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Tcnicas Experimentais
3.1.
Conceitos bsicos de espectroscopia
A espectroscopia o estudo da interao da radiao com a matria,
consistindo na absoro, emisso ou espalhamento da radiao por tomos ou
molculas. A luz uma radiao eletromagntica, numa faixa restrita de
comprimentos de onda ( ~ 180 nm, ultravioleta, a ~ 900 nm, infravermelho). As
ondas eletromagnticas so caracterizadas por uma frequncia () e um
comprimento de onda (), sendo essas grandezas fsicas relacionadas pela equao
= c, onde c a velocidade da luz para um determinado meio.
As ondas eletromagnticas tambm possuem propriedades de partcula e se
comportam como partculas (ftons) com energia bem definida E=h, onde h a
38
39
3.2.
Espectroscopia de absoro
Em geral, uma transio eletrnica consiste em promover um eltron de um
orbital de uma molcula no estado fundamental para um orbital desocupado por
absoro de um fton. As transies eletrnicas de orbitais mais externos
correspondem espectroscopia de absoro na regio do ultravioleta e visvel. O
orbital molecular formado por dois orbitais atmicos s ou de um orbital
atmico p e um orbital atmico s. O orbital molecular se forma por dois orbitais
atmicos p. O orbital molecular n consiste de eltrons no ligantes localizados em
heterotomos tais como oxignio ou nitrognio. Para ilustrar os nveis de energia
de uma molcula e as transies entre os trs tipos de orbitais moleculares, a Fig.
Figura 3.1.
molecular ocupado de mais alta energia; LUMO: orbital molecular desocupado de mais
baixa energia) (Valeur, 2001).
40
3.1
3.2
A = cl
3.3
Logo,
Densidade ptica a absorbncia para uma espessura da amostra igual a
1 cm. A falha em obedecer dependncia linear da absorbncia com a
concentrao, segundo a lei de Beer-Lambert, pode ser devida a altas
concentraes, formao de agregados ou presena de outras espcies
absorvedoras.
O princpio de Frank-Condon
41
Figura 3.2
3.3.
Espectroscopia de fluorescncia
A fluorescncia um fenmeno que envolve a perda de energia de uma
molcula no estado excitado por emisso de luz. Quando a molcula absorve um
42
Figura 3. 3
F =
k F + k IC
kF
+ k IS + k q [Q ]
3.4
43
enquanto
que
espectro
de
absoro
fornece
informaes
44
Figura 3. 4
45
46
a fosforescncia caracteriza-se por tempos de vida longos que variam desde 104s
at valores na faixa de segundos.
O estudo de tempos de vida do estado excitado amplamente usado em
espectroscopia de fluorescncia e pode oferecer informaes sobre reaes
intermoleculares tais como: formao de dmeros, excmeros, transferncia de
energia, distncias moleculares e difuso rotacional. A natureza do decaimento de
fluorescncia pode revelar detalhes sobre o microambiente do fluorforo. Por
exemplo, mltiplas constantes de decaimento podem ser atribudas a um
fluorforo em microambientes diferentes ou a processos de estado excitado. O
tempo de vida estabelece a janela temporal durante a qual outros processos de
estado excitado (difuso rotacional e translacional, transferncia de energia,
relaxamento dipolar) podem alterar a emisso e serem detectados.
H dois mtodos utilizados para medir o tempo de vida de fluorescncia de
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onde
3.5
exp( t / )
3.6
(t) a podemos expressar
tambm como
I = exp(t / )
3.7
47
Figura 3.5
I (t ) = i exp(t / i )
i =1
3.8
I i (t ) dt
fi =
i i
I (t ) dt
3.9
i i
i =1
Com f i = 1 .
0
t I (t ) dt
I (t ) dt
3.10
48
i i
i =1
n
i i
= fi i
i =1
3.11
i =1
i i
i =1
n
= ai i
i =1
3.12
i =1
i
n
3.13
i =1
49
Figura 3.6.
(Valeur, 2001).
50
A supresso de
3.14
51
3.15
grfico intercepta o eixo das ordenadas em F0/F = 1 e sua inclinao nos fornece a
constante KSV. O valor de 1/KSV a concentrao do supressor para a qual
F0/F = 2, ou seja, 50% da intensidade suprimida.
Em geral, um grfico de Stern-Volmer linear indica uma nica classe de
fluorforos ou pelo menos todos igualmente acessveis ao supressor. Se existir
mais de uma classe de fluorforos, cujas acessibilidades ao supressor so
distintas, ento o grfico de Stern-Volmer j no ser linear.
importante observar aqui que apenas o grfico linear de Stern-Volmer no
prova a ocorrncia de supresso dinmica ou esttica. A medida de tempos de
vida o mtodo mais definitivo para poder distinguir a supresso esttica da
dinmica. A supresso esttica remove uma frao dos fluorforos observados.
Fluorforos complexados no so fluorescentes e observa-se apenas a
fluorescncia dos fluorforos no complexados. A frao no complexada no
perturbada, e o tempo de vida vai permanecer constante igual a 0. Portanto para
uma supresso esttica /0 = 1. Em contraste, a supresso dinmica um
processo que diminui a populao do estado excitado pela adio de uma taxa de
decaimento no radiativo, implicando no decrscimo do tempo de vida
(Fig. 3.7 A). Este decrscimo equivalente ao da intensidade de fluorescncia:
F0/F = 0/ para uma supresso dinmica.
Por outro lado, tomando em conta o coeficiente de difuso das molculas, a
supresso dinmica pode ser distinguida da esttica. A supresso dinmica
52
valores das constantes de supresso esttica sejam mais baixos (Fig. 3.7 B).
Figura 3.7.
Outro mtodo adicional para distinguir entre estes dois tipos de supresso de
fluorescncia envolve a anlise dos espectros de absoro das espcies em
contato. A supresso de fluorescncia dinmica afeta apenas os estados excitados
dos fluorforos, e assim nenhuma mudana no espectro de absoro observada,
enquanto que na supresso esttica a formao do complexo no estado
fundamental frequentemente resulta em perturbao do espectro de absoro do
fluorforo.
53
3.3.4.
Anisotropia de fluorescncia
Ao iluminar uma amostra com luz polarizada, geralmente a fluorescncia
emitida pela amostra polarizada, podendo ter uma polarizao diferente da de
excitao. A extenso de polarizao de emisso pode ser descrita em funo da
anisotropia (r0). A origem deste fenmeno est baseada na existncia de
momentos de dipolos de transio da absoro e emisso, que esto alinhados ao
longo de direes especficas dentro da estrutura do fluorforo. A Fig. 3.8, mostra
Figura 3.8.
2001).
54
por vrios fenmenos como a difuso rotacional, que a causa mais comum na
despolarizao. Medies de anisotropia revelam o deslocamento mdio angular
do fluorforo que ocorre entre a absoro e a subsequente emisso de um fton.
Este deslocamento angular depende da velocidade e extenso da difuso
rotacional durante o tempo de vida do estado excitado. Os movimentos de difuso
interna, por sua vez, dependem da viscosidade do solvente, do tamanho e da
forma das espcies que sofrem difuso.
Para fluorforos pequenos em soluo de baixa viscosidade, a difuso
rotacional mais rpida que a emisso e, consequentemente, ela despolarizada e
a anisotropia prxima de zero.
A medida de anisotropia de fluorescncia esta ilustrada na Fig. 3.9. Neste
caso a amostra excitada com luz polarizada verticalmente e o vetor campo
eltrico de excitao est orientado paralelo ao eixo z. A intensidade da emisso
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r = //
I
+
2
I
//
3.16
55
Figura 3.9.
3.17
56
Figura 3.10.
57
3.18
IVH = k S H I
3.19
3.20
G=
I HV
I HH
3.21
3.22
r=
IVV GIVH
IVV + 2GIVH
3.23
58
1
I (t )[1 + 2 r (t )]
3
3.24
I =
1
I (t )[1 r (t )]
3
3.25
sendo r(t) o decaimento de anisotropia. Geralmente r(t) pode ser descrito como
um decaimento multiexponencial:
r (t ) = r0 g j exp( t / c ) = r0 j exp( t / c )
j
3.26
sendo
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I // (t ) I (t )
I (t ) I (t )
= //
I // (t ) + 2 I (t )
I (t )
3.27
r (t ) I (t )dt
rS =
3.28
I (t )dt
r0
1+
3.29
59
c = V RT
3.30
Figura 3.11.
60
r(t ) = ( r0 r ) exp( / c ) + r
3.31
r0
1+ c
+ r
3.32
61
3.4.
Espectrometria de massa
A espectrometria de massa uma tcnica micro analtica utilizada para obter
informao do peso molecular e de caractersticas estruturais da amostra. uma
tcnica destrutiva. A espectrometria de massa capaz de fornecer informao
sobre a composio elementar de amostras, a estrutura molecular e a composio
qualitativa e quantitativa de misturas complexas. O requisito bsico para uma
anlise por espectrometria de massa a formao de ons livres em fase gasosa. O
alcance e a utilidade do mtodo de espectrometria de massa so dependentes do
processo de ionizao. A forma do espectro de massa de uma espcie molecular
altamente dependente do mtodo de ionizao usado.
O espectrmetro de massa um instrumento que utiliza um campo
Figura 3.12.
al. 2001).
62
63
Figura 3.13.
64
Figura 3.14.
ons produzido por um laser acelerado em direo do tubo analisador, onde se produz