FACUAL

Mapeamento da resistncia do algodoeiro

mancha de ramulria (Ramularia areola) e
variabilidade do patgeno no Estado do Mato
Grosso

Relatrio Final

Perodo: Janeiro de 2005 a julho de 2006

Instituio Executora: Embrapa Algodo/Fundao Centro - Oeste
Data da Elaborao: 28/07/2006
Coordenador: Nelson Dias Suassuna

0 0

Campina Grande, 28 de julho de 2006

1 1

Apresentao
O presente relatrio versa acerca das atividades desenvolvidas, at a presente data, do projeto
Mapeamento da resistncia do algodoeiro mancha de ramulria (Ramularia areola) e variabilidade
do patgeno no Estado do Mato Grosso. O cronograma inicialmente proposto foi retardado, por conta
de atraso na aprovao e liberao de recursos do mesmo. Outra adequao ao projeto inicial foi a
insero de mais uma populao segregante envolvendo os gentipos VH-8 (G. barbadense) e
Guazuncho (G. hirsutum). Esses gentipos foram adicionados por j possuirmos RILs em homozigose
e serem contrastantes quanto reao doena.
Quanto ao estudo com o fungo Ramularia areola, descrevemos em detalhes um mtodo
simples, rpido e de baixo custo para produo massal de esporos visando inoculao artificial.
Tambm relatamos os resultados de variabilidade do patgeno com base em marcador molecular.

2 2

1.0

Introduo

Atualmente, esto identificadas cinqenta espcies de algodo do gnero Gossypium, distribudas

nos continentes, sia, frica, Austrlia e Amrica. Seis dessas espcies so alotetraplides (2n=4x=52)
e quarenta e quatro diplides (2n=2x=26).
O Algodo cultivado originrio de quatro espcies separadamente domesticadas G. hirsutum, G.
barbadense, G. arbreo e G. herbceo (Brubaker et al., 1999a; Brubaker e Wendel, 1994; Percy e
Wendel, 1990; Wendel, 1989; Wendel et al., 1992: Wendel et al., 1999). Nestes quatro casos, os povos
aborgines descobriram h diversos mil anos que aquelas propriedades originais das fibras do algodo
lhes eram teis para cordas, produo de roupas e outras aplicaes.
A melhoria na qualidade da fibra, o deslocamento da cultura para o cerrado, a mecanizao da
colheita, o uso de novas tcnicas de plantio e o desenvolvimento de cultivares mais adaptadas,
favoreceram a ganhos crescentes de produtividade e a reduo nos custos de produo impulsionando
o algodo nacional no mercado externo.
Todavia, o recente aumento nas reas plantadas na regio do cerrado deve-se s boas condies
ambientais que esta regio possui para seu cultivo, como relevo, solo e precipitaes. Entretanto, as
condies climticas (umidade elevada e temperaturas noturnas amenas) favorecem a incidncia de
doenas fngicas no algodoeiro.
As doenas que acometem o algodoeiro limitam a obteno de ndices satisfatrios de
produtividade. Uma das doenas mais importantes no cerrado brasileiro a mancha de ramulria,
causada pelo fungo Ramularia areola. A mancha de ramulria, at pouco tempo atrs, era considerada
uma doena secundria do algodoeiro que surgia no final do ciclo da cultura e auxiliava na desfolha
natural da planta (Cia, 1977; Cia e Salgado, 1997). Todavia, com o aumento da rea cultivada, cultivo
continuado de algodo e a suscetibilidade das cultivares em uso, a doena passou a surgir mais cedo e
causar desfolha precoce, implicando na necessidade de pulverizaes com fungicidas, as quais
variam, em mdia, de trs a quatro por safra. Os sintomas da doena so leses esbranquiadas,
iniciando-se pelas folhas mais velhas no tero inferior da planta, progredindo para os teros mdios e
superior, as quais induzem a desfolha precoce, acarretando perda de rea foliar fotossintetizante e,
conseqentemente, reduo da produo de fibra.
O controle qumico vem sendo empregado com sucesso. Entretanto, os custos so elevados e o
risco de insucesso dessa medida sempre existe, pois existe a possibilidade do surgimento e aumento
da freqncia de isolados do patgeno resistentes aos principais fungicidas em uso.
3 3

A resistncia gentica de cultivares preconizada como a medida mais eficaz e econmica de

controle da mancha de ramulria. Infelizmente, caractersticas como resistncia a doenas nem
sempre so correlacionadas com caractersticas agronmicas de interesse como produtividade, por
exemplo. A grande maioria das caractersticas herdveis de importncia econmica, como muitos
casos de resistncia doenas, resultam da ao conjunta de vrios genes (herana polignica). A
manipulao de caractersticas controladas por vrios genes mais complexa do que caractersticas
governadas por um ou poucos genes.
Mapas genticos de marcadores moleculares oferecem a possibilidade de estudar a arquitetura de
caractersticas quantitativas, ou seja, mapear e medir a magnitude do efeito dos principais fatores
genticos envolvidos no controle dessas caractersticas e, potencialmente, manipular esses fatores em
base individual durante os procedimentos de seleo e recombinao gentica.
Marcador qualquer caracterstica genticamente herdvel, que pode ser tanto morfolgica (cor
de flor) como obtida pelo DNA. Portanto um loco molecular que possua segregao mendeliana
considerado um marcador gentico. A vantagem do DNA sobre marcador morfolgico que o nmero
de diferenas em nvel de DNA que pode ser obtido entre dois indivduos imenso, quase infinito,
enquanto que o nmero de marcas morfolgicas bem restrito.
Marcadores Moleculares servem como ferramenta para uma srie de estudos genticos, por
consistirem em fragmentos de DNA, no so to suscetveis a alteraes no ambiente. Uma
metodologia usada no melhoramento gentico a Seleo Assistida por Marcadores. Consiste na
seleo de gentipos que contenham os marcadores ligados aos genes que conferem planta
resistncia, ao invs de se utilizar avaliao da resistncia da planta em si como critrio para sua
seleo. Isto aperfeioa o processo por evitar erros devidos falha ou escape da inoculao natural do
do fungo no campo. Para que isto seja vivel necessrio encontrar marcadores moleculares
estreitamente ligados aos genes de resistncia.
Inexistem estudos de herana da resistncia mancha de ramulria, todavia, com a expresso
contnua da severidade, ao invs de classes discretas, provvel que seja governada por mais de um
gene. Cultivares com maior nvel de resistncia (isto , com menor quantidade de sintomas mesmo na
presena do patgeno) ou tolerncia (isto , produtivas mesmo na presena do patgeno), que
possibilitem reduo de custos devidos a aplicaes de fungicidas e com bom potencial produtivo, so
buscadas no programa de melhoramento da Embrapa Algodo

4 4

2.0

Objetivos

Obter marcadores microsatlite e AFLP contrastantes entre um gentipo suscetvel e um

resistente a mancha de ramulria;

Iniciar estudos acerca da variabilidade do fungo Ramularia areola com base em

marcadores moleculares.

3.0 Materiais e Mtodos

Este trabalho est sendo realizado na Embrapa-Algodo em Campina Grande PB, nos
laboratrios de Biotecnologia e Fitopatologia.
3.1 Obteno de populaes segregantes
Foram realizados cruzamentos entre a cultivar Delta Opal (suscetvel mancha de ramulria) e a
linhagem CNPA CO 11612 (resistente), obtendo-se 15 plantas (F 1) que foram autofecundadas, de onde
obtivemos, 371 plantas F 2. O cruzamento inter-especfico (entre Gossypium hirsutum e G. Barbadense)
foi realizado com atraso devido florao tardia de G. barbadense.
3.2 Inoculao de R. areola nos gentipos VH8 e guazuncho
Uma segunda populao originada de Gossypium hirsutum (cultivar guazuncho) x G. barbadense
(cultivar VH-8) tambm foi envolvida no estudo. Desse cruzamento, dispomos de 140 RILs
(Recombinant Inbreed Lines). Essa populao foi gentilmente cedida pelo pesquisador do CIRAD, Marc
Giband, o qual participa do referido projeto. Os genitores desse cruzamento foram testados quanto
resistncia mancha de ramulria em condies controladas, visando estabelecer a reao de
sensibilidade nos parentais VH8 e guazuncho. Procedeu-se inoculao artificial em quatro plantas de
cada gentipo em cmara de crescimento (ambiente controlado, com 25 e umidade relativa do ar
acima de 85%). Inoculou-se uma suspenso de esporos com concentrao acima de 5 x 10 5
esporos/mL nas folhas at escorrimento. As plantas foram mantidas na cmara por 2 semanas. O
inculo foi preparado a partir de seis isolados do fungo crescidos em erlenmeyers contendo arroz
autoclavado (50 g de arroz parbolizado e 30 mL de gua) por 20 dias.

5 5

Observou-se uma necrose nos pontos de infeco em VH8, enquanto que ocorreu esporulao de
R. areola nas folhas do gentipo guazuncho, determinando-se, portanto, a suscetibilidade da cultivar
Guazuncho e a resistncia da cultivar VH-8, resistncia esta, desenvolvida como uma resposta de
hipersensibilidade (HR) infeco do patgeno. Esses resultados demonstram que esses gentipos
so contrastantes na reao ramulria e podem ser usados como parentais contrastantes na
construo do mapa gentico proposto.
3.3 Extrao de DNA vegetal
Amostras de DNA de folhas de cada um dos genitores (Delta Opal, CNPA CO 11612, Guazuncho
e VH-8) foram extradas a partir de cerca de 4 cm 2 de tecido vegetal oriundo de folhas novas de
algodoeiro foram transferidos para tubo de microcentrfuga de 1,5 ml e congelados imediatamente em
N2 lquido. O protocolo empregado para extrao de DNA genmico foi o do CTAB (cationic hexadecyl
trimethyl ammonium bromide) (Ferreira & Grattapaglia, 1998) com modificaes (Zhang & Stewart,
2000). Depois de congelado, o tecido foi macerado dentro do tubo de microcentrfuga com o auxilio de
um pistilo de vidro na presena de N 2 lquido. Aps macerao, adicionaram-se 600 l de tampo de
extrao com -mercaptoetanol (20 mM Tris-HCl, pH 8,0; 0,7 M NaCl, 10 mM EDTA, CTAB 1% e mercaptoetanol 1%) e agitou-se o tubo em vrtex por 30 s. Em seguida, os tubos foram acondicionados
em banho-maria a 65o C por 30 min, agitando-os a cada 5 min. Retiraram-se os tubos do banho-maria
deixando-os esfriar em temperatura ambiente e, em seguida, adicionaram-se 600 l de CIA
(clorofrmio- lcool isoamlico, na proporo de 24:1, respectivamente), e os tubos foram agitados por
inverso durante 5 min at obter uma emulso homognea. Os tubos foram centrifugados a 12000 rpm
por 5 min a 4o C. Nesta extrao, lipdios, protenas e a maioria dos polissacardeos so retidos na fase
orgnica inferior, enquanto DNA, RNA e alguns polissacardeos so retidos na fase aquosa superior.
Aps a centrifugao, transferiram-se as fases aquosa para novos tubos previamente marcados,
adicionaram-se 60 l de soluo de precipitao (10% CTAB e 1,4 M NaCl), misturou-se por inverso
durante 5 min e adicionaram-se 600 l de isopropanol frio (-20 o C). Em seguida, os tubos foram
centrifugados a 12000 rpm por 5 min a 4 C. O precipitado de DNA foi lavado duas vezes com 500 l de
etanol 70%, gelado, centrifugando a cada vez por 5 min. Lavou-se mais uma vez com 300 l de etanol
absoluto gelado, centrifugou-se por 5 min e deixou-se secar ao ar por 15 minutos sobre papel toalha. O
precipitado foi ressuspendido em 100 l de tampo TE (Tris-EDTA) e a seguir foi mantido por 30 min
em temperatura ambiente. As amostras foram armazenadas a -20 o C.

6 6

A estimativa da concentrao de DNA nas amostras foi realizada em gel de agarose (0,8%)
corado com brometo de etdio, por meio de comparao com marcadores de concentraes
conhecidas (25, 50 e 100 ng de DNA/L).
3.4 Obteno dos marcadores microssatlites (SSR)
Os marcadores microssatlites foram obtidos pela amplificao do DNA genmico inicialmente
dos gentipos Delta opal e CNPACO11612 e, posteriormente, de Guazuncho e VH8, com os primers
cujas seqncias foram publicadas por Nguyen et al. (2004) e Liu et al. (2000a e 2000b). A reao PCR
foi realizada a pH 8,3 em um volume total de 20uL, contendo 20ng de DNA genmico, 0,8pmol de cada
primer, 200umol de dNTP, 50mM de KCl, 10mM de Tris-HCl e uma unidade de Taq DNA polimerase.
Foram realizados 30 ciclos de temperatura, sendo cada ciclo composto por 93 C por 1 minuto (passo
1), 55oC for 2 minutos (passo 2) e 72 C por 3 minutos (passo 3), com uma extenso final de 72 C por
7 min. A velocidade de rampa (tempo para passar de uma temperatura para outra) entre os trs passos
foi de 42, 36 e 40 segundos, respectivamente. A concentrao de MgCl 2 e a temperatura de
anelamento do primer foram ajustadas para cada combinao de primer, de acordo com a
recomendao de quem os desenvolveu. Aps a reao foi adicionado 5ul de soluo contendo 20%
de Ficol, 0,01% de azul de bromofenol e, no caso de eletroforese em poliacrilamida, 60% de
formamida. Os fragmentos amplificados foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida 6%
contendo 6M de uria, e os gis corados com Nitrato de prata.
Foram realizados testes para deteco de marcadores microssatlites polimrficos com 112
primers microssatlites do CIRAD, entre Delta opal e CNPA CO11612 dos quais 10 se mostraram
polimrficos (Tabela 1), representando 8,9% de polimorfismo entre os testados.
Por serem indivduos da mesma espcie (G. hirsutum), D. opal e CNPA CO11612 no
apresentaram alto grau de polimorfismo com marcadores microssatlites, j que seriam necessrios
cerca de 250 primes polimrficos para gerar o mapa. A partir destes resultados identificamos que o
polimorfismo molecular intraespecfico dos gentipos de G. hirsurtum testadas foi baixo, dificultando o
mapeamento molecular.
Tabela 1: Primers polimrficos entre os gentipos de Gossypium hirsutum, Delta opal e CNPA
CO11612.
Loco
Cir 17
CIR 34
CIR 63

Cromossomo
c1/c10
c5
c20

Migrao da banda (pb) em DO

128
147
156

Migrao da banda (pb) em CO11612

131
146
154
7 7

CIR 121
CIR 148
CIR 216
CIR 249
CIR 364
CIR 373
CIR 381

c20
c12
c18
c4
c5
c5
c14

94
147
193
188
155
172/166
247

93
150
192
183
153
172
252

3.4 Obteno de marcadores AFLP

Os marcadores AFLP foram obtidos a partir de fragmentos gerados da digesto do DNA genmico
com enzimas de restrio tipo II, que clivam o DNA em stios especficos. Foram utilizadas duas
enzimas, uma de corte raro EcoRI, e outra de corte freqente MseI. Aps a clivagem do DNA, as
enzimas deixaram extremidades coesivas o que permitiu a ligao dos adaptadores, que consiste de
seqncias de nucleotdeos de fita dupla, permitindo assim a ligao dos iniciadores especficos a
essas seqncias, etapa chamada pr-amplificao, posteriormente foram realizadas as amplificaes,
com trs bases seletivas, com 11 combinaes de primers. Esta tcnica tambm baseada na
amplificao via PCR e os ciclos de denaturao, anelamento e extenso foram diferentes em cada
etapa.
Os fragmentos amplificados foram separados por eletroforese em gel de poliacrilamida 6%
contendo 6M de uria, e corados com nitrato de prata.
Foi verificado polimorfismo em 8 combinaes de primers, o que representou 81% das
combinaes de primers utilizadas. Foram encontradas 21 bandas polimrficas, num total de 394 locos,
portanto, o nvel de polimorfismo foi de 5,3%. Esses resultados foram relevantes, pois se verificou com
a tcnica AFLP, um maior numero de locos polimrficos identificados entre os gentipos estudados, em
uma nica reao PCR, com relao a outros marcadores moleculares como microssatlite.
3.5 Populao segregante

Entre Guazuncho e VH-8, estes primers do CIRAD j se mostraram polimrficos conforme

publicado por Lacape (2000). Portanto, esses gentipos foram eleitos para dar continuidade aos
trabalhos de mapeamento. As linhagens RILs provenientes do cruzamento entre Guazuncho e VH-8

8 8

foram plantadas em casa de vegetao e sero genotipadas (marcadores SSR) e fenotipadas

(inoculao artificial do patgeno) na prxima etapa do estudo.
3.6 Amostragem dos isolados de R. areola
Foram amostrados quatro municpios no Estado de Mato Grosso: Primavera do Leste, Pedra
Preta, Campo Verde e Novo So Joaquim. Em cada municpio foram obtidos at 10 amostras de folhas
com sintomas caractersticos da doena. Estas folhas foram enviadas ao Laboratrio de Fitopatologia
da Embrapa Algodo e procedeu-se isolamento.
3.7 Isolamento, cultivo in vitro e extrao de DNA do fungo
O isolamento direto de R. areola foi realizado em meio BDA (Batata, Dextrose e gar),
contendo estreptomicina (0,5 g.L-1). As colnias resultantes foram repicadas para placas de Petri
contendo o meio V8-10%, onde cada colnia foi carimbada nas novas placas diversas vezes. Em cada
local onde as colnias foram carimbadas originou-se uma nova colnia, e a partir dessas procedeu-se
a extrao de DNA fngico. Obtivemos 34 isolados do patgeno, os quais foram submetidos extrao
de DNA, seguindo o mesmo mtodo de extrao descrito para plantas anteriormente, diferindo apenas
a quantidade inicial de miclio, que foi em torno de 200 mg.
Reaes de PCR (45ciclos - 94 C 6, 35 1, 72 C 2) foram realizadas com cinco pares de
primers RAPD em 14 isolados representativos dos locais amostrados. As imagens dos gis de agarose
foram capturadas e armazenadas e a presena ou ausncia de todas as bandas foi registrada.
3.8 Quantificao da variabilidade gentica
As subpopulaes amostradas: 1) Pedra Preta (n=4 isolados), 2) Novo So Joaquim (n=4
isolados), 3) Primavera do Leste (n=3 isolados) e 4) Campo Verde (n=3 isolados) foram investigadas
para se determinar a estrutura gentica. Dados referentes aos marcadores moleculares (RADP) foram
utilizados para clculos de diversidade gentica. As bandas foram interpretadas como dois alelos
(presena ou ausncia) em um loco (Peever & Milgroom, 1994, McDonald, 1997). A diversidade
gentica de populaes de R. areola foi estimada pelo ndice de diversidade de Nei H (Nei, 1973). A
freqncia de alelos para cada loco RADP foi calculada para cada subpopulao e usada para estimar
a medida de diversidade gnica de Nei (1973), a qual indica a probabilidade de dois isolados,
escolhidos aleatoriamente em uma subpopulao, possurem alelos diferentes. A diversidade gentica
mxima 1, enquanto a mnima 0 (zero), indica uma populao geneticamente uniforme, formada por

9 9

uma linhagem clonal. Tambm foi calculada a estatstica Gst de Wright, coeficiente que mede
diferenciao gentica ocasionada por subestruturao de populaes, dada por Gst = (Ht Hs)/Ht, em
que Hs a mdia da diversidade gentica das sub-populaes e Ht a estimativa da diversidade
gentica de toda populao. As anlises de H, Gst, identidade gentica de Nei e a distncia entre
subpopulaes foram realizadas com auxlio do programa TFPGA verso 1.3 (Miller, 1997). Estimativas
de fluxo gnico foram calculadas com base na estatstica Gst. Calculou-se tambm o nmero mdio de
imigrantes (Nm) que deve ser trocado entre sub-populaes a cada gerao para manter o nvel de
similaridade gentica observado.
3.9 Variao gentica dentro e entre subpopulaes
42 locos RADP foram identificados nos isolados estudados, considerando todas as bandas
visveis, independente da intensidade. O ndice de diversidade gnica em toda a populao, em todos
os locos, variou de 0,0 a 0,489 (mdia de 0,154). Os valores de identidade gentica de Nei foram altos
e similares em todas as possveis combinaes envolvendo as quatro subpopulaes: 0,9160 (para a
comparao das subpopulaes Pedra Preta e Novo So Joaquim), 0,8327 (Pedra Preta e Primavera
do Leste), 0,8515 (Pedra Preta e Campo Verde), 0,9721 (Novo So Joaquim e Primavera do Leste),
0,9765 (Novo So Joaquim e Campo Verde) e 0,9835 (Primavera do Leste e Campo Verde).
A frao da variao gentica distribuda entre as subpopulaes - Gst (Nei, 1973) foi em
mdia 0,3593, indicando que mais de 35% da diversidade gnica est distribuda entre as quatro
subpopulaes. A medida de identidade gentica de Nei para os pares de subpopulaes em todos os
locos analisados, sugere baixa diferenciao entre as subpopulaes, confirmando em parte a
estatstica Gst. A diversidade gentica dentro de subpopulaes, Hs=0,0942, contribuiu para quase
toda a diversidade gentica total, Ht=0,147. O nmero mdio de migrantes foi estimado em 0,8916
indivduos em cada gerao entre as quatro subpopulaes, indicando que a cada ciclo de reproduo
do patgeno (cerca de 12 dias) ao menos um esporo alcana outra localidade dentro dos limites
geogrficos onde as amostras foram coletadas, o que confirma a alta taxa de migrao desse
patgeno, que disperso de maneira eficaz pelo vento. Esse fato corroborado pela alta identidade
gentica entre as subpopulaes.
A estatstica Gst particularmente alta para inferir acerca da clonalidade dos isolados
estudados. Maior nmero de isolados dever ser testado para inferir com maior segurana acerca da
distribuio da variao gentica entre subpopulaes. Se a variao existente for alta e estiver
distribda entre todas as subpopulaes amostradas ento riscos como quebra de resistncia gentica
com base em poucos genes de resistncia ou o surgimento de isolados do patgeno resistentes a

1010

fungicidas, principalmente queles com stio de atuao muito especficos, podero surgir em curto
espao de tempo.

3. 10 Mtodo para produo massal de esporos de Ramularia areola

O fungo Ramularia areola um patgeno hemibiotrfico, o que dificulta o seu cultivo in vitro.
Estudos em condies controladas necessitam de informaes sobre isolamento e meios de cultivos
que favoream o seu crescimento e esporulao. Foram montados dois ensaios com o objetivo de
avaliar a esporulao de dois isolados em funo do tempo de incubao. Uma suspenso de esporos
de cada isolado foi preparada a partir do crescimento do patgeno em meio V8 10%. 1mL da
suspenso foi transferido para erlenmeyers contendo arroz autoclavado (50g de arroz e 30mL de gua
destilada - ensaio 1) ou 300L para placas de Petri contendo 15ml meio V8 10% (ensaio 2). Os ensaios
foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial 2x4, sendo dois
isolados e quatro pocas de avaliao (7, 21, 28 e 35 dias aps a incubao), com duas repeties. As
placas ou erlenmeyers contendo o patgeno foram mantidos em 25C com 12 horas de luz. Para a
avaliao foram acrescentados s placas de Petri 10mL da gua destilada e uma gota de Tween, e aos
erlemmeyers 100mL de gua e duas gotas de Tween. Alquotas de 100L foram retiradas para estimar
a quantidade de esporos com auxlio de hemacitmetro. Houve interao significativa entre isolados e
tempo de avaliao em ambos ensaios (P=0,0019 Ensaios 1; P=0,0058 ensaio 2). O isolado Ra062
teve maior esporulao em arroz, enquanto que o isolado Ra042 produziu maior quantidade de
esporos em meio V8 10% aos sete dias aps a incubao. Maior quantidade de esporos foi obtida no
ensaio usando meio de arroz autoclavado, havendo uma tendncia de crescimento linear na
esporulao em funo do tempo para ambos os isolados.

1111

Campina Grande, 28 de julho de 2006

__________________________________
Nelson Dias Suassuna

1212

Pesquisador Responsvel

1313

5.0 Referncias Bibliogrficas

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