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Anlise comparativa da terapia com LED (64020 nm) e laser (660 nm)
sobre o processo de reparao cutnea em ratos idosos
Anlise comparativa da terapia com LED (64020 nm) e laser (660 nm)
sobre o processo de reparao cutnea em ratos idosos
Dissertao
de
Mestrado
apresentada ao Programa de PsGraduao em Bioengenharia da
Universidade do Vale do Paraba,
como complementao dos crditos
necessrios para obteno do ttulo
de
Mestre
em
Engenharia
Biomdica.
Orientador: Prof. Dra. Renata
Nicolau Amadei
Co-Orientador: Prof. Dr. Landulfo
Silveira Jnior
JOOPAULOALVESDO COUTO
da Costa
Prof. Dra. SandraMariaFonsec
Dirctordo lP&D Univap
SoJosdosCampos,l7 demarode 2009.
DEDICATRIA
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, agradeo a Deus, por me guiar e dar foras nos
momentos difceis de minha vida.
Agradeo aos meus pais pelo alto investimento em meus estudos; e
acima de tudo pelo amor, confiana, apoio e dedicao em todos os momentos
de minha vida.
Agradeo a minha namorada Priscila que esteve ao meu lado auxiliando
e me apoiando em todos os estgios deste trabalho.
Agradeo a minha sogra Ademilde, meu sogro Ponciano e aos
funcionrios da UnisulBahia pelo apoio e incentivo
Agradeo a Prof. Dra. Renata Amadei Nicolau pela confiana, pacincia
e principalmente pelos ensinamentos passados ao longo do desenvolvimento
deste trabalho.
E a todos aqueles que de alguma forma colaboraram para a elaborao
deste trabalho e no foram citados nominalmente.
Anlise comparativa da terapia com LED (64020 nm) e laser (660 nm)
sobre o processo de reparao cutnea em ratos idosos
RESUMO
O envelhecimento um processo dinmico e progressivo, no qual h
modificaes morfolgicas, fisiolgicas e bioqumicas. Observa-se uma menor
adeso entre as camadas derme e epiderme, diminuio na taxa de renovao
celular e reparao, elevao do tempo de cicatrizao de feridas. Atualmente,
tem se enfatizado o emprego de novas tecnologias voltadas geriatria, com
vistas melhoria de qualidade de vida de indivduos. A fototerapia tem sido
uma das reas de destaque nos avanos tecnolgicos, principalmente a
aplicao da terapia laser de baixa potncia (TLBP) com o objetivo de otimizar
o processo de cicatrizao tecidual. Os LEDs atualmente so alternativas de
baixo custo para as terapias que utilizam luz, contudo poucas pesquisas foram
conduzidas at o momento neste sentido. O objetivo do presente estudo foi
analisar comparativamente os efeitos da TLBP (660 nm) versus terapia com
LED (64020 nm) sobre o processo de reparao de feridas cutnea em ratos
idosos. Foram utilizados 54 ratos albinos, machos da linhagem Wistar, com 14
meses de idade, os quais foram submetidos retirada da pele no dorso do
animal. Os animais foram divididos em nove grupos (n=6 cada); sendo trs
grupos como controle, trs grupos tratados com laser e trs grupos tratados
com LED. O tratamento com o laser e o LED foi iniciado no ps-operatrio com
dose de 6 J/cm2 a cada 48 horas, totalizando 3 sesses. Os animais foram
sacrificados em 144, 312 e 480 horas aps a cirurgia. Os animais controle
tiveram simulao da aplicao da terapia com luz, com o aparelho desligado
(placebo). Aps o sacrifcio as amostras de tecido foram submetidas anlise
histolgica quantitativa e variao clnica macroscpica da ferida. Os
resultados mostraram diferenas estatisticamente significantes na contagem de
clulas inflamatrias, vasos sanguneos, fibroblastos e colgeno,
demonstrando que o LED e o Laser melhoram a qualidade da cicatriz de
animais idosos. Nenhuma diferena estaticamente significante foi encontrada
ao se avaliar o tempo de cicatrizao.
Palavras-Chave: Epitlio, Laser, LED (Light Emitting Diode), Reparao
tecidual.
Key Words: Epithelium Laser, LED (Light Emitting Diode), wound healing.
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
SUMRIO
1 INTRODUO
15
2 REVISO DA LITERATURA
17
2.1 Envelhecimento
17
18
21
22
23
25
26
26
27
29
30
34
36
38
3 OBJETIVO
43
43
43
4 MATERIAL E MTODOS
44
44
44
45
45
46
47
47
4.8 Histomorfometria
48
51
5. RESULTADOS
52
52
5.1.1Clculo da rea
52
53
53
55
56
57
6 DISCUSSO
59
7 CONCLUSES
64
REFERNCIAS
65
72
75
superficial
Anexo E Grficos do nmero de fibroblastos em derme profunda e 76
superficial
Anexo F Grficos da quantidade de colgeno em derme profunda e 77
superficial
15
1 INTRODUO
No Brasil, entre as dcadas de 40 e 60, ocorreu uma reduo
significativa da mortalidade da populao e a fecundidade se manteve
constante. A partir da segunda metade da dcada de 60 essa situao se
manteve levando s alteraes da faixa etria da populao brasileira1.
Entre os anos 1970 a 2000 a taxa de fecundidade diminuiu em 60% e
somadas diminuio da taxa de mortalidade fez com que o Brasil
envelhecesse rapidamente. Processo esse que demorou 6 dcadas em pases
Europeus e no Brasil ocorreu em um quarto de sculo. Com isso foi observado
que a expectativa de vida, que era em torno de 33,7 anos em 1950/1955,
passou para 50,99 em 1990, chegou at 66,25 em 1995 e dever alcanar
77,08 em 2020/20252.
Esse envelhecimento cronolgico vem acompanhado do envelhecimento
biolgico que traz consigo alteraes prprias em todos os rgos e sistemas,
alterando suas estruturas e funcionamento. Alteraes essas determinadas por
foras ambientais intrnsecas e extrnsecas3. Uma das alteraes mais visveis
o envelhecimento da pele que faz com que a mesma se torne mais fraca e
tornando o idoso mais suscetvel a leses drmicas ao mnimo trauma4,5.
Nas ltimas dcadas tem-se constatado a eficcia da terapia com laser
operando em baixa potncia (TLBP) sobre o processo cicatricial. A energia
depositada nos tecidos pela TLBP transformada imediatamente dentro da
clula promovendo efeitos biolgicos. Estes efeitos podem estar relacionados
acelerao de reaes bioqumicas, contribuindo significantemente no
processo de cicatrizao tecidual6,7.
A terapia com LEDs (Light Emitting Diodes ou luz emissora de diodo)
tem sido investigada, no somente pelos efeitos positivos sobre o processo de
reparao tecidual atestados, mas tambm pelo custo reduzido dos
equipamentos de LED comparados aos equipamentos de laserterapia. Autores
tm observado que a terapia com LEDs pode apresentar resultados superiores
terapia com laser8,9.
Considerando que, o envelhecimento acarreta mudanas no processo
de cicatrizao, e que no foram observados estudos envolvendo o emprego
16
da fototerapia sobre o processo de reparao de feridas em organismos
idosos, novos estudos se fazem necessrios neste sentido.
17
2 REVISO DA LITERATURA
2.1 Envelhecimento
O termo envelhecimento definido como um evento dinmico e
progressivo, onde h modificaes morfolgicas funcionais, bioqumicas e
psicolgicas, que determinam a perda gradual da capacidade adaptativa do
indivduo ao meio ambiente3,5.
O envelhecimento o acmulo de diversas alteraes deletrias nas
clulas e tecidos com o avanar da idade. As alteraes da idade podem ser
atribudas de acordo com o desenvolvimento e defeitos genticos, meio
ambiente, processos patolgicos e processos naturais10.
Rebelatto e Morelli11 relatam que vrias so as teorias que tentam
explicar o mecanismo pelo qual ocorre o envelhecimento, mas nenhuma delas
consegue por inteiro explicar esse mecanismo, o que reflete a dificuldade de
entender todo o processo. Acredita-se que o envelhecimento seja um processo
dinmico e progressivo, caracterizado por alteraes morfolgicas, fisiolgicas,
bioqumicas e psicolgicas que podem determinar maior vulnerabilidade.
As teorias de fundo biolgico tendem a focalizar os problemas que
afetam a preciso do sistema orgnico durante o processo de envelhecimento,
sejam eles de origem gentica, metablica, celular ou molecular. Pode-se
divid-las em duas categorias: as de natureza gentico-desenvolvimentista e as
de natureza estocstica. No primeiro caso, o envelhecimento visto como um
processo controlado geneticamente e, talvez, programado. Algumas correntes
associam essa possvel programao a um desequilbrio neuroendcrino,
levando a uma diminuio de integrao funcional dos sistemas orgnicos. As
teorias estocsticas trabalham com a hiptese de que o envelhecimento
dependeria do acmulo de agresses ambientais que atingem um nvel
incompatvel com a manuteno das funes orgnicas e da vida. Alguns
exemplos so as correntes que defendem a existncia de mutaes genticas
somticas progressivas ou erros da cadeia de sntese protica em virtude da
influncia de radiao ou substncias especficas. Todas essas teorias
carecem de comprovao definitiva, nenhuma delas tendo condies de
sobrepor-se s outras. H, portanto, muitas dvidas sobre a real influncia das
18
causas por elas apontadas no processo global de envelhecimento biolgico,
assim como sobre a forma pela qual poderiam interagir12.
2.1.1 Envelhecimento Cutneo
A pele o maior rgo do corpo humano e tambm o de maior peso.
Alm destas caractersticas, a pele o rgo que nos limita do meio exterior.
Sendo desta forma a interface entre os seres humanos e seu meio ambiente,
que protege os outros rgos do corpo de alteraes excessivas de
temperatura, leso mecnica, irradiao ultravioleta, substncias qumicas
txicas, patgenos de origem microbiana13.
Moi4 relata em sua dissertao que a pele caracterizada por trs
camadas superpostas: epiderme parte externa constitudo por um aglomerado
de clulas dispostas em camadas, no contem vasos sanguneos, estando em
renovao constante; derme camada intermediria composta de fibras de
colgeno e elastina, sendo irrigada por inmeros vasos sanguneos e linfticos
e onde se localizam as terminaes nervosas; hipoderme camada constituda
por tecido gorduroso (interno) que desempenha importante funo de proteo
de rgos internos contra traumas e perda de calor.
19
de envelhecimento a pele sofre alteraes, de composio, organizao e
tamanho15, 16.
As alteraes encontradas na pele do idoso decorrem basicamente da
ao da constituio gentica, fatores ambientais, da repercusso cutnea do
envelhecimento de outros rgos e de efeito de outras doenas cutneas e
sistmicas. Assim pode-se classificar o envelhecimento cutneo em: intrnseco
e extrnseco17, 18.
O envelhecimento intrnseco corresponde ao conjunto de alteraes
decorrentes
da
idade.
Apresenta
fatores
cronolgicos
(genticos)
da
pele
caracterizando
fotoenvelhecimento21.
20
A luz ultravioleta interage com vrias clulas localizadas em diferentes
regies, dependendo do comprimento da onda. A onda mais curta (280-320
nm) absorvida na epiderme e afeta os queratincitos, j a onda mais longa
(320-400 nm) interage com os queratincitos e os fibroblastos da derme24.
O fator ambiental que acelera o envelhecimento da pele a radiao
ultravioleta vinda do sol. O fotoenvelhecimento um processo acumulativo que
depende do sol e o tipo de pele. O componente gentico intrnseco do
envelhecimento no afetado no fotoenvelhecimento, mas os eventos resultam
do acmulo excessivo de danos celulares (estresse oxidativo). A acelerao do
envelhecimento tecidual causada pela exposio da pele ao sol envolve a
presena no tecido de cromforos absorvendo radiao ultravioleta, dos raios
solares de comprimento de onda entre 280 a 400 nm, em particular a radiao
UVB (280 a 320nm)25.
Ori et al.15 explica que para estudar os mecanismos envolvidos no
envelhecimento, portanto, necessrio compreender melhor as mudanas
estruturais e funcionais que ocorrem com o avanar da idade, distinguindo as
alteraes que possam representar um processo intrnseco daquelas que
refletem efeitos patolgicos cumulativos ou agresses ambientais externas.
Convm ainda considerar que, independente da idade do indivduo, a
espessura total da pele, espessura relativa da epiderme e derme, distribuio e
fentipo da populao celular na derme, presena de anexos cutneos e
densidade microvascular e de nervos variam conforme a regio do corpo.
Parece claro que muitas mudanas da pele, que so comumente vistas
na velhice, podem no ser resultado do envelhecimento por si s. As
mudanas da pele que so comumente observadas na velhice so melhores
referidas como associadas a do que causadas por envelhecimento26.
A pele envelhecida frente a fatores intrnsecos apresenta diminuio de
fibras elsticas, com sua fragmentao e desintegrao destas, a partir dos 60
anos de idade. J na pele envelhecida frente a fatores extrnsecos, ocorre
aumento do material elstico da derme, com deteriorao e homogeneizao
do colgeno4.
Para explicar as alteraes visveis a olho nu, Accursio27 reporta em seu
artigo que os achados histolgicos e as funes da pele se encontram
diminudas nesta faixa etria. Observa-se uma menor adeso entre as
21
camadas derme e epiderme, o que explica a pobre resistncia da pele do idoso
a pequenos traumas. Essa alterao tambm confere uma menor transferncia
de nutrientes de uma camada a outra da pele e uma modificao na absoro
de substncias pela pele do idoso, assim sendo, sabe-se que ocorre uma
diminuio de absoro de substncias lipoflicas pela pele do idoso. A
diminuio na taxa de renovao celular (30% a 50% entre a terceira e oitava
dcada de vida) e reparao de pele elevam o tempo de cicatrizao das
feridas que pode chegar a duas ou trs vezes mais do que o de uma pessoa
jovem.
2.1.1.1 Envelhecimento Intrnseco da Epiderme
A alterao mais evidente e constante o achatamento da juno
dermo-epidrmica, com o desaparecimento de ambas as papilas drmicas e as
redes terminais epidrmicas. Em relao ultra-estrutura, existe tambm uma
reduo nas projees das vilosidades citoplasmticas das clulas basais
epidrmicas no interior da derme. Isto resulta em uma superfcie contgua,
consideravelmente menor, entre os dois compartimentos, presumivelmente
uma reduo na comunicao e passagem dos nutrientes e menos
resistncia a fora de corte28.
Sauerman et. al.29 complementa descrevendo que a diminuio do
nmero das papilas drmicas um reflexo do aplainamento da juno dermoepidrmica, em particular isso no demonstrado na altura da papila drmica.
Nascimento30 diz que a zona dermo-epidrmica, de transio entre a
epiderme desprovida de vasos e a derme ricamente vascularizada, palco de
importantes
transformaes
aplainamento
dos
cones
interpapilares,
qualitativa
(glicosaminoglicanas),
do
quantitativa
sulfato
de
de
controitina,
mucopolissacardeos
do
cido
hialurnico
22
variaes dos diversos tipos de colgeno acontecem durante as vrias fases
de degradao da pele fotoexposta ou caduca. Silva e Carneiro
24
afirmam
do
estrato
de
Malpighi.
Alm
disso,
observaram
um
arranjo
nmero
de
melancitos
enzimaticamente
ativos
diminui
23
Histologicamente, a pele fotoenvelhecida apresenta maior compactao
do estrato crneo, aumento da espessura da camada granulosa e menor
concentrao de mucina na epiderme. Embora o nmero de melancitos esteja
reduzido, as reas com melanose solar e lentigo apresentam hipertrofia dessas
clulas no paciente fotoenvelhecido21.
Silva e Carneiro24 complementam explanando que as alteraes da
epiderme causadas pelo fotoenvelhecimento so caracterizadas por alteraes
na pigmentao associado com hipertrofia ou atrofia da epiderme, e deposio
de fragmentos de fibras elsticas.
2.1.1.3 Envelhecimento Intrnseco da Derme
No envelhecimento cutneo as maiores alteraes so vistas ao nvel da
derme. H uma reduo dos fibroblastos e a espessura das fibras colgenas
diminui. Aps os 60 anos, o colgeno torna-se rgido e menos elstico em
razo das alteraes da substancia fundamental amorfa pela reduo dos
mucopolissacardeos (glicosaminoglicanos) e alteraes qumicas. As fibras
elsticas mostram alteraes qumicas na elastina. H alteraes no contedo
de hidratos de carbono, lipdeos, cido glutmico e lisina. As fibras reticulares
apresentam alteraes similares s das fibras colgenas. H reduo de cerca
de 50% na quantidade de mastcitos na pele idosa19.
Ori et al.
15
24
mdia da derme, e o aparelho colgeno-elstico reticular mostrou-se mais
susceptvel disperso. Contudo, um arranjo mais compacto e espesso do
aparelho colgeno pode ser visto na derme profunda do grupo senil. No grupo
senil, a derme superficial exibiu reduo em sua celularidade e extenso em
ala da microvasculatura papilar, revelada pelo discreto declnio da
fluorescncia local.
O envelhecimento tecidual est associado com a atrofia da derme, to
quanto s mudanas na arquitetura e organizao. H uma diminuio na
sntese da matriz na derme e aumento da enzima que degrada a matriz do
colgeno. Radicais livres causam dano no tecido conectivo que compe a
derme, em particular o colgeno, que aparentemente influencia a interao
com a clula matriz31. A derme papilar perde sua caracterstica morfolgica de
cristas onduladas e adquire aspecto plano, acompanhando o desenho da
epiderme superficial, onde os cornecitos passam a apresentar naturalmente
menor interadeso 20.
Ultraestruturalmente, o colgeno diminui 1% ao ano, e as fibras
colgenas
remanescentes
tornam-se
desorganizadas,
compactas
fundamental
(glicosaminoglicanas),
pela
alterando
diminuio
dos
adversamente
mucopolissacardeos
turgor
cutneo.
Tais
da
compressibilidade
da
pele
ocorrem
pela
diminuio
de
25
mesma densidade, mas em ambos os calibres esto diminudos, se bem que
com o envelhecimento da pele h perda progressiva da vascularizao da
derme e do calibre vascular da mesma.
2.1.1.4 Envelhecimento Extrnseco da Derme
As caractersticas histolgicas mais marcantes do fotoenvelhecimento
so a elastose, representada por acmulos nodulares de material amorfo,
geralmente na juno da derme papilar e reticular. H substituio das fibras
colgenas maduras por colgeno com aparncia basoflica, formando um
material constitudo de elastina degradada e protenas microfibrilares ligadas
fibronectina, uma glicoprotena ligada a matriz drmica. O cido hialurnico
(Hialuronato), um mucopolissacardeo (glicosaminoglicano), envolvido na
manuteno do volume e elasticidade da derme diminui com o envelhecimento
da pele, isso pode ser explicado pela diminuio receptor do fator de
crescimento na epiderme, ativado pelos raios UV, e subseqente inibio do
sistema de hialuronato20, 21,32.
A inicializao da matriz metaloproteinase (MMP) toca a principal regra
na patognese do fotoenvelhecimento. Existem grupos de enzimas, subfamlia
das proteinases, responsveis pela degradao do colgeno. A luz ultravioleta
modifica a matriz dermal, protenas e induz a uma ampla variedade de
crescimento da famlia dos MMPs com atividade proteoltica para degradar a
matriz protica. Cada MMP degrada diferentes componentes da matriz protica
dermal, por exemplo, MMP-1 quebra o colgeno I, II e III e MMP-9 degrada
colgeno tipo IV e V 24.
H diminuio do lmen vascular, dos capilares na derme com um
nmero menor de formaes glmicas, alm de alteraes de esclerose dos
vasos. A diminuio do fluxo circulatrio cutneo contribui para menor
intensidade das reaes inflamatrias e para menor depurao de substncias
endgenas ou exgenas depositadas na pele. Os vasos sanguneos se
rompem com facilidade, promovendo extravasamento de hemcias na pele,
levando a manhas prpuras facilmente visveis na superfcie19, 33.
26
27
Li, Chen e Krisner37 correlaciona Eming, Krieg e Davidson36 com
Polacow et al.35 explicando que a cicatrizao um processo complexo que
grosseiramente pode ser dividido em trs fases sobrepostas: a fase
inflamatria, proliferativa e de remodelao. A fase inflamatria envolve
resposta vascular caracterizada pela coagulao sangunea e homeostasia
conforme os eventos celulares, incluindo infiltrao de leuccitos com uma
variedade de funes antimicrobianas e liberao de citocinas, o qual inicia a
fase proliferativa da reparao da ferida. Alguns autores tm dividido o
processo de reparao tecidual e quatro fases, com o primeiro estgio
comeado pela homeostasia elevando a importncia da resposta vascular.
Durante a fase proliferativa existe a formao de epitlio para cobrir a
superfcie da ferida que acompanha o crescimento do tecido de granulao de
acordo com o espao da leso. A formao do tecido de granulao envolve a
proliferao de fibroblastos, deposio de colgeno e outras substncias
extracelulares da matriz e desenvolvimento de novos vasos sanguneos. Uma
vez que o novo tecido da leso foi formando, a fase de remodelao tem inicio
para refazer a integridade estrutural do tecido e sua competncia funcional.
2.2.1 Fase de Homeostasia
Segundo Li, Chen e Krisner37 a ruptura dos vasos sanguneos leva ao
extravasamento do sangue ou apenas perda do plasma para o tecido
adjacente. O primeiro passo para a cicatrizao a homeostasia. Esta fase
consiste em dois processos: o desenvolvimento do cogulo e a coagulao. As
plaquetas so as primeiras clulas a aparecer aps a leso e ativam a cascata
de coagulao.
Quase concomitante ao estmulo lesivo, e devido influncia nervosa
(descargas adrenrgicas) e ao de mediadores oriundos da degranulao de
mastcitos, ocorre vasoconstrio como primeira resposta. A leso do
endotlio (ruptura, fissura ou eroso) dispara uma sequncia de eventos,
iniciando-se com a deposio das plaquetas, prosseguindo com sua ativao e
posterior recrutamento de novas plaquetas. O resultado a formao de um
trombo rico em plaquetas, que provisoriamente tampona a leso endotelial.
Esse trombo rico em plaquetas (trombo branco) rapidamente infiltrado pela
28
fibrina, transformando-se em um trombo fibrinoso. Logo aps, os eritrcitos so
capturados por essa rede fibrinosa e forma-se ento o trombo vermelho
principal responsvel pela ocluso do vaso sanguneo rompido. Este, alm de
limitar a perpetuao da perda de constituintes circulatrios para os interstcios
celulares, fornece uma matriz preliminar, que alicerar a migrao das clulas
responsveis pelo desencadeamento do processo de reparo. A adeso inicial
das plaquetas superfcie lesada ocorre pelas protenas de adeso presentes
na sua membrana. As principais delas so os receptores da glicoprotena
IIb/IIIa (GP IIb/IIIa). Esse receptor possui stios de ligao para o fibrinognio,
fator de Von Willebrand, vitronectina, fibronectina e trombospondina. Em
seguida, as plaquetas so ativadas por um grande nmero de substncias
presentes na matriz subendotelial e na corrente sangunea. O colgeno
subendotelial exposto pela ruptura do vaso e a trombina gerada pelos
processos de coagulao participam da ativao e agregao plaquetrias.
Alm disso, a plaqueta ativada aumenta a ao da protrombinase, que
promove maior produo da trombina, a partir da protrombina, criando assim,
condies para a amplificao da adeso plaquetria. O ADP liberado das
hemcias e grnulos densos das prprias plaquetas outro elemento
amplificador da agregao das plaquetas. Este induz nelas a exposio do
receptor glicoprotena IIb/IIIa ao fibrinognio e fator de Von Willebrand.
Contribuindo tambm para a agregao plaquetria, o cido araquidnico da
membrana das plaquetas em processo de agregao, convertido em TxA2
pelas enzimas ciclooxigenase e tromboxane sintetase. O TxA2, alm de forte
agonista da agregao plaquetria, um potente vasoconstritor e, tambm,
indutor da exposio dos stios de ligao da glicoprotena IIb/IIIa ao
fibrinognio e fator de Von Willebrand. Outro importante derivado do
araquidonato, que liberado por macrfagos e mastcitos, plaquetas e outras
clulas ativadas, o PAF. Este um ativador importante de plaquetas e indutor
da sua agregao. Como agonistas da agregao plaquetria, podem tambm
ser citadas a noradrenalina e a serotonina. Esses mediadores estimulam
diferentes cascatas de ativao plaquetria, porm, a via final comum a todos
a ativao do receptor da glicoprotena IIb/IIIa que pela interao com o fator
de Von Willebrand e o fibrinognio o verdadeiro efetor da agregao e
ativao plaquetria formando assim o coagulo e parando o sangramento38,39.
29
Na segunda fase o fibrinognio plasmtico que est extravasando da
rea lesada do vaso e o fibrinognio plaquetrio so induzidos a polimerizar
atravs das vias intrnsecas e extrnsecas da coagulao. O fator Hageman
ativa via intrnseca e a lipoprotena ativa a via extrnseca da coagulao O gel
extra vascular que ocupa a fenda criada pela leso composto de material
proveniente do sangue e por uma matriz extracelular fraca formada de
fibrinognio, fibronectina e fator Von Willebrand. As plaquetas ativadas liberam
fatores de crescimento como o TGF e o PDGF, quimiocinas como o CTAP-III
e tambm outras protenas como fibrinognio, fibronectina e tromboplastina
que so encontradas em seus grnulos. A interao das protenas dos
grnulos plaquetrios com protenas da matriz extracelular somados massa
de corpos plaquetrios agregados, ao se estabilizarem, formam uma matriz
provisria. Esta se torna mais consistente medida que a fibrina se polimeriza
pelas vias intrnsecas ou extrnsecas da coagulao35.
2.2.2 Fase Inflamatria
Os estmulos necessrios para o incio da reao inflamatria so
proporcionados logo aps o fim a leso do vaso. A resposta celular fase
inflamatria caracterizada pelo influxo de leuccitos para a rea lesada. No
inicio da fase inflamatria, neutrfilos e moncitos so as clulas mais
importantes no local da leso. Logo aps a leso, neutrfilos e moncitos
comeam a emigrar dos capilares para o ferimento, com os neutrfilos sendo
os primeiros a chegar em grande nmero tendo como funo principal neste
processo a eliminao de possveis
30
intercelular. A histamina, protease, lecotrienos e citocinas, representam uma
fonte adicional do sinal de recrutamento dos leuccitos. Os fatores de
crescimento PDGF e TGF so tambm importantes mediadores para os
leuccitos, uma vez no local da leso integram os receptores na superfcie
celular dos neutrfilos elevando a interao com a matriz celular. A infiltrao
de neutrfilos normalmente ocorre em poucos dias, mas a presena de
contaminao no ferimento pode prolongar a permanncia dos neutrfilos na
leso e pode atrasar o processo de cura41,42.
Li, Chen e Krisner37 dissertam que a migrao dos moncitos para o
espao tecidual e a transformao destes em macrfagos, torna este tipo
celular predominante na fase tardia da fase inflamatria. Inicialmente os
moncitos so atrados para o local do ferimento pelas mesmas substncias
quimiotticas que atraem os neutrfilos, e eles so recrutados continuamente
atravs de sinais deixados pelas substncias quimiotticas dos moncitos
especficos, assim como as protenas quimiotticas dos moncitos e protenas
inflamatrias dos macrfagos. A degradao da matriz extracelular produz
fragmentos de colgeno, fragmentos de fibronectina e trombina e tambm as
substncias quimiotticas dos moncitos. Os macrfagos so considerados as
clulas mais importantes na reao inflamatria. Os macrfagos digerem os
organismos patognicos; eliminam fragmentos teciduais; e destroem os
neutrfilos remanescentes. Aps as clulas, os tecidos e os microrganismos
serem
fagocitados,
estes
sero
destrudos
atravs
da
liberao
de
processo
realizado
pelos
moncitos/macrfagos
permitindo
31
das periferias para o centro da ferida. Isto se d pela matriz provisria formada
e seguindo a orientao do gradiente qumico de substncias quimiotticas.
Com o aumento do nmero de fibroblastos ativados para a produo de
colgeno no local, a matriz extracelular comea a ser substituda por um tecido
conjuntivo mais forte e mais elstico. Este processo denominado de
fibroplasia e para a sua eficincia necessria que ocorra em paralelo da
formao de novos vasos sanguneos, ou seja, necessria uma nova
vascularizao da regio. Alm da ao direta de fatores de crescimento sobre
as clulas dos vasos, a induo da angiognese , em parte, creditada baixa
tenso de oxignio.
Com o incio da fibroplasia ocorre a formao do tecido de granulao
(por volta do quarto dia) composto por macrfagos, fibroblastos e vasos
neoformados que esto suportados por uma matriz frouxa de fibronectina,
cido hialurnico (hialunorato) e colgeno tipos I e III. Este tecido edematoso
e caracterizado pela presena de muitos espaos vazios, devido imaturidade
dos vasos, os quais so extremamente exudativos e sangram com facilidade. A
nova vascularizao essencial neste estgio porque permite a troca de
gases e a nutrio das clulas metabolicamente ativas. Sob estmulo de fatores
de crescimento e de outros mediadores, as clulas endoteliais do interior de
capilares intactos nas margens da ferida passam a secretar colagenase e o
ativador do plasminognio. Essas substncias promovem aberturas na
membrana basal e permitem a migrao das clulas endoteliais que,
atravessando a parede do vaso e utilizando como substrato a matriz
extracelular provisoriamente produzida, seguem em direo regio da leso.
Uma vez na regio externa do vaso, elas passam pelo processo de
diferenciao para aquisio da capacidade de formao de novos tubos
capilares. As clulas endoteliais migratrias formam no exterior do vaso um
broto capilar que em seguida une-se ao capilar de onde eram originrias para o
restabelecimento do fluxo sanguneo 37.
Todo processo lesivo promove a perda de massa do tecido. A rea de
uma ferida aberta necessita ser preenchido e para isto so operadas duas
estratgias diferentes. Na primeira, a prpria natureza anatmica da leso
proporciona um estmulo para a migrao e proliferao das clulas (clulas
epiteliais e fibroblastos) a partir das suas margens. As clulas basais prximas
32
regio da leso, ao perderem a interao com as clulas adjacentes, so
ativadas, adquirem propriedades mitticas e proliferam em direo ao centro da
leso. Na segunda, mesmo quando o espao da leso est preenchido por
tecido de granulao, as margens se movem uma em direo outra, como se
houvesse uma fora de trao invisvel. Isto ocorre devido diferenciao de
alguns fibroblastos das margens da ferida para miofibroblastos, portanto, para
fibroblastos com capacidade contrtil37, 43.
Balbino, Pereira e Curi38 relatam que com a evoluo do processo, a
matriz extracelular, que inicialmente era composta principalmente por protenas
derivadas de plaquetas e do plasma, passa por modificaes em sua
composio. A migrao e ativao de macrfagos e fibroblastos para a regio,
somada presena de vasos neoformados, permitem que os componentes da
nova matriz extracelular passem a ser localmente produzidos principalmente
por estas clulas. Os fibroblastos passam a depositar grandes quantidades de
fibronectina que, embora seja substrato que desempenha outras funes,
basicamente serve para a fixao da prpria clula. Outra substncia produzida
em grande quantidade neste segundo estgio o cido hialurnico, um
polissacardeo glicosaminoglicano no sulfatado com facilidade de se ligar
gua, que auxilia na resistncia do tecido compresso. Estas duas
substncias predominam na matriz durante as primeiras fases do reparo, pois
esta combinao propicia um micro ambiente eficiente para a movimentao
das clulas, necessrias nesta etapa. medida que o processo de maturao
da ferida avana, a concentrao de cido hialurnico diminui e aumenta a
sntese de proteoglicanos ou glicosaminoglicanos sulfatados. Essa modificao
na composio da matriz extracelular favorece a fixao e imobilidade das
clulas favorecendo a diferenciao delas para fentipos mais maduros. As
clulas endoteliais dos vasos neoformados se diferenciam em clulas de
revestimento e os vasos neoformados assumem as caractersticas funcionais
de capilares. Os fibroblastos so as clulas que passam por mudanas de
fentipo mais acentuadas. Do fentipo de clulas imaturas migratrias e
replicativas no incio do processo, passam para fentipo caracterstico de
clulas ativamente engajadas na sntese protica, ou seja, o seu citoplasma se
torna volumoso e apresenta um retculo endoplasmtico rugoso abundante.
Com isto, eles passam a secretar grandes quantidades de colgeno. Este aos
33
poucos substitui os proteoglicanos e a fibronectina at se tornar o principal
componente da cicatriz em formao.
A tenso de oxignio um importante mecanismo de regulao do
processo de reparo. No incio do processo, a baixa tenso serve como estmulo
ao macrfago para a produo de fatores de crescimento, para a migrao e
proliferao centrpeta das clulas das margens da ferida e faz a induo da
angiognese. Nesta etapa, necessria uma alta tenso de oxignio para a
hidroxilao dos resduos de prolina e lisina nas cadeias polipeptdicas do
colgeno montadas no citoplasma dos fibroblastos. Isto proporcionado pela
rede capilar neoformada44,45.
Durante a fixao dos fibroblastos e seu amadurecimento para clulas
produtoras de colgeno, o processo de contrao da ferida alcana a sua
eficincia mxima. Isto ocorre devido mudana dos fibroblastos das margens
da ferida para miofibroblastos. Os fibroblastos destas regies marginais
comeam a exibir caractersticas funcionais similares s clulas do msculo
liso. Os miofibroblastos so encontrados alinhados ao redor de depsitos da
nova matriz extracelular, fazendo unies celulares e gerando fora de tenso.
Auxilia tambm no processo de contrao da ferida o ressecamento da sua
crosta superficial que durante a desidratao diminui de tamanho e arrasta o
tecido a ela aderido36.
O processo de reepitelizao da ferida se inicia imediatamente aps a
leso. Clulas primitivas da camada basal do tecido epidermal possuem
potencial mittico latente. Em tecidos normais, este se encontra inibido pelo
contato existente entre as clulas pela "inibio por contato". Com a ocorrncia
de uma leso, este mecanismo inibitrio desaparece e as clulas entram
imediatamente em processo mittico. A ineficincia e dificuldade de
constatao do processo mittico destas clulas nas etapas iniciais so
devidas , ainda, inexistncia de um substrato adequado para isto na regio da
ferida. Este somente fornecido quando o tecido de granulao alcana o nvel
da epiderme. Quando ativadas, as clulas da epiderme retraem os
tonofilamentos intracelulares, ocorrendo dissoluo dos desmossomas
intercelulares e nas margens do interior da clula se formam filamentos de
actina. Estas alteraes permitem sua movimentao em direo ao centro da
ferida. As clulas migram sobre a matriz celular provisria e, durante sua
34
trajetria, segue depositando quantidades significativas de fibronectina. A
superfcie da ferida umedecida e oxigenada um fator que acelera o processo
de migrao. Quando estas clulas encontram uma crosta recobrindo a regio
lesada, promovem uma dissecao entre esta e a matriz, porm, custa de um
retardo de velocidade de migrao. medida que a regio da leso vai sendo
coberta pelas clulas epidermais acionado o mecanismo de "inibio por
contato". As clulas voltam a apresentar o fentipo original, a membrana basal
refeita e os hemidesmossomos e desmossomos so reconstitudos46.
Segundo Balbino, Pereira e Curi38, ao final desta etapa, o leito da ferida
est totalmente preenchido pelo tecido de granulao, a circulao
restabelecida pela nova vascularizao e a rede linftica est passando por
regenerao. Lentamente o tecido de granulao enriquecido com mais fibras
colgenas o que comea a dar regio lesada a aparncia de cicatriz devido
ao acmulo de massa fibrosa.
2.2.4 Fase de Remodelao
Conforme Li, Chen, Krisner37 comentam a fase de remodelao tem
incio por volta do dcimo dia, o leito da ferida est totalmente preenchido pelo
tecido de granulao, com uma rede capilar atravessado-a, com a rede linftica
em regenerao. O tecido de granulao vai sendo enriquecido com mais
fibras de colgeno e comea a adquirir a aparncia de massa fibrtica
caracterstica da cicatriz. Nesta etapa, surgem as primeiras fibras de colgeno
tipo I. Com a evoluo do processo, acentua-se a deposio de colgeno e a
maioria das clulas desaparecem formando finalmente a cicatriz. consenso
atualmente, que a resoluo completa de uma ferida, somente pode ser
considerada depois de concluda a maturao e remodelagem da matriz
extracelular. Este processo ocorre lentamente levando muitos meses ou s
vezes anos.
Os eosinfilos aparecem nas ltimas fases da reparao e presumi-se
que podem estar relacionados produo de fatores de crescimento. Quando
a ferida completou o seu fechamento e os microrganismos foram eliminados,
os linfcitos constituem o subsistema leucocitrio mais abundante em feridas
humanas. Os linfcitos no somente so efetores imunes, mas tambm,
35
produtores de fatores de crescimento. De forma notvel, nesta etapa, eles so
atrados para a regio da ferida em igual nmero que os moncitos e, a partir
do dcimo quarto dia, so os leuccitos que predominam na regio38.
Segundo Carvalho39 a resistncia de uma cicatriz dada pela
quantidade de colgeno depositada e pela forma com que as fibras esto
organizadas. Quanto maior o nmero de ligaes covalentes transversais,
maior a resistncia da cicatriz. Quando secretado na forma de tropocolgeno,
as ligaes transversais das fibras se do por pontes de hidrognio. No
processo de amadurecimento da fibra, as lisinas, hidroxilisinas e lisinas
glicosiladas constituintes da molcula de tropocolgeno so oxidadas at
aldedos pela enzima lisiloxidase. Estes, aps a oxidao, se ligam
covalentemente com outros grupos aldedos ou com lisinas no oxidadas, o
que aumenta a resistncia da fibra.
O processo de remodelamento da cicatriz envolve etapas sucessivas de
produo, digesto e orientao das fibrilas de colgeno. Ocorrendo uma
transformao dos tipos de colgenos onde h uma degradao do colgeno
tipo III e aumento da sntese do colgeno tipo I. Este processo de converso da
derme consumado atravs de um controlado sistema de produo de
colgeno e lisina do velho colgeno. A deposio de colgeno feita a
princpio de maneira aleatria tendo como orientao a organizao da
fibronectina e dependente da natureza e direo das tenses aplicadas ao
tecido. Essas fibras so subsequentemente digeridas pela colagenase,
sintetizadas, rearranjadas de acordo com a organizao das fibras do tecido
conjuntivo adjacente e lateralmente ligadas por ligaes covalentes. Essas
ligaes so formadas entre molculas de tropocolgeno no mbito da fibrila e
entre
as
prprias
fibrilas.
Repeties
sucessivas
da
lise,
sntese,
36
48
os laseres so classificados
49
As primeiras reaes so
7,50
. Hawkins e Abrahamse
37
membranas da clula. Clcio liberado das mitocndrias dentro do citoplasma.
Com as alteraes nos nveis intracelulares deste on h o estmulo do
metabolismo celular e regularizao do mesmo, sinalizando o caminho
responsvel para os eventos necessrios na reparao da leso da mesma
forma que guia a migrao celular, a sntese de RNA e DNA, sntese de
protenas e proliferao celular. O terceiro efeito produzido em clulas
distantes. Alguns efeitos so os mesmo efeitos que os secundrios. Clulas
irradiadas ou energizadas comunicam-se umas com as outras e com clulas
no irradiadas, atravs do aumento dos nveis de citocinas ou fatores de
crescimento resultando em comunicao intercelular. Existe uma elevao na
resposta imune, com ativao dos linfcitos T e macrfagos, um aumento na
endorfina e diminuio da bradicinina resultando em alivio da dor 51,7.
Segundo Rosa e Hammerschitt52 os fotorreceptores celulares so
sensveis a certos comprimentos de onda, absorvem os ftons desencadeando
as reaes qumicas. Assim acelera a sntese de ATP (gliclise e fosforilao
oxidativa) em curto prazo e em longo prazo acelera a transcrio e replicao
de DNA, alm de promover os efeitos sistmicos53. Hawkins e Abrahamse54
explicam que a TLBP na regio do vermelho bastante absorvida por
componentes da cadeia respiratria. Ftons penetram o tecido e so
absorvidos em nvel de mitocndrias e membranas celulares52. A energia dos
ftons convertida em energia qumica dentro das clulas, em forma de ATP,
para a qual conduz para a normalizao da funo celular. A permeabilidade
da membrana celular se altera e alteraes fisiolgicas ocorrem. Pequenas
doses de luz intensificam o gradiente protnico na mitocndria, seguido de
aumento da liberao de Clcio no citoplasma. Este processo d incio a vrios
processos biolgicos como sntese de DNA e RNA, mitose celular e clulas de
proliferao. Altas doses podem liberar muito clcio, podendo sobrecarregar as
clulas e inibir o metabolismo celular.
Posten et al.49 descreve que vrios elementos tm sido usados para
estabelecer parmetros para a TLBP. Pesquisas iniciais usaram laseres
baseados em gases inativos (inertes), incluindo Helio-Nenio (He-Ne; 632,8
nm), rubi (694 nm) Argnio (488 e 514 nm). Estudos subsequentes usaram
laseres semicondutores de diodo, incluindo Arseneto de Glio (GaAs, 904 nm)
e Arseneto de Glio-Aluminio (GaAlAs; 600 e 1000 nm). A maioria dos estudos
38
da TLBP, possivelmente devido ao custo e a utilidade de uso, tem utilizado o
laser na regio visvel do espectro eletromagntico. Rosa, Hammerschmitt e
Souza48 afirmam que estes comprimentos de onda tm sido bastante usado
como finalidade teraputica devido boa absoro pelos tecidos biolgicos.
O laser 660 nm um laser de baixa potncia (radiao eletromagntica
coerente na regio do vermelho). O efeito trmico associado com a irradiao
laser de baixa de potncia ocorre antes de um minuto, os efeitos fisiolgicos
so conferidos diretamente a biomodulao das clulas expostas. Estudos tm
revelado que a radiao coerente na regio visvel do espectro eletromagntico
estimula a proliferao celular, atua sobre o sistema imune e estimula a sntese
de colgeno. observado tambm que os nveis de ATP celular aumentam em
quase o dobro aps a irradiao com laser de He-Ne (632,8 nm) quando
absorvida por clulas em cultura. Uma possibilidade pode ser que a energia
laser absorvida pelos cromforos intracelulares e convertidos em energia
metablica55, 48.
A radiao eletromagntica coerente na regio do vermelho tem efeito
sobre o processo de cicatrizao. Estudos com linfcitos mostram que a TLBP
pode levar a um aumento da secreo de imunoglobulinas, liberao de
citocinas, atividade fagocitria e leucocitria. Estudos com macrfagos
demonstraram um aumento na atividade dos lisossomos e fosfatases,
estimulando a liberao de fatores de crescimento e aumentando a atividade
fagocitria55, 57.
Segundo Say et al.58 culturas de linfcitos irradiados com laser na regio
do vermelho apresentam aumento na capacidade de fagocitose, incremento da
superfcie de contato, bem como afinidade do organismo invasor. Dessa forma
se pode concluir que este tipo de estimulao eleva o reconhecimento de
antgenos por acrscimo na atividade linfocitria.
2.4 Light Emitting Diodes (LED)
H algum tempo vm sendo apresentado no mercado aparelhos que tm
sua luz emitida por diodos (light emitting diodes), gerando radiao
eletromagntica no coerente, tanto na regio visvel quanto infravermelha do
39
espectro eletromagntico, com faixa estreita de emisso (variao na faixa de
20 nm) e alta intensidade (50 a 100 mW)8,9 (figura 2).
40
mecanismo
ligado
ao
envolvimento
do
processo
bioqumico
termoluminescncia
um
termo
dado
emisso
de
luz,
suficiente
VET
ou
RC
para
termoluminescncia
ou
41
Outras caractersticas interessantes so: a maior seletividade da luz,
maior tempo de vida til do aparelho e menor custo de energia66. A variao
trmica presente nos aparelhos de LED incapaz de causar maiores danos
quando o aparelho usado em tempos prolongados. Em vista dessas
vantagens alem do baixo custo e praticidade os aparelhos de LED vem
conquistando o mercado, assim como sendo cada vez mais estudados67.
Segundo
Califano64
terapia
com
luz
de
baixa
potncia
explica
que
fotobiomodulao
ocorre
devido
luz
69
LED no vermelho 633 nm, possui uma variedade de efeitos, assim como
atenuao da dor, cicatrizao e propriedades anti-virais.
Takezak et al.70 descreve que em nvel dos fibroblastos, seus resultados
usando um LED 633 nm demonstram uma elevao do nvel de metabolismo,
devido ao acrscimo abundante de mitocndrias quando comparado como
fibroblastos no irradiados. O aumento no nmero de mitocndrias nas clulas
so indicativos da grande demanda de energia, diretamente relacionada com o
aumento do metabolismo.
Vink et al.71 comenta em seu estudo que a biomodulao positiva da
cicatrizao frequentemente vista com ceticismo. Os benefcios reais da
terapia LED, podem somente ser estabelecidos por investigao histolgica e
clnica realizada sobre protocolos controlados. Aplicao LED em feridas
42
cutneas, em pele humana, pode ser assumida pela aplicao de parmetros
dosimtricos, mas futuras investigaes so necessrias para explicar o
mecanismo de biomodulao e fornecer protocolos para o uso efetivo de
parmetros de tratamento com LED72.
43
3 OBJETIVO
3.1 Objetivo Geral
Anlise comparativa da terapia com LED (64020 nm) e laser (660 nm)
sobre o processo de reparao de feridas cutnea em ratos idosos.
3.2 Objetivos Especficos
Avaliar quantitativamente:
-
O nmero de fibroblastos;
O nmero de vasos;
O nmero de colgeno;
44
4 MATERIAL E MTODOS
4.1 Aspectos ticos
Est pesquisa est de acordo com os princpios ticos seguindo as
diretrizes nacionais e internacionais da pesquisa envolvendo animais.
Protocolo nA94/CEP/2007 (anexo A).
4.2 Modelo Experimental
Foram utilizados 54 ratos albinos machos idosos, linhagem Wistar; com
o peso corporal mdio de 500g e idade de 14 meses, provenientes do Biotrio
da W.C. LirioME (Animais de Laboratrio) da cidade de Vitria do Estado do
Esprito Santo
Os animais foram mantidos no Biotrio da UnisulBahia Faculdades
Integradas em gaiolas apropriadas de polietileno padro, em grupos aleatrios
de 6 animais por gaiola, com acesso a gua e rao ad libitum, passando por
um perodo de adaptao de cinco dias. A sala foi mantida com as condies
de iluminao controlada em ciclos de 12 horas claro/12 horas escuro.
Os 54 animais foram aleatoriamente divididos em nove grupos com n=6:
- Grupo Controle 144: animais sem tratamento, sacrificados aps 144
horas do procedimento cirrgico.
- Grupo Controle 312: animais sem tratamento, sacrificados aps 312
horas do procedimento cirrgico.
- Grupo Controle 480: animais sem tratamento, sacrificados aps 480
horas do procedimento cirrgico.
- Grupo Laser 144: animais tratados com Laser, sacrificados aps 144
horas do procedimento cirrgico.
- Grupo Laser 312: animais tratados com Laser, sacrificados aps 312
horas do procedimento cirrgico.
- Grupo Laser 480: animais tratados com Laser, sacrificados aps 480
horas do procedimento cirrgico.
- Grupo LED 144: animais tratados com LED, sacrificados aps 144
horas do procedimento cirrgico.
45
- Grupo LED 312: animais tratados com LED, sacrificados aps 312
horas do procedimento cirrgico.
- Grupo LED 480: animais tratados com LED, sacrificados aps 480
horas do procedimento cirrgico.
4.3 Procedimento Cirrgico
O procedimento cirrgico foi realizado no laboratrio de Fisiologia da
UnisulBahia Faculdades Integradas. Todos os animais receberam por via
subcutnea, um pr-tratamento com atropina (relaxante muscular), na dose de
0,04 ml para cada 100 g de peso corpreo, aguardando 15 minutos para o
procedimento anestsico79. As drogas anestsicas foram cloridrato de
Ketamina10% (Syntec), 0,1 ml /100 g de peso corpreo com xilazina 2%
(Syntec), 0,1 ml / 100 g, por via intramuscular, utilizando-se seringa de insulina
de 1 ml. Aps anestesia os animais foram tricotomizados na regio dorsal,
realizando a anti-sepsia da regio com lcool iodado 2%. Foi realizado uma
inciso circular com um punch 0,8 cm de dimetro (instrumento estril para
bipsia) na regio tricotomizada, com profundidade de aproximadamente 1
mm.
4.4 Terapia com Laser e LED
Os equipamentos utilizados no estudo foram: laser de escala industrial
(Bio
Wave
LLLT
Dual
Kondortheck,
referncia
em
equipamentos
46
O procedimento teraputico teve incio 30 minutos aps a leso
(irradiao nica) e se repetiu a cada 48 horas, num total de 3 aplicaes.
Todos os animais receberam a mesma manipulao.
Para o procedimento teraputico, os animais foram posicionados em
uma mesa, em decbito ventral, imobilizados manualmente. As regies
lesionadas receberam a aplicao do laser ou LED em contato direto com a
ferida de forma pontual, formando um anglo de 90 em relao ferida (figura
3) na dosagem de 6 J/cm durante 100 segundos para o laser e 60 segundos
para o LED. Os equipamentos foram protegidos com filme plstico para evitar
contaminao. A rea de leso dos animais foi fotografada diariamente para
posterior anlise mtrica por anlise de imagem (programa ImageJ).
24
48
72
96
120
144
168
3 aplicao
2 aplicao
Cirurgia e 1 aplicao
Sacrifcio
192
216
240
264
288
312
336
Sacrifcio
360
384
408
432
456
480
47
Os animais foram sacrificados em 144, 312 e 480 horas aps a cirurgia,
sendo trs grupos com 144 horas, trs grupos com 312 horas e trs grupos
com 480 horas aps a leso. Foi utilizado o mesmo procedimento anestsico
empregado para a cirurgia. Depois de anestesiados os animais receberam
cloreto de potssio a 10% (KCl, 1ml) por via intracardaca. A regio da inciso
circular dos ratos foi removida e fixada em soluo de formol a 10% por vinte e
quatro horas e posteriormente foi submetida processamento histolgico.
4.6 Tcnica Histolgica
Aps a fixao, as amostras de pele foram enviadas ao
Histotec na cidade de
laboratrio
48
4.8 Histomorfometria
As lminas histolgicas foram submetidas anlise por microscpica
ptica e a captura digital no laboratrio de laser de alta potncia do Instituto de
Desenvolvimento e Pesquisa da Universidade do Vale do Paraba. A captura
das imagens foi efetuada atravs de uma cmara digital da marca Leica, com
resoluo de 1280 X 1024 pixels e acoplada a um microscpio trinocular. As
fotomicrografias foram obtidas em aumentos de 40, 100 e 200 vezes e
armazenadas no formato TIFF (Tagged Image File Format).
Os cortes forma representativos da regio mediana da amostra do tecido
e
para
quantificao
da
quantidade
de
clulas
inflamatrias,
49
neovascularizao, fibroblastos e colgeno, forma digitalizadas quatro campos
por corte, sendo 4 cortes por lmina, duas lminas por animal. Todas as
imagens foram digitalizadas atravs do programa Leica Qwin, foram tambm
padronizadas quanto intensidade da luz do microscpio e altura do
condensador com a objetiva de 40 x. Houve a obteno de valores mdios para
cada corte e depois para cada animal e ao final a mdia do grupo (controle,
laser ou LED nas diferentes horas ps-operatrias).
O programa utilizado para realizar a contagem das clulas inflamatrias,
fibroblasto, vasos neoformados e quantidade de colgeno presente na imagem
foi o programa Image J 1,42d. As imagens foram adquiridas atravs das
seguintes ordens de comando: File, open e o arquivo desejado. Para a
contagem das clulas a srie de comandos utilizados foi: Plugins, Analyze, Cell
Counter, Initialyze e Type (figura 5). Onde type 3 correspondia contagem de
clulas inflamatrias (figura 7), type 5 correspondia contagem de fibroblastos
(figura 6) e type 7 correspondia contagem de neovasos (figura 6), que foram
contados manualmente. Para medir a quantidade de colgeno, em m2, o
procedimento foi a sequncia de comandos: Image, Type, 8-Bit, em seguida
voltando em Image, Adjust, Threshold. Realizava-se a marcao e clicava-se
em Aply. Para finalizao da mensurao da rea de colgeno clicava-se em
Messure (figura 7).
50
51
52
5 RESULTADOS
5.1 Anlise macroscpica
5.1.1 Clculo de rea
A anlise da rea das feridas est cronologicamente representada na
figura 8.
Figura 8. rea da ferida dos diferentes grupos no decorrer de 480 horas. Valores expressos
em mdia erro padro, * p<0,05.
53
reduo de 26% somente neste perodo. Este percentual reduzido de
contrao da ferida no grupo LED (96 horas) foi compensado em 144 horas em
relao aos outros grupos. Observa-se que aps 312 horas os animais j
apresentavam completa ocluso da ferida (anexo B).
5.2 Anlise microscpica
Para a contagem de vasos, fibroblastos, clulas inflamatrias, e
quantidade de colgeno; foram selecionadas duas regies da derme,
superficial e profundo, sendo os resultados expressos nas tabelas 1 a 4 e
anexos C a F.
5.2.1 Contagem de Clulas inflamatrias
O resultado da contagem de clulas inflamatrias est expresso na
tabela 1.
Tabela 1 - Resultado da contagem de clulas inflamatrias encontradas 144, 312 e 480 horas
ps-leso, nos grupos controle, laser e LED.
CLULAS INFLAMATRIAS (n/rea 55.492 m2)
Controle
Laser
LED
Horas
Superficial
Profundo
Superficial
Profundo
Superficial
Profundo
127,022,4
110,98,0a,b 163,221,2a,b 97,014,8a,b 219,973,9a,b 68,55,5b,e
144
48,96,2
45,13,3
45,14,4
60,05,3c
56,812,2
42,73,4
312
34,53,4
37,32,5
19,52,4
23,76,3
14,32,3
16,11,7
480
Dados expressos em mdias e erro padro. Resultado considerado significativamente quando
p<0,05 (a- 144 vs 312, b- 144 vs 480, c- 312 vs 480, d- controle vs laser, e- controle vs LED, flaser vs LED).
54
A maior concentrao de clulas inflamatrias foi encontrada nos grupo
tratado com LED 144 em derme superficial, quando comparado aos demais
grupos (figura 9).
A144
B144
C144
A312
B312
C312
A480
B480
B480
Figura 9. Fotomicrografias de derme superficial dos grupos controle (A), grupo tratado com
laser (B) e grupo tratado com LED (C), nos diferentes momentos de reparao (144, 312 e 480
horas). H&E, 40X.
55
de p<0,001 e
Horas
168
336
504
56
A144
B144
A312
B312
A480
B480
C144
C312
C480
Figura 10. Fotomicrografias de derme profunda dos grupos controle (A), grupo tratado com
laser (B) e grupo tratado com LED (C), nos diferentes momentos de reparao (144, 312 e 480
horas). H&E, 40X.
57
Horas
144
312
480
36976,2767,4
40999,31.261,5
41998,21.785,6
41785,4626,8d
46271,1548,5d
47025,7610,5
39871,01.405,4
45022,5943,2
45346,2829,1
45747,61.613,0e
48611,01.015,1e
49711,66247,5e
47257,01.291,0e,f
46169,31.987,6
45790,11.627,8
58
59
6 DISCUSSO
Segundo Balbino, Pereira e Curi38 a diviso do processo de reparo da
leso feita em trs fases, sendo considerados, prioritariamente, os aspectos
macroscpicos e histolgicos predominantes em cada uma delas. Nessa forma
a viso e a descrio do processo, torna-se secundrio as caractersticas
assumidas pela leso, ao longo de sua evoluo, resultam da sucesso ou
sobreposio de eventos celulares e tissulares resultantes da ativao celular
por mediadores qumicos.
Com o envelhecimento ocorre uma reduo das funes corporais em
todos os nveis, bem como a diminuio da velocidade nas reaes corporais,
assim levando diminuio da cicatrizao, tendo em vista uma diminuio da
mitose e da vascularizao tecidual21.
A primeira fase da cicatrizao chamada de fase inflamatria e
caracterizada
por
aumento
do
fluxo
sanguneo,
alteraes
da
38,73
54,08
70,
57
60
apresentaram-se com menos celularidade nos grupos tratados, inferindo sobre
a normalizao de reatividade do tecido, como melhoria do pH, reduo de
produo de prostaglandinas, aumento da atividade mitocondrial, aumentando
os radicais oxidantes, que estimulam a cadeia respiratria e a produo de
ATP, que levam a sntese de DNA e RNA, consequentemente acarretando
mitoses e proliferao celular
74, 75
dificultosa
em
tcnicas
histolgicas
convencionais,
considerando
as
76
61
Segundo Li, Chen e Kirsner37 a formao de novos vasos ocorrem
devido pr-existncia de vasos adjacentes leso. Em resposta leso as
clulas endoteliais iniciam o processo de angiognse.
Na anlise do nmero de fibroblastos, em fase proliferativa (312 horas),
observou-se ausncia de diferena estatstica entre os grupos de estudo, o
mesmo ocorrendo nos estudos de Rabelo76 para feridas de animais saudveis
tratados com radiao eletromagntica coerente na regio do vermelho (632,8
nm). Entretanto diferenas significativas do nmero de fibroblastos foram
observadas no grupo LED 144 horas em relao ao grupo laser em 144 horas,
corroborando com estudos de base realizados por Vinck et al.71. Os autores
verificaram que em 144 horas a radiao eletromagntica no coerente na
regio do visvel promove aumento do nmero fibroblastos quando comparados
grupos LED no infravermelho e laser. Ainda que fora da fase proliferativa estes
dados so fundamentais para a compreenso dos resultados obtidos na rea
de colgeno obtida na fase de sntese para os grupos tratados com luz.
O fibroblasto desempenha um papel crucial na cicatrizao da ferida, a
maioria dos estudos publicados na literatura sobre a TLBP examinaram os
seus efeitos sobre fibroblasto, crescimento celular, migrao, e produo de
colgeno52.
70
62
produo de mediadores inflamatrios, como citocinas. O TGF uma
importante citocina que age durante o processo de cicatrizao, ativando a
proliferao celular. possvel que o laser atue sobre os macrfagos na cadeia
respiratria, reforando a produo TGF , o que inibe a diapedese dos
macrfagos no tecido conjuntivo. Este mecanismo pode explicar o reduzido
nmero de macrfagos e edema na derme irradiada em comparao com a
derme controle. O TGF tem um elevado nmero de efeitos biolgicos, como a
induo da diferenciao de fibroblastos em miofibroblastos e a angiognese e
a estimulao da sntese de colgeno
78
pesquisas
foram
feitas
com
utilizao
da
radiao
49,51,56,60,74,81
63
tratados com radiao eletromagntica no vermelho do que os animais que no
utilizaram esse tipo de terapia
49,80,82
dados obtidos nessa pesquisa, pois todos tanto os grupos tratados como os
grupos controles tiveram o mesmo tempo de cicatrizao. A nica diferena
observada em 96 horas aps o procedimento cirrgico, onde os grupos
controle e os grupos tratados com laser tinham uma rea de ferida menor que o
grupo tratado com LED, mas aps 144 horas do processo cirrgico no havia
diferena estatisticamente significante no tamanho da leso entre os trs
grupos. Posten et al.49 explica que os efeitos da cicatrizao em muitas vezes
so dependente de fatores intrnsecos, tais como a localizao e as tenses
sobre a ferida, como muito sobre como a terapia em si. Ferreira80 complementa
relatando dizendo que h atrasos na reepitelizao, tanto em humanos quanto
em animais idosos e que este atraso se deve mais ao processo sistmico do
que ao prprio processo de envelhecimento.
Vrios estudos foram realizados visando melhoria do processo de
reparao da pele atravs da luz Laser, mas a dificuldade observada ao
tentar estabelecer os parmetros que serviram de guias para a pesquisa, visto
os diferentes padres de utilizao da radiao Laser. Recentemente as
pesquisas cientficas tm-se voltado para a os efeitos da terapia com LED no
tecido biolgico e por esse motivo ainda h uma escassez de pesquisas sobre
seus efeitos. Outro ponto a ser levantado a grande variedade de parmetros
e padres na utilizao do LED, o que dificulta estabelecer um padro para o
tratamento das leses de pele. Muitos artigos tm como objetivo a melhora da
reepitelizao depois de uma leso, mas so raros aqueles que falam do
assunto no idoso, visto que a populao mundial vem envelhecendo. Com isso
faz-se necessrio mais pesquisas sobre o assunto aqui abordado.
64
7 CONCLUSES
Com os resultados obtidos verificou-se que o tratamento com a Luz
coerente e no coerente favoreceram o processo de reparao epitelial dos
ratos idosos, sendo que os animais tratados com a luz no coerente (LED) no
comprimento de onda do 64020 nm apresentaram melhores resultados
quando comparados com a luz coerente (Laser) no comprimento de onda no
660nm.
65
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72
Anexo A Certificado do Comit de tica e Pesquisa
73
Anexo B Tabela de dados da rea da leso dos diferentes grupos
experimentais
Grupos
Controle
Laser
LED
0h
0,5
0,5
0,5
48h
96h
144h
192h
240h
288h
336h 384h 432h 480
0,340,01 0,170,03 0,090,01 0,040,01 0,0060,004 0,00150 0
0
0
0
0,300,01 0,190,01 0,120,01 0,020,01 0,0030,001
0
0
0
0
0
0,350,02 0,260,01* 0,130,01 0,050,01
0,0010
0
0
0
0
0
74
Anexo C Grficos do nmero de clulas inflamatrias em derme profunda e
superficial
75
Anexo D Grficos do nmero de vasos sanguneos em derme profunda e
superficial
76
Anexo E Grficos do nmero de fibroblastos em derme profunda e superficial
77
Anexo F Grficos da quantidade de colgeno em derme profunda e
superficial