Acta Scientiae Veterinariae. 35(Supl.): S125-S130, 2007.

ISSN 1678-0345 (Print)

ISSN 1679-9216 (Online)

Tcnicas de diagnstico imunolgico em suinocultura

Andr Felipe Streck1, Danielle Gava2, Herbert Rech1 & Cludio Wageck Canal1
1

Laboratrio de Virologia, Faculdade de Veterinria, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, RS/Brasil.
2
Setor de Sunos, Faculdade de Veterinria, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, RS/Brasil.
CORRESPONDNCIA: Cludio Wageck Canal [Av. Bento Gonalves, 9090 CEP: 91540-000; cludio.canal@ufrgs.br].

1 INTRODUO
1.1 O que imunodiagnstico?
Testes de imunodiagnstico so aqueles que se baseiam na especificidade da resposta imune para detectar
anticorpos, antgenos ou linfcitos. Desta forma, pode-se fazer o diagnstico de infeces, detectar autoimunidade,
processos alrgicos ou neoplsicos e tambm para a deteco e ou quantificao de hormnios ou drogas [10].
Embora o mtodo mais seguro para se diagnosticar uma infeco seja o isolamento e a caracterizao do
agente infeccioso, isto nem sempre possvel de ser alcanado. Devido a localizao do agente em stios de difcil
acesso (ex.: encfalo), a no disposio de mtodos simples, prticos ou seguros para o isolamento ou cultivo do
agente infeccioso (ex.: infeces por vrus) e a administrao de drogas antiinfecciosas que impeam o crescimento
do patgeno in vitro. Nessas circunstncias, as tcnicas de imunodiagnstico so muito importantes, j que permitem
confirmar a infeco atravs da presena de antgenos dos agentes infecciosos ou, mais freqentemente, das pegadas deixadas por eles ao entrar em contato com o sistema imune [10,12].
1.2 Princpios e mtodos de imunodiagnstico
Os testes de imunodiagnstico baseiam-se no princpio da especificidade da resposta imune. Para se detectar anticorpos ou linfcitos utilizam-se como reagentes os antgenos ou seus componentes, enquanto que, para se
detectar os antgenos, so usados anticorpos [3].
Os mtodos de imunodiagnstico podem ser divididos em teste sorolgicos, quando detectam a presena
de anticorpos ou antgenos no soro ou em outros lquidos orgnicos e teste cutneos (ex.: teste intradrmico com
tuberculina), quando detectam a presena de linfcitos. So vrios os mtodos para a realizao dos testes sorolgicos:
precipitao, floculao, aglutinao, imunofluorescncia, testes imunoenzimticos e radioimunoensaios. Cada mtodo
apresenta caractersticas, aplicaes e limitaes prprias [8,12].
1.3 Interpretao dos testes de imunodiagnstico
A sensibilidade e especificidade so dois critrios importantes para a escolha de um mtodo de imunodiagnstico. Um mtodo ser considerado mais sensvel quanto menor a concentrao de anticorpos ou antgenos
ele for capaz de detectar. Quanto menos sensvel o teste, maior a probabilidade de deixar de detectar anticorpos ou
antgenos em concentraes baixas e, conseqentemente, maior ser a probabilidade de obteno de resultados
negativos falsos. A sensibilidade de um teste de imunodiagnstico depende do mtodo utilizado, da especificidade do
anticorpo, da antigenicidade e distribuio dos eptopos do antgeno. Existem mtodos muito sensveis, como os imunoenzimticos, capazes de detectar concentraes de anticorpos to pequenas quanto 0,0001 mg/mL, e outros menos
sensveis como os de precipitao, que s detectam anticorpos quando em concentraes superiores a 10 mg/mL.
Alm da baixa sensibilidade do teste, outras circunstncias podem causar resultados falso negativos, como o perodo
de janela imunolgica, o fenmeno de pr-zona e falhas tcnicas (reagentes fora do prazo de validade; inativao
dos anticorpos ou de reagentes por calor, cidos ou bases; no utilizao de controle positivo; erros de identificao
e de procedimento; dentre outros) [10,12].
Os antgenos utilizados nas tcnicas de imunodiagnstico para a deteco de anticorpos variam muito em
sua complexidade e grau de pureza. Podem ser empregados como antgenos desde pequenas seqncias peptdicas
at componentes bacterianos complexos, formados por muitos antgenos. Quanto mais simples e puro for o antgeno,

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maior ser a especificidade da tcnica, pois haver menor probabilidade de que ocorram reaes cruzadas com outros
antgenos e, em conseqncia, menor ocorrncia de resultados falso positivos. Diferentemente da sensibilidade, que
depende do mtodo de imunodiagnstico empregado, a especificidade depende das caractersticas do antgeno. Alm
da baixa especificidade do teste, outras situaes podem causar resultados falso positivos, como a vacinao prvia,
a administrao de soros hiperimunes ou imunoglobulinas, a transferncia passiva de anticorpos e falhas tcnicas
(erros de identificao e de procedimento; no utilizao de controle negativo; dentre outros) [6,10,12].
Como os agentes infecciosos compartilham seqncias antignicas entre si, determinado antgeno utilizado
em um teste de imunodiagnstico pode apresentar reatividade cruzada com anticorpos induzidos por outros agentes
infecciosos. A ocorrncia dessas reaes cruzadas pode dificultar a interpretao dos testes de imunodiagnstico.
Entretanto, o teste apresentar sempre ttulos mais elevados para anticorpos especficos para o antgeno do que
para anticorpos decorrentes de reatividade cruzada. Portanto, existe a necessidade de se estabelecer pontos-de-corte
(cut-off) para cada tcnica, ou seja, os ttulos (ou outra medida de quantificao) a partir dos quais os resultados
positivos indicam a presena de anticorpos especficos [6,10,12].
J o valor preditivo de um teste de imunodiagnstico indica seu grau de preciso e depende da sensibilidade
e especificidade do mtodo utilizado. A sensibilidade mede a percentagem de indivduos com testes positivos em
uma populao sabidamente positiva, enquanto a especificidade indica a percentagem de indivduos com testes negativos em uma populao sabidamente negativa. O valor preditivo do mtodo ser melhor quando sua sensibilidade e
especificidade se aproximarem de 100%.
A deteco de anticorpos por um teste de imunodiagnstico, mesmo com ttulos altos, no significa que o
indivduo esteja imune. Indica somente que o indivduo entrou em contato com o antgeno em algum momento de
sua vida. Para afirmar que determinado teste positivo corresponde a uma infeco atual ou recente necessrio detectar a elevao do ttulo de anticorpos da classe IgM, j que esta imunoglobulina a que aparece mais precocemente
aps o primeiro contato com o antgeno e a que mais cedo desaparece da circulao aps cessado o estmulo
antignico (devido sua curta meia vida). Ttulos elevados de IgG ocorrem mais tardiamente e podem permanecer
positivos por anos aps a infeco. Outro mtodo para se verificar se a presena de anticorpos indica infeco atual
ou passada consiste em coletar amostras pareadas de soro com pelo menos trs semanas de intervalo. A elevao
do ttulo de anticorpos de quatro vezes ou mais na segunda amostra de soro indica infeco atual, desde que testada
nas mesmas condies da primeira amostragem [3,5].

2 TCNICAS DE IMUNODIAGNSTICO
2.1 Soro-aglutinao rpida em placa (SARP)
A tcnica de soro-aglutinao rpida em placa (SARP) o mtodo sorolgico mais simples e comumente
utilizado. Sua realizao efetuada em superfcie de vidro, podendo ser uma placa especfica para o teste ou lmina
simples. O teste efetuado com a adio de uma gota de antgeno e uma gota da amostra de soro sobre esta superfcie. Este material deve ser homogeneizado, e suavemente agitado por cerca de 1 minuto. A leitura pode ser realizada
a olho nu ou com ajuda de lentes e a incidncia de luz. Caso existam anticorpos especficos (aglutininas) no soro, ir
ocorrer a formao de grumos ou floculao formada pelo complexo antgeno-anticorpo. A presena destes grumos
indicativa de que o soro possui anticorpos especficos para reagir com o antgeno utilizado [1,2,3,12].
Esta aglutinao (grumos) pode ocorrer em distintos graus, sendo possvel estimar atravs de tabelas
comparativas se o soro possui concentraes de anticorpos baixas ou altas. Entretanto, se ocorrer um excesso na
concentrao de anticorpos, pode ocorrer inibio da reao de aglutinao, fenmeno conhecido como pro-zona [12].
O teste de SARP um mtodo sensvel, quantitativo, porm apresenta baixa especificidade. Devido
presena de fenmenos como reaes cruzadas e pro-zona, este teste utilizado apenas como mtodo de triagem
em populaes sunas. Este teste pode ser utilizado para doenas como Leptospirose, Micoplasmose, Salmonelose,
Pasteurelose, Erisipelose, Febre Suna e Reoviruoses, dentre outras [8,11].
2.2 Imunodifuso em gel de gar (AGID)
A tcnica de imunodifuso em gel de gar (AGID) uma tcnica simples de precipitao de antgenos por
anticorpos. Esta tcnica permite a visualizao do complexo antgeno-anticorpo em uma linha de precipitao. A reao
normalmente realizada em laboratrios de diagnstico por difuso dupla, mtodo de Ouchterlony & Elek, onde o
antgeno e anticorpo podem migrar livremente em um meio semi-slido, como o gar ou a agarose [2].

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O teste realizado em camada simples de gar. Para isto, deve-se cobrir uma placa de Petry ou lmina
com uma soluo aquecida de agarose, formando uma camada slida de 2 a 4 mm de espessura. Aps esta camada
de gel solidificar, so realizadas perfuraes circulares (cavidades), com cerca de 5 mm de dimetro e 10 mm de
espaamento entre eles. Usualmente, utiliza-se um sistema radial de perfuraes, onde existe uma cavidade central
e cinco cavidades dispostas perifericamente. Na cavidade central adicionado o antgeno e nas cavidades perifricas
as amostras de soros a serem testadas. A seguir, o material incubado em cmara mida por 48 a 72 horas. Anticorpos
presentes no soro e antgeno iro migrar radialmente no gel de gar, conforme sua solubilidade e massa molecular.
Quando ambos reagentes se ligarem e atingirem concentraes timas (formao de complexo antgeno-anticorpo)
aparecer uma linha de precipitao branca e opaca. A leitura deve ser realizada em uma sala escura e a visualizao
da precipitao realizada com incidncia de um feixe de luz sob um fundo preto [2,4,12].
Para o teste ser validado, devem ser inseridos nas cavidades perifricas soros hiperimunes e um soro negativo para o antgeno. A linha de precipitao do soro testado considerada positiva quando esta possui identidade
com a linha formada pelo soro hiperimune, podendo estas unir-se e formar uma linha curva contnua. Quando houver
excesso de anticorpo, esta linha pode ir a uma posio mais central, e quando houver pouco anticorpo, assumir uma
posio mais perifrica [2,4,7].
As vantagens mais interessantes desta tcnica so sua simplicidade, custo e sensibilidade aceitveis. A
AGID, por no necessitar utilizao de equipamentos especiais, pode ser utilizada em laboratrios de pequeno porte
e locais com pouca infra-estrutura. Entre os inconvenientes desta tcnica, est sua moderada sensibilidade, alm do
perodo de realizao ser superior a 48 horas. Esta tcnica pode ser aplicada ao diagnstico de Febre Aftosa, Pseudoraiva, dentre outras doenas [8,11].
2.3 Inibio da Hemaglutinao (HI)
O mtodo de Inibio da Hemaglutinao (HI) utilizado para mensurar anticorpos, capazes de reagir com
antgenos capazes de induzir a aglutinao de hemcias. Alguns microrganismos possuem, em sua superfcie, estruturas capazes de se ligar a receptores presentes nas hemcias, produzindo o fenmeno de hemaglutinao (HA).
Estas estruturas so denominadas hemaglutininas e so constitudas de glicoprotenas. A ligao da hemaglutinina
do patgeno com o receptor da hemcia de suno regida primariamente pela especificidade estrutural, contudo, ainda
influenciam fatores como pH, temperatura, concentrao e composio inica do meio [2]. Neste mtodo, a presena
de anticorpos capazes de inibir a reao de HA do patgeno determina sua identificao sorolgica.
Para a execuo do HI, antes necessrio revelar a atividade biolgica do agente contra o qual o soro ser
testado, efetuando a constatao da HA. Para isto, uma suspenso de hemcias (usualmente 1%) incubada em
repouso com diluies seriadas do agente por um determinado perodo de tempo. Geralmente, utilizam-se placas de
micro-titulao com 96 cavidades em forma de V, o que torna o processo mais simples e de rpida execuo. Aps
a incubao, realizada a leitura da hemaglutinao. As hemcias que aglutinarem por ao do agente, iro sedimentar
no fundo da cavidade. Devido aglutinao, formaro uma fina camada de hemcias aglutinadas sob a superfcie da
cavidade. Por outro lado, as hemcias que no aglutinarem, tambm iro sedimentar, entretanto formaro um aglomerado de hemcias que ir se deslocar ao verter suavemente a placa. A recproca da maior diluio capaz de produzir
completa hemaglutinao das hemcias corresponde ao ttulo do agente testadoa uma unidade hemaglutinante. Aps
titulada a suspenso antignica (agente), comum empregar de quatro a oito unidades hemaglutinantes em um teste
[1,2,4,12].
A tcnica de HI inicia com a diluio seriada das amostras de soro em placas de micro-titulao. A suspenso antignica adicionada aos soros em quantidades constantes e a mistura incubada em repouso, por determinado
perodo e temperatura. Ao trmino da incubao, adiciona-se a suspenso de hemcias e realizada uma nova
incubao nas mesmas condies. Se na amostra de soro houver a presena de anticorpos especficos contra o
agente, os mesmos iro se ligar na hemaglutinina do patgeno e impedir que ocorra a hemoglutinao. Caso no haja
anticorpos no soro, a hemaglutinina ficar ativa e ir ocorrer a hemagutinao (Figura 1).
A reao positiva deste teste indica a presena de anticorpos e tambm pode ser utilizada para quantificar
(titular) os anticorpos, se forem testadas diluies seriadas do soro. As vantagens mais interessantes desta tcnica
so sua elevada sensibilidade e especificidade, o que proporciona a esta prova sorolgica ser considerada prova
padro-ouro mesmo em comparao a outros mtodos mais modernos e custosos (Tabela 1).
O mtodo de HI pode ser utilizado para deteco de anticorpos contra Parvovirose, Circovirose, Influenza,
Micoplasmose e Reovirose, dentre outros [8,11].

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Figura 1. Esquema ilustrativo do teste de HI, demonstrando a ao esperada das hemcias

frente a um soro positivo e um soro negativo para um determinado patgeno.
Tabela 1. Caractersticas mais relevantes dos mtodos de SARP, AGID, HI, ELISA e SN.
Mtodo

Facilidade
de execuo

Sensibilidade

Especificidade

Capacidade de
quantificao

Custo por prova

SARP

Fcil

Baixa

Baixa

Moderada

Baixo

AGID

Fcil

Baixa

Baixa

Ausente

Baixo

HI

Fcil

Mdia

Alta

Presente

Baixo

ELISA

Fcil

Alta

Mdia

Presente

Moderado

SN

Moderada

Mdia

Alta

Moderada

Elevado

2.4 Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)

O teste de ELISA foi descrito pela primeira vez em 1971 e, desde ento, tem sido considerado uma das mais
importantes tcnicas de diagnstico para a sade humana e produo animal. A deteco de um antgeno imobilizado
sobre uma fase slida (micro-placa de poliestireno) mediante anticorpos que direta ou indiretamente produzem uma
reao cujo produto, por exemplo, um colorante, mensurado por um espectrofotmetro. Os resultados so interpretados aps a leitura realizada por este equipamento, com uma absorbncia no comprimento de onda que varia entre
340 e 650 nm (de acordo com o cromgeno utilizado). Esta absorbncia ser proporcional quantidade do antgeno
ou do anticorpo especfico presente na amostra testada.
Dentre as variaes da ELISA (ELISA indireto, ELISA de competio por anticorpo, ELISA de competio
por antgeno e ELISA sanduiche), apenas o ELISA indireto e ELISA de competio por anticorpo visam a deteco
e titulao do anticorpo (Figura 2). O ELISA indireto o mtodo de ELISA mais utilizado. Ele consiste na sensibilizao
da micro-placa de poliestireno com um determinado antgeno, e a seguir, adiciona-se as amostras de soro a serem
testadas. realizado um processo de incubao e lavagem e, se houver anticorpos especficos no soro, eles iro
permanecer fixados ao antgeno. Aps, adiciona-se um anti-anticorpo conjugado a uma enzima, chamado simplesmente de conjugado. realizada nova lavagem e adicionado o substrato, que inicia uma reao em contato com a
enzima resultando em mudana de colorao. Desta forma, se houver anticorpos no soro, o conjugado ir se ligar,
possibilitando a mudana de colorao [2,4].
Por sua vez, no ELISA de competio, a amostra de soro a ser testada incubada previamente com o
antgeno e, apenas depois, adicionada sobre a micro-placa. As micro-placas deste mtodo de ELISA so sensibilizadas com o anticorpo, e deste modo, se houver anticorpo no soro testado, o antgeno no se ligar aos anticorpos

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Figura 2. Esquema ilustrativo das distintas metodologias da tcnica de ELISA (ELISA indireto, ELISA de competio com deteco do anticorpo, ELISA sanduche e ELISA de competio com deteco do antgeno).

sensibilizados na micro-placa. Aps realizar uma lavagem, este complexo antgeno-anticorpo formado inicialmente
ser descartado. Posteriormente, ao se adicionar o conjugado, estes no encontraro antgenos para se fixar e, igualmente, sero descartados em nova lavagem. Por isto, se o soro for positivo, o substrato no encontrar enzima para
reagir, e a colorao permanecer inalterada. Se no houver anticorpos no soro, o antgeno e posteriormente, o anticorpo conjugado com a enzima iro permancer na micro-placa, possibilitando alterao na colorao [2,4].
A tcnica de ELISA um mtodo simples e prtico, permitindo uma completa automao do sistema,
sendo possvel testar grande nmero de amostras simultaneamente e com o mnimo de pessoal. Os antgenos ou
anticorpos marcados podem ser estabilizados, podendo ser conservados por longo tempo. Alm disto, uma tcnica
rpida, com alta sensibilidade, podendo assim ser utilizada para deteco de anticorpos no soro, leite e secrees,
alm de poderem ser especficos para uma determinada classe de imunoblobulina (IgG, IgM, IgA ou IgE). Apresenta
como desvantagem o custo das micro-placas, Kits de reagentes e espectrofotmetro de placa, ocorrncia de reaes
inespecficas que podem diminuir a especificidade e no est disponvel para todos os agentes infecciosos. Esta
tcnica tem sido utilizada para Doena de Aujeszky, Brucelose, Peste Suna Clssica, Pleuropneumonia, Disenteria
Suna, Febre Aftosa, Gastrenterite Transmissvel, Parvovirose, PRRS, dentre outros. Devido a possibilidade de automao, tm sido a tcnica mais utilizada na monitoria e diagnstico de doenas de sunos e aves, tanto pelo servio
de defesa animal quanto pela agroindstria [7,8,9].
2.5 Soroneutralizao (SN)
O teste de soroneutralizao, tambm chamado de vrus-neutralizao, utilizado para detectar anticorpos
que possuem capacidade de neutralizar a infectividade do vrus ou a toxidade de um agente infeccioso. O teste,
geralmente, utiliza soro, mas eventualmente pode utilizar outros fluidos corporais que possuam anticorpos. Nessa
prova sorolgica, examina-se a amostra de soro frente ao vrus ou toxina suspeita de causar a infeco ou leso
celular. Pode ser utilizada para praticamente todas as infeces virais, sendo os seus resultados bastante confiveis.
O objetivo da prova no apenas o diagnstico, mas tambm epizootiolgico, ou seja, determinar a prevalncia e
distribuio de anticorpos contra um determinado agente. Pode ser executada para obterem-se resultados qualitativos
ou quantitativos. Como a neutralizao de um determinado vrus s ocorre por anticorpos especficos contra ele, essa
tcnica altamente especfica para todos os vrus ou toxinas utilizadas.
Inicialmente, incuba-se o soro-teste (inativado) com uma quantidade fixa do vrus para o qual se est pesquisando anticorpos. O procedimento bsico consiste em misturar diluies apropriadas de soro e vrus em microplacas de 96 orifcios, incubando-a em condies ideais de temperatura (37oC) e tempo (1, 2, ou 4h). Aps a incubao
do vrus com a amostra de soro a ser testada, a mistura adicionada a cultivos celulares susceptveis replicao

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do vrus (ou ao da toxina). O cultivo ento monitorado diariamente (durante 3 a 5 dias) para ver se h a produo
de efeito citoptico. Se o soro possua anticorpos, o vrus ser neutralizado (opsonizado) e no produzir dano as
clulas. Se o soro no possuir anticorpos, o vrus permanecer vivel e causar citopatologia nas clulas de cultivo.
Apresenta vantagens alta especificidade e sensibilidade, alm de ter a capacidade de determinar os ttulos
de anticorpos nas populaes imunizadas ou desafiadas a campo. Contudo os resultados so demorados e requer
laboratrio com estrutura para manipulao de cultivo celular. Uma desvantagem que pode diminuir sua sensibilidade
quando sua utilizao se d para a deteco de anticorpos contra vrus antigenicamente variveis, como os vrus
de genoma RNA. Neste caso, a utilizao de um vrus padro diferente dos vrus que ocorrem no campo pode levar
a resultados falso negativos.
So exemplos de viroses em que se pode fazer o diagnstico atravs de soroneutralizao a Doena de
Aujeszky, Rinite Atrfica, Estomatite Vesicular, Gastrenterite Transmissvel, Raiva, Doena de Teschen e Talfan, dentre
outras [7,8,9].

3 CONCLUSO
Atualmente, a suinocultura tem vrias de tcnicas de imunodiagnstico a disposio. A anlise dos resultados sorolgicos e a interpretao dos ttulos dos anticorpos permite a verificao da eficcia dos programas de
vacinao ou a deteco de desafios de campo na agroindstria. Este controle simultneo de inmeros patgenos
permite o estabelecimento de um perfil sorolgico para as diversas enfermidades. Desta forma, possibilita traar
planos vacinais e profilxicos exclusivos para cada propriedade, regio, poca do ano e categoria animal.
Dentre os mtodos de imunodiagnstico, no existe uma prova que possua fcil execuo, baixo custo e
de resultado sempre preciso. Poucos so baratos e quase todos eles apresentam dificuldades e problemas potenciais
na sua execuo. Por isto, existe uma tendncia para se adotar mtodos de imunodiagnstico cada vez mais sensveis, quantitativos, padronizados e automatizados, como os testes imunoenzimticos. Contudo, mesmo os mtodos
de menor sensibilidade ainda apresentam papel fundamental na suinocultura moderna, principalmente na triagem de
doenas.

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Supl. 1

www.ufrgs.br/favet/revista

S130