberao do
contedo do leo no solvente [49,50].
O ultra-som pode facilitar a dilatao e hidratao do material da planta
e causar alargamento dos poros da parede celular. Melhora a inchao e a
razo de transferncia de massa e, ocasionalmente, quebra a parede celular,
resultando no aumento da eficincia de extrao elou reduo do tempo de
extrao [58].
Para as glndulas internas, importante reduzir o tamanho das
partculas do material, aumentando assim o nmero de clulas diretamente
expostas extrao por solvente com ultra-som.
Sumarizando, podemos dizer que os possveis benefcios do ultra-som
na extrao so: o aumento da transferncia de massa, quebra das clulas
vegetais, aumento na penetrao do solvente e diminuio de efeitos capilares
[59].
O efeito do ultra-som no processo de extrao depende da freqncia,
potncia do aparelho e do tempo de extrao [60].
Existem dois tipos distintos de aparelhos geradores de ondas ultrasonoras [59,60]: o banho de ultra-som e a sonda, que podem ser visualizados
na Figura 3.
17
No banho de ultra-som, o transdutor diretamente preso no fundo da

cuba do aparelho e a energia ultra-sonora transmitida atravs de um lquido,
usualmente a gua. A energia irradiada verticalmente pelas ondas sonoras
geradas na base do banho e transmitidas atravs das paredes do vaso para o
frasco com a mistura extratora [51,57].
Figura 3: Esquema geral de sistemas de aplicao de ondas ultra-sonoras no
campo da qumica: (a) banho indireto, (b) banho direto e (c) sonda.
banho de ultra-som, a mais ampla fonte laboratorial disponvel de
irradiao ultra-snica, apresenta como vantagens uma melhor distribuio de

energia atravs das paredes do vaso de extrao e o fato de no requerer
adaptao especial para o frasco extrator. Apresenta como desvantagens o
fato de que a quantidade de energia fornecida para o frasco extrato r no
18
facilmente quantificvel, porque depende do tamanho do banho, do tipo de

recipiente, da espessura das paredes do recipiente e da posio do frasco de
extrao no banho. difcil controlar a temperatura do sistema, pois o
equipamento tende a aquecer quando usado por longos perodos (a
temperatura do meio extrator mais alta que a temperatura do Iquido no
banho) [49].
A sonda, por outro lado, encontra-se fixada na extremidade do
amplificador do transdutor, em contato direto com o sistema extrator. Apresenta
como vantagens a potncia totalmente disponvel (no h transferncia de
irradiao ultra-snica pelas paredes do vaso) e a possibilidade de ser
sintonizada para fornecer um melhor desempenho a diferentes potncias.
Como desvantagens, apresenta: freqncia fixa, dificuldade de controle de
temperatura em sistemas sem refrigerao e o fato de que espcies radicalares
podem ser formadas na ponteira da sonda, conseqentemente apresentando
problemas relacionados contaminao do meio extrator com a ponteira [5157].
A eficincia da extrao por ultra-som comparvel, ou pode ser ainda

melhor que a obtida por Soxhlet, e tem como vantagens: alta reprodutibilidade,
possibilidade de utilizao de vrios tamanhos de amostra, rapidez de
processamento da amostra e baixo custo.
Na rea de qumica analtica, a radiao de ultra-som tem sido usada
freqentemente no pr-tratamento de amostras slidas, o que facilita e acelera
operaes, tais como a extrao de compostos orgnicos e inorgnicos,
disperso, homogeneizao, nebulizao, lavagem e derivatizao [61-63].
Nesta tcnica, a amostra moda misturada ao solvente e colocada em
um recipiente, que imerso em um banho de ultra-som. A amostra
submetida, geralmente, a vrios solventes em ordem crescente de polaridade,
dependendo da classe de compostos a serem extrados, em um tempo
determinado (muito menor do que na extrao por Soxhlet) e a uma freqncia
prpria do banho. Aps, o extrato submetido filtrao e concentrao.
19
Exemplos de trabalhos publicados utilizando ultra-som como tcnicas de

extrao de plantas esto apresentados na Tabela 11.
Tabela 11: Reviso da literatura sobre aplicao de ultra-som na extrao de
plantas.
Amostra
Hibiscus tiliaceus I.
Analito
Mentha x piperata
Fagopyrum
esculentum
steres, cidos carboxlicos

mentol
hemicelulose
Referncia
Melechi et aI.
Shot~ruk
et aI.
Hromdkov et aI.
Ch preto, ch mate
Valerian officinalis I.
metilxantina
Lacerda et aI.
bomeol
Valachovic et aI.
Salvia officinalis
cineol, bomeol
Salisov et aI.
Chresta spp
esterides e triterpenos
Schinor et aI.
Macleaya cordata
alcalides
Zhal"!9. et ai
Sophora japonica
antioxidantes
Paniwnyk et aI.
Manjerona e organo cis-sabineno hidratado, terpineol-4 e Rodrigues
a-terpineoi, timol e carvacrol
Panax ginseng
saponinas
Wu et aI.
Soja
gordura
Stavarache et aI.
Celulose
eucalipto
P!QQ.as et aI.
Rosmarinus officinalis vitamina E
Torre et aI.
Soja
isoflavonas
Rosta--.a.no et aI.
Pastinaca sativa
furanocumarinas
Sowa etal.
Flores de citros
\inalol
Alissandrakis
et
aI.
Pisfachia vera
antioxidantes
Goli et aI.
Oleo vegetal
cidos graxos
Chemat et aI.
Eucommia ulmodies
cidos clorognicos
Li et aI.
[64]
[65]
[66]
[24]
[41]
[44]
[67]
[68]
[69]
[70]
[71]
[72]
[73]
[74]
[75]
[76]
[77]
[78]
[79]
[80]
2.3 Extrao com lquido pressurizado (PLE)
A extrao com lquido pressurizado (PLE) uma tcnica de extrao

relativamente
nova,
que
utiliza
solventes
convencionais
em
elevada
temperatura e presso, com o objetivo de melhorar extraes quantitativas de

amostras slidas e semi-slidas [81-82]. A elevao da temperatura aumenta a
solubilidade,
razo de difuso e transferncia de massa, enquanto a
viscosidade e a tenso superficial dos solventes so menores do que

temperatura ambiente. Tambm ocorre a interrupo das fortes interaes
soluto-matriz, causadas por foras de Van der Waals, pontes de hidrognio e
interaes de dipolo entre as molculas do soluto e os stios ativos da matriz. A
20
alta presso melhora a penetrao do solvente na matriz, o que favorece a

extrao. A tcnica de extrao com lquido pressurizado tem a vantagem de
reduzir o tempo de extrao e o descarte de solventes [83].
processo de extrao com lquido pressurizado (PLE) usando o
equipamento ASE 300 constitudo de 6 etapas: 1) colocao da clula no

fomo; 2) preenchimento da clula com solvente; 3) extrao esttica; 4)
flushing com solvente novo; 5) purga do solvente do sistema com liberao da
presso residual e 6) esvaziamento da clula. Um esquema geral do

equipamento assim como a descrio das principais etapas pode ser
visualizado na Figura 4.
Uma presso controlada aplicada clula de extrao contendo uma
quantidade de amostra conhecida. A clula mantida aquecida (temperatura
constante) durante todo o tempo de extrao. Aps a extrao, o extrato
liberado atravs da passagem de gs inerte (N2 ultra-puro) e a amostra
lavada com uma quantidade definida do mesmo solvente usado na extrao
(flushing). O extrato e o lquido de lavagem so coletados em um frasco
apropriado.
Neste sistema, o processo de extrao realizado em temperaturas que
excedem o ponto normal de ebulio do solvente, e, dessa forma, a presso na
clula de extrao deve permanecer alta para manter o solvente no estado
lquido. Temperatura e presso influenciam na eficincia do processo. Devido
s altas presses e temperaturas utilizadas, a capacidade de sOlubilizao, a
difusividade e a cintica de extrao so aumentadas, acompanhadas por uma
diminuio dos tempos de extrao e volumes de solventes [52].
Desde o desenvolvimento do primeiro aparelho de extrao acelerada
com solvente, em 1995, poucas referncias podem ser encontradas quanto
aplicao da mesma na extrao de plantas [84].
21
Figura 4: (A) Esquema geral do Equi~amento e (B) Etapas da extrao com
lquido pressurizado no sistema ASE M: 1)colocao da clula no forno; 2)

preenchimento da clula com solvente; 3) extrao esttica; 4) flushing com
solvente novo; 5) purga do solvente do sistema com liberao da presso
residual e 6) esvaziamento da clula.
22
2.3.1 Vantagens e desvantagens da extrao com lquido pressurizado
uso da extrao acelerada por solventes apresenta algumas
vantagens e desvantagens sobre a utilizao de tcnicas convencionais de

extrao:
Vantagens:
Reduzido tempo de extrao;
Fcil de operar;
Preparo da amostra antes da extrao fcil e rpido;
Alta presso durante a extrao permite a extrao de compostos

termicamente degradveis;
Pode-se utilizar somente um solvente ou uma mistura de solventes;
Utiliza pouco solvente;
Sistema automatizado;
resultando
em alta reprodutibilidade dos
parmetros de extrao (temperatura, presso, tempo esttico, volume

de "f/ush");
Extrao de vrias amostras em um ciclo.
Desvantagens:
Alto custo do equipamento;
A extrao no seletiva;
"Clean-up" geralmente necessrio antes das anlises cromatogrficas.
Desde o desenvolvimento do primeiro aparelho de extrao acelerada

com solvente, em 1995, poucas referncias podem ser encontradas quanto
aplicao da mesma na extrao de plantas [84].
23
Algumas referncias bibliogrficas utilizando extrao acelerada por

solventes aplicadas a plantas encontram-se resumidas na Tabela 111.
Tabela 111: Reviso da literatura sobre aplicao da extrao com lquido

pressurizado (PLE) na extrao de plantas.
amostra
Referncia
analito
Ch preto,caf
cafena
Dawidowicz et aI.
85
Ch preto, caf
cafena
Dawidowicz et aI.
86
Spirulina platensis
antioxidantes
Herrero, M. et aI.
87
Spirulina platensis
antioxidantes
Herrero, M. et aI.
88
Ma
polifenis
Alonso-Salces et aI.
89
Castanha
vitamina E
Delgado-Zamarreno et aI. 90
Soja
isoflavonas
Rostagno et aI.
91
Alecrim
antioxidantes
Herrero, M. et aI.
92
Curcuma phaeocaulis sesquiterpenos Yang et aI.
93
Plantas medicinais
ginsenosdeos
Choi et aI.
94
Plantas medicinais
alcalides
Ong et aI.
95
Soja
isoflavonas
Klejdus et aI.
96
Plantas medicinais
timol, saponinas Benthin et aI.
97
Ch
catequinas
98
Pineiro et aI.
Juniperus virginianna cedrol, cedreno Eller et aI.
99
Angelica sinensis
cido ferrlico
Lao et aI.
100
Ma
polifenis
Alonso-Salces et aI.
101
24
2.4 Extrao com fluido supercrtico
A extrao com fluido supercrtico uma operao unitria que explora

as propriedades dos solventes acima de seus pontos crticos [102,103].
o solvente chamado de supercrtico porque se encontra acima de sua

temperatura crtica e de sua presso crtica. A temperatura crtica a
temperatura mais alta, na qual um gs pode ser convertido em lquido pelo
aumento da presso. Por sua vez, a presso crtica a presso mais elevada,
na qual o lquido pode ser convertido em gs pelo aumento da temperatura
[104-106]. Neste estado, comparativamente aos lquidos, o solvente apresenta
coeficiente de difuso mais alto, viscosidade mais baixa e maior densidade do
que os gases. As viscosidades mais baixas e as taxas de difuso mais altas do
fluido supercrtico o tornam adequado para extrao de compostos presentes
em matrizes slidas, por exemplo, extratos de plantas [107 -110].
A densidade, viscosidade e difusividade so propriedades da regio
crtica que so afetadas por mudanas na temperatura e/ou presso. O
aumento da presso leva a maior densidade (o que favorece o rendimento do
processo), por outro lado, menores difusividades e maiores viscosidades so
produzidas (o que desfavorece o rendimento) [111-114]. Estas propriedades
so apresentadas na Tabela IV [58].
Tabela IV: Propriedades termodinmicas dos fluidos [58].
Estado do
Fludo
Gs
Densidade
(g.cm -3)
Difusividade
(cm2 . seg-1 )
(0,6-2) x 10-3
0,1-0,4
0,6-1,6
(0,2-2)
0,2-0,5
0,7 x 10-3
Viscosidade
(g. cm-1 . seg-1 )
(1-3)
10-4
Lquido
x 10-5
(0,2-3) x 10-2
Supercrtico
(1-3)
x 10-4
25
A temperatura apresenta, em determinado limite, um efeito oposto ao da

presso: o incremento da temperatura ocasiona uma diminuio na densidade
(desfavorece o rendimento), um aumento na difusividade e diminuio da
viscosidade (favorece o rendimento). H de se salientar tambm, que o
aumento da temperatura ocasiona um aumento na presso de vapor do leo,
favorecendo o incremento do rendimento na extrao. Assim, o efeito da
temperatura e presso complexo, e o seu entendimento de fundamental
importncia na anlise do processo de SFE [115-118].
2.4.1 Dixido de carbono como solvente
o dixido de carbono (C02) um solvente particularmente atrativo para

aplicao em alimentos, mais especificamente em plantas, pois, alm de
atender aos critrios para escolha do solvente, apresenta certas caractersticas
que comprovam a sua habilidade e justificam seu uso. No caso do C02, o
ponto crtico alcanado sobre a curva lquido-gs a uma temperatura prxima
ambiente (31,3 C) e presso relativamente baixa de 73 atm.
CO2 supercrtico completamente miscvel em hidrocarbonetos de
baixo peso molecular e em compostos orgnicos oxigenados. Sua solubilidade

mtua com a gua pequena, o que possibilita sua utilizao na extrao de
compostos orgnicos de solues aquosas. Tem alta volatilidade, comparado
com qualquer composto orgnico, facilitando a separao e possibilitando a
recuperao do produto e sua recirculao como solvente. As propriedades de
transporte so favorveis, pois apresenta baixa viscosidade e alto coeficiente
de difuso. Com seu baixo calor de vaporizao, especialmente perto do ponto
crtico, o consumo de energia em muitos processos baixo [119].
No estado lquido, o C02 miscvel com todos os solventes lquidos

comuns, do metano I ao pentano, e com hidrocarbonetos monoterpnicos
puros, monoterpenos aldedicos e todos os cidos carbnicos lquidos [120].
26
2.4.2 Tcnica de extrao supercrtica
A SFE uma tcnica analtica que apresenta meios bastante atrativos

para o processamento de produtos de ocorrncia natural, devido a vrias
caractersticas distintas, tais como a facilidade de recuperao do soluto e
reciclagem do solvente com a simples manipulao de temperatura e/ou
presso, a possibilidade de direcionar a separao pela escolha das condies
termodinmicas de temperatura e/ou presso, e, com isso, a sintonia do poder
de solvncia do fluido usado na extrao para uma determinada extrao e/ou
separao, e o controle da seletividade do processo pela escolha apropriada
do solvente e da combinao solvente/co-solvente utilizados [121].
Vrios trabalhos so apresentados na literatura relacionados ao
emprego de fluidos supercrticos como solventes na extrao de compostos
naturais. Os resultados apresentados apontam para um aumento considervel
no rendimento do processo, atravs do emprego de um solvente atxico,
totalmente liberado no final do processo e da utilizao de temperaturas
amenas, evitando a possvel degradao de compostos termolbeis. Em
adio, os meios supercrticos permitem ainda elevada controlabilidade no
poder de solvatao do solvente, possibilitando processos simples e pouco
onerosos de separao aps a extrao. Tais caractersticas dos meios
supercrticos so de grande valia para a extrao e a obteno de produtos
naturais de alto valor, tanto que tem sido amplamente empregados.
Na Tabela V so apresentadas algumas referncias bibliogrficas
encontradas na literatura sobre a tcnica de SFE aplicada extrao de
produtos naturais.
27
Tabela V: Aplicaes da extrao com fludo supercrtico em plantas.

Analito
metilxantinas
alcalides
cafena,
teobromina,
esqualeno, fitol, vitamina E,
cido palmtico, esterides.
Laurus nobilis L.
cineol, linalol, metil eugenol
Lupinus spp
alcalides
Carum copticum
timol, mirceno, limoneno
Mentha pulegium L.
menta
Zataria multiflora Boiss timol, terpineno, p-cimeno
Hypericum perforatum alcanos, cidos orgnicos e
L.
steres
Ginkgo biloba
flavanides e terpenides
cis-sabineno
hidratado,
Majorana
horlensis acetato de cis-sabineno
Moench
hidratado, terpineol-4 e 0.terpineol.
Origanum vulgare
cis-trans-sabineno
hidratado, timol
Euphorbia macrocfada hidrocarbonetos
Tabemaemontana
alcalides
catharinensis
Pistachia vera
antioxidantes
Lupinus spp, Plinia alcalides
pinnata
Ch
catequinas
o.-pineno,
l3-pineno,
Ferufa assa-foetida
mirceno,
limoneno,
13ocimeno
cido
hexadecanico,
Foenicufum vufgare Mil! tetradecano,sabineno,
0.pineno, mirceno
Jugfans regia L
compostos fenlicos
Amostra
lIex paraguariensis
lIex paraguariensis
lIex paraguariensis
Referncia
Saldana et aI.
Saldana et aI.
Esmelindro et aI.
N
122
123
124
Caredda et aI.
Lanas et aI.
Khajeh et aI.
Aghel et aI.
Ebrahimzadeh et aI.
Seger et aI.
125
126
127
128
129
130
Yang et aI.
131
132
Rodrigues et aI.
Rodrigues et aI.
133
zcan etal.
Pereira et.al.
134
135
Goli et.al.
Lanas et aI.
136
137
Chang et aI.
138
139
Khajeh et aI.
140
Khajeh et aI.
Amaral et aI.
141
2.4.3 Equipamento tpico da extrao supercrtica
sistema de extrao por C02 supercrtico consiste basicamente de
cinco componentes: (A) fonte de C02; (8) bomba de alta presso; (C) cela de
extrao;
(O) restrito r de presso e (E) coletor,
alm dos sistemas
controladores de temperatura e presso [142], conforme pode ser visualizado

na Figura 5.
28
C02 fornecido ao sistema j pressurizado atravs de cilindros
sifonados. A presso de operao, se superior a do cilindro, obtida por uma

bomba de alta presso. A matriz do soluto "lavada" pelo solvente no extrato r
e a mistura solvente-soluto submetida a uma descompresso por vlvula
redutora de presso. A mistura passa a ser, ento, gs-soluto, sendo este
recolhido no separador para posterior anlise. O gs que emana do separador
pode ser recirculado, quando em escala preparativa.
Figura 5: Esquema representativo de um processo de extrao supercrtica,

composto por: cilindro sifonado do solvente, bomba de alta presso, clula de
extrao, vlvula de descompresso e frasco coletor.
2.5 Comparao das tcnicas de extrao
Na Tabela VI so comparadas as principais vantagens e desvantagens

das diferentes tcnicas de extrao utilizadas.
29
Tabela VI: Comparao entre mtodos de extrao utilizados em plantas.

Tcnica
Vantagens
Desvantagens
tempo elevado de extrao;

grande quantidade de solvente;
exposio do analista a solventes;
requer evaporao do solvente.
rpido;
tamanho da amostra limitado;
o CO2 no contaminante ambiental; depende da matriz;
mtodo seletivo, pode-se variar a alto custo.
temperatura e presso;
pequena quantidade de solvente;
no requer filtrao;
sem exposio a solventes;
pode ser automatizado.
grande quantidade de solvente;
rpido;
grande quantidade de amostra;
trabalhoso;
baixo custo.
requer filtrao;
requer evaporao do solvente;
exposio do analista a solventes.
rpido;
custo muito elevado
mnima quantidade de solvente;
no requer filtrao;
totalmente automatizado;
fcil de usar
mtodo padro;
grande quantidade de amostra;
Macerao
baixo custo.
SFE
Ultra-som
PLE
3.0 PLANEJAMENTO ESTATSTICO DE EXPERIMENTOS
As variveis de um planejamento estatstico representam caractersticas

fsicas, qumicas ou fsico-qumicas, as quais definem ou influenciam uma
determinada resposta. Em geral, estas variveis so avaliadas dentro de um
campo experimental previamente delimitado [143].
A resoluo deste tipo de problema seguiu, durante muito tempo,
metodologias baseadas no mtodo emprico de tentativa e erro, ou aquelas
onde todas as variveis, menos uma, eram mantidas constantes. Na maioria
das situaes, esta abordagem representa um gasto desnecessrio de tempo,
esforo e recursos [144]. Em contraposio a essa sistemtica, a abordagem
moderna utiliza metodologias estatsticas de planejamento e otimizao de
experimentos, as quais tm se mostrado bastante promissoras [145]. Atravs
de planejamentos experimentais baseados em princpios estatsticos, os
30
pesquisadores podem extrair do sistema em estudo o mximo de informao

til, fazendo um nmero mnimo de experimentos [146].
Planejar experimentos definir uma seqncia de coleta de dados
experimentais para atingir certos objetivos. De forma geral, podemos dividir as
tcnicas de planejamento de experimentos em trs grandes grupos: a)para
desvendar o grau de dependncia entre variveis e respostas; b )para
desenvolver e discriminar modelos; c) para estimativa tima de parmetros dos
modelos. Os dois ltimos grupos exigem modelos do processo/fenmeno
(tericos ou semi-empricos) sob investigao [147].
Um experimento fatorial aquele que consiste em selecionar um
nmero de variveis (fatores e condies) a serem investigadas realizando-se
experimentos em todas as combinaes possveis destes nveis e fatores.
Desta forma, um projeto fatorial 22 possui dois nveis e dois fatores requerendo
quatro condies experimentais. O nmero de condies experimentais,
obtidas a partir de um projeto fatorial, cresce exponencialmente com o aumento
do nmero de nveis e/ou variveis empregadas. Por exemplo, com trs
variveis e trs nveis, tm-se 27 condies experimentais.
Os experimentos fatoriais tm como caracterstica principal incluir, em
cada ensaio completo, todas as combinaes possveis dos diferentes fatores
ou conjuntos de tratamentos, exceto no caso particular dos experimentos
fatoriais fracionrios [148].
Os experimentos fatoriais fracionrios so utilizados quando o nmero
de experimentos a serem realizados elevado. Neste caso, pode-se realizar
um planejamento com uma frao determinada do planejamento fatorial
completo, denominado de frao meia. A construo dessa frao meia segue
metodologia descrita nos modelos estatsticos [146].
importante salientar que nmeros de experimentos e nmero de
condies experimentais so conceitos distintos, j que certo nmero de
rplicas deve ser adicionado ao nmero de condies experimentais para
fornecer o nmero de experimentos.
31
As rplicas ou repeties de experimentos so de fundamental

importncia e servem para determinar o erro experimental na resposta em
estudo
e/ou
reprodutibilidade
do
esquema
experimental
utilizado
(metodologia + equipamento).
Existem vrias maneiras de abordar tal aspecto durante o planejamento
dos experimentos, sendo que a escolha da abordagem peculiar a cada
experimento/equipamento e ser ditada, principalmente, pela experincia do
analista [147).
4.0 ANLISE INSTRUMENTAL
4.1 Cromatografia gasosa (GC)
A cromatografia uma poderosa tcnica de separao usada para os

componentes de uma mistura complexa. Os componentes da amostra so
distribudos entre duas fases, uma das quais permanece estacionria,
enquanto a outra elui entre os interstcios ou sobre a superfcie da fase
estacionria. O movimento da fase mvel (FM) resulta numa migrao
diferencial dos componentes da amostra. O mecanismo envolvido nesta
migrao diferencial vai depender do tipo de fase mvel e estacionria utilizada
[149,70).
A amostra, que pode ser um gs ou um lquido voltil, injetada no
injetor do cromatgrafo atravs de uma micro-seringa ou de um sistema de
injeo automtico, onde aquecida e vaporizada.
temperaturas,
Em determinadas
as substncias vaporizam e, de acordo com as suas
propriedades e as da fase estacionria, so retidas por determinado tempo,

chegando sada da coluna em tempos diferentes. Os componentes da
amostra movem-se na coluna numa velocidade determinada por vrios fatores,
mas principalmente pela fora de reteno, que vai depender da solubilidade
destes compostos na fase estacionria e da sua volatilidade na fase mvel. Os
32
componentes da amostra, j separados na coluna, entram no detector, onde

so individualmente detectados [150,71].
Atualmente, a maioria dos espectrmetros de massas conectada a um
cromatgrafo a gs (GC/MS) ou lquido (LC/MS), assim este ltimo serve como
um meio de separao dos analitos e posterior introduo no espectrmetro de
massas. O tipo de fonte de ionizao mais comum em espectrometria de
massas a de impacto por eltrons (EI), a qual emprega um filamento
aquecido para gerar eltrons com energia suficiente para provocar ionizao
dos analitos de interesse, mediante impacto destes eltrons energizados. Os
ons formados so direcionados para o analisador, cuja funo separ-los de
acordo com sua relao massa/carga (m/z) [151,72].
GC/MS uma tcnica muito utilizada pelos pesquisadores para anlise

de extratos de plantas,
pois permite a separao dos componentes
vaporizveis e fornece um espectro de massas para cada pico. Esse espectro

indica a massa molecular e o padro de fragmentao. Pela massa molecular
obtm-se dados sobre a classe qumica a qual a substncia pertence,
enquanto que o padro de fragmentao serve para comparar com os dados
da biblioteca de espectros de massas do computador. Uma vez feita a
comparao, o computador mostra as probabilidades quanto identidade da
substncia analisada. Para aumentar a sensibilidade e melhorar a seletividade
da tcnica GC/MS, os analitos podem ser analisados no modo SIM
(monitoramento de ons selecionados) [152,73].
Para selecionar os ons a serem monitorados, analisa-se o espectro de
massas de cada
composto,
ou
classe de compostos tentativamente
identificados e realiza-se uma nova injeo da amostra marcando estes ons.

Tem-se, desta forma, a transformao do espectrmetro de massas de
detector universal para detector seletivo. O cromatograma resultante (MIC Monitoring lon Chromatogram) difere do cromatograma inicial (TIC - Total lon
Chromatogram) por apresentar maior sensibilidade, maior seletividade e menor
nmero de picos.
Rosnge1a Assis Jacques
33
4.2 Espectroscopia de absoro atmica (FAAS)
Essa tcnica de determinao de elementos qumicos envolve a

absoro ou emisso de luz por tomos, causada pela absoro de uma
determinada forma de energia, que altera a estabilidade da configurao
eletrnica destes elementos, promovendo a excitao de eltrons. Aps este
estado de instabilidade, o tomo imediatamente retorna forma estvel. Esse
processo libera energia em quantidades proporcionais quelas absorvidas na
excitao, e os comprimentos de onda de energia emitida so caractersticos
de cada elemento. Portanto, cada comprimento de onda da radiao absorvida
ou emitida corresponde a um determinado elemento [74,154].
A energia absorvida ou emitida no processo mensurada e aplicada a
trs campos da espectroscopia atmica: absoro, emisso e plasma. No caso
da emisso atmica, a amostra recebe uma carga de energia, produzindo a
excitao dos eltrons aptos a emitir luz. Caso o tomo absorva luz com
comprimento de onda especfico para atingir o estado de excitao, o processo
chamado de absoro atmica. Em emisso atmica, a energia de excitao
gerada por uma chama, enquanto que o processo de absoro atmica utiliza
principalmente uma lmpada (ctodo oco) como fonte de energia. Existem
lmpadas que emitem espectro de um s elemento, como tambm lmpadas
para vrios elementos, ficando a cargo de o monocromador selecionar o
comprimento de onda desejado.
o processo que utiliza lmpada de ctodo oco para anlise simples, ou

seja, de um elemento cada vez, mais confivel, pois produz uma intensidade
de emisso superior quela da lmpada para anlise de vrios elementos, o
que compromete a anlise quando uma maior preciso exigida [75,155].
Foram desenvolvidos equipamentos que utilizam processadores altamente
especializados nas determinaes qumicas. A automatizao proporcionou
agilidade e confiabilidade s anlises, calibrando e tornando estas curvas de
calibrao mais precisas, fornecendo resultados e correlaes entre dados de
absorbncia e concentrao com maior exatido [76,156].
34
CAPITULO 3:
DETERMINAO DOS MINERAIS
DAS FOLHAS DE ERVA-MATE
CULTIVADAS SOB DIFERENTES
CONDiES AGRONMICAS-
1.0 EXPERIMENTAL
1.1 Detalhamento experimental de campo
As amostras de erva-mate foram coletadas em um experimento de

campo, montado nas dependncias da Indstria e Comrcio de Erva-Mate
Baro Ltda., no municpio de Baro de Cotegipe - RS, com manejo realizado
mediante controle de adubao, intensidade de luz e idade da folha. Neste
experimento foram conduzidos oito (8) tratamentos, onde cada tratamento
dispunha de sete (7) plantas para a coleta das amostras. Todas as plantas, no
incio do experimento, tinham idade em torno de sete anos e foram podadas
em condies idnticas. Neste ponto elas foram identificadas como tendo zero
(O) meses de idade de folha.
efeito da idade de folha foi avaliado com coletas semestrais,
possibilitando a anlise de folhas de 6, 12, 18 e 24 meses, onde se alternam as

fases de inverno e vero. Desta forma, as amostras de 6 e 18 meses
corresponderam ao perodo de vero, e as amostras de 12 e 24 meses ao
perodo de inverno.
mtodo utilizado para investigar o efeito da adubao empregou
quatro tratamentos diferentes: no primeiro deles (linha 1), nenhum adubo foi
adicionado s plantas; no segundo (linha 2), foi aplicada uma dose de
300g/planta/ano de uria (fonte de nitrognio); no terceiro (linha 3) aplicou-se
uma dose de 120 g/planta/ano de cloreto de potssio (fonte de potssio); no
quarto tratamento (linha 4) foi aplicada uma dose de 300g/planta/ano de uria e
mais 120 g/planta/ano de cloreto de potssio.
Para avaliar o efeito da incidncia de luz sobre a composio qumica da
erva-mate, a rea experimental foi dividida em duas metades, sendo que em
uma delas foi utilizada uma tela de sombreamento (sombrite), na qual 75% da
luminosidade incidente retida, e na outra metade as plantas foram deixadas a
pleno sol.
36
A Figura 6 mostra o experimento de campo que evidencia o controle de
intensidade de luz.
(a)
(b)
Figura 6: Foto ilustrativa do experimento de campo: (a) rea a pleno sol e (b)
rea sombreada.
1.2 Amostras
A amostra de cada tratamento constituiu-se de ramos e folhas de sete

(7) plantas. Em cada uma destas sete plantas foram coletados de 500 a 600 g
de folhas e ramos do tero superior, mdio e inferior. Para cada tratamento
foram retirados 4 kg de amostras homogeneizadas, para cada idade de poda.
Aps a coleta, as amostras foram submetidas ao processo de secagem
em estufa com recirculao de ar por um perodo de 24 horas, a uma
temperatura entre 32 e 35 C.
A umidade total das amostras foi determinada segundo o mtodo padro
do Instituto Adolfo Lutz (IAL) citado por Valduga [7], ficando em torno de 5 %
para todas as amostras. Aps a secagem, as amostras foram modas e
classificadas quanto granulometria, em peneiras Tyler (40 mesh). Para evitar
a oxidao, as amostras foram acondicionadas em ambiente inerte (com N2)
dentro de frascos de vidro e armazenadas em refrigerador (6 a 8C) at o
momento da extrao.
37
1.2.1 Digesto das amostras
As amostras de cada tratamento (3g) foram calcinadas a 700 C por um

perodo de 5 horas, at a decomposio de toda a matria orgnica. As cinzas
obtidas foram solubilizadas em 2 mL de cido ntrico e 2 mL de perxido de
hidrognio a 30% e aquecidas at a obteno uma soluo clara.
Posteriormente, esta soluo foi transferida para bales volumtricos,
completando-se o volume a 50 mL com gua deionizada.
1.3 Procedimento para determinao dos minerais
Para a determinao dos minerais foi utilizado um espectrmetro de

absoro atmica com chama (FAAS) modelo Varian AA55.
Foram utilizadas lmpadas de ctodo oco de Ca, Mg, Na, Mn, Zn, Fe e
Cu como fonte de radiao. Os elementos foram medidos em condies de
operao otimizadas por FAAS em chama de ar/acetileno ou xido
nitroso/acetileno. Os parmetros instrumentais so apresentados na Tabela
VII.
As determinaes de Ca, Mg, Cu, Mn, Zn e Fe foram realizadas no

FAAS, no modo absoro, e a determinao de Na e K no modo emisso.
Todas as anlises foram realizadas em triplicata para as amostras e solues
padro. Os clculos dos teores dos minerais nas amostras foram baseados em
uma curva de calibrao obtida com as solues padro.
Para eliminar possveis interferncias na determinao de Ca e Mg, foi
adicionado cloreto de lantnio nas amostras e nas solues padro na
proporo de 1% (w/v).
38
Tabela VII: Parmetros instrumentais utilizados no FAAS.
Elemento
(nm)
Intensidade da
Fenda (nm)
Concentrao de
trabalho (mg L-1 )
lmpada (mA)
Ca
239,9
10
0,2
2-800
Na
303,2
0,2
2-400
Mg
202,6
1,0
0,15-20
Mn
403,1
0,2
0,5-60
Zn
213,9
1,0
0,01- 2.0
Cu
324,7
0,5
0,03 -10
Fe
248,3
0,2
0,06 -15
Os efeitos das variveis investigadas no contedo dos metais

selecionados foram estatisticamente avaliados por anlise de varincia
acoplada ao teste de Tukey, com nvel de confiana de 95%. Todas as anlises
estatsticas foram realizadas usando o software Statistica Windows 6.0.
39
2.0 RESULTADOS E DISCUSSO
2.1 Influncia das condies agronmicas sobre o teor de minerais nas

folhas de erva-mate
A Figura 7 apresenta uma foto das folhas de erva-mate detalhando o

efeito da intensidade de luz sobre as mesmas.
a)
b)
Figura 7: Foto das folhas da erva-mate com idade de 18 meses, sem

adubao e cultivada sob sol (a) e sombra (b).
Percebe-se que a folha da planta cultivada sob menor intensidade de luz

(Figura 7(b mais escura e mais espessa.
Os teores de cinzas obtidos para as folhas de erva-mate, em funo das
condies agronmicas investigadas, esto apresentados na Tabela VIII
(pgina 43). As anlises foram realizadas em triplicata e os resultados
representam a mdia dos experimentos. Os teores de cinzas das folhas de
40
erva-mate ficaram em torno de 4,97 a 7,63 %, mostrando-se de acordo com a

literatura [7].
Os valores das cinzas so mais elevados em amostras de plantas
protegidas do sol, uma vez que o metabolismo da planta diminudo devido
reduo na fotossntese das folhas. Segundo Kaspary [156], mudas de ervamate desenvolvidas em condio de sombreamento adquirem maior altura e
maior produo de matria seca, ou seja, maior produo de material mineral.
Este fato talvez esteja ligado aparncia da folha, como j foi visualizado na
Figura 7.
As Tabelas IX e X (pginas 44 e 45) mostram os resultados em termos
de quantidade de macronutrientes e micronutrientes em mg/100g nas folhas de
erva-mate proveniente de plantas cultivadas ao sol e sombra, em diferentes
pocas de poda e com diferentes tipos de adubao. Pode-se observar que os
macro-nutrientes (K, Ca, Mg e Mn) apresentam valores entre 500 e 2500
mg/100g, sendo o potssio o composto majoritrio. Estes valores esto de
acordo com os valores encontrados por Sanz et al.[42] e Garcia et a/.[43]. Em
geral, o teor de K, Ca, Mg e Mn so altos para tecidos de plantas, e a ordem
crescente de concentrao destes metais : K>Ca>Mg>Mn [157, 158].
Entre os micronutrientes (Na, Zn, Fe e Cu), o sdio o elemento
majoritrio, apresentando um teor acima de 50 mg/100 g nas folhas de ervamate.
A Tabela XI (pgina 46) apresenta os resultados da anlise estatstica

da influncia da intensidade de luz, idade das folhas e adubao no teor de
macro e micro-nutrientes das folhas de erva-mate. Os valores apresentados
nesta tabela so a mdia dos valores do contedo dos metais para cada
condio. Pode-se observar que a idade das folhas exerce uma grande
influncia no seu contedo mineral.
O comportamento dos macro e micronutrientes levemente afetado
pelas condies agronmicas (idade das folhas, fertilizao e intensidade de
luz). Em folhas jovens (6 meses) os macronutrientes e os micronutrientes tm
geralmente os maiores valores de concentrao.
41
A concentrao dos macronutrientes, exceto para magnsio, diminui

com o aumento da idade de poda das folhas. Alm disso, o contedo de alguns
micronutrientes aumentado em folhas de idade intermediria, em torno de 12
meses, e alguns deles no apresentam uma significativa diminuio do teor
com o tempo.
Com relao intensidade de luz, plantas cultivadas sombra
apresentaram maiores teores de minerais (com exceo do magnsio e
mangans) do que as cultivadas ao sol.
A erva-mate uma espcie arbrea que ocorre naturalmente nas
florestas, nas condies de sub-bosque, ou seja, tolerando o sombreamento
natural causado por espcies de maior altura, o que faz com que seja
conhecida tambm como planta reprodutora sombra. Portanto, ao ser
cultivada fora de suas condies naturais, pode-se esperar alteraes
fisiolgicas no sentido de sua adaptao ao meio. o que ocorre quando a
mesma cultivada em condies de luminosidade mais intensa. Nesta
situao, a planta tende a reduzir a superfcie foliar no s para diminuir a
fotoinibio (inibio da captao de luz pela clorofila, o que resulta em menor
fotossntese das plantas) e o aquecimento excessivo, mas tambm para reduzir
a perda de gua [159).
Em condies de sombreamento, a erva mate considerada uma
espcie de alta longevidade foliar. A planta metaboliza substncias qumicas
inibidoras de insetos desfoliadores, o que propicia folha muito mais tempo
para realizar a fotossntese que numa planta que se desenvolve em condies
de pleno sol. Com isso, a planta sombreada tambm deve assimilar uma maior
quantidade de nutrientes [160).
Em relao ao Mg, o mesmo absorvido pelas plantas na forma de on
Mg+2 e constitui o ncleo central da molcula de clorofila, fundamental para a
fotossntese. Como no houve diferena de concentrao deste elemento nas
folhas sombreadas e no sombreadas, o maior acmulo dos outros nutrientes
(K, Ca, Cu, Zn e Fe) nas folhas sombreadas pode no ser s devido
fotossntese, mas tambm a outros fatores, como menor evapotranspirao
(perda de gua durante o processo de evaporao e transpitao) e menor
42
aquecimento foliar. Isso faz com que a prpria fotossntese seja mais eficiente,
uma vez que os estmatos tendem a ficar mais tempo abertos, em funo da
menor perda de gua. Assim, pode-se esperar que no ambiente mais
sombreado, a atividade metablica seja mais constante.
Na Tabela XI tambm observado um aumento expressivo no contedo
de mangans quando as plantas so adubadas com fontes de nitrognio e
potssio ao mesmo tempo. No caso do Mn, a maior concentrao foliar no
ambiente sombreado foi observada somente no tratamento sem adubao.
Quando se aplicou s N, os teores de Mn no diferiram significativamente.
Porm, chama a ateno o fato de que quando se aplicou N juntamente com K
ou apenas K, houve um expressivo aumento de Mn foliar nas duas situaes
de luminosidade. Como no h na literatura informaes a respeito de uma
possvel sinergia entre K e Mn, pode-se trabalhar com a hiptese de que tenha
ocorrido um deslocamento de ons Mn+2 da CTC (capacidade de troca de
ctions) do solo pela aplicao do adubo potssico, o que levaria a uma maior
disponibilidade de Mn+2 para as plantas. A hiptese se fundamenta pelo fato de
que em solos cidos (pH < 5,0) o Mn pode estar ocupando, como ction
adsorvido eletrostaticamente, 20 a 30% da CTC do solo. Neste caso, a
concentrao de Mn+2 na soluo do solo, que , em ltima anlise, de onde as
plantas retiram os nutrientes, pode ter aumentado em funo da sua
substituio na CTC pelos ons K" que foram supridos atravs da adubao
potssi~
[159].
Os teores de K foliar foram maiores na condio de sombreamento,

entretanto, nas duas condies de luminosidade, os tratamentos envolvendo
aplicao de N ao solo propiciaram sensveis decrscimos no teor de K
(Tabela IX). Embora no ocorra na literatura registros de antagonismo entre N
e K, os dados obtidos indicam a possibilidade de o N inibir a absoro de K na
cultura da erva-mate.
43
Tabela VIII: Teor de cinzas [g/100g
base seca]
das amostras de erva-mate sob diferentes condies agronmicas (intensidade
de luz, idade de poda da folha e adubao).
Teor de cinzas (g/100g ) desvio padro

Adubao
6 meses
sol
12 meses
sombra
sol
sombra
18 meses
sol
sombra
24 meses
sol
sombra
Sem adubo
5,390,04
6,430,03
5,30O,10
7,470,15
5,880,14
5,940,21
6,230,04
6,71O,06
5,250,05
6,400,04
5,300,14
7,630,05
5,110,06
5,600,14
5,850,01
6,840,01
4,970,05
5,690,06
5,400,10
7,100,20
6,070,10
6,230,01
5,47O,01
6,260,06
N +K
5,340,05
5,770,11
5,320,05
7,000,10
6,400,36
6,44O,13
6,350,06
7,210,10
44
Tabela IX: Contedo de macronutrientes das folhas de erva-mate em funo da idade da folha, incidncia de luz e adubao.
Mineral
Ca
Mg
Mn
Fertilizao
semadubao
N
K
N+K
sem adubao
N
K
N+K
sem adubao
N
K
N+K
sem adubao
N
K
N+K
Contedo de metais (mg/100g base seca) desvio padro

6 meses
12 meses
18 meses
sombra
sol
sombra
sol
Sol
sombra
1476,3:t7,9 1746,9:t55,5 1072,9:t15,5 1136,2:t11,8 612,6:t7,7 649,6 :t5,3
1034,9:t7,4 1430,3:t31,5 810,8:t 4,6 857,1 :t 13,9 513,9:t 13,7 597,3 :tO,7
1637,2:t18,6 2084,6:t12,5 1220,3:t17,9 1535,1 :t12,O 653,2:t8,5 696,0:t14,1
1159,1 :t 29,5 1933,5 :t 3,2 1082,0 :t 10,1 1260,5:t 18,4 612,6:t 2,5 667,2 :t8,9
464,6:t 16,1 755,1 :t6,1 345,3 :t6,4 480,9:t 16,8 415,0:t2,2 648,1 :t10,4
814,9 +2,9 852,0 :t 16,2 630,7 :t8,8 811,9:t17,6 639,0:t 1,4 815,0:t 2,7
631,2:t 12,4 826,0 :t9,7 598,1 :tO,4 691,4:t 7,4 521,1 :t6,9 721,0 :t4,4
598,1 :tO,4 793,4 :t 12,2 517,0 :t9,5 628,7 :t 28,1 429,4 :t5,4 661,9 :t3,0
761,8:t 1,8 743,O:t 7,1 788,8 :t4,7 777,5:t 2,1 748,5 :t4,0 757,6 :t4,8
768,5 :t3,O 780,5:t 7,2 797,7 :t5,O 797,0 :tO,5 768,0 :t8,2 773,7:t 13,4
744,7 + 1,6 729,7:t 1,1 765,3 + 7,5 765,2 :t2,8 727,7:t 10,7 749,2:t 10,4
762,0:t 1,0 755,0 +2,0 794,0:t 1,4 784,0 :t5,7 754,5 :t4,7 773,4 :t6,5
182,7 :t3,3 186,5:t 7,7 128,5:t 2,3 172,6:t 2,7 116,8:t 3,8 149,8:t 2,1
219,3:t6,1 216,2 :t4, 1 170,0:t 1,1 182,4 :t5,7 149,1 :tO,9 158,7:t 1,2
271,2:t 7,4 318,4:t9,5 180,2:t 2,9 210,0 :t2,8 267,1 :t2,6 201,8:t 1,6
275,8:t 8,8 354,2:t 10,5 258,8:t 2,5 221,7 :t4,7 282,6:t 2,2 217,5.:t 2,1
24 meses
sol
sombra
545,0 :t4,O 590,40:t 7,7
513,9:t 13,7 543,2:t 2,5
653,2:t8,5 673,4 +8,8
612,6:t 2,5 554,3 +6,0
414,5:t1,6 514,1 :t13,4
550,7:t 7,9 720,1 :t8,2
521,1 :t6,9 703,1 :t 3,1
424,3 :t5,3 569,6 :t6,6
726,8 :t3,7 753,8 :t6,O
797,5 :t3,8 786,9 :t3,3
709,5:t 1,3 726,8 :t3,8
775,6 :t2,5 775,9 :t2,8
122,1 :tO,8 148,1 :tO,8
152,4 .:t0,8
152,7.:t2,1
240,6:t 1,6 182,6.:t 1,6
262,1 :t2,4 239,7 :t3,2
45
Tabela X: Contedo de micronutrientes das folhas de erva-mate em funo da idade da folha, incidncia de luz e adubao.
Contedo de metais (mg/100g base seca) desvio padro

Mineral Fertilizao
6 meses
sol
sem adubao 4,7 0,1

Zn
Fe
12 meses
18 meses
24 meses
sombra
sol
sombra
sol
sombra
sol
sombra
6,5 0,2
3,6 0,1
6,8 0,2
4,2 0,1
5,7 0,1
3,3 0,1
4,9 0,1
6,5 0,1
8,1 0,1
5,1 0,1
9,8 0,1
5,9 0,1
6,4 0,1
5,4 0,1
9,1 0,1
5,30,1
6,9 0,2
4,1 0,1
8,7 0,1
5,4 0,1
6,4 0,1
3,9 0,1
8,7 0,1
N+K
5,4 0,1
7,7O,1
4,4 0,1
9,2 0,1
4,5 0,1
6,4 0,1
4,3 0,1
8,2 0,2
sem adubao 5,4 0,1
8,8 0,1
6,4 0,1
11,60,2 7,90,1
8,2 0,1
7,60,1
7,80,1
5,8 0,1
9,0 0,1
6,6 0,1
11,6 0,1 8,1 0,1
8,5 0,1
7,70,1
8,1 0,1
6,0 0,1
9,3 0,1
6,7 0,1
11,8 0,1
8,3 0,1
8,7 0,1
8,0 0,1
8,3 0,1
N+K
6,2 0,1
9,2 0,1
7,0 0,1
12,00,1 8,30,1
8,9 0,1
8,2 0,1
8,4 0,1
semadubao 1,000,11,500,1 0,880,11,470,1 0,730,21,100,1 0,800,1 0,910,1

Cu
0,930,1 1,330,1 0,770,1 1,270,1 0,680,1 0,890,1 0,790,1 0,890,1
0,88 0,1 1,17 0,1 0,74 0,1 1,17 0,1 0,64 0,1 0,82 0,1 0,75 0,1 0,76 0,1
N+K
0,840,1 1,000,1 0,700,1 0,980,1 0,620,1 0,780,1 0,730,1 0,740,1
sem adubao 31,9 1,2 48,7 1,1 21,1 0,6 50,1 1,9 37,2 0,6 56,5 0,8 30,6 2,1 22,0 0,1
Na
27,9 1,3 46,3 0,5 22,5 0,6 41,1 1,3 26,1 0,7 34,4 0,6 29,9 2,5 26,2 0,2
30,9 1,8 38,8 2,3 29,4 0,3 34,6 0,7 27,0 0,7 32,8. 2,3 29,5 1,1 32,8 0,1
N+K
20,8 1,3 40,2 1,5 24,3 0,8 29,6 0,4 34,3 0,3 27,6 ,8 31,7 1,3 30,4 3,5
46
Tabela XI: Anlise estatstica (ANOVA com teste de Tukey a 5%) dos contedos dos minerais das folhas de erva-mate, sob
diferentes condies agronmicas.
Mineral
06
meses
K
Idade das folhas
Intensidade de luz
mg/100g
12
18
mg/100g
Sol
sombra
meses
24
Adubao
mg/100g
Sem adubao
N
N+K
meses meses
1562,9a 1121,9b 625,3c 585,8 d
926,7 b
1030,8a
978,7 b
787,7c 1144,1 a 985,2 b
Ca
716,9a
588,Ob
606,3c 522,2 d
532,2b
699,5a
504,7 d
729,3a 651,6b 577,8c
Mg
755,6b
783,7 a
756,6b 756,7 b
761,9a
764,3a
757,2c
783,7 a 739,7d 771,8 b
Mn
253,Oa
190,5b
192,9b 187,5b
205,Oa
207,Oa
150,9d
175,1 c 234,Ob 264,Oa
Na
35,67 a
31,56b
34,58a 29,12 b
284
, b
370
, a
37,30a
31,79b 31,97 b 29,88c
Fe
745
, d
922
, a
837
, b
801
, c
714
, b
939
, a
795
, c
818
, bc
840
, ab
852
, a
Zn
637
, a
645
, a
559
, c
597
, b
473
, b
745
, a
495
, c
701
, a
619
, b
625
, b
Cu
108
, a
100
, b
O,78c
O,80c
O,80b
1,05a
1,05a
O,94b
08r
,
O,80d
Letras iguais entre dois nveis da mdia de um fator, no tem diferena significativa a 5 % (Teste de Tukey).
47
3.0 CONCLUSES PARCIAIS
A avaliao da influncia das variveis agronmicas na quantidade dos

minerais nas folhas de erva-mate permitiu concluir que:
As folhas de erva-mate apresentaram altas quantidades dos metais K, Ca,

Mn e Mg estando de acordo com os nveis encontrados para as plantas.
Analisando a influncia da idade de poda das folhas de erva-mate podese observar que o teor de minerais mais alto em folhas jovens.
Plantas cultivadas em reas sombreadas apresentam maior quantidade

de nutrientes do que aquelas plantadas ao sol.
As variveis agronmicas que mais influenciaram foram a idade de poda

das folhas e a intensidade de luz.
A Espectrometria de Absoro Atmica (FAAS) permitiu determinar com

segurana a composio mineral das amostras estudadas.
48
CAPTULO 4:
APLICAO DO CO 2 A ALTAS
PRESSES NA EXTRAO DE
COMPOSTOS ORGNICOS
DE ERVA-MATE
1.0 EXPERIMENTAL
Neste captulo foram estudadas as variveis da tcnica de extrao

(temperatura e presso) com fluido supercrtico (SFE) nas amostras de folhas
de erva-mate sob diferentes condies agronmicas (intensidade de luz, idade
de folha e adubao) sobre o rendimento de extrato. Tambm foram
identificados e quantificados os principais compostos das folhas de erva-mate
de 18 meses, avaliando a intensidade de luz e a adubao sobre estes
compostos. Foi utilizado o mesmo experimento de campo descrito no captulo
3. O tratamento inicial das amostras seguiu o mesmo procedimento indicado no
captulo 3, quanto coleta das amostras, secagem, moagem, classificao
granulomtrica e estocagem.
1.1 Reagentes e solventes
Para o procedimento de extrao supercrtica foi utilizado C02 (White

Martins) de grau UP, com 99,9% de pureza (cilindro com tubo pescador). Os
padres cafena, teobromina, cido mirstico, cido hexadecanico, cido
esterico,
esqualeno,
tricosano,
heneicosano,
eicosano,
docosano,
hexacosano,
heptacosano, triacontano,
nonacosano,
linolenato de metila,
linoleato de metila, oleato de metila, f3-sitosterol, agnosterol, hexadecanoato de

metila, hexadecanoato de etila, pentadecanoato de etila, gama-delactona,
estearato de metila, tetracosano, vitamina E, estigmasterol, fitol e bifenila foram
adquiridos da Aldrich, Paio Alto, Califrnia, EUA. Foram preparadas solues
estoques de cada padro (1000 /lg mL-1 ) em diclorometano e guardadas sob
refrigerao. Os solventes (grau p.a.) utilizados foram adquiridos da Merck,
bidestilados.
50
1.2 Extrao com C02 supercrtico
As extraes foram realizadas em uma unidade em escala de

laboratrio, que consiste basicamente de um cilindro de C02, dois banhos
termostticos (QUIMIS), uma bomba de alta presso (ISCO 260D), um reator
em ao inoxidvel (100 mL), um transdutor de presso (SMAR LD301)
equipado com um controlador (SMAR, HT 201) com uma preciso de 0,012
MPa e um tubo coletor de vidro, conforme esquematizado na Figura 8 e
visualizado atravs de foto na Figura 9.
F
A
Figura 8: Esquema representativo de um sistema de extrao a altas

presses: (A) - cilindro de C02; (B) e (C) - banhos termostticos; (D) - extrato r;
(E) - tubo coletor de vidro; (F) - bomba de alta presso; (G) - medidor de
presso; (H) - vlvula micromtrica com sistema de aquecimento.
1.3 Variveis de extrao
As condies de extrao foram estabelecidas nas temperaturas de 20,

30 e 40C e nas presses de 100, 175 e 250 atm. Foram avaliados os efeitos
destas variveis sobre o rendimento de extrato da folha (seca) de erva-mate e
sua composio qumica. O intervalo de variveis estudado (temperatura e
51
presso) foi estabelecido de forma a cobrir a regio de interesse no que se

refere s propriedades de transporte e poder solvente do dixido de carbono.
Figura 9: Fotografia com vista parcial da unidade de extrao com dixido de

carbono pressurizado.
As amostras de erva-mate (25 g) foram colocadas no extrator e o C02 foi

bombeado at a presso de extrao. Este solvente foi deixado em contato
com a amostra por 1 h para estabilizao do sistema. Aps, a vlvula
micromtrica foi aberta, sendo coletado o leo solubilizado. O fluxo de C02 foi
acompanhado atravs do registrador da bomba de alta presso. O leo
extrado foi coletado e pesado em intervalos de tempo definidos (15 a 20 min).
Um outro tubo foi conectado ao equipamento e a extrao continuou at que
no se obteve quantidade significativa de extrato em intervalo de tempo
determinado. O tempo de extrao em cada experimento foi estabelecido em
aproximadamente 400 minutos, isotermicamente, presso constante. Cada
experimento consumiu em mdia 10 h, incluindo-se pesagem da amostra,
carga do extrator, estabilizao da temperatura do extrato r e dos banhos,
extrao, despressurizao e descarga do extrato r.
52
Um planejamento experimental fatorial 22 foi estabelecido para avaliar a

influncia das variveis do processo no rendimento e na composio qumica
do extrato. As extraes foram realizadas nas temperaturas de 20 a 40C e
presses de 100 a 250 atm. As corridas foram realizadas em duplicata, em
todas as condies.
1.4 Cromatografia lquida preparativa em slica gel
Os extratos brutos de SFE foram submetidos cromatografia lquida

preparativa em slica gel, conforme a seguinte metodologia: em uma coluna de
vidro (30 cm x 11 mm) foram adicionados 3,0 g de slica previamente ativada a
180C por 20 horas em cpsula de porcelana revestida com papel de alumnio
perfurado e,
posteriormente,
guardada em dessecador.
A coluna foi
condicionada com 20 mL de hexano e este eluente foi descartado. Em um

bquer, foram adicionados cerca de 100 mg da mistura dos extratos obtidos
por SFE, e misturados com 0,5 g de slica e 3 mL de hexano, homogeinizando
bem. Aps a evaporao do solvente, esta mistura foi colocada no topo da
coluna. A seguir fez-se eluir cerca de 150 mL dos seguintes solventes,
seguindo a ordem de polaridade: hexano, tolueno, diclorometano, acetato de
etila, acetona e metanol. Foram obtidas seis fraes (Figura 10) que foram
concentradas em atmosfera de nitrognio e mantidas em dessecador at peso
constante.
1.5 Cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massas

(GC/MS)
Os extratos obtidos na extrao das amostras de erva-mate com C02 a

altas presses foram analisados por GC/MS, conforme condies analticas
descritas na Tabela XII.
53
Figura 10: Esquema do fracionamento aplicado mistura dos extratos

obtidos por SFE.
Tabela XII: Condies cromatogrficas utilizadas na anlise dos extratos'

obtidos com C02 a altas presses por GC/MS.
Parmetro
Condio
Equipamento
Coluna
Ionizao
Modo de injeo
Gs de arraste e fluxo
Programao de Temperatura
Temperatura do injetor e interface
GC/MS - Shimadzu QP-5050A
OV - 5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 IJm)

Impacto eletrnico com 70 eV
Split 1:20
He; 1,5 mL min--'
100C (1 min) - 3C min-1 - 280C (30 min)
280C
A identificao de alguns compostos foi feita com base na injeo de

padres (cafena, teobromina, cido mirstico, cido hexadecanico, cido
este ri co ,
esqualeno,
eicosano,
docosano,
hexacosano,
nonacosano,
tricosano,
heneicosano, heptacosano, triacontano, linolenato de metila,
linoleato de metila, oleato de metila, l3-sitosterol, agnosterol, hexadecanoato de

metila, hexadecanoato de etila, pentadecanoato de etila, gama-delactona,
estearato de metila, tetracosano, vitamina E, estigmasterol, fitol), usando a
54
usando a bifenila como padro interno, atravs da comparao dos espectros

de massas e dos tempos de reteno dos compostos. Os demais compostos
foram identificados por comparao com os espectros de massas da biblioteca
Wiley do equipamento. Foram preparadas solues estoque de cada padro a
1000 I-1g mL-1 em diclorometano e solues contendo todos os padres em
vrias concentraes, alm de solues de cada extrato em torno de 3000 I-1g
mL-1 em diclorometano, sendo injetado 11-1L de cada soluo. A quantificao
de alguns destes compostos nos extratos foi efetuada a partir da injeo da
mistura padro e dos extratos no sistema GC/MS operando no modo SIM
(monitoramento de ons individuais). A programao de temperatura foi
modificada para a quantificao dos compostos utilizando-se uma programao
de temperatura mais rpida. As condies cromatogrficas foram: 140C (O
min)-10 C/min-170 C(5 min.)-10C/min -230C -20C/min -290C (10 min),
Tinjetor=280 cC, Tdetector: 290C, split: 1:20 e fluxo de 1,5 mU mino Usou-se o
mtodo de padronizao interna, com a bifenila como padro interno. Os ons
usados neste procedimento foram: cafena (m/z = 194), cidos palmtico e
esterico (mlz = 73), fitol (m/z = 143), esqualeno (mzl = 69), vitamina E (m/z =
165) e bifenila (PI) (m/z = 154) (m/z=massa/carga).
1.5.1 Derivatizao
As amostras e os padres foram derivatizados utilizando-se a

combinao de BSTFA (N, O-bis (trimetilsil) trifluoroacetamida) e TMCS
(trimetilclorossilano) na proporo de 99:1 dos reagentes e amostra e a mistura
de BSTFA e TMCS foi realizada na proporo de 1: 1(v/v) [161]. Uma reao
esquemtica do processo de derivatizao est apresentada no Anexo 1,
exemplificando a derivatizao para o caso do cido hexadecanico (cido
palmtico) e para o fitol. Esta derivatizao tornou-se necessria para melhorar
a separao cromatogrfica de substncias muito polares, as quais podem ficar
retidas
irreversivelmente
na
coluna
cromatogrfica.
55
2.1 Efeito das variveis de extrao (P x T)
A etapa inicial da extrao das amostras de erva-mate consistiu em

avaliar o efeito da presso e da temperatura sobre o rendimento da mesma.
A Tabela XIII resume as condies de extrao e os resultados
alcanados quanto ao rendimento. Os rendimentos foram calculados com base
na porcentagem do leo extrado em relao massa seca da amostra
colocada no extrator, em um tempo de 400 minutos. Observa-se uma grande
variao na densidade do solvente (0,612 a 0,963 g/cm 3 ) calculada com base
em dados fornecidos por Angus e colaboradores [162]. As variveis, vazo do
solvente e massa de erva-mate, foram mantidas constantes em 2 9 min-1 e
25 g, respectivamente.
Tabela XIII: Condies experimentais e rendimentos obtidos nas extraes de

erva-mate com C02 a altas presses. Erva-mate com idade de poda de 12
meses cultivada a pleno sol e sem adubao.
Experimento
Temperatura
Presso Densidade
Rendimento
(OC)
(atm)
(g cm-3)
(gextratJ1 OOgerva -mate)
30
175
0,868
1,93
20
250
0,963
1,73
40
250
0,880
2,46
20
100
0,854
1,19
40
100
0,612
0,53
56
A Figura 11 mostra o efeito da temperatura e da presso sobre o

rendimento da extrao da erva-mate, empregando dixido de carbono a alta
presso
como
solvente.
As
curvas experimentais de extrao foram
construdas atravs do rendimento total de extrato de erva-mate, em funo da

massa de dixido de carbono utilizada, que foi monitorada pelo decaimento no
volume do solvente na bomba de seringa.
3,0
4Cf>c 250atm
2,5

+ +
+ + o o
+
0+ o+ o o o
0+ 0+ 0+ 0+
20C 250atm
.. 4QC 100atm
"*c
Q)
E
'
2ff'c 100atm
11
2,0
+ 3O"c
1,5
r:::
Q)
a:: 1,0
175atm
0,0 .
+>
J::.
J::.
J::.
11
11
..
..
..
.
..
.
..
..
.
..
. . .. .. ..
o +
o + J::.
0,5
J::.
o +
11
11
11
11
J::.
J::.
J::.
11
100
200
300
400
500
600
Massa de dixido de carbono [9)
Figura 11: Curvas de extrao obtidas para erva-mate usando C02 a altas
presses (condies descritas na Tabela XIII). Erva-mate com idade de poda
de 12 meses cultivada a pleno sol e sem adubao.
Como podemos observar nesta Figura, as curvas de extrao so

formadas por uma etapa linear inicial (taxa constante de extrao), onde a
solubilidade do leo no solvente (funo somente de temperatura e da presso)
governa a extrao. Nesta etapa, o leo est completamente exposto e as
partculas slidas esto cobertas por uma camada deste. Neste perodo, o
solvente deixa o extrato r saturado de leo e a concentrao do leo no
solvente, na sada do extrator, igual a sua solubilidade no solvente. Numa
segunda etapa, a taxa de extrao decresce em funo da resistncia
difuso no interior das folhas. Neste perodo, a superfcie do slido comea a
apresentar falha na camada superficial de leo e a rea efetiva de troca diminui
consideravelmente. Assim, a transferncia de massa controlada pela difuso
57
das partculas do slido e pela difuso do solvente-soluto para fora da matriz

porosa.
Pode-se observar que em presses menores (100 atm), medida que
se aumenta a temperatura, diminui o rendimento da extrao. Este fato se deve
brusca reduo da densidade. Para altas presses (250 atm), o aumento da
temperatura at 40C resulta no aumento do rendimento da extrao. Nesta
regio est claramente demonstrado que, apesar da densidade diminuir com o
aumento da temperatura, a diminuio da viscosidade, o aumento do
coeficiente de difuso do solvente e o aumento da presso de vapor do leo,
compensam este decrscimo. Isto faz com que o rendimento seja aumentado
quando se altera a temperatura de 20 para 40 oCo Em termos de rendimento, a
amostra de erva-mate analisada a 250 atm e 40C foi a que apresentou maior
valor, de 2,46 %.
2.2 Fracionamento dos extratos
Aps a definio dos efeitos das variveis temperatura e presso no

processo de extrao por SFE, uma mistura de todos os extratos da Tabela
XIII foi submetida a um fracionamento em slica gel. Diferentes solventes foram

utilizados e a ordem de eluio foi seguida de acordo com o aumento da
polaridade dos solventes: hexano, tolueno, diclorometano, acetato de etila,
acetona e metanol. A Tabela XIV apresenta os resultados dos rendimentos dos
extratos obtidos na cromatografia lquida preparativa (fracionamento).
Podemos observar nesta tabela que o extrato da frao de tolueno o
que apresenta maior rendimento em comparao com as outras fraes. Este
fato pode estar associado presena de ceras isoladas nesta frao. A perda
mxima de massa durante o fracionamento foi de 4%.
58
Tabela XIV: Rendimentos dos extratos (mistura dos extratos da Tabela XIII)
obtidos por cromatografia lquida preparativa (fracionamento), expressos em
gramas (extrato) de cada solvente pela quantidade global da mistura do
extrato.
2.2.1
Frao
Eluenfe
Hexano
3,6
Tolueno
59,2
Diclorometano
8,8
Acetato de eti la
14,8
Acetona
3,2
Metanol
6,4
Anlise
cromatogrfica
Rendimento(% )
(GC-MS)
dos
extratos
obtidos
no
fracionamento cromatogrfico em slica gel

A mistura de todos os extratos de SFE (conforme Tabela XIII),
fracionados com hexano, tolueno, diclorometano, acetato de etila, acetona e
metanol foram analisados via GC/MS.
A identificao de alguns compostos foi feita com base na injeo de
padres e da bifenila como padro interno, atravs da comparao dos
espectros de massas e do tempo de reteno de cada padro.
A Figura 12 apresenta o cromatograma do on total da mistura dos

extratos de erva-mate obtidos por extrao com fludo supercrtico.
Os extratos de erva-mate apresentaram uma mistura complexa de
hidrocarbonetos, compostos oxigenados (lcoois, cidos graxos, steres,
fitoesteris) e nitrogenados (cafena e teobromina), estando de acordo com a
literatura [7,15,28].
59
37
51
25
44
48
25
5Cl
tempo de reteno (min.)
Figura 12 - Cromatograma do on total da mistura dos extratos de erva-mate

obtido via extrao supercrtica com C02 (condies de extrao da mistura
dos extratos apresentada na Tabela XIII). Identificao dos picos apresentada
na Tabela XV. Condies cromatogrficas descritas na Tabela XII.
.
Alguns trabalhos citados na literatura tm se preocupado em identificar

e quantificar as metilxantinas (cafena, teobromina e teofilina) dos extratos de
erva-mate obtidos via extrao com fluido supercrtico. Em geral, todos estes
estudos esclarecem que, nas condies de extrao estudadas, a cafena o
composto majoritrio [7,15,24-28].
Em outro trabalho, Esmelindro e colaboradores [28] estudaram os
efeitos das condies de processamento industrial sobre os compostos da
erva-mate utilizando a tcnica de extrao por fludo supercrtico. Neste estudo,
os extratos obtidos da extrao com C02 da erva-mate, analisados via GC/MS,
apresentaram em sua composio cafena, teobromina, cido hexadecanico,
fitol, esqualeno, octacosanol, esterides e terpenos.
Nos extratos obtidos das folhas de erva-mate com fluido supercrtico,
51 compostos foram detectados e identificados (por comparao dos tempos
Ro~~gela
Assis Jacques
60
de reteno dos padres ou tentativamente identificados com base na

biblioteca Wiley NBS do equipamento), e se encontram listados na Tabela XV
em ordem de eluio na coluna cromatogrfica OV-5. Foram considerados
tentativamente identificados quando as probabilidades de semelhana do
espectro de massa foram superiores a 84%.
Cafena (pico 7), cido hexadecanico (picos 11, 13 e 14), esqualeno
(pico 37), fitol (picos 15 e 18), vitamina E (pico 44), stigmasterol (picos 49 e 50)
e sitosterol ou stigmastadienol (picos 48 e 51) so alguns dos mais abundantes
e importantes constituintes dos extratos de erva mate. A cafena responsvel
pelas propriedades estimulantes das folhas de erva-mate, pois tem efeito sobre
o sistema nervoso central, acelera a entrada de oxignio nos pulmes,
aumenta a velocidade do metabolismo e acelera o batimento cardaco [29]. O
esqualeno apresenta propriedades de preveno contra o cncer [163,164] e o
stigmasterol e seus derivados so reconhecidos como antioxidantes [87,88]. A
extrao
de fitoesteris
de
plantas
tem
aumentado
interesse de
pesquisadores devido aos seus efeitos na reduo de osteosporose e o

controle dos nveis de colesterol [165,166]. A vitamina E uma substncia
reconhecida pelas suas propriedades medicinais ( o mais potente antioxidante
nutricional lipossolvel), sendo utilizada contra aproximadamente 80 doenas,
como cncer, fibrose cstica, insuficincia pancretica e doenas neurolgicas,
como Alzheimer [167]. A indstria alimentcia tem utilizado a vitamina E nos
leos comestveis como um protetor contra a peroxidao lipdica, auxiliando a
conservao de suas propriedades [168].
Os steres graxos (steres de cidos e lcoois de cadeias longas) formam uma
das principais classes na composio das ceras epicuticulares. Essa classe
composta, principalmente, por derivados do cido palmtico (C16) (cido
hexadecanico) e cido esterico (C18) [169].
O fracionamento dos extratos de plantas utilizando uma coluna
preparativa com slica resultou em distintas fraes com diferentes graus de
complexidade, que pode ser visualizado nos cromatogramas da Figura 13 e
Tabela XV.
61
A frao de hexano (A) contm principalmente hidrocarbonetos,

incluindo esqualeno e vitamina E. Cafena e teobromina foram encontradas nas
fraes de acetato de etila (D) e acetona (E). lcoois e fenis, tais como fitol,
tambm esto presentes nestas fraes.
(~
Hexano
(8) Tolueno
11 13
(C) DlcJorometano
(D) Acetato da rila
(E) Acetona
3D
(F) Metanol
50
_li.
de -Dflo .....)
Figura 13 : Cromatograma do on total das fraes do extrato fracionado dos

extratos de erva-mate obtido por C02 a altas presses. Identificao dos picos
apresentada na Tabela XV. Condies cromatogrficas descritas na Tabela
XII.
62
r
.,~
-T-abela XV: Compostos identificados na mistura dos extratos da Tabela XIII e

das fraes do extrato fracionado de erva-mate com idade de poda de 12
meses, cultivada a pleno sol e sem adubao, obtido por SFE.
N
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
mdio
6,6
8,8
11,5
14,3
16,7
18,6
22,1
21,9
22,8
23,2
24,1
24,5
25,5
26,9
28,6
29,1
29,2
29,9
30,3
30,7
30,9
31,0
31,4
32,5
33,7
34,6
34,7
35,6
36,6
36,7
38,6
38,7
40,5
40,6
42,4
42,5
42,7
44,2
45,8
45,9
47,5
47,7
47,9
48,8
50,2
52,3
53,0
nome do composto
cido octanico (*)
cido nonanico (*)
cido decanico (*)
cido undecanico (*)
cido dodecanico (*)
cido tridecanico (*)
cafena
cido tetradecanico (*)
teobromina
pentadecanoato de metila
hexadecanoato de metila
cido pentadecanico (*)
hexadecanoato de etila
cido hexadecanico (*)
fitol
cido heptadecanico (*)
linolenato de metila
fito I (ter-TMS)
docosano
cido linolico (*)
cido linolnico (*)
cido olico (*)
cido esterico (*)
tricosano
cido nonadecanico (*)
tetracosanol
tetracosano
cido eicosanico (*)
pentacosanol
pentacosano
hexacosanol
hexacosano
heptacosanol
heptacosano
octacosanol
octacosano
esqualeno
nonacosano
triacontanol
triacontano
commato de metila (C ou D)
commato de metila (C ou D)
untriacontano
vitamina E
dotriacontano
estigmasterol
tritriacontano
frmulalMM
identificao (*)
prob.(%)
C11H2402Si/206
C12H2602Si1220
C13H2s02Si/234
padro, MS
padro, MS
padro, MS
padro, MS
padro, MS
padro, MS
padro, MS
padro, MS
padro, MS
MS
MS
padro, MS
padro, MS
padro, MS
padro, MS
padro, MS
padro;MS
padro, MS
MS
MS
MS
MS
padro, MS
padro, MS
MS
MS
padro, MS
MS
MS
padro, MS
MS
padro, MS
MS
padro, MS
MS
padro, MS
padro;MS
padro, MS
MS
padro, MS
MS
MS
padro/MS
padro/MS
padro, MS
padro, MS
padro, MS
85
88
85
88
87
86
96
92
90
88
86
85
90
96
93
90
89
90
88
92
90
90
92
86
89
85
86
85
87
88
88
88
86
87
88
88
92
90
89
88
87
87
87
90
89
87
88
C14H300~i/248
C15H322Si/262
C1sH340~iI286
CsH1ON40i194
C17H360i300
C7HsN402/180
C1sH3202/254
C17H3402/270
C1sH380i314
C1sH3602/284
C19H4002Si/328
C2QH400/296
C2QH422Si/342
C19H322/292
C23H480Si/368
C22H461'31 O
C21H4002Si/352
C21H38~i/350
C21H4202Si/354
C21H4402Si/356
C23H48i324
C22H462Si/370
C24H500/354
C24Hsof338
C23H480~i/384
C25H520/368
C25Hsi352
C26H540/382
C26HsJ366
C27H560/396
C27Hssf380
C2sH580/410
C28Hssf394
C30Hsof41O
C29HsoI408
C30H620/438
C30Hsi422
C31HsoOJ486
C31HsoOJ486
C31HsJ436
C29H5002/430
C32Hssl450
C29H480/412
C33Hssl464
63
Continuao da Tabela XV
W
m~io
48
49
50
51
53,2
54,1
54,9
55,1
nome do composto
estigmasterol (ter-TMS)
estigmast-5-em-3-ol (3-beta)
estigmast-8-em-3-ol (3-beta)
beta-sitosterol (ter-TMS)
frmulalMM
Identificao (*)
prob.{%)
C29H480Si/528
C29H500/414
C29H500/414
C32H580Si/486
padro, MS
MS
MS
padro, MS
89
89
88
88
(*) identificado sob a forma de ster trimetil silH (TMS)
As fraes obtidas pela eluio com acetato de etila (D), acetona (E) e
metano I (F) apresentaram principalmente steres, cidos saturados e
insaturados. Alguns destes compostos tm sido citados na literatura em
extratos de erva-mate obtidos por SFE [28] e por outros processos de extrao.
Tambm podemos observar na Figura 13 que a maior porcentagem de cafena
foi eluda na frao de acetato de etila (D), completando-se a eluio nos
solventes subsequentes. interessante notar que nos extratos brutos foram
encontrados cidos carboxlicos e tambm steres metlicos e etlicos. Isto
pode ser afirmado pois, os cidos livres foram derivatizados formando o ster
TMS, enquanto os outros aparecem como steres metlicos e etlicos.
tambm interessante observar que o cromatograma da frao (B) (eludo com
tolueno) apresenta alguns compostos que no foram identificados com picos
intensos e tambm que esta frao tem uma alta porcentagem de extrato
(Tabela XIV). Podemos concluir que alguns compostos a base de cera podem
ter sido isolados nesta frao.

Em geral alguns rgos (as folhas) so recobertos externamente por
uma fina camada de cera, que desempenha grande importncia biolgica nas
relaes entre a planta e o meio ambiente em que esteja inserida. Por
definio, ceras epidrmicas so compostos hidrofbicos, da superfcie das
plantas, que so removidos por uma breve imerso em solvente orgnico,
como clorofrmio ou hexano. Elas so misturas complexas de compostos de
cadeias longas (> C1s), tais como cidos graxos, hidrocarbonetos, lcoois,
aldedos, cetonas, steres, compostos alifticos polinucleares e compostos
fenlicos; compostos que podem apresentar massas moleculares altas [169].
64
2.3 Efeito das variveis agronmicas sobre o rendimento da SFE

Para analisar o efeito das variveis agronmicas, as extraes foram
realizadas mantendo fixas a temperatura em 30C e a presso em 175 atm, ou
seja, as condies do ponto central do planejamento estatstico.
2.3.1 Efeito da adubao e sombreamento
Para avaliar o efeito da adubao, foram selecionadas as plantas a

pleno sol com idade de poda de 12 meses. Tendo-se dividido o terreno de
plantio em linhas, os diferentes tratamentos foram distribudos como descrito a
seguir: as plantas da Linha 1 no receberam nenhum tipo de adubao; as da
Linha 2 receberam uma adubao, tendo como fonte de nitrognio a uria; as
da Linha 3 receberam adubao, tendo como fonte de potssio o cloreto de
potssio e as plantas da Linha 4 receberam uma adubao com fonte de
nitrognio e de potssio simultaneamente.
A Figura 14 apresenta o efeito da adubao e sombreamento sobre as
curvas cinticas da extrao da erva-mate.
25
,
2O
,
! Sol-Linha 1
Sol-Linha 2
... Sol-Linha 3
O Sol-Linha 4
Sombra-Linha 1
Sombra-Linha 2
... Sombra-Linha 3
O Sombra-Linha 4
+ + +
+
++
+ .. '"
~ 1,5t ......- - - -.....
'6
tt**
*-
~ ~
0,5
..
Ot<~O
: * Ooe
......
t O. 0.0.
C1 c) O O
*.;. .J.~
10
......
O O
t ~~ ~
~

'I
0,0 .................-............~..........---.................._~..........---...................._
O
100
200
300
400
500
..................................
600
700
massa de 0l91
Figura 14: Cintica da extrao da erva-mate de 12 meses de poda, sob

diferentes intensidades de luz e adubao. Temperatura de extrao de 30C
e presso de extrao de 175 atm.
Observa-se que quando a adubao das plantas feita somente com
fontes de nitrognio, maiores foram os rendimentos obtidos, comparados com
65
as plantas que no receberam nenhum tipo de adubo. O mesmo efeito, embora

em menor escala, acontece quando se aduba as plantas com fonte de potssio
(cloreto de potssio). Quando as plantas foram adubadas simultaneamente
com fontes de nitrognio e potssio, uma sinergia negativa foi observada, e o
rendimento da extrao no apresentou mudanas significativas em relao
aquele obtido a partir de plantas no adubadas.
Tambm podemos observar que, independente da condio de
adubao, quando as plantas se encontram a pleno solo rendimento da
extrao (quantidade de compostos solveis no dixido de carbono)
aumentado em relao aquele obtido com plantas sombreadas. Porm, quando
as plantas sombreadas so adubadas com fonte de nitrognio, um aprecivel
aumento no rendimento da extrao observado.
2.3.2 Efeito da idade de poda
O efeito da idade de poda das folhas sobre o rendimento da extrao .

pode ser observado atravs da Figura 15.
(I 6meses
0,9
C
O
12meses
18 meses
24meses
DCCO O
O O
?fi
o
QI
O O
0,6
E
'
C C
QI
a::
0,3
+
00'
, O
~ O
100
+ +
+ +
+ + +
C O
++
+ +
~ <e
200
<;t <1\ <) <) QtOeoe oeottO O

300
400
500
600
700
Massa de dixido de carbono [g]
Figura 15: Cintica da extrao da erva-mate sob diferentes idades de poda,

plantadas a pleno sol e adubadas com nitrognio. Temperatura de extrao de
30
c e presso de extrao de 175 atm.
66
Podemos observar que at os 18 meses, o acrscimo na idade de poda

das folhas proporciona um aumento significativo no rendimento da extrao. A
partir de 18 meses, a quantidade de compostos volteis passveis de extrao
diminui consideravelmente, chegando aos 24 meses com rendimentos
similares aos obtidos com plantas de 6 meses de idade de poda. Este
comportamento pode ser explicado em termos do tempo de vida das folhas,
onde, segundo Mosele [3], as folhas de erva-mate caem antes de completarem
24 meses e, neste sentido, as folhas coletadas aps 24 meses de poda podem
ser, na verdade, folhas bastante jovens.
2.4 Anlise quantitativa dos compostos da erva-mate
A anlise quantitativa dos extratos por C02 a altas presses sob

diferentes condies agronmicas (intensidades de luz, fertilizao e idade de
poda de 18 meses), foi realizada utilizando-se como padres a cafena, cido
palmtico, fitol, cido esterico, esqualeno, vitamina E, e a bifenila como padro
interno. Para a quantificao dos compostos da erva-mate foram escolhidas as
folhas com idade de poda de 18 meses, pois nesta idade a folha apresentou
maior rendimento de extrato. A Tabela XVI apresenta as concentraes dos
compostos quantificados da erva-mate (cafena, cido palmtico, fitol, cido
esterico, esqualeno e vitamina E) calculadas usando como padro interno a
bifenila. Todas as anlises foram realizadas em duplicata (extraes e injeo
da amostra e padres). Alguns destes compostos foram selecionados em
funo de suas caractersticas e aplicaes. A cafena um alcalide
pertencente ao grupo das metilxantinas [8, 9,14]. As xantinas so substncias
capazes de estimular o sistema nervoso, produzindo um estado de alerta de
curta durao [5,29]. Particularmente, a cafena a substncia estimulante de
maior consumo em todo o mundo. O fitol um lcool diterpnico, que
material bsico para a produo sinttica de vitamina K1 e E [170]. O
esqualeno um bactericida natural, empregado amplamente na indstria
cosmtica, na fabricao de cremes e emulses [163-164]. A vitamina E uma
vitamina essencial para a atividade do organismo e, atualmente vem sendo
amplamente estudada em funo de sua poderosa atividade antioxidante [167].
67
Tabela XVI: Compostos das folhas de erva mate com idade de 18 meses de poda, quantificados em funo do tipo da fertilizao
e incidncia de luz.
mg/kg desvio padro(*)

sombra
sol
composto
sem adubo
cafena
4290 84,8
8688,969,1 5487,O80,6 4689,383,9 1705,O21,2 5418,127,6 2889,815,5 2058,210,3
N+K
sem adubo
N+K
c. palmtico
242,2 16,7 2299,3
358,412,9 256,811,5
129,24,7
210,69,6
288,86,4
255,810,5
fitol
336,3 10,8 182,78,2
229,93,4
102,85,9
332,810,2
111,85,6
132,75,2
93,42,2
c. esterico
29,75 1,0
28,60,6
28,00,7
28,40,8
31,8O,4
31,40,3
26,60,7
27,30,9
esqualeno
10501,1158,7 9596,9118 8389,640,7 9193,852,6 12801,171,8 9742,7104,2 8595,787,7 9073,824
vitamina E
1260,1 39,1
1525,650,1 1227,846,5 1091 ,629,6 1930,040,1
2755,456,1
1548,526,7 999,216,4
(*) mdia de trs determinaes
68
A Tabela XVII apresenta os resultados da anlise estatstica da influncia

de intensidade de luz e do tipo de adubao na quantidade dos compostos
orgnicos selecionados. Os valores apresentados nesta tabela so os valores
mdios obtidos em cada nvel das variveis. Letras iguais entre dois nveis da
mdia de um fator, no tem diferena significativa a 5 % (teste de "Tukey"), o que
pode ser observado com o contedo de cido esterico.
Tabela XVII: Anlise estatstica (ANOVA com teste de Tukey a 5%). Efeito da
intensidade de luz e do tipo de adubao sobre a concentrao (mg/kg de
amostra) de compostos selecionados do extrato de folhas de erva-mate com 18
meses de idade, obtidos por SFE.
mg/kg
intensidade de luz
adubao
composto
sombra
cafena
5788,8a 3017,8b
4188,4b
sol
sem adubo
N+K
7053,5a 2997,5d 3373,8c
c.palmtico
271,6a
221,1 b
185,7d
219,8c
323,6a
256,3b
fitol
212,9a
167,7b
334,6a
147,2c
181,3b
982
, d
c. esterico
284
, a
296
, a
291
, a
296
, a
300
, a
273
, a
esqualeno
9420,3b 10053,4a
11651,2a
9669,8b 8492,7d 9133,6c
vitamina E
1808,3a 1276,3b
1595,1 b
2140,5a 1388,2c 1045,4d
Analisando a Tabela XVII, pode-se observar que a intensidade de luz tem

um efeito negativo sobre as concentraes de cafena, fitol, cido palmtico e
vitamina E. Desta forma, maiores teores de cafena, fitol, cido palmtico e
vitamina E podem ser obtidos das plantas que se encontram em reas protegidas
69
do sol. Em relao ao esqualeno e ao cido esterico, a concentrao

aumentada sob intensidade de luz, ou seja, em plantas cultivadas a pleno sol.
Mazzafera [171], estudando a erva-mate, observou as mesmas tendncias
quando analisou cafena, ou seja, encontrou maiores concentraes em folhas
parcialmente sombreadas.
o efeito
da adubao sobre a composio qumica mostrou-se bastante
correlacionado com a intensidade de luz. Quando as plantas de erva-mate so

adubadas com fontes de nitrognio ocorre um aumento significativo do teor de
cafena e vitamina E. O fito I e o esqualeno apresentaram maiores concentraes
em plantas no adubadas, enquanto que o teor de cido palmtico aumentou em
plantas adubadas com K.
O efeito da fertilizao nitrogenada sobre a produo de alcalides tem
sido objeto de pesquisas. Embora com algumas excees, muitas pesquisas tm
apresentado aumento no contedo de alcalides nas folhas de erva-mate com
fertilizao nitrogenada. Em alguns casos, a resposta pode variar de acordo com
a fonte nitrogenada utilizada na fertilizao (nitrato, amnia ou uria)
[2~].
Segundo Mazzafera [172], como os alcalides so compostos nitrogenados,

baixo teor de cafena esperado em tratamentos com menor disponibilidade de
N. O nvel de cafena varia como parte integrada do metabolismo de compostos
nitrogenados da planta, e em funo do fornecimento deste elemento.
Tambm podemos observar na Tabela XVII que a concentrao de
cafena diminuiu com a utilizao de adubao com fonte de potssio e com fonte
de nitrognio e potssio simultaneamente. Alm do nitrognio, pesquisas
demonstram que a reduo de K geralmente resulta em aumento da
porcentagem de alcalides em plantas [23]. Mazzafera [171], ao estudar o
comportamento do suprimento de nutrientes sobre o contedo de cafena em
folhas de caf (Coffea arbica L.), observou que a ausncia de K induziu o
aumento do contedo de cafena nas folhas.
De acordo com a literarura, a concentrao de cafena nas folhas de ervamate pode variar de 0,16 % em folhas velhas, a 1,4 % em folhas jovens, sobre a
70
massa das folhas secas [8, 14, 22,23,173]. Saldaria et aI. [26] identificaram e
quantificaram a cafena em extratos de folhas de erva-mate obtidos por extrao
por fludo supercrtico e encontraram valores de 4308 mg/kg deste composto, na
temperatura de 70C e presso de 255 atm.
Em um outro trabalho, Saldaria et aI. [27], observaram que a modificao
do solvente com diferentes quantidades de etano I resultou em um aumento da
concentrao de cafena nos extratos das folhas de erva-mate obtida por SFE a
200 atm e 70C (de 3320 mg/kg para 6110 mg/kg de cafena nas folhas ervamate). Os valores de cafena da Tabela XVII esto dentro da faixa de
concentrao encontrada por estes pesquisadores.
A verificao da influncia das variveis de extrao da tcnica de

extrao por fluido supercrtico e das variveis agronmicas das folhas de ervamate, permitiu concluir que:
As variveis temperatura e presso exercem efeito pronunciado sobre a

quantidade de extrato produzido. Presses maiores (250atm) levam a
melhores rendimentos, uma vez que a elevao da presso (aumento da
densidade) incrementa o poder de solubilizao do solvente.
Foi observado um maior rendimento de extrato das folhas de erva-mate

na presso de 250 atm e 40C;
O fracionamento dos extratos obtido por SFE permitiu a identificao de 51

compostos presentes nas folhas de erva-mate.
O manejo da planta tambm interfere no rendimento da extrao.
Em relao ao sombreamento das plantas, observou-se que plantas

cultivadas a pleno sol produzem maior quantidade de extratos orgnicos
do que plantas sombreadas, utilizando a tcnica de SFE.
71
A idade de poda das folhas tambm afeta notadamente o rendimento da

extrao. At os 18 meses, o acrscimo na idade de poda das folhas
proporciona um aumento significativo no rendimento da extrao. Aps os
18 meses a quantidade de compostos volteis passveis de extrao
diminui consideravelmente, chegando aos 24 meses com rendimentos
semelhantes aos das plantas de 6 meses de idade de poda.
Quando as plantas so adubadas somente com fontes de nitrognio,

obtm-se maiores rendimentos em massa de extrato quando comparados
com as plantas sem adubao. O mesmo efeito acontece quando se
aduba as plantas com fonte de potssio (cloreto de potssio). Quando as
plantas so adubadas simultaneamente com fontes de nitrognio e
potssio, o rendimento da extrao no apresenta mudanas significativas
em relao aquele obtido a partir de plantas no adubadas.
A partir dos resultados alcanados pode-se concluir que a intensidade de

luz tem um efeito negativo sobre a concentrao da cafena, fitol, cido
hexadecanico e vitamina E. A concentrao do esqualeno aumentada
sob intensidade de luz.
72
1.0 EXPERIMENTAL
Neste captulo foram estudadas as condies da extrao por ultra-som,

utilizando um planejamento estatstico 2~1 nas amostras de folhas de erva-mate,
adubadas com nitrognio, plantadas ao sol e com idade de folha de 18 meses.
Neste planejamento foram avaliadas as seguintes variveis de extrao: tempo
de extrao, polaridade do solvente, quantidade de amostra, temperatura do
banho de extrao e relao de massa de amostra/volume de solvente. O
tratamento inicial das amostras seguiu o mesmo procedimento indicado nos
captulos anteriores, quanto secagem, moagem, classificao granulomtrica e
estocagem. De forma idntica, tambm os padres e solues estoque foram
preparados conforme o item 1.2 da parte experimental do captulo 4.
1.1 Extrao por ultra-som
Utilizou-se um aparelho modelo Fisher Scientific - FS14H, com potncia

de 90 W, freqncia de 40 kHz e intensidade de radiao de 0,27 W/cm 2 . As
dimenses do banho utilizado foram de 24 cm x 14 cm x 10 cm (Figura 16).
Foram utilizados erlenmeyers de 250 e 500 mL, com boca esmerilada,
conectados a um condensador de ar de 30 cm de altura.
Primeiramente, realizou-se um planejamento fatorial fracionrio 2~1, que
inclui a avaliao dos seguintes parmetros:
X1: tempo de extrao (60 e 180 minutos)
X2: temperatura do banho (25 e 75 e)
Xa: polaridade do solvente (hexano e metanol)
~:
Xs: relao de massa de amostra/volume de solvente (1:10 e 1:30) (g/mL)
quantidade de amostra (2,5 e 7,5 g)
74
..
Condensador de ar
..
Parede da aparelho
4-Rl-- gua
--H---- AIIIOStra +solvente
Figura 16: Equipamento utilizado para extrao com ultra-som das folhas de
erva-mate.
Como varivel de resposta, em todos os planejamentos realizados

considerou-se a porcentagem do rendimento de cada extrao e o perfil
cromatogrfico, resultando em 16 experimentos (Tabela XVIII, apresentada na
seo de resultados j com os rendimentos obtidos), gerando uma equao que
descreve um modelo ajustado ao experimento global. Nesta equao identificamse as variveis mais importantes do processo de extrao e a interao entre as
mesmas.

(GC/MS)
Os extratos obtidos na extrao das amostras de erva-mate por ultra-som

foram analisados por GC/MS, conforme condies analticas descritas na Tabela
XII.
75
A identificao e quantificao de alguns compostos (cafena, teobromina,

cido mirstico, cido hexadecanico, cido esterico, esqualeno, eicosano,
docosano, hexacosano, nonacosano, tricosano, heneicosano, heptacosano,
triacontano, linolenato de metila, linoleato de metila, oleato de metila, {3-sitosterol,
agnosterol, hexadecanoato de metila, hexadecanoato de etila, pentadecanoato
de etila,
gama-delactona, estearato de metila, tetracosano, vitamina E,
estigmasterol, fitol), bem como as derivatizaes foram realizadas conforme

descrito no item 1.6.1 do captulo 4.
76
CAPTULO 5:
APLICAO DO U'lTRA-SOM
NA EXTRAO DE COMPOSTOS
ORGNICOS DE ERVA-MATE
A etapa inicial da extrao das amostras de erva-mate por ultra-som

consistiu em avaliar o efeito das variveis tempos de extrao, quantidade de
amostra, relao massa/solvente, polaridade do solvente e temperatura de
extrao sobre o rendimento das mesmas.
A Tabela XVIII apresenta os resultados e as condies experimentais de
um planejamento estatstico 25-1, aplicado em dois nveis (+1 e -1) para cada
varivel. Foi considerada como varivel de resposta porcentagem em massa
(g/100g) da extrao.
Os rendimentos foram calculados com base na
porcentagem do extrato em relao massa da amostra utilizada na extrao.

Os resultados foram analisados utilizando o software "Statistics for
Windows" verso 6.0 e, discriminando os efeitos significativos, foi obtida a
seguinte equao emprica:
A partir desta equao, temos a mdia dos coeficientes assinalados com

asterisco, na qual o efeito apresenta diferena significativa em nvel de 5% de
confiana (p< 0,05), utilizando o teste de "Tukey". Em outras palavras, os
parmetros assinalados, que so a troca do nvel baixo ao nvel alto de uma
varivel, causam uma significante variao na varivel de sada (rendimento de
extrato). Substituindo os valores tericos de A (i = 1 a 10) a equao expressa
como:
Y (%) =5.32 + 0.48X1 + 1.08X2 + 4.59X3 + 0.38X4 + O.85Xs + O.83X1X4 - 0.59X1Xs - 0.47X4Xs + 0.43 XW + 0.63 XW
77
Tabela XVIII: Variveis e resultados de um planejamento fatorial fracionrio 25-1

do processo de extrao por ultra-som, das folhas de erva-mate.
variveis e valores
exp
1
2
3
4
5
6
7
X1
(-) 60
(-) 60
(-) 60
(-) 60
(+) 180
(+) 180
(+) 180
(+) 180
(-) 60
(-) 60
(-) 60
(-) 60
(+) 180
(+) 180
(+) 180
(+) 180
X2
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
25
25
25
25
25
25
25
25
75
75
75
75
75
75
75
75
(-)
(-)
(+)
(+)
(-)
(-)
(+)
(+)
Hex
Hex
Met
Met
Hex
Hex
Met
Met
Hex
Hex
Met
Met
Hex
Hex
Met
Met
rendo em massa (%)
Xs
N
(-)
(-)
(+)
(+)
(+)
(+)
(-)
(-)
2,506
2,508
7,501
7,486
7,506
7,501
2,502
2,505
7,509
7,506
2,507
2,505
2,503
2,504
7,505
7,503
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
(-)
(+)
1:10
1:30
1:10
1:30
1:10
1:30
1:10
1:30
1:10
1:30
1:10
1:30
1:10
1:30
1:10
1:30
exper.
0,33
0,63
5,84
9,95
0,66
1,13
6,78
13,4
0,33
0,64
6,6
9,6
0,78
1,39
12,1
12,6
teor.
0,00
1,32
6,73
9,93
0,13
0,80
7,98
13,07
1,77
0,07
6,31
9,02
1,43
1,61
12,70
13,53
(+)
(-)
(-)
(+)
(+)
(-)
(+)
(+)
(+)
(+)
(-)
(-)
(-)
(+)
(+)
(+)
(-)
(-)
(+)
(-)
(-)
(-)
(+)
(+)
(+)
(+)
(-)
(+)
(+)
(+)
(+)
(+)
(-1) nvel baixo; (+1) nvel alto; X1 (tempo de extrao em minutos); Xz (temperatura
extrao De); X3 (polaridade do solvente); X4 (massa de amostra em g); X5 (massa
9
10
11
12
13
14
15
16
de
de
amostra/volume de solvente em glL).
Os maiores valores esto em negrito na equao e representam uma

grande influncia no processo, sendo os coeficientes que possuem valores p <
0,05 no teste de ''Tukey'' .. Os valores experimentais de porcentagem de extrato
em massa (mg/100g) e os obtidos pela aplicao da equao acima (valor
terico) para cada experimento so apresentados na Tabela XVIII.
A anlise da equao permitiu observar que todas as variveis
manifestaram um efeito positivo. As principais variveis que influenciaram o
processo de extrao por ultra-som foram X2 (tempo de extrao),
do solvente) e
Xa (polaridade
Xs (razo massa de amostra / volume de solvente). Assim, maior
tempo de extrao (180 minutos), maior quantidade de solvente (225 mL) e

solvente mais polar (metanol), produzem maior quantidade de extrato nas folhas
de erva-mate. A varivel X3 (polaridade do solvente) apresentou um efeito
positivo mais alto (+ 4.59 ~), isto , quanto maior a polaridade do solvente maior
78
ser a massa de extrato. A interao entre as variveis (X1x..) apresentou efeito

significativo
(0.83X1~),
indicando que grande quantidade de amostra e maior
temperatura de extrao produzem mais extrato. As outras interaes entre as

variveis no apresentaram efeito significativo.
Baseado nestas informaes, pode-se concluir que as condies mais
favorveis, entre as estudadas para a extrao por ultra-som, so: maior
quantidade de solvente, solvente polar e maior tempo de extrao.
A Figura 17 apresenta a correlao entre os valores experimentais e

aqueles calculados pelo modelo emprico.
~16
~
~
~14
C/)
Cb
I o exp~rjmental J
teonco
E: 12
E
(J)
E
"-c:
010
1::
(J)
~ 6
"'o
4
2
o
o
o
2
~
4
~
6
2
10
12
~
14
16
experimento
Figura 17: Correlao entre os rendimentos obtidos experimentalmente e
aqueles calculados pelo modelo emprico do planejamento fatorial fracionrio 25-1.
Pode-se observar que, para alguns experimentos (1, 6, 8, 11 e 14), existe

uma apropriada aproximao entre os dados experimentais e tericos. Tambm
possvel concluir que o modelo capaz de capturar as principais tendncias das
observaes experimentais, com o valor do coeficiente de correlao entre o
experimental e o calculado (R
= 0,984)
bastante prximo da unidade. O
79
experimento 16 (7,5 g de amostra, 225 mL de metanol, 180 minutos de extrao a

75C) foi o que apresentou as melhores condies de extrao pelo processo de
ultra-som.
2.2 Caracterizao qumica dos extratos
A Figura 18 apresenta os cromatogramas do on total dos extratos de erva

-mate obtido por sonicao com hexano e metanol.
A Tabela XIX e a Figura 18 apresentam os principais compostos
identificados nos extratos das folhas de erva-mate com idade de poda de 18
meses, cultivadas a pleno sol, adubadas com fonte de nitrognio e a composio
qumica individual de cada extrato obtida para cada solvente, utilizando o mtodo
de extrao por ultra-som.
Os extratos das folhas de erva-mate obtidos por ultra-som apresentam em
sua composio uma mistura complexa de hidrocarbonetos, lcoois, teres,
steres, cidos carboxlicos e compostos nitrogenados (cafena, teobromina),
estando tal composio de acordo com a literatura [7].
Nos extratos de erva-mate, 25 compostos foram detectados e identificados
(por comparao dos tempos de reteno dos padres ou tentativamente
identificados com base na biblioteca Wiley NBS de espectros de massas do
equipamento) e esto listados na Tabela XIX em ordem de eluio na coluna
cromatogrfica OV-5 (metil silicone com 5% de grupos fenila). Os compostos s
foram considerados positivamente identificados quando as probabilidades de
semelhana entre os espectros de massa (comparando com o banco de
espectros da biblioteca do equipamento) foram superiores a 84%.
80
(AI S onicao
com hexano
16
28
....
N
!ia
....o.
21
ZOOM
25
16
(8) Sonicao
com metanol
....
N
::;:
o. . . . . - - - - - - - - ,
....
20
29
7
ZOOM
25
50 tempo de reteno (min.)
Figura 18: Cromatogramas do on total dos extratos obtidos por ultra-som com
hexano (A) e metanol (B), das amostras de erva-mate com idade de poda de 18
meses, cultivada a pleno sol e adubada com fonte de nitrognio. Os picos
identificados esto na Tabela XIX. As condies cromatogrficas esto descritas
na Tabela XII.
81
Tabela XIX: Principais compostos identificados nos extratos por ultra-som com
hexano e metanol, das amostras de erva-mate com idade de poda de 18 meses,
plantada a pleno sol e adubada com fonte de nitrognio.
N
Solvente
hexano metanol
compostos identificados
mdio
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
6,54
8,80
11,36
15,48
16,74
18,10
20,74
21,81
22,82
24,47
25,70
26,40
26,94
29,22
29,99
30,63
30,80
30,91
31,38
35,62
39,52
42,92
44,18
54,97
62,86
cido octanico(*)
cido nonanico(*)
cido decanico (*)
cido heptanodiico(*)
cido dodecanico (*)
cido octanodiico(*)
cido nonanodiico(*)
cafena
teobromina
cido pentadecanico{*)
cido undecanodiico(*)
cido palmitoleico (*)
cido hexadecanico(*)
cdo heptadecanico(*)
fitol (TMS-derivado)
cido linoleico(*)
cido linolnico(*)
cido olico (*)
cido esterico(*)
cido eicosanico(*)
cido docosanico(*)
esqualeno
nonacosano
estigmast-8-en-3-01
agnosterol(ter-TMS derivado)
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
frmulalMM
CllH24~Si/206
C12H260~i/220
C13H2S02Si/234
C13H2S04Si2/304
C15H3202Si/262
C14H3004Sii318
ClsH324Si2/332
CsH10N402/194
C7HsN402/100
ClsH3802/314
C17H3604Si2/360
C38H7402Si/591
C19H4Q02Si/328
C20H4202Si/342
C23H480Si /368
C21H4Q02Si/352
C21H380~i/350
C21H4202Si/354
C21H4402Si/356
C23H4802Si/384
C25Hs202Si/412
C30Hso/410
C29H60/408
C29HsoO/414
C33H560Si /496
Identificao
(*)
MS
MS
MS
MS
MS
MS
MS
PadrolMS
Padro/MS
Padro/MS
MS
padrolMS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
MS
MS
MS
padro/MS
MS
MS
padro/MS
padro/MS
padrolMS
padro/MS
probo
(%)
85
88
85
85
87
92
90
96
92
85
86
87
96
90
90
92
90
90
92
85
85
92
90
85
85
(*) identificado sob a forma de ster trimetil silil (TMS)
Cafena (8) e cido hexadecanico (13) so os compostos predominantes

dos extratos de erva-mate obtidos por ultra-som. A cafena, segundo vrios
autores, est associada com as propriedades estimulantes e diurticas das folhas
de erva-mate [29].
Comparando-se os cromatogramas da Figura 18 podemos verificar que o
cido heptanodiico, cido dodecanico, cido octanodiico, teobromina, cido
undecanodiico, cido palmitoleico, cido eicosanico, cido docosanico e
agnosterol foram identificados somente no extrato utilizando metanol.
82
Pela comparao dos extratos de erva-mate obtidos por ultra-som,

podemos verificar que o metano I apresenta uma maior capacidade extratora dos
compostos relativamente ao hexano.
Os
compostos
metilxantinas
(cafena
identificados
e
neste
teobromina),
extrato foram:
cidos
hidrocarbonetos,
carboxlicos
saturados
insaturados, steres, fitol e fitosteris (estigmasterol e agnosterol).

Em geral, a polaridade do solvente apresenta uma grande influncia no
rendimento de extrato, sendo que a alta polaridade produz maior quantidade de
extrato [88]. O planejamento fatorial 25-1 tambm mostrou que um maior tempo de
extrao aumenta o rendimento do extrato.
Pela anlise dos resultados pode-se observar que a tcnica de ultra-som
pode ser aplicada s amostras de erva-mate, como um mtodo de extrao, com
as vantagens de reduo do tempo de extrao e solvente.
3.0 CONCLUSES PARCIAIS:
Os resultados obtidos para a determinao da melhor condio de

extrao por ultra-som dos compostos orgnicos da erva-mate e da anlise
qualitativa dos extratos possibilitaram estabelecer as seguintes concluses:
As principais variveis que influenciaram o processo de extrao por ultrasom foram: tempo de extrao, polaridade do solvente e razo massa de
amostra I volume de solvente.
Maior tempo de extrao (180 minutos), maior quantidade de solvente

(225 mL) e solvente mais polar (metanol), produzem maior quantidade de
extrato nas folhas de erva-mate.
A utilizao de um planejamento experimental possibilitou a determinao

da melhor condio de extrao dos compostos orgnicos da erva-mate
utilizando a tcnica de extrao com lquido pressurizado. A condio
83
tima ocorreu com 225 mL de metanol, 7,5 9 de erva-mate, 180 minutos

de extrao a 75C.
As condies mais favorveis, entre as estudadas para a extrao por

ultra-som, so: maior quantidade de solvente, solvente polar e maior
tempo de extrao.
O metanol apresenta uma maior capacidade extratora dos compostos da

erva-mate do que o hexano.
84
CAPTULO 6:
APLICAO DA EXTRAO COM
lQUIDO PRESSURIZADO NA
ANLISE DOS COMPOSTOS
ORGNICOS DE ERVA-MATE
1.0 EXPERIMENTAL
1.1 Amostras, reagentes e solventes.
Neste captulo foram estudadas as condies da extrao por extrao com

lquido pressurizado (PLE), utilizando um planejamento estatstico
26-2
nas
amostras de folhas de erva-mate, adubadas com nitrognio, plantadas ao sol e

com idade de folha de 18 meses. Neste planejamento foram avaliadas as
seguintes variveis de extrao: tempo de extrao, polaridade do solvente,
quantidade de amostra, "flushing", nmero de ciclos e temperatura de extrao.
Como varivel de resposta, em todos os planejamentos realizados, considerou-se
a porcentagem do rendimento em massa de cada extrao e o perfil
cromatogrfico. O tratamento inicial das amostras seguiu o mesmo procedimento
indicado nos captulos anteriores, quanto secagem, moagem, classificao
granulomtrica e estocagem. De forma idntica, tambm os padres e solu>es
estoque foram preparados conforme o item 1.2 da parte experimental do captulo
4.
1.2 Extrao com lquido pressurizado (PLE) ou extrao acelerada com

solventes (ASE)
A partir deste captulo o termo ASE ser usado como sinnimo de PLE,
uma vez que o equipamento usado assim designado comercialmente. As folhas
de erva-mate foram extradas em um equipamento de ASE 300 da marca
Dionex, conforme visualizado na foto da Figura 19. Foram utilizadas clulas de
ao inoxidvel para extrao, com capacidade mxima de 100 mL e frascos
coletores de vidro com capacidade de 250 mL.
86
Figura 19: Foto ilustrativa do aparelho de Extrao Acelerada com Solventes

ASE 300
Para a otimizao do processo de extrao, foi elaborado um
planejame~to
fatorial fracionrio 26-2 que envolve as seguintes variveis:
X1 = temperatura (50 e 100C)
X2
X3 = polaridade do solvente (hexano e metanol)
=flushing (50 e 100
%)
N = massa de amostra (2,5 e 7,5 g)

Xs =tempo de extrao (10 e 30 min)
X6 = nmero de ciclos (1 e 3 ciclos)
As variveis presso e tempo esttico foram mantidas constantes em 1500

psi e 5 minutos, respectivamente.
A matriz obtida para este primeiro
planejamento, utilizando 2 nveis, mostrada na Tabela XX.
87
Como varivel de resposta, em todos os planejamentos realizados,

considerou-se a porcentagem do rendimento em massa de cada extrao e o
perfil cromatogrfico, resultando 16 experimentos.

(GC/MS)
As anlises cromatogrficas dos padres e dos extratos obtidos das

amostras de erva-mate por PLE foram analisados por GC/MS, conforme
condies analticas descritas na Tabela XII, seguindo-se o procedimento
descrito nos captulos 4 e 5.
88
A etapa inicial na extrao das amostras de erva-mate consistiu em avaliar

o efeito das variveis temperatura de extrao, "flushing", quantidade de amostra,
polaridade do solvente, tempo de extrao e nmero de ciclos sobre o
rendimento das mesmas.
A Tabela XX apresenta os resultados e as condies experimentais de um
planejamento estatstico 26-2, aplicado em dois nveis (+1 e -1) para cada varivel.
Foi considerada como varivel de resposta a porcentagem em massa (g/100g) da
extrao. Os rendimentos foram calculados como porcentagem do extrato em
relao massa da amostra utilizada na extrao.
Os resultados foram analisados utilizando o software "Statistics for
Windows" verso 6.0, e discriminando os efeitos significativos foi obtida a
seguinte equao emprica:
Nesta equao, apresentada a mdia dos coeficientes sinalizados com

asterisco, na qual o efeito apresenta diferena significativa em nvel de 5% de
confiana (p< 0,05) utilizando o teste de "Tukey". Em outras palavras, para os
parmetros assinalados, a troca do nvel baixo ao nvel alto de uma varivel
causa uma significativa variao na varivel de sada (rendimento de extrato).
Substituindo os valores tericos de Ai (i
=1 a 1O) :
y % = 7.753 + 1.030 X1 + 0.608 X2+ 6.089 X3 + 1.788 X4 - 0.841 Xs + 0.283 Xs+ 0.546 X1X4 + 2.009 X1X2 - 0.649 Xw.
Os altos valores (em negrito) apresentam uma grande influncia no

processo, sendo os coeficientes que possuem valores p < 0,05 no teste de
89
"Tukey". Os valores experimentais de porcentagem de extrato em massa (g/100g)

e os obtidos pela aplicao da equao acima (valor terico) para cada
experimento so apresentados na Tabela XX.
Tabela XX: Variveis e resultados de um planejamento fatorial fracionrio 26-2,

utilizados na extrao com lquido pressurizado.
variveis e valores
rendo em massa
(%)
X2
X1
Exp.
Xa
Xs
Xs
exp.
terico
(-)
50
(-)
50
(-)
Hex
(-)
2,483
(-)
(-)
1,1
0,70
(-)
50
(-)
50
(-)
Hex
(-)
2,589
(+) 30 (+)
1,3
0,91
(-)
50
(-)
50
(+) Met (+) 7,575
10
(-)
14,1
16,58
(-)
50
(-)
50
(+) Met (+) 7,517 (+) 30 (+)
15,9
14,21
(-)
50
(+) 100
(-)
Hex (+) 7,480
(-)
10
(+)
1,0
0,90
(-)
50
(+) 100
(-)
Hex (+) 7,661
(+) 30
(-)
0,70
0,0
(-)
50
(+) 100 (+) Met
(-)
2,627
(-)
10
(+)
11,5
1.1,98
(-)
50
(+) 100 (+) Met
(-)
2,538
(+) 30
(-)
8,1
8,44
(+) 100
(-)
50
(-)
Hex (+) 7,681
10
(+)
2,5
2,89
10
(+) 100
(-)
50
(-)
Hex (+) 7,656 (+) 30
(-)
1,5
1,91
11
(+) 100
(-)
50
(+) Met
(-)
2,541
(-)
10
(+)
12,5
11,73
12
(+) 100
(-)
50
(+) Met
(-)
2,505
(+) 30
(-)
8,2
8,17
13
(+) 100 (+) 100
(-)
Hex
(-)
2,568
(-)
10
(-)
2,9
2,98
14
(+) 100 (+) 100
(-)
Hex
(-)
2,579
(+) 30 (+)
2,4
3,13
15
(+) 100 (+) 100 (+) Met (+) 7,596
10
(-)
23,1
20,93
16
(+) 100 (+) 100 (+) Met (+) 7,587 (+) 30 (+)
17,2
18,56
(-)
(-)
(-)
10
Legenda: X 1 Temperatura (50 e 100C); X 2 Flushing (50 e 100 %); X 3 Polaridade

do solvente (hexano e metano/); X 4 massa de amostra (2,5 e 7,5 g); X 5 =tempo de
extrao (10 e 30 min) eX6 nmero de ciclos (1 e 3 ciclos)
90
A anlise da equao permitiu observar que todas as variveis

manifestaram um efeito positivo, com exceo da varivel Xs. As principais
variveis que influenciaram a tcnica por extrao com lquido pressurizado
foram X1 (temperatura de extrao), X3 (polaridade do solvente) e
(massa de
amostra). Assim, maior temperatura de extrao (100C), maior quantidade de

amostra (7,5 g) e solvente mais polar (metanol) produzem maior quantidade de
extrato das folhas de erva-mate. A varivel X3 (polaridade do solvente)
apresentou um efeito positivo mais elevado (+ 6,089 X3), isto , quanto maior a
polaridade do solvente maior ser a massa de extrato.
As variveis como volume de "f1ushing" (X2), tempo de extrao (Xs), e
nmero de ciclos (Xs) no influenciaram significativamente o processo de
extrao acelerada com solvente. A interao entre as variveis X1 e X2
manifestou efeito significativo (2,009
X1~),
indicando que elevada temperatura
de extrao e elevado volume de "f1ushing" produzem mais extrato. Portanto,

maior quantidade de amostra, maior polaridade de solvente e elevado volume de
"f1ushing" implicam um maior rendimento nos extratos de erva-mate utilizando

esta tcnica.
A influncia da temperatura no processo de ASE pode ser explicada pelo
aumento do coeficiente de difuso do solvente na amostra (matriz slida) com o
aumento da temperatura de extrao, que favorece a cintica de dessoro dos
compostos da matriz.
A Figura 20 apresenta a interao entre os dados experimentais com
aqueles propostos pelo modelo emprico. Pode-se observar que somente para os
experimentos 3, 4, 15 e 16 os valores experimentais e tericos no foram
semelhantes. Para os outros experimentos existe uma apropriada aproximao
entre os dados experimentais e tericos.
Tambm na Figura 20 possvel observar que o modelo capaz de
capturar as principais tendncias das observaes experimentais, com o valor do
coeficiente de correlao entre o experimental e o calculado
R = 0,984. O
experimento 15 (7,5 9 de amostra, 100% de "f1ushing", metanol, 10 minutos de
91
extrao a 100C e um ciclo) foi o que apresentou as melhores condies de

extrao pelo processo de extrao com lquido pressurizado.
Para efeito de comparao, o experimento 13 (2,5 9 de amostra, 100%
"f1ushing", hexano, 10 minutos de extrao a 100C e um ciclo) tambm foi
considerado, pois, esta foi a melhor condio do processo de PLE com hexano.
-25
Io
i!
-.5=
I:
ai
Experi mental
Terico
20
-=
I:
ai
ti:
15
10
~ ~
O
O
O O
O
4
10
O
12
Q
14
16
18
Condio elqJerimental
Figura 20: Comparao dos rendimentos do modelo emprico e dos valores

obtidos experimentalmente de um planejamento fatorial fracionrio
26-2
para a
extrao acelerada com solventes.
2.2 Caracterizao qumica dos extratos
A Figura 21 presenta os cromatogramas do on total dos extratos de erva mate obtidos por extrao com lquido pressurizado (PLE) utilizando hexano e
metanol como solventes. A identificao dos picos est apresentada na Tabela
XXI.
92
16
A) hexano
40
23
39
16
B) metano I
41
Figura 21: Cromatogramas do on total dos extratos obtidos por extrao com
lquido pressurizado (PLE) com hexano (A) e metanol (8), das amostras de ervamate com idade de poda de 18 meses, cultivada a pleno sol e adubada com fonte
de nitrognio. Os compostos correspondentes aos picos identificados esto
listados na Tabela XXI. As condies cromatogrficas esto descritas na Tabela
XII.
93
Tabela XXI: Principais compostos identificados nos extratos por extrao com
lquido pressurizado com hexano e metanol, nas amostras de erva-mate com
idade de poda de 18 meses, cultivada a pleno sol e adubada com fonte de
nitrognio.
W
Solvente
hexano metanol
mdio
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
6,54
7,67
8,80
11,36
14,30
16,74
18,10
20,74
21,81
22,0
23,86
24,45
24,47
25,70
26,40
26,94
28,56
29,22
29,99
30,63
30,80
30,91
31,38
33,69
35,62
36,72
39,52
40,48
40,50
42,43
42,55
42,92
43,12
44,18
45,82
45,88
47,68
47,87
48,7
54,97
62,86
cido octanico(*)
cido butanodiico(*))
cido nonanico(*)
cido decanico (*)
cido undecanico(*}
cido dodecanico (*)
cido octanodiico(*)
cido nonanodiico(*)
cafena
cido tetradecanico(*)
cido hexadecanico
cido pentadecanico(*}
cido palmitoleico (*)
cido hexadecanico(*}
fitol
cido heptadecanico(*}
fitol(ter-TMS-derivado)
cido linoleico(*)
cido linolnico(*)
cido olico (*)
cido esterico(*}
cido nonadecanico(*)
cido eicosanico(*}
pentacosano
cido docosanico(*)
heptacosanol
heptacosano
octacosanol
octacosano
esqualeno
hexadecanal
nonacosano
triacontanol
triacontano
acet estigmasta-5,22-dien-ol
untriacontano
vitamina E
estigmast-8-en-3-ol
agnosterol(TMS-derivado)
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
CllH240~i1206
Cl0H2204Si2/262
C12H2602Si/220
C13H2S02Si/234
C14H3002Si/248
C15H322Si/262
C14H3004Sii318
C15H3204Si2/332
CSH10N4021194
C17H3602/300
C17H3402/270
ClsH322/256
ClsH3802/314
ClsH3602/284
C38H740~i/591
C19H4002Si/328
C20H400 /296
C20H4202Si/342
C23H480Si /368
C21H4002Si/352
C21H380~i/350
C21H420~i/354
C21H440~i/356
C22H4602Si/370
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
frmulalMM
X
X
X
C23H480~i/384
C25H52/352
C25H5202Si/412
C27H560 /396
C27H56/380
C2sH580 / 410
C28H58/394
C30H50/410
ClsH400
C29H60/408
C30H620 /438
C30H62/422
C31H5002/454
C31H64/436
C29H5002/430
C32H560Si /528
C33H560Si /496
Identificao
(*)
MS
MS
MS
MS
MS
MS
MS
MS
Padro/MS
Padro/MS
Padro/MS
Padro/MS
MS
padrolMS
padro/MS
padrolMS
padrolMS
padrolMS
padro/MS
MS
MS
MS
padro/MS
MS
MS
padro/MS
MS
MS
padro/MS
MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
MS
Padro/MS
MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
probo
(%)
85
87
88
85
88
87
92
90
96
92
85
85
85
96
87
96
93
90
90
92
90
90
92
89
85
88
85
86
87
88
88
92
88
90
89
88
87
87
89
85
85
94
Nos extratos de erva-mate obtidos por PLE, 41 compostos foram

detectados e identificados (por comparao dos tempos de reteno dos padres
ou tentativamente identificados com base na biblioteca Wiley NBS do
equipamento) e esto listados na Tabela XXI em ordem de eluio na coluna
cromatogrfica OV-5. Foram considerados tentativamente identificados quando
as probabilidades de semelhana do espectro de massa foram superiores a 84%.
Nos extratos das folhas de erva-mate obtidos por extrao com lquido
pressurizado foram identificados cafena, hidrocarbonetos, cidos carboxlicos,
fitosteris, steres, lcoois, vitamina E, e aldedos.
Cafena (9), cido
hexadecanico (16), cido linolnico (21), cido esterico (23) e nonacosano (34)
so os maiores compostos dos extratos de erva-mate obtidos por extrao com
lquido pressurizado (PLE) utilizando hexano e metanol como solventes. Na
frao hexnica foram identificados um nmero maior de compostos em
comparao com a frao metanlica. Podemos observar que alguns compostos
so identificados simultaneamente nas duas fraes, o que indica que a extrao
destes compostos pode ser realizada com apenas um solvente.
Os resultados obtidos para a determinao da melhor condio de

extrao dos compostos orgnicos da erva-mate e da anlise qualitativa dos
extratos possibilitaram estabelecer as seguintes concluses:
As principais variveis que influenciaram a tcnica por extrao com

lquido pressurizado foram temperatura de extrao, polaridade do
solvente e massa de amostra.
As variveis como volume de "f1ushing", tempo de extrao e nmero de

ciclos no influenciaram significativamente no processo de extrao
acelerada por solvente.
95
A utilizao de elevada temperatura de extrao e elevado volume de

"flushng" produzem mais extrato das folhas de erva-mate.

tima ocorreu com metanol, 7,5 g de erva-mate, 100% de "flushing", 10
minutos de extrao a 100C e 1 ciclo.
Apesar da frao metanlica apresentar um maior rendimento, esta exibe

um menor nmero de compostos, mas com massa molecular mais elevada
do que os compostos da frao hexnica.
Nos extratos de erva-mate obtidos por PLE, 41 compostos foram

detectados e identificados. Entre eles podemos citar a cafena, fitol,
hidrocarbonetos, cidos carboxlicos, fitosteris, steres, lcoois, vitamina
E, e aldedos.
Cafena, cido hexadecanico, cido linolnico, cido esterico e

nonacosano so os compostos majoritrios dos extratos de erva-mate
obtidos por extrao com lquido pressurizado (PLE) utilizando hexano e
metanol como solventes.
96
CAPTULO 7:
COMPARAO DE TCNICAS DE
EXTRAO DE COMPOSTOS
ORGNICOS DA ERVA -MATE
USANDO SOLVENTES ORGNICOS
1.0 EXPERIMENTAL
Neste captulo foram comparados os mtodos de extrao utilizando

solventes orgnicos (ultra-som e extrao com lquido pressurizado), na condio
tima de extrao, com o mtodo clssico de macerao. Foram utilizadas
amostras de erva-mate, adubada com nitrognio, plantada ao sol e com idade de
poda da folha de 18 meses. O tratamento inicial das amostras seguiu o mesmo
procedimento indicado nos captulos anteriores, quanto secagem, moagem,
classificao granulomtrica e estocagem. De forma idntica, tambm os padres
e solues estoque foram preparados conforme o item 1.2 da parte experimental
do captulo 4.
1.1 Amostras, reagentes e solventes
O tratamento das amostras e a escolha dos solventes e reagentes

seguiram o mesmo mtodo descrito nos captulos anteriores.
1.2 Tcnicas de extrao utilizadas
Alm das tcnicas j discutidas e desenvolvidas nos captulos anteriores

(extrao por ultra-som e extrao com lquido pressurizado) foi tambm
aplicado, para fins de comparao, o mtodo clssico de extrao por
macerao.
98
1.2.1 Procedimento para a extrao por macerao
Cerca de 7,5 g de amostra foram colocados em um erlenmeyer de 500

mL, conforme esquema da Figura 22. A extrao foi realizada utilizando 225 mL
dos seguintes solventes orgnicos: hexano, tolueno, diclorometano, acetato de
etila, acetona e metanol (razo massa/solvente 1:30). Solvente e amostra
permaneceram misturados por um perodo de 10 dias, com agitao ocasional. O
mesmo procedimento foi repetido para os outros solventes, utilizando uma nova
amostra. Aps uma filtragem, os filtrados foram concentrados em evaporador
rotatrio, secos sob N2 e guardados ao abrigo da luz e calor.
..
Condensador. ar
Figura 22 - Desenho esquemtico do equipamento usado para macerao.
1.2.2 Procedimento para a extrao por ultra-som
Para a comparao de mtodos, a extrao dos compostos ativos das

folhas de erva-mate foi realizada na melhor condio de extrao estudada no
Captulo 5 (7,5 g de amostra, 225 mL de solvente, 180 minutos de extrao a
99
75C). O extrato foi recuperado por filtrao em papel filtro Whatman 1PS. Os
solventes foram usados na mesma ordem de polaridade do processo de
macerao: hexano, tolueno, diclorometano, acetato de etila, acetona e metano!.
Aps a extrao com um solvente, uma nova amostra de erva-mate foi extrada
com o solvente seguinte, e assim sucessivamente. Estes extratos foram secos
sob N2, pesados e guardados ao abrigo da luz e calor.
1.2.3 Procedimento para a extrao com lquido pressurizado
Para a extrao dos compostos ativos, as folhas de erva-mate foram

extradas na melhor condio de extrao estudada no Captulo 6 (7,5 g de
amostra, 100% de "flushing", 10 minutos de extrao a 100C e 1 ciclo). O
extrato foi recuperado por filtrao em papel filtro Whatman 1PS. Os solventes
foram usados pela ordem de polaridade: hexano, tolueno, diclorometano, acetato
de etila, acetona e metano!. Aps a extrao com um solvente, uma nova
amostra de erva-mate foi
extrada com
o solvente seguinte e assim
sucessivamente. Estes extratos foram secos sob N2, pesados e guardados ao

abrigo da luz e calor.
1.3 Anlise cromatogrfica dos extratos (GC/MS).
A anlise cromatogrfica dos extratos obtidos na extrao das amostras

de erva-mate foi realizada por GC/MS, conforme condies analticas descritas
na Tabela XII, e seguindo o procedimento descrito nos Captulos 5 e 6.
A identificao e quantificao dos compostos seguiram o procedimento
experimental descrito no captulo 4, item 1.5, pgina 55.
100
2.1 Anlise do rendimento dos extratos de erva-mate
Os resultados obtidos nas extraes por macerao, ultra-som e extrao

acelerada por solvente dos extratos das folhas de erva-mate com hexano,
tOlueno, diclorometano, acetato de etila, acetona e metanol expressos em g/100g
so apresentados na Tabela XXII. O teor de umidade de cada amostra foi
calculado e apresentou um valor mdio de 6%.
Tabela XXII - Rendimento das extraes por macerao, ultra-som e extrao

acelerada por solvente, obtido para as amostras de erva-mate, expresso em
gramas de (extrato) por 100 g de amostra.
solventes- extrato (g/1 00 g)

mtodo
hexano
macerao 2,40O,05
tolueno
diclorometano acetato de etila
acetona
metanol
1,90O,04
2,50O,10
1,80O,06
7,3O,14
14,3O,14.
ASE
2,90O,08
4,20O,07
2,10O,04
1,30O,05
3,20O,08
23,1 O,2
US
1,35O,07
4,40O,1
1,90O,09
2,30O,1
3,OO,08
14,4O,2
A Tabela XXIII apresenta os resultados da anlise estatstica dos efeitos
das tcnicas de extrao e do tipo de solvente utilizado sobre o rendimento de

extrato das folhas de erva-mate. Os valores apresentados nesta tabela so a
mdia dos valores do rendimento do extrato para cada condio. Letras iguais
entre dois nveis da mdia de um fator no tem diferena significativa a 5% (teste
de Tukey).
Pode-se verificar nesta Tabela que os trs mtodos de extrao
estudados apresentam diferena significativa (p < 0,05), sendo que o mtodo de
extrao com lquido pressurizado exibiu maior rendimento. A alta presso e
temperatura de 100C utilizados no processo de extrao favoreceram a
penetrao do solvente dentro da matriz, aumentando a transferncia de massa,
e, conseqentemente, melhorando a extrao. A tcnica de extrao com lquido
101
pressurizado tem a vantagem de reduzir o tempo de extrao, a diminuio do

descarte de solventes e vrias amostras podem ser extradas ao mesmo tempo.
Tabela XXIII: Anlise estatstica (ANOVA com teste de Tukey a 5%). Efeito das
tcnicas de extrao e o tipo de solvente considerado sobre o rendimento de
extrato das folhas de erva-mate.
extrato (g/100g)
mtodo de extrao
solventes
macerao
US
PLE
hexano
tolueno
diclorometano
acetato
de etila
acetona
metanol
5,Ob
4,6c
6,2a
2,2d
3,5c
2,2d
1,8d
4,5b
17,3a
Os extratos obtidos por ultra-som por 180 minutos so comparveis

aqueles realizados pelo mtodo de extrao por macerao por 10 dias. A
eficincia da extrao utilizando-se a tcnica de ultra-som comparvel a obtida
por macerao e tem ainda como vantagens a possibilidade de utilizao de
vrios tamanhos de amostra, a rapidez de processamento da amostra e o baixo
custo.
Quanto aos solventes utilizados, podemos constatar que os solventes
hexano,
diclorometano e acetato
de etila
no apresentaram diferena
significativa, ou seja, os trs solventes exibiram praticamente o mesmo

rendimento. Entre os solventes utilizados, o que apresentou maior rendimento foi
o metanol, resultado devido maior polaridade deste solvente [88].
2.2 Anlise dos extratos de erva-mate por GC/MS
2.2.1 Extrao por macerao
A Figura 23 apresenta os cromatogramas das fraes de hexano, tOlueno,

diclorometano, acetato de etila, acetona e metanol, dos extratos obtidos por
macerao das folhas de erva-mate. A Tabela XXIV apresenta os principais
compostos identificados nos extratos obtidos por macerao.
102
lln
16
A) Hexano
30.5 31
"'1'------'
&
39
B) TOIueno
8
32
39
Dl Acetato de etila
E)_na
FI Metanol
16
Figura 23: Cromatogramas do on total dos extratos das folhas de erva-mate

obtidos por macerao com hexano (A), tolueno (8), diclorometano (C), acetato
de etila (O), acetona (E) e metano I (F). As condies cromatogrficas esto
descritas na Tabela XII. Os picos detectados ou tentativamente identificados
esto na Tabela XXV.
103
Tabela XXIV: Principais compostos identificados nos extratos obtidos por

macerao com hexano(H), tolueno(T), diclorometano(D), acetato de etila (AE),
acetona (A) e metanol(M) nas amostras de erva-mate com idade de poda de 18
meses, cultivada a pleno sol e adubada com fonte de nitrognio.
W
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
1R
mdio
6,54
8,80
11,36
14,3
16,74
18,10
20,74
21,81
22,00
22,82
23,22
23,86
24,47
24,87
26,40
26,94
28,56
29,22
29,99
30,25
30,63
30,80
30,91
31,38
33,69
35,62
36,72
39,52
40,50
42,43
42,55
42,92
43,02
44,18
45,82
45,88
47,87
48,7
54,15
H T O AE A M
cido octanico (*)

cido nonanico (*)
cido decanico(*}
cido undecanico(*)
cido dodecanico (*)
cido octanodiico (*)
cido nonanodiico(*)
cafena
teobromina
pentadecanoato de etila
cido hexadecanico
cido palmitoleico(*)
fitol
fitol (ter-TMS derivado)
docosano
cido lnoleico (*)
cido linolnico(*)
cido oleico(*)
cido esterico(*)
cido eicosanico(*)
pentacosano
cido docosanico
heptacosano
octacosanol
octacosano
esqualeno
estigmast-5-en-3-ol
nonacosano
triacontanol
triacontano
untriacontano
vitamina E
estigmat-5-en-3-ol (3-beta)
X X X X
X X X X
X X X X
X
X X X X
X X
X
X X X X
X X X X
X
X
X
X
X X X
X X
X
X X
X X X X
X
X X X X
X X X X
X
X X X X
X X X X
X X X X
X X X X
X
X X X X
X X X
X
X
X X X
X
X
X X X X
X
X
X
X
X
X X
X X
X
X
X X
X
X
X X
X
X X
X
X X X X X
X
X
X X X
X
X X X
Identificao
(*)
MS
MS
MS
MS
MS
MS
MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
MS
padro/MS
MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
MS
MS
MS
padro/MS
MS
MS
padro/MS
MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
probo
(%)
85
88
85
88
87
92
90
96
92
90
89
88
85
89
87
96
93
90
90
88
92
90
90
92
89
85
88
85
87
88
88
92
85
90
89
88
87
89
85
104
Como pode ser observado nos cromatogramas da Figura 23, os extratos

de hexano, tolueno, diclorometano, acetato de etila, acetona e metanol
permitiram a identificao dos principais compostos extrados das amostras de
erva-mate.
Pelo
mtodo
de
extrao
por macerao foram
tentativamente
identificados 39 compostos, como metilxantinas, cidos graxos, steres, lcoois,

fitoesteris e hidrocarbonetos. Pode-se destacar a cafena, teobromina, fitol,
esqualeno, cido palmtico, esqualeno, vitamina E e fitoesteris caractersticos
desse tipo de amostra [27,28], sendo a cafena, o cido palmtico (cido
hexadecanico) e o esqualeno os compostos majoritrios. Comparando-se esses
cromatogramas, constata-se que a cafena, cido hexadecanico, cido esterico
e o esqualeno so identificados em todos os extratos, no se podendo diferenciar
os solventes extratores, segundo a eficincia de extrao. Tambm podemos
observar que alguns compostos foram identificados em uma nica frao, como
o caso do cido undecanico, cido tetradecanico, pentadecanoato de metila,
docosano, cido nonadecanico, octacosanol, estigmast-5-en-3-01 e vitamina E,
devido maior seletividade destes compostos relativamente ao solvente extrator.
2.2.2 Extrao por ultra-som
A Figura 24 apresenta os cromatogramas das fraes de hexano, tolueno,

diclorometano, acetato de etila, acetona e metanol, dos extratos obtidos por ultrasom das folhas de erva-mate.
A Tabela XXV apresenta os principais compostos identificados nestes

extratos, o tempo de reteno mdio dos compostos e o mtodo de identificao
utilizado.
105
11
A)
22
H_no
13
'I.
..&
~Wl
2.
~13D
3S
3&
37
22
D) _ _ _
"
11
22
'I.
F)_noI
Figura 24: Cromatogramas do on total dos extratos obtidos por extrao com
ultra-som com hexano (A) tolueno (8), diclorometano (C), acetato de etila (D),
acetona (E), metanol (F) das amostras de erva-mate com idade de poda de 18
meses, cultivada a pleno sol e adubada com fonte de nitrognio. Os picos
identificados esto na Tabela XXV. As condies cromatogrficas esto
descritas na Tabela XII.
106
Tabela XXV: Principais compostos identificados nos extratos obtidos por extrao com
ultra-som com hexano(H), tolueno(T), diclorometano(D), acetato de etila (AE), acetona (A)
e metanol(M) nas amostras de erva-mate com idade de poda de 18 meses, cultivada a
pleno sol e adubada com fonte de nitrognio.
N
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
mdio
6,54
6,99
7,67
8,80
11,36
14,3
15,48
16,74
18,10
20,74
21,81
22,82
23,86
24,11
24,45
24,47
24,87
25,55
25,57
25,70
26,40
26,94
28,56
29,22
29,25
29,99
30,63
30,80
30,91
31,38
33,69
35,62
39,52
42,92
44,18
48,7
54,15
62,89
cido octanico (*)

glicerol(*)
cido butanodiico(*)
cido nonanico (*)
cido decanico(*)
cido undecanico(*)
cido heptanodiico(*)
cido dodecanico (*)
cido nonanodiico(*)
cafena
teobromina
linoleato de etila
gama-delactona
cido hexadecanico
eicosano
cido undecanodiico(*)
fitol
cido cafeico(*)
fitol (*)
cido linoleico(*)
cido linolnico(*)
cido oleico
cido esterico(*)
cido eicosanico(*)
cido docosanico(*)
esqualeno
- nonacosano
vitamina E
estigmaterol (ter-TMS)
agnosterol (ter -TMS)
T D AE A M
X X
X X
X X
X
X
X X
X
X
X X X
X X X X
X X X X X
X X X X X
X
X
X
X
X
X
X
X
X X
X
X X
X
X
X
X
X
X X
X X X X X X
X
X
X X X
X
X X
X X X X X X
X X X X X X
X X X X X X
X X X X X X
X X X X X X
X
X
X
X
X
X X
X
X
X
X
X X
X X X X X X
X
Identificao
(*)
MS
MS
MS
MS
MS
MS
MS
MS
MS
MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
MS
padro/MS
MS
padro/MS
MS
MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
MS
padro/MS
MS
MS
padro/MS
padro/MS
MS
MS
MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
probo
(%)
85
89
89
88
85
88
87
87
90
90
96
90
88
89
91
87
89
87
89
88
88
96
93
90
88
93
92
90
90
92
87
85
85
92
90
89
85
85
107
Analisando os cromatogramas da Figura 24, podemos observar que as

fraes de hexano, tOlueno, diclorometano, acetato de etila, acetona e metanol
permitiram a identificao dos principais compostos extrados das folhas de ervamate. Na tcnica de extrao por ultra-som foram identificados praticamente os
mesmos compostos presentes nos extratos obtidos por macerao. Alm destes
compostos, podemos destacar o cido cafeico, que um cido fenlico
conhecido
como
cido
clorognico,
com
propriedades
antioxidantes
anticarcinognicas [40,172]. Tambm foram tentativamente identificados os

compostos glicerol, linoleato de etila e gama-delactona.
2.2.3 Extrao com lquido pressurizado
A Figura 25 apresenta os cromatogramas das fraes de hexano, tOlueno,

diclorometano, acetato de etila, acetona e metanol, dos extratos obtidos por
extrao com lquido pressurizado. A Tabela XXVI apresenta a identificao
destes compostos.
No presente estudo, os extratos obtidos por PLE apresentaram em sua
composio metilxantinas, hidrocarbonetos, lcoois, steres, cidos graxos,
vitamina E e fitoesteris, caractersticos das folhas de erva-mate como
apresentado nos captulos anteriores. Como pode ser observado na Figura 25,
nos extratos obtidos por extrao com lquido pressurizado, foi tentativamente
identificado um maior nmero de compostos comparados aos mtodos de
extrao por macerao e ultra-som.
108
20
31
A)He.....o
B)Tolueno
C) DicIOl'"ornetano
48
O) Acetato de etia.
49
9
E)
Acetona
F)
48
7
Metenol
49
Figura 25: Cromatogramas do on total dos extratos das folhas de erva-mate

obtidos por extrao com lquido pressurizado (PLE) com hexano (A), tolueno (8),
diclorometano (C), acetato de etila (O), acetona (E) e metanol (F). As condies
cromatogrficas esto descritas na Tabela XII. Os picos identificados esto na
Tabela XXVI.
109
Tabela XXVI: Principais compostos identificados nos extratos obtidos por

extrao com lquido pressurizado com hexano (H), tolueno(T), diclorometano(D),
acetato de etila (AE), acetona (A) e metanol(M) nas amostras de erva-mate com
idade de poda de 18 meses, cultivada a pleno sol e adubada com fonte de
nitrognio.
W
1R
mdio
6,54
7,67
8,80
11,36
14,3
16,74
18,10
20,74
21,81
22,0
22,82
23,86
24,44
24,45
24,47
24,87
25,55
25,57
26,40
26,94
27,98
28,15
20,28
28,56
28,78
29,22
29,99
30,63
30,80
30,91
31,38
33,69
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33 34,58
34 35,62
35 36,72
36 39,52
37 40,48
38 40,50
39 42,43
40 42,55
AE A
X
X
X
X
X
X
X X
X
X
X X X X
X X X X
X X X X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
H T O
cido octanico (*)

cido butanodiico(*)
cido nonanico (*)
cido decanico(*)
cido undecanico(*)
cido dodecanico (*)
cido nonanodiico(*)
cafena
teobromina
lso-fitol
gama-delactona
cido hexadecanico
eicosano
Iinoleato de metila
linolenato de meti la
oleato de metila
fitol
estearato de metila
fitol (ter-TMS derivado)
cido linoleico(*)
cido Iinolnico(*)
cido oleico(*)
cido esterico(*)
tetracosanol
cido eicosanico(*)
pentacosano
cido docosanico
heptacosanol
heptacosano
octacosanol
octacosano
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X X X X X
X X
X
X X
X
X
X X
X X X
X X X
X X X X X X
X
X
X X
X
X X
X
X X
X X
X X
X
X X
X
X X X X
X
X X X
X
X X X
X
X X
X
X X
X
X X
X X X X
X
X
X X X X
X X
X X
Identificao
(*)
MS
MS
MS
MS
MS
MS
MS
MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
MS
padro/MS
MS
padro/MS
MS
padro/MS
MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
padro/MS
MS
MS
padro/MS
padro/MS
MS
padro/MS
MS
padro/MS
MS
MS
padro/MS
MS
padro/MS
probo
(%)
85
89
88
85
88
87
90
90
96
90
90
88
89
91
87
89
87
89
88
96
89
90
90
93
90
90
93
92
90
90
92
87
86
85
88
85
87
88
87
89
110

Continuao da Tabela XXVI.
N
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
(*)
H T O AE A M
mdio
X X
42,92 esqualeno
43,02 estigmast-5-en-ol
44,18 nonacosano
X X
45,82 triacontanol
X X
45,88 triacontano
X X
47,69 estigmasta-5,22-dien-ol acetato X X
47,87 untriaconatano
X X
48,7 vitamina E
X X X
54,15 estigmast-5-em-ol (3-beta)
X X
62,89 agnosterol (ter-TMS)(*)
compostos identificados como derivados TMS
X
X
X
X X
X
X
Identificao
(*)
padro/MS
padrolMS
padro/MS
MS
padro/MS
padro/MS
padrolMS
padro/MS
padrolMS
padrolMS
probo
(%)
92
85
90
88
89
85
88
89
86
87
2.2.4. Anlise quantitativa comparativa dos extratos de erva-mate
A Tabela XXVII apresenta as concentraes dos compostos quantificados
nos extratos das folhas de erva-mate utilizando as tcnicas de extrao por

macerao, ultra-som e extrao com lquido pressurizado expressos em mg/kg,
em base seca, calculadas usando-se como padro interno a bifenila.
A Tabela XXVIII apresenta os resultados da anlise estatstica dos
efeitos das tcnicas de extrao e da polaridade dos solventes utilizados na

concentrao dos compostos das folhas de erva-mate. Os valores apresentados
nesta tabela so a mdia dos valores das concentraes dos compostos para
cada condio. Letras iguais entre dois nveis da mdia de um fator, no tem
diferena significativa a 5% (teste de Tukey). Analisando a Tabela XXVIII podese observar que as tcnicas de extrao utilizadas apresentaram diferena
significativa (p < 0,05) sobre a concentrao dos compostos analisados.
111
Tabela XXVII: Concentrao dos compostos quantificados nos extratos obtidos

nas diferentes tcnicas de extrao (macerao, ultra-som e extrao com lquido
pressurizado) das folhas de erva-mate com idade de poda de 18 meses, cultivada
a pleno sol e adubada com fonte de nitrognio, expressos em mg/kg.
composto
hexano
mglkg desvio ~adro (*)

extrao por macerao
diclorometano acetato de etila
tolueno
458,8 15,5
cafena
cido palmtico. 228,1 10,5
2,1 O,14
fitol
2,0 O,1
cido esterico
1157,4 40,1
esqualeno
131,3 6,5
vitamina E
4271,9 95
216,8 8,7
4,4 0,3
0,07 O,O01
121,85,5
280,4 13
2977,9 45
114,5 5,5
2,1 0,2
5,2 0,7
33,6 1,9
115,5 4,O
acetona
metanol
1047,6 32,4 2786,7 76 950,2 23,5

45,1 2,3
29,5 O,8
13,4 O,6
1,4 0,1
1,9 0,08 0,35 0,01
O,5O,05
0,8 O,07 O,05O,O01
104,3 4,4 389,1 10,0 309,9 10,5
111,9 4,5 83,1 3,O
57,4 2,O
extrao por ultra-som

cafena
cido palmitico.
fitol
cido esterico
esqualeno
vitamina E
574,9 25
256,4 10,1
3,4O,3
9,9O,3
841,3 24,8
279,3 16,3
3878,586,5 4184,1 65,3 1057,811,9 932,6 16,6

31,8 2,3
8,9 0,4
4,4 O,2
137,2 5,O
ND
0,33 0,01
0,34O,01
2,5 0,07
ND
0,34 0,07
15,8 O,5
2,3 0,14
520,6 14
60,1 2,8
893,2 15,1 1416,3 50,9
27,8 1,3
514,38,3
366 7,7
120,3 6,6
568,3 17,8
12,5 O,3
0,035 0,001
O,05O,O01
151 7,0
55,0 1,4
extrao com liquido pressurizado
1895,2 55
cafena
744,3
20,1
cido palmtico.
4,7 O,2
fitol
7,30,4
cido esterico
1187,5 83,1
esqualeno
76,1 1,2
vitamina E
ND NO DETECTADO
1040,4 45 4724,685 848,9 36

473,8 17,5 42,9 1,8
34,3 1,0
11,21,O
1,3 0,2
O,44O,O
8,3 0,08
O,9O,05
1,4O,1
313,4
5,7 .
105,8 6,5
389,1 10
27 1,6
91,82,9
90,9 1,6
(*) Os resultados referem-se mdia de trs determinaes
6358,580
52,33,1
0,84 O,O8
0,4 O,02
120,2 3,2
64,3 1,8
4805,2 65
13,2 O,5
1,2 O,14
0,37 O,01
34,2 2,O
6,85O,5
Tabela XXVIII: Anlise estatstica (ANOVA com teste de Tukey a 5%) referente
concentrao dos compostos das folhas de erva-mate com idade de poda de 18
meses, cultivada a pleno sol e adubada com fonte de nitrognio (mg/kg de
amostra) obtidos por macerao, ultra-som e extrao com lquido pressurizado.
mglkg de erva-mate (base seca)
tcnica
composto macerao
cafena
cido
palmtico
fitol
cido
esterico
esqualeno
vitamina E
2082,2b
107,9b
2,Ob
1,4c
352,7b
129,9b
US
solventes
ASE
1866c 3278,88
75,~
226,88
1,1 c
4,78
3,38
4,88
647,1B 358,4b
227,1 8 59,5c
hexano tolueno diclorometano
976,;3e 4836,38
409,68 135,4c
3,4b
9,78
1,gc
0,;3e
1062,1B 378,4c
162,2b 286,38
3989,1 b
53,2d
acetato
de etila
acetona metanol
1048,6d 2814,6c 789,1f

170,7b
3O,ae
20Y
1,;2e
7,1 b
4,28
3,OC
1,gc
1,3d
0,27f
0,5e
494,7b
162,8b
243,6d
68,21
279,5d
77,1d
258,1 d
76,3e
112
Atravs da anlise quantitativa dos extratos da erva-mate, pode-se

observar que as concentraes de cafena, cido palmtico e fitol apresentaram
maiores valores utilizando-se como tcnica a extrao com lquido pressurizado.
Tambm se observa na Tabela XXII que os extratos brutos obtidos por esta
tcnica de extrao apresentaram maior rendimento.
Analisando a Tabela XXVII pode-se verificar que a polaridade do solvente
extrator influencia na concentrao dos compostos estudados. Para obter
maiores concentraes de cafena devemos utilizar como solvente o tolueno. O
hexano eficiente na extrao do cido hexadecanico, cido esterico e
esqualeno. Na extrao por fludo supercrtico, utilizando-se o dixido de carbono
como solvente, foram extradas maiores quantidades de esqualeno (Tabela XVI,
Captulo 4). Como este composto mais apoiar, o mesmo ser mais
eficientemente extrado em compostos apoiares. O fitol extrado mais
eficientemente no solvente acetona.
Dawidowicz e Dorota [85] compararam as tcnicas de extrao por
macerao, extrao assistida por microondas, disperso da matriz em fase
slida, ultra-som e extrao com lquido pressurizado para extrao e isolamento
de cafena em amostras de ch e caf. Os resultados obtidos por estes autores
revelaram que o mtodo de extrao acelerada por solvente mais efetivo na
extrao de cafena do que os outros mtodos utilizados. A temperatura e a
presso so fatores importantes na extrao da cafena, e aps 10 minutos de
extrao o efeito do tempo insignificante no processo. Em outro trabalho, os
mesmos autores mostraram que a quantidade total de cafena em amostras de
caf e ch extrada no primeiro ciclo. A condio de extrao utilizada por estes
pesquisadores foi de 100C, 60 bar e de 10 minutos de extrao[86]. A tcnica
de PLE foi menos eficiente para a extrao da vitamina E (talvez pela sua
possvel degradao nesta temperatura) e do esqualeno.
Delgado-Zamarreiio [90] e colaboradores utilizaram a tcnica de extrao
com lquido pressurizado para a extrao de vitamina E de girassol, utilizando
temperaturas mais baixas (50C), acetonitrila como solvente extrator, 10 minutos
de extrao e 2 ciclos. Foram obtidas recuperaes entre 82 e 110 % do analito.
113
A comparao das tcnicas de extrao utilizando solventes orgnicos na

extrao das folhas de erva-mate permitiu concluir que:
A extrao acelerada por solventes possibilitou a identificao de um maior

nmero de compostos, comparados com as tcnicas de ultra-som e
macerao. Esta tcnica tambm apresentou o maior rendimento de extrato.
Na extrao com ultra-som utilizando como solvente extrator o acetato de etila

e acetona foi identificado o cido cafeico, que um cido clorognico que
apresenta propriedades antioxidantes e anticarcinognicas.
Na extrao com lquido pressurizado utilizando como solvente extrator o

diclorometano foram identificados os steres oleato de metila, linoleato de
meti la, linolenato de metila e estearato de metila.
As concentraes de cafena, cido palmtico e fitol apresentaram maiores

valores utilizando-se a extrao com lquido pressurizado.
A polaridade do solvente extrator influencia na concentrao dos compostos

estudados.
114
CAPTULO 8:
CONCLUSES
CONCLUSOES GERAIS
Considerando que a erva-mate uma matriz complexa, as tcnicas de

extrao estudadas mostraram-se eficientes para a extrao, separao e
caracterizao das amostras.
A composio qumica dos extratos mostrou-se dependente das variveis
agronmicas, da polaridade do solvente e da tcnica de extrao utilizada.
CONCLUSOES ESPECFICAS
Quanto extrao por fluido supercrtico (5FEJ:
As variveis temperatura e presso exercem efeito pronunciado sobre a

quantidade de extrato produzido. Presses maiores (250atm) levam a
maiores rendimentos, uma vez que a elevao da presso (aumento da
densidade) incrementa o poder de solubilizao do solvente.
Foi observado um maior rendimento de extrato das folhas de erva-mate na

presso de 250 atm e 40C.
O fracionamento dos extratos obtido por SFE permitiu a identificao de 51

compostos presentes nas folhas de erva-mate.
Quanto extrao com ultra-som:

utilizando a tcnica de ultra-som. A condio tima ocorreu com metano I,
180 minutos de extrao, a 75C e usando-se 7,5 g de amostra em 225
mL de solvente.
As condies mais favorveis, entre as estudadas para a extrao por

ultra-som, so: maior quantidade de solvente, solvente polar e maior
tempo de extrao.
116
uma tcnica rpida, bastante reprodutiva, fcil de ser operada e barata.
Quanto extrao com lquido pressurizado (PLE):

tima ocorreu com metanol, 7,5 g de erva-mate, 100% de "flushing", 10
minutos de extrao a 100C e 1 ciclo.
Temperatura, presso e massa de amostra so variveis que afetam o

processo da extrao.
Apesar da frao metanlica apresentar um maior rendimento, esta exibe

um menor nmero de compostos, mas com massa molecular mais elevada
do que os compostos da frao hexnica.
A PLE uma tcnica rpida, bastante reprodutiva, fcil de ser operada,
totalmente automatizada e no requer filtrao.
Quanto comparao entre os mtodos de extrao usando solventes

orgnicos:
O mtodo de extrao com lquido pressurizado apresentou maior

rendimento, especialmente quando se utiliza o solvente mais polar, no
caso o metano!.
A extrao acelerada por solventes possibilitou a identificao de um

maior nmero de compostos, comparados com as tcnicas de ultra-som e
macerao.
As concentraes de cafena, cido palmtico e fitol apresentaram maiores

valores utilizando-se a extrao com lquido pressurizado.
A eficincia da extrao utilizando-se a tcnica de ultra-som comparvel
obtida por macerao e tem ainda como vantagens a alta

reprodutibilidade, a possibilidade de utilizao de vrios tamanhos de
amostra, a rapidez de processamento da amostra e o baixo custo.
117
Quanto s tcnicas analticas utilizadas:
A cromatografia lquida preparativa serviu como um fracionamento do

extrato, permitindo um melhor isolamento dos compostos de interesse.
A cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massas

mostrou-se eficiente para anlise orgnica dos extratos das folhas de ervamate,
independente do
mtodo de extrao,
especialmente
pela
possibilidade de utilizar os modos SCAN e SIM na identificao e

quantificao dos mesmos.
A espectrometria de absoro atmica (FAAS) permitiu determinar com

segurana a composio mineral das amostras estudadas.
Quanto composio qumica das amostras:
As folhas de erva-mate apresentaram altas quantidades dos metais K, Ca,

Mn e Mg estando de acordo com os nveis encontrados para as plantas.
A constituio orgnica da erva-mate (I/ex paraguariensis) apresentou-se

muito diversificada. Nas folhas de erva-mate foram identificadas' as
metilxantinas (cafena e teobromina), steres, cidos orgnicos, lcoois,
hidrocarbonetos, vitamina E, aldedos e fitosteris.
Quanto importncia dos compostos identificados:
Entre os compostos identificados foram encontradas substncias de

elevado
valor
agregado
tais
como:
cafena
(responsvel
pelas
propriedades estimulantes da erva-mate), fitosteris (reconhecidos pelas

suas caractersticas antioxidantes),
vitamina E (com reconhecidas
propriedades medicinais e utilizada pela indstria alimentcia, nos leos

comestveis, contra a peroxidao lipdica), cido cafeico (antioxidante e
anticarcinognico)
esqualeno
(bactericida
natural,
empregado
amplamente na indstria comstica, na fabricao de cremes e emulses).
118
Quanto s variveis agronmicas investigadas:
Em relao a intensidade de luz , observou-se que plantas a pleno sol

produzem maior quantidade de extratos orgnicos do que plantas
sombreadas, utilizando a tcnica de SFE.
A idade de poda das folhas tambm afeta notadamente o rendimento da

extrao. At os 18 meses, o acrscimo na idade de poda proporciona um
aumento significativo no rendimento da extrao. Aps os 18 meses a
quantidade de compostos volteis passveis de extrao diminui
consideravelmente,
chegando
aos
24
meses
com
rendimentos
semelhantes aos das plantas de 6 meses de idade de poda.
Quando as plantas so adubadas somente com fontes de nitrognio,

obtm-se maiores rendimentos em massa de extrato quando comparados
com plantas sem adubao. O mesmo efeito acontece quando se aduba
as plantas com fonte de potssio (cloreto de potssio). Quando as plantas
so adubadas simultaneamente com fontes de nitrognio e potssio, o
rendimento da extrao no apresenta mudanas significativas em relao
aquele obtido a partir de plantas no adubadas.
Analisando a influncia da idade de poda das folhas de erva-mate, podese observar que o teor de minerais mais alto em folhas jovens. Plantas
cultivadas em reas sombreadas apresentam maior quantidade de
nutrientes do que aquelas plantadas ao sol. O metabolismo da planta de
erva-mate fortemente influenciado pelas condies agronmicas de
plantio, que se reflete diretamente na composio mineral das folhas. As
variveis agronmicas que mais influenciaram foram a idade de poda das
folhas e a intensidade de luz.
A partir dos resultados alcanados pode-se concluir que a intensidade de

luz tem um efeito negativo sobre a concentrao da cafena, fitol, cido
hexadecanico e vitamina E. A concentrao do esqualeno aumentada
sob intensidade de luz, ou seja, em plantas cultivadas a pleno sol.
119
CAPITULO 9:
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
[1] INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATSTICA - IBGE, CO

ROM Censo Agropecurio, N 22, RS, 1995-1996.
[2] INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATSTICA - IBGE, CO
ROM Censo Agropecurio, N23, 1997-2000.
[3] Mosele, S.H. A governaa na cadeia agroindustrial da erva-mate na regio do
Alto Uruguai Rio-Grandense.Tese de Mestrado em Administrao, Porto

Alegre, Ed. UFRGS, 2002.
[4] Gosmann, G. Saponinas de I/ex paraguariensis de St. Hil. Tese de Mestrado
em Farmcia. Porto Alegre, Universidade Federal do Rio Grande do Sul,
1989,108p.
[5] Simes, C.M.O., Spitzer, V., In Farmacognosia: da Planta ao Medicamento -
leos Volteis; Ed. Universidade/UFRGS/Ed. da UFSC, Porto Alegre, RS/

Florianpolis/SC, 1999, p 733-749.
[6] Gilberti, G.C. Dominguezia., 1989, v.7, n01, p.1-22
[7] Valduga, E. Caracterizao Estrutural e Qumica da Erva-mate (I/ex
paraguariensis St. HiI.) e de Espcies Utilizadas na Adulterao, Dissertao

de Mestrado, Universidade Federal do Paran, UFPR, Curitiba, PR, Brasil,
1994, 119 p.
[8] Zampier, A. C. Avaliao de Nveis de Nutrientes, Cafena, e Taninos em
Erva-mate
(I/ex
paraguariensis
St.
HiI.)
Dissertao
de
Mestrado,
Universidade Federal do Paran, UFPR, Curitiba, PR, Brasil, 2001

[9]
Carvalho,
P.
silviculturais,
E.
Espcies
R.
potencialidades
florestais
e
uso
brasileiras:
da
recomendaes
madeira.
Curitiba:
EMBRAPAlCNPFlorestas, 1994.
[10] Gilberti, G.C. Darwiniana, 1979, v.22 n01-3, p. 217-240.
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Phytochemistry, 1996, v.42, n04, 1119-1122.

[12] Azzolini, M., Maccari J.R, A. Produtos Alternativos e Desenvolvimento da
Tecnologia
Industrial
na
Cadeia
Produtiva
da
Erva-Mate.
MCT/CNPq/PADCT, Curitiba, PR, 2000.

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Dissertao de mestrado, UFRGS, Porto Alegre,1993.
121
[14] Athayde, M. L. Meti/xantinas e saponinas em quatro populaes de "ex
paraguariensis A. St. Hi/; Triterpenos e saponinas em outras espcies do

gnero "ex. Tese de doutorado, UFRGS, Porto Alegre, 2000.
[15] Cansian, R. Variabilidade Gentica e de Compostos Volteis e Semi-Volteis
em Populaes Nativas de "ex paraguariensis (St. Hi/.) do Brasil, Visando a

Conservao da Espcie, Tese de Doutorado, So Carlos, SP, 2003.
[16] Montanha, J. A
Estudo qumico e biolgico das saponinas de lIex
paraguariensis St. Hi/-Aquifoliaceae. Dissertao de mestrado, UFRGS,

Porto Alegre, 1990.
[17] Gosmann, G, SChenkel, E.P.,Seligmann, O. Journal of Natural Products,
1989,v.52,1367-1370.
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saponinas em estudos iniciais em culturas de clulas em suspenso,

Dissertao de mestrado, UFRGS, Porto Alegre, 1997.
[19] Kraemer, K.H., Taketa, AT.C., SChenkel, E.P., Gosmann, G., Guillaume, D.
Phytochemistry, 1999, v.42, n04, 1119-1122.

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10, n06, 443-446.
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[27] Saldaria, M. D.A, Zetzi, C., Mohamed, R. S, Brunner, G. J. Agric. Food
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[28] Esmelindro, M.C., Toniazzo, G., Lopes, D., Oliveira, D., Dariva, C. Journalof
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130
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[171] Mazzafera, P. Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal, 1994, v.60, 149-151.
[172] Mazzafera, P. Bragantia, 1999, v.58, 387-391.
[173] Choi, Y.H., Sertic, S., Kim, H.K., Wilson, E. G., Michopoulos, F., Lefeber,
A.W.M., Erkelens, C., Kricun, S.D.P., Verpoorte, R. J. Agric. Food Chem.,
2005, v.53, 1237-1245.
131
CAPTULO 10:
SUGESTES PARA TRABALHOS

FUTURO.S
A partir dos resultados constatados durante o desenvolvimento deste

trabalho, pode-se propor as seguintes pesquisas nesta rea:
Estudar a presena de antioxidantes nos extratos: determinar sua ao e

identificar os principais compostos responsveis por esta ao.
Estudar a extrao "sub-crtica" com gua operando o equipamento ASE

300.
Estudar a extrao com fluido supercrtico (SFE) mediante a utilizao de

co-solvente, com a avaliao do co-solvente adequado e da proporo
necessria de adio ao solvente principal.
Estudar os compostos volteis da erva-mate usando microextrao em

fase slida (SPME).
Estudar a composio qumica das flores e frutos da erva-mate.
133
CAPTULO 11:
PRODUO CIENTFICA GERADA
11.1. Trabalhos Publicados
-Influence of agronomic variables on the composition of mate tea leaves (lIex

paraguariensis) extracts obtained from C02 extraction at 30C and 175 bar,
Jacques, Rosngela Assis, Esmelindro, ngela Aquino; Santos, Jonathan G. dos;

Dariva, Cludio; Mossi, Altemir;, J. Agric. Food Chem., 52: 1990-1995,2004.
- Comparison of accelerated solvent extraction, Soxhlet extraction and ultrasoundassisted extractions of nerolidol, fatty acids, phytosterols and vitamin E from
leaves of Piper gaudichaudianum Kunth, Pres, Valria Flores; Jacques,
Rosngela Assis; Melecchi, Maria Ins Soares; Abad, Fernanda Contieri;
Martinez, Migdalia Miranda, Oliveira, Eniz Conceio; Caramo, Elina Bastos, J.
of Chromatogr. A, 2005, in press (disponvel on line).
- Optimization of Accelerated Solvent Extraction of Piper gaudichaudanum Kunth

leaves, Pres, Valria Flores; Jacques, Rosngela Assis; Melecchi, Maria Ins
Soares; Abad, Fernanda Contieri; Martinez, Migdalia Miranda, Oliveira, Eniz
Conceio; Caramo, Elina Bastos, J. of Chromatogr. A, 2005, in press
(disponvel on line).
-The use of ultrasound in the extraction of lIex paraguarensis leaves: A
comparison with maceration, Jacques, Rosngela Assis; Freitas, Lisiane dos
Santos; Dariva, Cludio; Oliveira, Ana Paula; Oliveira, Jos Vladimir. and
Caramo, Elina Bastos, paper aceito para publicao na revista Ultrasonics
Sonochemistry.
11.2 Trabalhos completos em anais de eventos
Influncia das variveis agronmicas na composio mineral da erva-mate (lIex

paraguarienss).Jacques, Rosngela Assis; Oliveira, Ana Paula de; Dariva,
Cludio; Caramo, Elina Bastos;Oliveira, Jos Vladimir de. In: XIX CONGRESSO
BRASILEIRO DE CINCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS, 2004, Recife.
135
11.3 Resumos em anais de eventos
- Preliminary studies of accelerated solvent extracts (ASE) of lIex paraguarensis.

Jacques, Rosngela Assis; Caramo, Elina Bastos; Oliveira, Jos Vladimir de;
Caovilla, Marcela. X COLACRO, 2004, Campos do Jordo,SP.
- Determinao da composio qumica mineral da erva-mate de 6,12,18 e 24
meses. Jacques, Rosngela Assis; Oliveira, Ana Paula de; Caramo, Elina
Bastos; Oliveira, Jos Vladimir de, 12 ENCONTRO NACIONAL DE QUMICA
ANAlTICA, 2003 , So Luis-MA.
- Estudo preliminar da composio dos extratos de erva-mate obtidos por SFE.

Jacques, Rosngela Assis; Dariva, Cludio; Vecchia, Rafael Dalla; Caramo,
Elina Bastos; Oliveira, Jos Vladimir de. 12 ENCONTRO NACIONAL DE
QUMICA ANAlTICA, 2003, v. 12, p. SE-73; So Luis-MA.
- Avaliao do contedo mineral da folha de erva-mate Jacques, Rosngela

Assis; Caramo, Elina Bastos; Oliveira, Jos Vladimir de; Oliveira, Ana Paula
IX CONGRESSO CATARINENSE DE FARMACUTICOS E BIOQuMICOS,
Florianpolis 2002.
- Comparao de tcnicas de extrao (macerao, ultra-som e extrao
acelerada com solvente) no estudo dos compostos da erva-mate lIex
paraguariensis), Jacques, Rosngela Assis; Caramo, Elina Bastos; Oliveira,
Jos Vladimir de; Oliveira, Ana Paula, Dariva, Cludio;Freitas, Lisiane Santos
13 ENCONTRO NACIONAL DE QUMICA ANALTICA, 2005, Niteri, RJ.
136
CAPTULO 12:
ANEXOS
ESTRUTURAS QUMICAS
12.1 - Estruturas das Metilxantinas
~N
/C~
N
o~
/CHs
H",
N
I ~
N
O~
I
CHs
C~
>
Teobromina
Cafena
Teofi li na
Rosngela Assis J acques
138
12.2 - Derivatizao
CHs
.t.mostra
-:
+ CH3 -S1-x _
Para BSTFA,
Amostra -
-si
..
-CH3
HX
CHs
CH..
ParaTMCS,
x= Cl
~ si O C~ CH CMe (CH2l:3 CH tv1e (CH2l:3 CH Me {CH2~ CH M~
Fitol derivatizado
tv1e (CH 2)14C{O) O Si Me3

Al;.
hexadecanico
139

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UNfVERSIDADE-FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

CARACTERIZAO QUMICA DA ERVA MATE (1lex

paraguariensis): APLICAO DE DIFERENTES

ROSNGELA ASSIS JACQUES

-UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

CARACTERIZAO QUMICA DA ERVA MATE (1lex

paraguariensis): APLICAO DE DIFERENTES

ROSNGELA ASSIS JACQUES

Tese apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Quimica.da UFRGS como

PPGQ - UFRGS - TESE DE DOUTORADO

Rosngela Assis Jacques

PPGQ - UFRGS - TESE DE DOUTORADO

Esta tese foi julgada adequada para a obteno do ttulo de Doutor em

Pro a. Dra. Martha Bohrer Adaime (UFSM/Santa Maria)

Profa. Dra. Slvia Sargenti (UFSM/Santa Maria)

Prof. Dr. Slvio Luiz Pereira Dias (IQ-UFRGS/Porto Alegre)

Prof. Dr. Adriano Lisboa Monteiro

PPGQ - UFRGS - TESE DE DOUTORADO

Rosngela Assis Jacques

PPGQ - UFRGS - TESE DE DOUTORADO

Aos meus amados pais Terezinha e Manoel, pela infinita pacincia e

Ao Edilson De Toni, pelo infinito amor, dedicao e, principalmente pela

Rosngela Assis Jacques

PPGQ - UFRGS - TESE DE DOUTORADO

professora Ora. Elina Bastos Caramo pela amizade, orientao, dedicao

Aos professores Or. Jos Vladimir de Oliveira e Or. Cludio Oariva,

Aos colegas e amigos do Curso, em especial a Ins, Valria, Ceclia e

Anelise Schmidt e Flvio Pavan pela amizade.

Aos bolsistas de iniciao cientfica Ana Paula, Rafael, Jonathan, Bruna e

Aos demais alunos do Laboratrio E-202 pela colaborao e amizade.

Aos demais professores e funcionrios do Instituto de Qumica da UFRGS, pelo

Ao Or. Srgio do Amaral professor da URI-campus de Erechim, pela

Eunice Valduga pela prestatividade, amizade e profissionalismo.

Rosngela Assis Jacques

PPGQ - UFRGS - TESE DE DOUTORADO

toda a famlia da prof. Elina que me acolheu carinhosa e cuidadosamente,

Ervateira Baro pelo plantio da erva-mate e cuidados com a colheita das

Aos amigos do Instituto de Qumica da UPRGS e a todos aqueles que de uma

Rosngela Assis Jacques

PPGQ - UFRGS - TESE DE DOUTORADO

PPGQ - UFRGS - TESE DE DOUTORADO

1.4 Cromatografia lquida preparativa em slica gel.................... ....................................

Rosngela Assis Jacques

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2.2.3 Extrao com lquido pressurizado................................................... ....................

Rosngela Assis Jacques

PPGQ - UFRGS - TESE DE DOUTORADO

Foto ilustrativa da planta de erva-mate... .......................................... ........ ........

Rosngela Assis Jacques

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Rendimento das extraes por macerao, ultra-som e extrao

Rosngela Assis Jacques

PPGQ - UFRGS - TESE DE DOUTORADO

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ASE - extrao acelerada por solvente

Rosngela Assis Jacques

PPGQ - UFRGS - TESE DE DOurORADO

SCAN - modo de operao na espectrometria de massas por varredura de

Rosngela Assis Jacques