INFLUÊNCIA de DIFERENTES CONCENTRAÇÕES de Enzima Lactase e Temp Sobre A Hidrolise Da Lactose

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CINCIAS RURAIS

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIA E TECNOLOGIA
DOS ALIMENTOS
INFLUNCIA DE DIFERENTES CONCENTRAES

DE ENZIMAS LACTASE E TEMPERATURAS SOBRE
A HIDRLISE DA LACTOSE EM LEITE
PASTEURIZADO
DISSERTAO DE MESTRADO
Ana Paula Trevisan
Santa Maria, RS, Brasil

2008
INFLUNCIA DE DIFERENTES CONCENTRAES DE

ENZIMAS LACTASE E TEMPERATURAS SOBRE A
HIDRLISE DA LACTOSE EM LEITE PASTEURIZADO
por
Ana Paula Trevisan
Dissertao apresentada ao Curso de Mestrado do Programa

de Ps-Graduao em Cincia e Tecnologia dos Alimentos, rea de
Concentrao em Cincia e Tecnologia dos Alimentos, da Universidade Federal
de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para obteno do grau de
Mestre em Cincia e Tecnologia dos Alimentos
Orientador: Prof. Ernesto Hashime Kubota
Santa Maria, RS, Brasil

2008
Universidade Federal de Santa Maria

Centro de Cincias Rurais
Programa de Ps-Graduao em Cincia e Tecnologia dos Alimentos
A Comisso Examinadora, abaixo assinada, aprova a Dissertao de Mestrado
INFLUNCIA DE DIFERENTES CONCENTRAES DE ENZIMAS

LACTASE E TEMPERATURAS SOBRE A HIDRLISE DA LACTOSE
EM LEITE PASTEURIZADO
elaborada por
Ana Paula Trevisan
como requisito parcial para obteno do grau de Mestre em Cincia e

Tecnologia dos Alimentos
Comisso Examinadora
Prof. Ernesto Hashime Kubota, Dr.

(Presidente/Orientador)
Prof. Neila S.P.S. Richards, Dra.

(Co-orientadora)
Prof. Luisa Helena R. Hecktheuer, Dra. (UFSM)
Prof. Clair Jorge Olivo, Dr. (UFSM)
Santa Maria, 28 de abril de 2008.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, pela minha existncia e pelas oportunidades concedidas por ele
ao longo de minha vida.
Aos meus pais, Felipe e Claudete, e minha irm, Rafaela, pelo carinho e apoio no
apenas durante a execuo deste trabalho, mas em todos os momentos de minha vida.
Ao meu noivo Douglas, pelo carinho, ateno, compreenso e grande colaborao

durante todo o experimento e a redao da dissertao, especialmente nas companhias,
caronas e lanches noturnos na UFSM, e s leituras e correes do texto.
Ao professor Ernesto Hashime Kubota e professora Neila S.P.S. Richards (UFSM),

pela orientao prestada durante a elaborao deste estudo, pelas sugestes, pela amizade,
pelo respeito e disposio constante.
professora Rosane Coradine Noal (UFSM), pela grande disposio em ajudar,

apoiar e aconselhar em todos os momentos ao longo do experimento, inclusive em questes
pessoais.
UFSM, por me possibilitar a oportunidade de participar desse mestrado, um sonho

realizado.
Aos professores do Programa de Ps-Graduao em Cincia e Tecnologia dos

Alimentos, por me auxiliarem e dirimirem dvidas.
Aos funcionrios Marialene Manfio e Moiss Alves Dias, pela disposio e prontido
em auxiliar-me nas tcnicas laboratoriais de anlise de alimentos, to conhecidas e praticadas
por eles.
professora Luisa Helena R. Hecktheuer (UFSM) e ao professor Clair Jorge Olivo

(UFSM),
por
me
concederem
honra
de
integrar
banca
examinadora.
A todos os colegas de mestrado, especialmente Diala, pelo auxlio no experimento,

principalmente na anlise microbiolgica.
s amigas Carline, Laura e Larissa, pela ajuda e pela companhia nos longos perodos
de experimento.
Enfim, a todos que direta ou indiretamente contriburam para a realizao deste

trabalho.
RESUMO
Dissertao de Mestrado
Programa de Ps-graduao em Cincia e Tecnologia dos Alimentos
INFLUNCIA DE DIFERENTES CONCENTRAES DE ENZIMAS LACTASE E
TEMPERATURAS SOBRE A HIDRLISE DA LACTOSE EM LEITE
PASTEURIZADO
AUTORA: ANA PAULA TREVISAN
ORIENTADOR: ERNESTO HASHIME KUBOTA
CO-ORIENTADORA: NEILA S. P. S. RICHARDS
Data e local de defesa: Santa Maria, 28 de abril de 2008.
A intolerncia lactose a intolerncia a carboidrato mais comum entre pessoas de
todas as faixas etrias e afeta cerca de 70% dos adultos do mundo. Devido prevalncia desta
condio na populao mundial, tem aumentado o interesse comercial nos leites e derivados
com teor reduzido de lactose. E isto pode ser obtido atravs da hidrlise da lactose,
principalmente pelo mtodo enzimtico, com a utilizao da enzima lactase. O grau de
hidrlise da lactose depende da dosagem da -galactosidase no leite e das condies de
processamento e por isto, extremamente importante avaliar a influncia dessas condies
para obteno do leite com teor reduzido de lactose, como temperatura durante a hidrlise e
concentrao da lactase, sobre a eficincia do processo de hidrlise e sobre as caractersticas
fsico-qumicas e microbiolgicas do produto final. O objetivo do presente estudo foi observar
a influncia de diferentes temperaturas e concentraes de enzimas lactase sobre a hidrlise
da lactose em leites pasteurizados. Foram utilizadas amostras de leite pasteurizado,
proveniente da Usina Escola de Laticnios (UFSM). A enzima lactase, fornecida por duas
empresas, foi adicionada ao leite em diferentes concentraes (0,1g/L; 0,2g/L; 0,5g/L; 0,8g/L
e 0,9g/L) e a hidrlise foi realizada a diferentes temperaturas (7,9C; 12C; 22C; 32C e
36,1C), sendo estas duas variveis combinadas entre si atravs da Metodologia de Superfcie
de Resposta (MSR) por delineamento central composto rotacional. A hidrlise foi
acompanhada por crioscopia at que esta se estabilizasse. Foram realizadas anlises fsicoqumicas e microbiolgicas antes e aps a hidrlise da lactose e anlise sensorial aps. A
adio da enzima lactase modificou caractersticas e propriedades fsico-qumicas do leite,
reduzindo pH, crioscopia, teores de gordura e lactose e aumentando densidade, extrato seco
total (EST), extrato seco desengordurado (ESD), teores de protena e glicose. Houve diferena
entre a eficincia das duas enzimas na reduo do teor de lactose. A hidrlise da lactose
atingiu valores de 80% a 100%, reduzindo o teor de lactose para menos de 1g/100g,
possibilitando a ingesto do leite por indivduos intolerantes a este carboidrato. As maiores
porcentagens de hidrlise e, conseqentemente, os menores teores de lactose foram
verificados em temperaturas de 15 a 30C e com o uso de concentraes de enzima de 0,6 a
1,0 g/L. A mdia da contagem total aps a hidrlise ultrapassou o limite estabelecido pela
legislao, porm, nas contagens realizadas por amostra de leite, com o uso da enzima 1, trs
tratamentos no excederam esse limite e com o uso da enzima 2, sete. Os maiores valores de
contagem total foram encontrados nas maiores temperaturas e com o uso de menores
concentraes de enzimas. As diferenas entre amostras de leite com teores de lactose
diferentes, no foram sensorialmente percebidas atravs do teste triangular.
Palavras-chave: Leite; hidrlise da lactose; intolerncia lactose; lactase; anlise
microbiolgica; anlise sensorial.
ABSTRACT
Master Thesis
Post-Graduation Program in Food Science and Technology
INFLUENCE OF DIFFERENT LACTASE ENZYMES CONCENTRATIONS AND
TEMPERATURES OVER THE HYDROLISIS OF LACTOSE IN PASTEURIZED
MILK
AUTHOR: ANA PAULA TREVISAN
SUPERVISOR: ERNESTO HASHIME KUBOTA
CO-SUPERVISOR: NEILA S. P. S. RICHARDS
Date and place of defense: Santa Maria, April 28, 2008.
The intolerance to lactose is the most common intolerance to carbohydrates among
people of all ages and it affects about 70% of the adult population worldwide. Due to the
prevalence of this condition on the world population, the commercial interest on milk and
derivatives with reduced amount of lactose has increased. Such product can be obtained
through lactose hydrolysis, mainly through the enzymatic method, using lactase enzyme. The
level of lactose hydrolysis depends on the dosage of -galactosidase in milk, as well as on its
processing conditions and, for this reason, it is extremely important to evaluate the influence
of such conditions concerning obtainment of milk with reduced amount of lactose, such as
temperature during hydrolysis and lactase concentration, over the efficiency of the hydrolysis
process and over the physical, chemical and microbiological characteristics of the final
product. The aim of the present study was to observe the influence of different temperatures
and concentrations of lactase enzymes over the lactose hydrolysis in pasteurized milks.
Samples of pasteurized milks from the Usina Escola de Laticnios (UFSM) were used.
Lactase enzyme, supplied by two companies, was added to the milk in different quantities
(0.1g/L; 0.2g/L; 0.5g/L; 0.8g/L e 0.9g/L) and hydrolysis was accomplished in different
temperatures (7.9C; 12C; 22C; 32C e 36.1C). These two variables were combined through
Response Surface Methodology (RSM) by rotational composed central delineation.
Hydrolysis was followed by crioscopy until it reached stabilization. Physical, chemical and
microbiological analysis were carried out before and after lactose hydrolysis, and sensorial
analysis was carried out after hydrolysis. Lactase enzyme input modified physical and
chemical properties and characteristics of milk, reducing pH, crioscopy, fat and lactose levels
and increasing density, total dry extract (TDE), free-fat dry extract (FDE), glucose and protein
levels. There was a difference between the efficiency of the two enzymes on the reduction of
the lactose level. Lactose hydrolysis reached values in between 80% and 100%, reducing
lactose level to less than 1g/100g, thus enabling milk ingestion by individuals who are
intolerant to this carbohydrate. Higher percentages of hydrolysis and, consequently, lower
lactose levels were verified in temperatures in between 15 and 30C, using enzyme
concentrations in between 0.6 and 1.0 g/L. The average total count after hydrolysis was
beyond the limit established by law, but concerning the count per milk sample, using enzyme
1 and 2, treatments three and seven did not exceed this limit, respectively. Higher values of
total count were found at the highest temperatures and using lowest enzyme concentrations.
Differences among milk samples with different lactose levels were not sensorially perceived
through triangular test.
Key words: Milk; lactose hydrolysis; lactose intolerance; lactase; microbiological analysis;
sensorial analysis.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 Estrutura qumica da lactose...............................................................................16
FIGURA 2 Hidrlise da lactose.............................................................................................18
FIGURA 3 Modelo central composto rotacional para 2 fatores............................................28
FIGURA 4 pH do leite conforme temperatura e concentrao da enzima lactase 1..............33
FIGURA 5 pH do leite conforme temperatura e concentrao da enzima lactase 2..............33
FIGURA 6 Densidade do leite conforme temperatura e concentrao da enzima
lactase 1...............................................................................................................35
FIGURA 7 Densidade do leite conforme temperatura e concentrao da enzima
lactase 2...............................................................................................................36
FIGURA 8 Crioscopia do leite conforme temperatura e concentrao da enzima
lactase 1..............................................................................................................37
FIGURA 9 Crioscopia do leite conforme temperatura e concentrao da enzima
lactase 2...............................................................................................................37
FIGURA 10 Percentual de hidrlise estimada, conforme temperatura e concentrao
da enzima lactase 1...........................................................................................38
FIGURA 11 Percentual de hidrlise estimada, conforme temperatura e concentrao
da enzima lactase 2............................................................................................39
FIGURA12 Valor estimado de lactose final conforme temperatura e concentrao
FIGURA 13 Valor estimado de lactose final conforme temperatura e concentrao
FIGURA 14 Percentual de hidrlise encontrada, conforme temperatura e concentrao
FIGURA 15 Percentual de hidrlise encontrada, conforme temperatura e concentrao
10
FIGURA 16 Valor encontrado de lactose, conforme temperatura e concentrao da

enzima lactase 1.................................................................................................44
FIGURA 17 Valor encontrado de lactose, conforme temperatura e concentrao da
enzima lactase 2.................................................................................................45
FIGURA 18 Valor estimado de lactose durante a hidrlise, para as enzimas 1 e 2,
na temperatura de 12 C e nas concentraes de enzima de 0,2 e
0,8 g/L................................................................................................................47
na temperatura de 22 C e nas concentraes de enzima de 0,1; 0,5
e 0,9 g/L.............................................................................................................47
na temperatura de 32 C e nas concentraes de enzima de 0,2 e
0,8 g/L................................................................................................................48
nas temperaturas de 7,9 e 36,1 C e na concentrao de enzima de
0,5 g/L................................................................................................................49
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 Composio aproximada do leite (% em peso)..................................................14
TABELA 2 Aplicaes biotecnolgicas da enzima -galactosidase.....................................22
TABELA 3 Variveis independentes e nveis de variao....................................................29
TABELA 4 Delineamento experimental para as duas variveis independentes...................30
TABELA 5 Parmetros fsico-qumicos da matria-prima e das amostras aps a reao
de hidrlise.........................................................................................................31
TABELA 6 Quantidades de lactose final estimadas para cada temperatura, enzima
e concentrao utilizadas...................................................................................46
TABELA 7 Contagem total da matria-prima e das amostras aps a reao de
hidrlise..............................................................................................................50
TABELA 8 Contagem total de microrganismos presentes nas amostras e perodo por
tratamento e enzima utilizada............................................................................51
SUMRIO
RESUMO...................................................................................................................................5
ABSTRACT...............................................................................................................................6
LISTA DE FIGURAS...............................................................................................................7
LISTA DE TABELAS..............................................................................................................9
1 INTRODUO....................................................................................................................11
2 OBJETIVOS.........................................................................................................................12
2.1 Objetivo Geral...................................................................................................................12
2.2 Objetivos Especficos........................................................................................................12
3 REVISO BIBLIOGRFICA...........................................................................................13
3.1 Leite....................................................................................................................................13
3.2 Lactose...............................................................................................................................16
3.2.1 Hidrlise da lactose.........................................................................................................17
3.2.2 Intolerncia lactose.......................................................................................................19
3.3 Lactase...............................................................................................................................21
3.4 Anlise Sensorial...............................................................................................................22
4 MATERIAL E MTODOS................................................................................................24
4.1 Material.............................................................................................................................24
4.1.1 Matria-prima..................................................................................................................24
4.1.2 Enzima lactase.................................................................................................................24
4.2 Mtodos.............................................................................................................................24
4.2.1 Tratamentos.....................................................................................................................24
4.2.2 Anlises fsico-qumicas.................................................................................................25
4.2.3 Anlise microbiolgica...................................................................................................26
4.2.4 Anlise sensorial.............................................................................................................26
4.2.5 Planejamento estatstico..................................................................................................27
4.2.6 Anlises estatsticas.........................................................................................................30
5 RESULTADOS E DISCUSSO........................................................................................31
5.1 Anlises fsico-qumicas...................................................................................................31
5.2 Anlise microbiolgica.....................................................................................................50
5.3 Anlise sensorial...............................................................................................................52
6 CONCLUSES...................................................................................................................54
7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS..............................................................................55
11
1 INTRODUO
O leite considerado o mais nobre dos alimentos, pois sua composio rica em
protena, gordura, carboidratos, sais minerais e vitaminas, proporciona nutrientes e proteo
imunolgica ao neonato, e alm de suas propriedades nutricionais, oferece elementos
anticarcinognicos (MLLER, 2002). Porm, cerca de 70% da populao adulta do mundo
no pode consumir este alimento, pois incapaz de digerir a lactose, principal carboidrato do
leite (BEYER, 2002; SCHLIMME, BUCHHEIM, 2002).
A intolerncia lactose a reao adversa a carboidrato mais comum e afeta pessoas
de todas as faixas etrias. causada por uma deficincia de lactase, a enzima que digere o
acar do leite. A lactose que no hidrolisada em galactose e glicose permanece no intestino
e atua osmoticamente para atrair a gua para o intestino. As bactrias colnicas fermentam a
lactose no digerida, gerando cidos graxos de cadeia curta, dixido de carbono e gs
hidrognio, podendo resultar em inchao, flatulncia, clicas e diarria (BEYER, 2002). A
severidade desses sintomas depende da quantidade ingerida e da quantidade de lactose que
cada pessoa pode tolerar (SUENAGA et al., 2001).
Em vrios estudos, a ingesto de leite com lactose hidrolisada tem reduzido os
sintomas em pessoas intolerantes a esse carboidrato (VESA, MARTEAU, KORPELA, 2000).
A hidrlise da lactose um processo promissor para a indstria de alimentos, pois possibilita
o desenvolvimento de novos produtos sem lactose em sua composio (LONGO, 2006) ou
com um teor reduzido desse carboidrato, que pode ser consumido por indivduos intolerantes,
alm de prevenir a cristalizao da lactose na produo de sorvetes, de produtos fermentados
como o iogurte, de leite condensado e doce de leite (CARMINATTI, 2001; SANTIAGO et
al., 2004; OLIVEIRA, 2005).
A hidrlise enzimtica, atravs da enzima -galactosidase, um dos mtodos mais
interessantes para reduo do teor de lactose no leite e nos seus derivados (MATIOLI et al.,
1994), sendo que o grau de hidrlise da lactose depende da dosagem da lactase no leite e das
condies de processamento (VINHAL, 2001).
Assim sendo e tendo em vista os fatos acima, torna-se extremamente importante
avaliar a influncia das condies de processamento para obteno do leite com teor reduzido
de lactose, como temperatura durante a hidrlise e concentrao da lactase, sobre a eficincia
do processo de hidrlise e sobre as caractersticas fsico-qumicas e microbiolgicas do
produto final.
12
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Estudar a influncia de diferentes concentraes de enzimas lactase e temperaturas

sobre a hidrlise da lactose em leite pasteurizado.
2.2 Objetivos especficos
- Acompanhar a hidrlise da lactose e comparar o mximo percentual de hidrlise

alcanado e o tempo para atingir este valor conforme temperatura, enzima utilizada e sua
concentrao.
- Avaliar a eficincia de enzimas de marcas diferentes na hidrlise da lactose.
- Determinar e comparar as caractersticas fsico-qumicas do leite antes e aps a
reduo do teor de lactose.
- Determinar e comparar as caractersticas microbiolgicas do leite antes e aps a
hidrlise da lactose.
- Comparar as caractersticas sensoriais dos leites com teores reduzidos de lactose,
verificando a percepo de diferenas entre amostras com teores de lactose diferentes.
13
3 REVISO BIBLIOGRFICA
3.1 Leite
Segundo a legislao brasileira, entende-se por leite, sem outra especificao, o

produto oriundo da ordenha completa e ininterrupta, em condies de higiene, de vacas
sadias, bem alimentadas e descansadas (BRASIL, 2002). um alimento lquido que contm
aproximadamente 86% de gua e est constitudo por uma mistura de vrias substncias como
lactose e minerais em soluo, protenas, gorduras na forma de emulso, vitaminas e gases
(ORNELLAS, 1995).
Desde os primrdios da civilizao, o leite tem sido utilizado na alimentao humana
como fonte de protena, gordura, energia e outros constituintes essenciais (TRONCO, 2003).
considerado a primeira fonte de nutrientes para os mamferos e a maior fonte de clcio
absorvvel disposio do homem (SOUSA, RIBEIRO, 2005). Para Mller (2002), o leite
considerado o mais nobre dos alimentos, pois sua composio rica em protena, gordura,
carboidratos, sais minerais e vitaminas, proporciona nutrientes e proteo imunolgica ao
neonato, e alm de suas propriedades nutricionais, oferece elementos anticarcinognicos,
presentes na gordura, como o cido linolico conjugado, esfingomielina, cido butrico,
caroteno, vitaminas A e D.
Vrios so os componentes do leite. O que se apresenta em maior proporo a gua,
sendo os demais formados principalmente por gordura, protenas e carboidratos, todos
sintetizados na glndula mamria e encontrados em soluo na gua. Existem tambm
pequenas quantidades de substncias minerais, substncias hidrossolveis transferidas
diretamente do plasma sanguneo, protenas especficas do sangue e traos de enzimas
(TRONCO, 2003). Na Tabela 1 apresentada a composio aproximada do leite.
14
Tabela 1 Composio aproximada do leite (% em peso).

gua
87,0
Gordura
Extrato seco total
4,2
Extrato seco
protenas........................3,3
desengordurado
casena..................2,7
8,8
13,0
prot. do soro.........0,6
prot. da membrana do
glbulo de gord....0,04
lactose...........................4,7
minerais.......................0,65
c. orgnicos...............0,18
compostos
orgnicos
minoritrios.................0,14
Fonte: SCHLIMME, BUCHHEIM (2002) (adaptado).
A gua o componente mais abundante, no qual se encontram em soluo os demais

compostos. A gordura do leite est formada, em sua maior proporo, por triglicerdeos (9798%), pequenas quantidades de esteris, cidos graxos livres e fosfolipdeos. Os glbulos de
gordura encontram-se protegidos por uma membrana de natureza protica, na qual ficam
associados fosfolipdeos, protenas e outras substncias. As protenas do leite so subdivididas
em casena (80%) e protenas do soro (20%). A casena uma substncia coloidal, complexa,
associada ao clcio e ao fsforo, podendo ser coagulada por ao de cidos, coalho e/ou
lcool e formada por vrias submicelas (S1, S2), , e , mantidas unidas por interaes
hidrofbicas e pontes salinas, apresentando um comportamento distinto frente ao clcio. As
protenas do soro so formadas pelas fraes: albumina do soro, -lactoalbumina, lactoglobulina, imunoglobulinas e protease-peptonas. A lactose encontra-se totalmente em
soluo verdadeira na fase aquosa do leite. As substncias minerais so designadas cinzas e
so formadas pelo clcio, que representa um papel muito importante para a sade humana,
fsforo, e quantidades pequenas de sdio, potssio, magnsio, flor, iodo, enxofre, cobre,
zinco, ferro, entre outras. O leite contm ainda diversas vitaminas, classificadas como
lipossolveis (A, D, E, e K) e hidrossolveis (B e C) (TRONCO, 2003).
A composio do leite caracterstica para cada espcie e, portanto, diferente entre
elas. Tambm varia dentro de uma mesma espcie de acordo com raa, idade, estgio de
lactao, alimentao, manejo e estado sanitrio dos animais (SCHLIMME, BUCHHEIM,
15
2002). E ainda sofre influncia do ambiente, atravs da estao do ano (variaes sazonais) e
da temperatura ambiental (TRONCO, 2003). Porm, embora exista essa variao, as relaes
entre os diversos constituintes do leite so muito estveis, podendo ser utilizadas para indicar
se houve adulterao na sua composio (Blowey apud ANDRADE, 2005).
Por sua composio completa e balanceada, o leite um substrato ideal para o
desenvolvimento de diversos grupos de microrganismos. Os componentes do leite, incluindo
protena, gordura, lactose e outros constituintes menores, so considerados substratos
passveis de serem utilizados e degradados por estes microrganismos. Bactrias, leveduras,
fungos, vrus e outros podem provocar significativas alteraes no leite e mesmo sua
contaminao, sendo o grupo das bactrias o com maior representatividade. Estas alteraes
podem ocorrer devido produo de cido (bactrias lticas) e gs (coliformes), aumento da
viscosidade do leite (Alcaligenes viscolatis, Aerobacter aerogenes e certos micrococos),
protelise (Bacillus), liplise (Pseudomonas, Achromobacter, leveduras do gnero Candida,
fungos do gnero Penicillium), produo de sabores variados (a malte bactrias lticas,
amargos bactrias proteolticas, de batata Pseudomonas graveolens, a sujo bactrias
coliformes, a medicamento Aerobacter aerogenes, a leveduras) e produo de cor
(TRONCO, 2003). Alm destas alteraes, a proliferao dos microrganismos pode trazer
prejuzos sade do consumidor e causar problemas no processamento industrial (VINHAL,
2001).
Os fatores higiene, tempo e temperatura so fundamentais na qualidade
microbiolgica do leite e determinam a contagem bacteriana. A taxa de multiplicao dos
diferentes tipos de microrganismos est relacionada diretamente com a temperatura de
armazenamento do leite (TRONCO, 2003). A populao de coliformes, por exemplo, duplica
a cada 20 a 30 minutos quando o leite submetido temperaturas de 25 a 40 C, enquanto
que mantido sob temperaturas de 2 a 5C, reduz-se a possibilidade de multiplicao das
bactrias capazes de transformar a lactose em cido ltico (VINHAL, 2001). Segundo Kocin
(apud LONGO, 2006), a temperatura de 40C ideal para a proliferao de microrganismos
patognicos no leite. Por estes motivos, preciso cuidado no processamento do leite,
procurando evitar a proliferao dos microrganismos e os problemas decorrentes dela.
As principais propriedades fsico-qumicas do leite so: pH, que varia de 6,4 a 6,9
(TRONCO, 2003); acidez, que varia de 0,14 a 0,18 g de cido ltico em 100mL; densidade
relativa, que varia de 1.028 a 1.034 g/mL e ndice crioscpico mximo de -0,512C (BRASIL,
2002). Essas propriedades auxiliam na caracterizao do leite e determinao da sua
qualidade.
16
O ndice crioscpico definido como a temperatura em que o leite passa do estado

lquido para o estado slido (TRONCO, 2003). O ponto de congelamento do leite, assim
como o de qualquer soluo aquosa, est diretamente relacionado com a concentrao dos
constituintes solveis na soluo (MONTIP, 1992). Por este motivo e por ser a mais
constante das caractersticas do leite, a propriedade fsico-qumica mais eficiente na anlise
qualitativa do leite. O ponto de congelamento determinado principalmente pela
concentrao dos componentes em soluo como lactose, alguns minerais, certas protenas e
gases como o oxignio, nitrognio e dixido de carbono, sendo que entre estes, os
componentes de baixo peso molecular, como a lactose e os cloretos so os que o afetam em
maior grau (Pinkerton, Peters apud MONTIP, 1992).
3.2 Lactose
Como pode ser observado na Tabela 1, a lactose o componente majoritrio do

extrato seco do leite, podendo variar de 4,5 a 5,2 g% conforme alimentao e intervalos de
lactao. tambm o principal carboidrato do leite de vaca (SCHLIMME, BUCHHEIM,
2002). Sua concentrao relativamente constante e est pouco sujeita variaes estacionais
(MAHAUT et al., 2004).
A lactose um dissacardeo constitudo por um radical -D-galactose e um radical Dglicose e considerada um acar redutor, porque o grupo no carbono anomrico da poro
glicose no est envolvido na ligao glicosdica, portanto, ela est livre para reagir com
agentes oxidantes (CAMPBELL, 2000). Na Figura 1 est representada a estrutura qumica da
lactose.
Figura 1 Estrutura qumica da lactose.

Fonte: CAMPBELL (2000).
17
A lactose tem como caractersticas a baixa solubilidade em gua (15 a 20%) e o baixo
poder adoante, quando comparada a outros acares (TOMS, 1998; TRONCO, 2003).
Quando comparada com a sacarose, cerca de dez vezes menos solvel (Valsechi apud
LONGO, 2006) e apresenta um poder edulcorante seis vezes inferior (MAHAUT et al., 2004).
Faz parte, juntamente com as substncias minerais, como fsforo, sdio e cloretos, das
substncias com atividade osmtica do leite. A retirada da lactose pode provocar uma reduo
de mais de 50% do ponto de congelamento (SCHLIMME, BUCHHEIM, 2002).
A molcula de lactose contm um nmero de stios ativos que a tornam sensvel a
modificaes enzimticas e/ou qumicas, sendo esta uma caracterstica comum aos
carboidratos (CARMINATTI, 2001).
Fisiologicamente, a lactose uma substncia energtica e seus monossacardeos
entram na constituio de cerebrosdios, abundantes na massa cerebral e mielina nervosa
(Behmer, Eskin apud CARMINATTI, 2001). No organismo humano age como uma
promotora na absoro e reteno de clcio no intestino e na absoro de magnsio e
mangans (MANAN, KARIM, KIT, 1999). Tambm prolonga a ao da vitamina D, em caso
de reduo da radiao solar, e ajuda na preveno do raquitismo e da osteomalcia (Kocin
apud LONGO, 2006). A utilizao da lactose pela microflora intestinal resulta na produo de
cido ltico e na diminuio do pH, promovendo o desenvolvimento da microflora intestinal
lactoflica desejvel, inibindo o desenvolvimento de bactrias putrefativas e patognicas
(TRONCO, 2003).
3.2.1 Hidrlise da lactose
uma reao necessria para a digesto da lactose. A lactose hidrolisada pela

enzima lactase, a nvel de mucosa intestinal, em dois monossacardeos, a glicose e a
galactose, carboidratos mais simples, que so melhor absorvidos pelo organismo
(CAMPBELL, 2000; BEYER, 2002).
Na Figura 2 est representada a reao de hidrlise da lactose.
18
Figura 2 Hidrlise da lactose.

Fonte: Goursaud apud LONGO (2006).
Segundo Schlimme e Buchheim (2002), a hidrlise da lactose cada vez mais

importante para seu uso alimentar, pois modifica a solubilidade da lactose, o dulor, o poder
redutor e a fermentabilidade e consegue-se, sobretudo, fazer com que seja digervel pelos
consumidores intolerantes a esse carboidrato. Devido ao alto nvel de lactose presente no leite,
o consumo deste alimento fica restrito para as pessoas intolerantes e, por este motivo, a
reduo do teor de lactose no leite e nos seus derivados de grande importncia nutricional e
comercial (SILVA, CARDOSO, 2007).
um processo promissor para a indstria de alimentos porque possibilita o
desenvolvimento de novos produtos sem lactose em sua composio (LONGO, 2006) ou com
um teor reduzido desse carboidrato, para pessoas com intolerncia lactose, alm de prevenir
a cristalizao da lactose na produo de sorvetes, de produtos fermentados como o iogurte,
de leite condensado e doce de leite (CARMINATTI, 2001; SANTIAGO et al., 2004;
OLIVEIRA, 2005).
A hidrlise ocasiona modificaes fsicas e qumicas dos produtos, pois aumenta a
solubilidade, o poder adoante e a digestibilidade dos acares e a viscosidade, o corpo, a
textura e o paladar dos produtos (VINHAL, 2001; Louserma apud ANDRADE, 2005).
Existem dois mtodos utilizados para a hidrlise da lactose: o mtodo cido e o
mtodo enzimtico. Na hidrlise cida, a reao muito rpida, mas envolve solues
diludas de cido fortes como sulfrico e clordrico, e condies operacionais severas de pH e
temperatura (1,0<pH<2,0; 100<temperatura<150C), e por isto tem sua aplicao comercial
na indstria alimentcia restrita, pois acarreta alteraes no sabor e cor dos alimentos
(LADERO, SANTOS, GARCA-OCHOA, 2000; SANTIAGO, 2002). J a hidrlise
enzimtica, pode ser aplicada no leite sem um tratamento prvio e os produtos obtidos
preservam as propriedades nutricionais da matria-prima, aumentando seu dulor (LADERO,
SANTOS, GARCA-OCHOA, 2000). Por ser realizada sob condies operacionais
consideravelmente mais brandas (3,5<pH<8,0; 5<temperatura<60C), reduz no s a
19
possibilidade de alterao dos compostos sensveis ao calor, como as necessidades

energticas, os efeitos de corroso do meio sobre equipamentos e a formao de subprodutos
indesejveis (Gekas, Lopez-Leiva; Bailey, Ollis apud ANDRADE, 2005).
Para a elaborao dos leites com lactose hidrolisada, considerados leites modificados,
em escala industrial, usa-se a tcnica de eliminao da lactose por ultrafiltrao ou a hidrlise
da lactose em resinas catalticas por enzimas livres ou imobilizadas, em um reator enzimtico
de membrana (MAHAUT et al., 2004). Segundo Silva e Cardoso (2007), o processo de
hidrlise, na maioria das vezes, realizado utilizando enzimas livres e estas deixam o reator
juntamente com o produto, no sendo possvel a sua reutilizao.
Segundo Matioli et al. (1994), a hidrlise enzimtica, atravs da enzima galactosidase, um dos mtodos mais interessantes para reduo do teor de lactose no leite e
nos seus derivados.
As enzimas utilizadas podem ser de origem microbiana (Kluyveromyces lactis,
Kluyveromyces fragilis) ou fngica (Aspergillus niger, Aspergillus orizae) (MAHAUT et al.,
2004). A estabilidade e atividade da enzima depende da fonte de onde procede e por razes de
segurana, a -galactosidase extrada geralmente das leveduras alimentares Kluyveromyces
lactis e Kluyveromyces fragilis (GACESA, HUBBLE, 1990).
O grau de hidrlise da lactose depende da dosagem da lactase no leite e das condies
de processamento (VINHAL, 2001).
3.2.2 Intolerncia lactose
A intolerncia aos alimentos uma reao reproduzvel, desagradvel (adversa) a um

alimento especfico ou a um ingrediente alimentcio que no oferece bases psicolgicas e que
ocorre sempre que o alimento ingerido. Pode ocorrer devido a uma falha do processo
digestivo, que depende da ao de enzimas capazes de degradar os alimentos, em virtude de
deficincias enzimticas (LESSOF, 1996).
A intolerncia lactose a reao adversa a carboidrato mais comum e afeta pessoas
de todas as faixas etrias. causada por uma deficincia de lactase, a enzima que digere o
acar do leite. A lactose que no hidrolisada em galactose e glicose permanece no intestino
e atua osmoticamente para atrair a gua para o intestino. As bactrias colnicas fermentam a
lactose no digerida, gerando cidos graxos de cadeia curta, dixido de carbono e gs
hidrognio. Pode resultar em inchao, flatulncia, clicas e diarria (BEYER, 2002). A
severidade dos sintomas depende da quantidade ingerida e da quantidade de lactose que cada
20
pessoa pode tolerar (SUENAGA et al., 2001). O mtodo diagnstico mais utilizado simples,
atravs da presena de hidrognio no ar expirado, pois a fermentao da lactose origina esse
gs, que absorvido e posteriormente expulso na expirao (LESSOF, 1996).
Com exceo da populao da Europa do Norte e Central e seus descendentes na
Amrica e na Austrlia, 70 a 100% dos adultos do mundo so intolerantes lactose. Na
Amrica do Sul, a prevalncia de intolerncia a esse carboidrato de 65 a 75% (VRESE et
al., 2001). Segundo During apud Longo (2006), esta uma das mais comuns desordens
genticas. E dados existentes indicam que a populao tolerante tende a diminuir
(OLIVEIRA, 2005).
Existem trs tipos de intolerncia lactose, decorrentes de diferentes processos. A
deficincia congnita de lactase, que um defeito gentico muito raro e manifesta-se nos
recm-nascidos logo aps a primeira ou segunda ingesto de leite, sendo uma condio
permanente. Na intolerncia ontogentica lactose ou hipolactasia tipo adulto, as
manifestaes clnicas so menos intensas e mais tardias, e ocorre devido a uma tendncia
natural de diminuio da produo de lactase com o avanar da idade. A intolerncia
secundria lactose a mais comum e pode ocorrer em consequncia de doenas que causam
algum tipo de dano mucosa intestinal, ou aps todas as cirurgias no aparelho digestivo, ou
tambm em prematuros em que uma imaturidade enzimtica associada a um processo
infeccioso pode levar intolerncia (SUENAGA et al., 2001; FARIAS, FAGUNDES NETO,
2004; LONGO, 2006).
Quanto ao tratamento, no caso de intolerncia congnita lactose, existe a necessidade
de seguimento de dieta isenta de lactose. Se a deficincia enzimtica for adquirida, essa forma
de se alimentar no permanente, podendo-se retornar dieta habitual aps a resoluo do
problema. No caso de deficincia ontogentica, como existe apenas uma diminuio de
atividade enzimtica, no h a necessidade de excluir a lactose completamente da dieta,
bastando haver uma reduo da quantidade de leite e derivados de acordo com a tolerncia
individual (FARIAS, FAGUNDES NETO, 2004).
A maioria dos adultos intolerantes lactose pode consumir uma pequena quantia da
mesma (6 a 12g) sem sintomas principais, especialmente quando consumida com refeies ou
na forma de iogurte com culturas ativas (BEYER, 2002). A enzima lactase e os derivados de
leite tratados com ela esto disponveis para pessoas que no digerem a lactose e possuem
desconforto com a ingesto de leite (BEYER, 2002). Em vrios estudos, a ingesto de leite
com lactose hidrolisada tem reduzido os sintomas em pessoas intolerantes a esse carboidrato
(VESA, MARTEAU, KORPELA, 2000). Essa seria a melhor alternativa para pessoas
21
intolerantes, inclusive porque no se deve deixar de ingerir leite e produtos lcteos, pois eles
fazem parte de uma dieta equilibrada, sendo ricos em nutrientes como protenas e clcio, que
so vitais para que o organismo seja forte e saudvel (SPG, 2006). Segundo Moriwaki e
Matioli (2000), a reduo ou eliminao do leite e seus derivados da dieta de crianas
intolerantes lactose pode comprometer a absoro de protena e riboflavina, alm do clcio.
3.3 Lactase
Lactase o nome usualmente utilizado para denominar a enzima -D-galactosidase

galactohidrolase. classificada como uma hidrolase e catalisa, entre outras, a reao de
hidrlise da lactose -D-galactose e -D-glicose (CARMINATTI, 2001; ANDRADE, 2005;
OLIVEIRA, 2005; LONGO, 2006). Essa enzima est presente em todos os filhotes de
mamferos desde o nascimento, estando muito diminuda nos adultos exceo dos humanos
que, dependendo principalmente da etnia, tm menor ou maior atividade da mesma. Ela est
localizada em todo o intestino delgado e no sofre influncia na quantidade e atividade com a
ingesto de lactose e outros acares (FARIAS, NETO, 2004).
O uso da -galactosidase para produzir quantidades pequenas de leite com baixo teor
de lactose para alimentao de crianas e adultos foi feito durante anos em clnicas mdicas.
Mas o interesse comercial no produto acentuou-se nos anos sessenta, estimulado pela
oportunidade de vender mais leite e pela necessidade de encontrar novas aplicaes para o
soro de queijo (MAHONEY, 1997).
A lactase pode ser empregada para elaborao de produtos lcteos com teor reduzido
de lactose, minimizando problemas de arenosidade causada pela cristalizao da lactose e
formando acares de maior poder adoante e de maior solubilidade (EVANGELISTA, 2001;
ANDRADE, BRANDO, ALVIM, 2004).
A -galactosidase apresenta diversas potencialidades de utilizao, que se encontram
sintetizadas na Tabela 2.
22
Tabela 2 Aplicaes biotecnolgicas da enzima -galactosidase

Produo de leite com teor reduzido de lactose
Obteno de produtos derivados do leite com baixa concentrao de lactose
Produo de iogurtes adocicados
Incorporao em medicamentos para combater a intolerncia lactose
Obteno de concentrados para sorvetes com baixa concentrao de lactose
Produo de xaropes alimentares
Tratamento enzimtico na produo de queijo
Processamento da lactose contida no soro e permeado de soro
Fonte: OLIVEIRA, 2005.
A enzima lactase encontra-se espalhada na natureza e pode ser isolada a partir de

vegetais (como pssego, damasco, ma e amndoas), rgos animais (como intestino,
crebro, testculos e placenta), bactrias, leveduras (enzima intracelular) e fungos (enzima
extracelular), sendo que a grande vantagem dos microrganismo em relao aos vegetais o
fato de atingirem produtividades maiores (SANTIAGO et al., 2004; OLIVEIRA, 2005).
Destas vrias fontes de lactase, nem todas so aceitas ou reconhecidas como seguras
quando a enzima est sendo utilizada em processos alimentcios. Preparaes enzimticas a
partir de Aspergillus niger, Aspergillus oryzae e Kluyveromyces sp. (lactis ou marxianus) so
consideradas seguras, porque j tm sido bastante utilizadas e submetidas a numerosos
estudos (Gekas, Lpez-Leiva apud CARMINATTI, 2001). Segundo a legislao brasileira, a
enzima lactase utilizada na indstria de alimentos deve ser de origem microbiana, proveniente
de levedura Kluyveromyces lactis (BRASIL, 2003c).
De acordo com a fonte da enzima, as suas propriedades, a temperatura e o pH timo
diferem (CARMINATTI, 2001; ANDRADE, 2005; OLIVEIRA, 2005).
A faixa de pH e a temperatura timas para a lactase variam de 3,0 a 7,3 e de 30 a 60C,
respectivamente, sendo que as melhores condies operacionais para a enzima recomendada
pela legislao vai do pH 6,9 ao 7,3 a uma temperatura de 35C (Segel apud ANDRADE,
2005).
3.4 Anlise Sensorial

A anlise sensorial uma disciplina cientfica utilizada para evocar, medir, analisar e
interpretar reaes das caractersticas dos alimentos e materiais como so percebidas pelos
sentidos da viso, olfato, gosto, tato e audio (ABNT, 1993b).
23
As caractersticas sensoriais de um leite normal so: aspecto lquido, odor e sabor

caractersticos, sem odores nem sabores estranhos, sendo o sabor ligeiramente adocicado,
devido principalmente ao seu contedo de lactose e colorao branco-amarelada e opaca,
devido disperso da luz pelas micelas de fosfocaseinato de clcio e dos glbulos de gordura
(cor branca) e tambm ao caroteno e riboflavina (cor amarelada) (VINHAL, 2001; BRASIL,
2002).
Os testes sensoriais, os quais utilizam os rgos dos sentidos humanos como
"instrumentos", devem ser includos como garantia de qualidade por tratarem-se de uma
medida multidimensional integrada, que possui importantes vantagens, como por exemplo,
determinar a aceitao de um produto por parte dos consumidores (CARDELLLO,
CARDELLO, 1998).
De fato, a importncia de se avaliar os alimentos sensorialmente de proporcionar ao
consumidor prazer em consumir o produto, para que este seja aceito no mercado e,
finalmente, se torne um hbito alimentar. Com isso, a avaliao sensorial se torna um suporte
tcnico tanto para a pesquisa quanto para a indstria e o marketing (LONGO, 2006).
Dentre os objetivos da avaliao sensorial est comparar produtos alimentcios a fim
de detectar diferenas entre eles com base nos atributos sensoriais que os caracterizam. Para
isso, existem diversos mtodos que podem ser utilizados, e um deles o teste triangular, que
um mtodo sensorial discriminativo, onde se verifica se existe diferena entre duas amostras
submetidas a tratamentos diferentes (SGS, 2008).
24
4 MATERIAL E MTODOS
4.1 Material
4.1.1 Matria-prima
Para a realizao deste estudo, foi utilizado leite pasteurizado da marca UNI, cedido
pela Usina Escola de Laticnios, pertencente Universidade Federal de Santa Maria (UFSM).
Segundo a legislao (BRASIL, 2002), as amostras utilizadas enquadraram-se como leites
semi-desnatados, pois os teores de gordura destas ficaram na faixa de 0,6 a 2,9g/100g de leite.
Optou-se por utilizar leite com menor teor de gordura no experimento para que esta no
interferisse sobre a reao de hidrlise, podendo minimiz-la. As amostras foram retiradas na
Usina Escola e transportadas para o Departamento de Tecnologia e Cincia dos Alimentos da
Universidade Federal de Santa Maria para que fossem realizadas as anlises.
4.1.2 Enzima Lactase

Foram utilizadas enzimas de duas marcas comerciais diferentes, que sero citadas ao
longo da dissertao como enzimas 1 e 2. Os nomes das marcas foram omitidos para
preserv-las e evitar qualquer tipo de constrangimento ou prejuzo pelos possveis resultados
encontrados. Estas enzimas eram provenientes de leveduras Kluyveromyces lactis, conforme
especificao da legislao (BRASIL, 2003a), que so obtidas comercialmente atravs da
fermentao de uma cepa selecionada e especfica desta levedura. Segundo informaes
tcnicas de uma das marcas, a enzima em questo pode atuar em uma ampla faixa de
temperatura, que varia de 6C a 40C. As enzimas foram armazenadas durante todo o perodo
do experimento em local refrigerado, visando a manuteno da sua viabilidade.
4.2 Mtodos
4.2.1 Tratamentos
Foram utilizadas cinco temperaturas: 7,9C; 12C; 22C; 32C e 36,1C; e cinco
diferentes concentraes de enzima: 0,1g/l; 0,2g/l; 0,5g/l; 0,8g/l e 0,9g/l; combinadas entre si
atravs da Metodologia de Superfcie de Resposta (MSR). Para determinar os valores de
temperatura e concentraes de enzima, foi delimitado um valor para o ponto central e a partir
deste valor, foram calculados os demais utilizando a Equao 2, que ser apresentada e
25
melhor discutida no item 4.2.5, que trata do planejamento estatstico do experimento. Os

leites foram colocados em frascos autoclavveis, e a seguir foram colocados em banho
ultratermostatizado, regulado na temperatura pr-estabelecida. Foram utilizados quatro
frascos por tratamento, dois para o controle da crioscopia e para as anlises fsico-qumicas de
cada enzima e dois para as anlises microbiolgicas, que permaneceram fechados durante
todo o tratamento. Aps o leite atingir a temperatura desejada, foram adicionadas as enzimas.
O acompanhamento da hidrlise da lactose foi feito atravs de anlise de crioscopia, realizada
em intervalos de 1 hora. Com esses valores, foi feita uma estimativa da porcentagem de
hidrlise, utilizando-se a Equao 1, recomendada por uma das empresas fornecedoras da
enzima (apud Longo, 2006).
% de Hidrlise alcanada = 350,877 x (Crioscopia final) (Crioscopia inicial)

0,00285
(1)
O tratamento foi encerrado quando a crioscopia estabilizou, ou seja, no aumentou em

medidas consecutivas. Aps o fim dos tratamentos, o leite passou por um processo de
pasteurizao lenta, onde foi deixado a 63C por 30 minutos (MAHAUT et al., 2004). Este
processo foi feito com o intuito de inativar a enzima e reduzir a carga microbiana presente
devido ao manejo do leite e adio da enzima. Vinhal (2001) comprovou que temperaturas
superiores a 40C, a lactase apresenta baixa estabilidade trmica.
4.2.2 Anlises fsico-qumicas

As anlises fsico-qumicas descritas abaixo foram realizadas no leite antes e aps a
hidrlise da lactose.
- Acidez total titulvel: foi determinada por meio de titulao da amostra com soluo
Dornic (0,11 N), utilizando como indicador a fenolftalena, segundo metodologia oficial
(BRASIL, 2006);
- pH: foi determinado por medida direta com pHmetro digital, modelo DM 20P, da
marca Digimed, segundo metodologia oficial (BRASIL, 2006);
- Crioscopia: foi determinada por medida direta com crioscpio eletrnico (PEREIRA
et al., 2001), modelo MK 540, da marca ITR;
- Densidade a 15C: foi determinada por medida direta atravs do equipamento de
ultra-som Lactoscan 90, da Milkotronic Ltd.;
- Gordura: foi determinada por medida direta atravs do equipamento de ultra-som
Lactoscan 90, da Milkotronic Ltd.;
26
- Extrato seco total (EST): foi determinado atravs da soma da gordura e do extrato
seco desengordurado, medidos no equipamento Lactoscan 90, da Milkotronic Ltd.;
- Extrato seco desengordurado (ESD): foi determinado por medida direta atravs do
equipamento de ultra-som Lactoscan 90, da Milkotronic Ltd.;
- Protena: foi determinada por medida direta atravs do equipamento de ultra-som
Lactoscan 90, da Milkotronic Ltd.;
- Glicose: foi determinada por meio de espectrofotmetro, modelo 600, da marca
FEMTO, atravs de leitura da absorbncia a 505 nm. Para a formao da colorao vermelha
utilizada para a leitura da absorbncia, foi usado o kit Glicose Monoreagente da empresa
Bioclin e as amostras foram colocadas em banho-maria a 37C por 10 minutos.
A lactose foi determinada antes da sua hidrlise, por medida direta atravs do
equipamento de ultra-som Lactoscan 90, da Milkotronic Ltd. Para determinar a lactose das
amostras aps terem sido submetidas aos tratamentos e o grau de hidrlise da lactose, foi
determinada a glicose, para ento fazer-se a estequiometria da reao, considerando que para
cada molcula de lactose degradada so formadas uma molcula de glicose e uma molcula
de galactose.
A utilizao do equipamento de ultra-som ao invs dos tradicionais mtodos qumicos
justifica-se por vrios motivos como: rapidez dos resultados, medio de vrios parmetros de
uma s amostra em uma s operao, reduo dos custos por anlise, no utilizao de
reagentes, medidas automticas, maior preciso e exatido, medidas idnticas independente
do operador, no necessria uma instruo especial para o operador, amostra no precisa ser
submetida a nenhum tratamento anterior anlise, maior segurana para o operador
(LACTOSCAN, 2007).
4.2.3 Anlise microbiolgica

Foi realizada a contagem total de microorganismos do leite (UFC/mL), segundo as
tcnicas preconizadas pelo Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento (BRASIL,
2003b). Esta anlise foi feita nas amostras antes e aps elas terem sido submetidas aos
tratamentos.
4.2.4 Anlise sensorial

Os leites com teor reduzido de lactose foram submetidos a anlises sensoriais de
acordo com as normas descritas pela ABNT (1993). Foi realizado o teste triangular, para
verificar se os julgadores perceberiam a diferena entre amostras com teores de lactose
27
diferentes, j que foram realizados vrios tratamentos que originaram leites com teores de
lactose muitas vezes semelhantes. Se essas diferenas fossem perceptveis, seriam feitos o
teste de comparao mltipla e o de preferncia. A anlise foi realizada com estudantes
universitrios e funcionrios pblicos de ambos os sexos e com idades variadas, instrudos
para a participao, em cabines individualizadas no Laboratrio de Anlise Sensorial do
Departamento de Tecnologia e Cincia dos Alimentos da Universidade Federal de Santa
Maria.
Participaram 34 julgadores, avaliando a diferena global entre duas amostras de leite
submetidas a tratamentos diferentes, de acordo com o teste triangular (ABNT, 1993b;
DUTCOSKY, 1996). Metade comparou uma amostra submetida a um dos maiores
percentuais de hidrlise (90,5%) com uma submetida a um dos menores (57,5%), enquanto a
outra metade avaliou uma amostra que sofreu uma hidrlise intermediria (76%) com uma
que sofreu o maior ou o menor percentual de hidrlise (90,5% ou 57,5%). Portanto, as
amostras avaliadas apresentavam, aproximadamente, 0,45; 1,15 e 2,03 g/100g de lactose.
Foram apresentadas simultaneamente trs amostras de leite, com as posies casualizadas
entre os julgadores, codificadas com algarismos de trs dgitos, sendo que duas eram idnticas
e uma diferente. As amostras foram servidas em recipientes plsticos juntamente a ficha de
avaliao e com um copo de gua mineral e bolachas de gua e sal para limpeza do palato
entre a avaliao das amostras (FERREIRA, 2000).
4.2.5 Planejamento estatstico

Para o planejamento do experimento quanto aos tratamentos foi utilizada a
metodologia de superfcie de resposta (MSR). A MSR a tcnica de otimizao mais usada
em cincia de alimentos, provavelmente pela sua compreenso terica, alta eficincia e
simplicidade (ARTEAGA et al., 1994).
A MSR envolve quatro passos bsicos: seleo dos parmetros do sistema (variveis e
seus nveis); formulao do delineamento experimental (o mais comum o delineamento
central composto rotacional DCCR); encontrar o modelo (DCCR adequado somente para
modelos lineares e quadrticos testes estatsticos avaliam a validade do modelo, incluindo a
falta de ajuste e a anlise de resduo); e encontrar as solues timas (se o modelo for
estatisticamente vlido, pode ser usado para predizer o ponto timo do sistema) (ARTEAGA
et al., 1994).
28
O experimento foi conduzido conforme delineamento central composto rotacional

(DCCR), com 2 variveis independentes. Este delineamento para 2 variveis contm um
mnimo de 2N + 2N + 1 pontos ou ensaios, onde N o nmero de variveis. Os ensaios
definidos por estes pontos compreendem: 2N pontos para um modelo fatorial completo
(combinam nveis +1 e 1); 2N pontos axiais ou estrela em cada eixo, com distncia do centro
igual distncia de cada vrtice (um nvel em e os outros em zero) (valores mnimo e
mximo), mais um ou mais pontos no centro do modelo (nvel zero). O valor de depende do
nmero de pontos do modelo fatorial (F) e do nmero de fatores (N), sendo calculado pela
equao: = (F) = (2N) . Neste caso, com 2 variveis: (22) =
44
= 1,414.
A Figura 3 apresenta, numa forma grfica, o DCCR para 2 fatores. Os DCCR so

modelos otimizados para encontrar modelos quadrticos. O nmero de pontos centrais
suficiente para testar a validez do modelo quadrtico encontrado, bem como para testar a falta
de ajuste do modelo (ARTEAGA et al., 1994).
Figura 3 Modelo central composto rotacional para 2 fatores

FONTE: ARTEAGA et al. (1994) (adaptado).
Neste trabalho, o nmero mnimo de ensaios seria 9 (22 + 2.2 + 1), sendo 4 fatoriais, 4
axiais e um central. Foram realizados 12 ensaios, sendo 4 repeties no ponto central. As duas
variveis independentes foram: temperatura da reao e concentrao de enzima. As faixas de
variao entre o limite inferior e o superior de cada varivel foram determinadas seguindo-se
indicaes da literatura. Os nveis das variveis tm seus valores mostrados na Tabela 3.
29
Tabela 3 Variveis independentes e nveis de variao

Variveis
Nveis
-
-1
+1
X1 = temperatura da reao (C)
7,9
12
22
32
36,1
X2 = concentrao de enzima (g/l)
0,1
0,2
0,5
0,8
0,9
Os valores codificados e reais das duas variveis utilizadas no delineamento estatstico

dos ensaios so mostrados na Tabela 4.
Para a manuteno da eqidistncia entre os valores das 2 variveis independentes, o
programa SAS foi utilizado, neste planejamento, com os fatores ou variveis independentes
codificados, sendo as respostas apresentadas em valores reais. Para transformar valores
codificados das variveis independentes em valores reais, empregou-se a Equao 2.
X Y
x=
q
x = valor codificado da varivel X;

onde:
X = valor real da varivel;

Y = valor real da varivel no ponto central;
q = intervalo de variao de X.
(2)
30
Tabela 4 Delineamento experimental para as duas variveis independentes

Tratamento
ou
Variveis reais
Variveis ajustadas
Ensaio
x1
x2
Temperatura da
Concentrao
reao (C)
de enzima (g/l)
-1
-1
12
0,2
-1
12
0,8
-1
32
0,2
32
0,8
22
0,5
22
0,5
1,414
36,1
0,5
-1,414
7,9
0,5
1,414
22
0,9
10
-1,414
22
0,1
11
22
0,5
12
22
0,5
x1= Temperatura da reao (C) e x2= Concentrao de enzima (g/l)

4.2.6 Anlises estatsticas
Os resultados foram analisados atravs do programa Statistic 7.0, utilizando o
delineamento de blocos inteiramente casualizados. Os dados foram submetidos anlise de
varincia (ANOVA) e as mdias comparadas entre si atravs do teste de Tukey, ao nvel de
5% de probabilidade de erro.
31
5 RESULTADOS E DISCUSSO
5.1 Anlises fsico-qumicas
Na Tabela 5 so apresentadas as mdias dos 12 tratamentos para os parmetros fsicoqumicos das matrias-primas e das amostras.
Tabela 5 Parmetros fsico-qumicos das matrias-primas e das amostras aps a reao de

hidrlise.
Parmetro
Enzima (lactase)
Matria-prima
17,5 *
17,5
17,8
aA
6,68
6,62
bA
6,69
6,63
bB
0,99
0,87
bA
1,03
0,84
bB
1032,96
1035,07
bA
1032,93
1035,75
bB
9,92
10,35
bA
9,95
10,48
bB
8,93
9,47
bA
8,92
9,64
bB
3,42
3,62
aA
3,42
3,69
bB
-0,488
-0,652
bA
-0,488
-0,703
bB
Lactose estimada
4,79
2,04
bA
(g/100g)
4,78
1,18
bB
Glicose (g/100g)
0,0
1,73
bA
0,0
2,12
bB
Acidez (D)
pH
Gordura (g/100g)
Densidade (g/mL)
EST (g/100g)
ESD (g/100g)
Protena (g/100g)
Crioscopia (C)
Leite aps hidrlise

17,8
aA
**
32
Lactose encontrada
4,79
1,39
bA
(g/100g)
4,78
0,54
bB
* Mdias na linha seguidas por uma mesma letra (minscula) no diferem significativamente entre si pelo teste
de Tukey em nvel de 5% de probabilidade de erro.
** Mdias de um mesmo parmetro na coluna seguidas por uma mesma letra (maiscula) no diferem
significativamente entre si pelo teste de Tukey em nvel de 5% de probabilidade de erro.
Na Tabela 5 pode-se observar que a hidrlise da lactose elevou ligeiramente a acidez

do leite, no apresentando, porm, diferena significativa entre a acidez das amostras antes e
aps a hidrlise, e nem com o uso das enzimas diferentes. Os leites submetidos hidrlise
com as 2 enzimas apresentaram-se dentro dos padres estabelecidos (14-18D) pela legislao
vigente para leites pasteurizados (BRASIL, 2002).
Aps as amostras terem sido submetidas aos tratamentos com as enzimas, o pH
decresceu ligeiramente, diferindo estatisticamente, mas permaneceu na faixa de valor
considerado normal, que varia de 6,4 a 6,9 (TRONCO, 2003). Houve tambm diferena
significativa entre as mdias do pH final das amostras com o uso das duas enzimas. Esse
aumento da acidez e reduo do pH ocorre devido atividade dos microorganismos presentes
no leite, principalmente s bactrias lticas, que promovem a sua acidificao. Segundo
Longo (2006), pela ao das bactrias lticas, uma molcula de lactose d origem a quatro
molculas de cido ltico. Esta atividade favorecida pelo longo perodo decorrido durante os
tratamentos e/ou s temperaturas a que as amostras foram submetidas. O aumento da
contagem de microrganismos foi verificado e ser apresentado e melhor comentado ao longo
da discusso.
As Figuras 4 e 5 apresentam os grficos de superfcie de resposta do pH das amostras
aps estas terem sido submetidas reao de hidrlise, com o uso das enzimas 1 e 2,
respectivamente. Neste tipo de grfico podem-se visualizar os valores do parmetro avaliado,
com a utilizao de diversas concentraes de enzima e temperaturas.
33
6,8
6,7
6,6
Figura 4 pH do leite conforme temperatura e concentrao da enzima lactase 1.
6,8
6,7
6,6
Figura 5 pH do leite conforme temperatura e concentrao da enzima lactase 2.
34
Pode-se observar, atravs das Figuras 4 e 5, uma menor reduo do pH das amostras a
temperaturas inferiores e a concentraes menores ou maiores de enzima, enquanto observase uma maior reduo, ou seja, um pH final inferior, a uma temperatura prxima a 40C e a
concentraes intermedirias de enzima (0,4 a 0,6 g/L).
A quantidade de gordura das amostras decresceu significativamente com os
tratamentos, tanto com a enzima 1 quanto com a 2. Foi verificado que houve uma maior
diminuio com o uso da enzima 2, a que mostrou-se mais eficiente na hidrlise da lactose.
No foi encontrada na literatura uma justificativa para esta reduo. Sabe-se que na reao de
hidrlise, para que ocorra a formao de glicose e galactose necessrio que a lactose reaja
com a gua, diminuindo, portanto, a quantidade de gua livre no leite. Isto poderia ocasionar
um ligeiro aumento do teor de gordura devido a maior concentrao da soluo e no o
contrrio. Foi o observado nos valores de extrato seco total (EST), extrato seco
desengordurado (ESD) e protena das amostras, que aumentaram aps a hidrlise, sendo que
os maiores acrscimos foram verificados com a utilizao da enzima 2, que provocou uma
maior reduo da lactose, e possivelmente uma maior utilizao da gua presente no leite,
concentrando-o mais. Esta reduo do teor de gordura pode ter sido ocasionada devido
prpria reao de hidrlise ou a algum tipo de influncia do princpio do equipamento
utilizado sob a quantificao da gordura, o que poderia ser verificado atravs da avaliao da
gordura de uma mesma amostra por meio de equipamento e mtodo butiromtrico (BRASIL,
2006).
A utilizao da enzima lactase (-galactosidase) ocasiona modificaes fsicas e
qumicas no leite (VINHAL, 2001), como o aumento da sua viscosidade. Isto pode ser
percebido na Tabela 5 observando-se os valores de densidade que aumentaram
consideravelmente e significativamente do ponto de vista estatstico nos tratamentos com o
uso da enzima 1 e 2, com respectivos acrscimos de 2,11 e 2,82 g/mL. Sabe-se que a
densidade de um corpo lquido a relao existente entre a sua massa (expressa pelo peso) e
volume, e que esta diminui com o aumento da quantidade de gordura, o que normalmente se
d com a elevao da proporo de protena, lactose e sais minerais (TRONCO, 2003). No
presente estudo, o que foi verificado aps a reao de hidrlise foi uma reduo do teor de
gordura do leite, porm um aumento no teor de protena e um aumento da densidade do leite.
Para a reduo do teor de lactose do leite, podemos relacionar o aumento de densidade com o
de viscosidade, mas nem sempre esta relao possvel, como no caso do desnate, onde a
reduo do teor de gordura acompanhada por um aumento de densidade, mas no por um
aumento da viscosidade, e sim sua reduo (TRONCO, 2003).
35
As Figuras 6 e 7 apresentam os valores de densidade conforme temperatura e

concentrao das enzimas 1 e 2. Ocorreu um maior aumento da densidade nas temperaturas de
10 a 30 C e de 18 a 40 C e nas concentraes de enzima de 0,9 a 1,0 g/L e de 0,82 a 1,0 g/L,
com a utilizao das enzimas 1 e 2, respectivamente. Como j citado, este aumento
acompanhou a reduo do teor de lactose.
1036
1035
1034
1033
Figura 6 Densidade do leite conforme temperatura e concentrao da enzima

lactase1.
36
1036
1035,5
1035
Figura 7 Densidade do leite conforme temperatura e concentrao da enzima lactase

2.
A enzima 2 apresentou uma maior eficincia, o que pode ser visualizado na Tabela 5
atravs dos valores de crioscopia, glicose e lactoses estimada e encontrada. Isto, segundo o
fabricante, ocorre devido baixa atividade de protease da soluo, o que a torna mais pura
quando comparada a outras lactases oferecidas no mercado. A crioscopia diminuiu 0,164C
com a enzima 1 e 0,215C com a enzima 2. Esta reduo deve-se ao fato de que com a
hidrlise ocorre um aumento dos acares redutores do leite, que passa a apresentar, alm da
lactose, glicose e galactose resultantes da reao. Com isto aumenta a concentrao dos
constituintes solveis na soluo leite (MONTIP, 1992), afastando cada vez mais o ponto de
congelamento do ponto 0, que o da gua pura. Segundo Sclimme e Buchheim (2002), a
retirada da lactose do leite pode provocar uma reduo de mais de 50% do ponto de
congelamento. No presente experimento, com a utilizao da enzima 1 obteve-se uma reduo
de 33,6% do ponto de congelamento e com a enzima 2 de 44,1%.
As Figuras 8 e 9 apresentam os valores de crioscopia das amostras aps a reao de
hidrlise, conforme a temperatura e a concentrao das enzimas 1 e 2.
37
-0,5
-0,6
-0,7
Figura 8 Crioscopia do leite conforme temperatura e concentrao da enzima lactase

1.
-0,6
-0,65
-0,7
Figura 9 Crioscopia do leite conforme temperatura e concentrao da enzima lactase

2.
38
A maior reduo da crioscopia (Figuras 8 e 9) deu-se, com o uso da enzima 1, na faixa

de temperatura de 8 a 27C e na concentrao de enzima de 0,69 a 1,0 g/L e com o da enzima
2, na faixa de 16 a 31C e na concentrao de 0,6 a 0,9 g/L. Tambm se pode perceber um
maior decrscimo no valor da crioscopia com o uso da enzima 2, quando comparado ao da
enzima 1 e conforme j comentado anteriormente, quanto maior este decrscimo, maior a
reduo do teor de lactose.
Com os valores encontrados de crioscopia, calculou-se atravs da Equao 1,
recomendada por um dos fabricantes (apud LONGO, 2006), a hidrlise estimada, a qual a
mdia dos tratamentos foi 57,2% com a utilizao da enzima 1 e 75,4% com a enzima 2. A
partir da calculou-se a lactose estimada, que diferiu significativamente com a utilizao das 2
enzimas e apresentada nas Figuras 10 e 11.
60
40
20
0
Figura 10 Percentual de hidrlise estimada, conforme temperatura e concentrao da

enzima lactase 1.
39
80
60
40
Figura 11 Percentual de hidrlise estimada, conforme temperatura e concentrao da

enzima lactase 2.
Atravs das Figuras 10 e 11, pode-se visualizar a porcentagem de hidrlise estimada

conforme as temperaturas e concentraes de enzima utilizadas e observa-se um valor
superior a mdia dos tratamentos, apresentada na Tabela 5. Isto ocorre, pois nestes grficos h
um cruzamento dos dados obtidos em cada tratamento, o que nos d uma combinao entre
mais valores de temperatura e concentraes de enzima. Percebe-se que um maior valor de
hidrlise, prximo a 80%, foi alcanado nas faixas de temperatura de 14 a 27C e de 15 a
29C e nas concentraes de enzima de 0,79 a 1g/L e de 0,58 a 1,0 g/L, com o uso das
enzimas 1 e 2, respectivamente. A hidrlise da lactose em glicose e galactose cada vez mais
importante para seu uso alimentar. Mediante a hidrlise da lactose modificam-se a sua
solubilidade, seu dulor, seu poder redutor e sua fermentabilidade, conseguindo-se, sobretudo,
fazer com que ela seja digervel por consumidores intolerantes lactose (SCHLIMME,
BUCHHEIM, 2002).
40
A enzima 2 mostrou-se novamente mais eficaz, alcanando valores superiores de

hidrlise da lactose, o que tambm pode ser verificado atravs das Figuras 12 e 13, que
apresentam os valores de lactose final estimados atravs da crioscopia usando-se a Equao 1.
O teor de lactose da matria-prima foi 4,78 e 4,79 g/100g, valor superior ao encontrado por
Longo (2006), de 4,11%, que cita que com este nvel a ingesto do leite pode causar
desconforto para pessoas com intolerncia lactose .
5
4
3
2
Figura 12 Valor estimado de lactose final conforme temperatura e concentrao da

enzima lactase 1.
A Figura 12 mostra o valor estimado de lactose final com o uso da enzima 1, que foi
inferior na faixa de temperatura de 13 a 28C e com o uso de concentraes de enzima de 0,7
a 1,0 g/L.
41
3
2
1
Figura 13 Valor estimado de lactose final conforme temperatura e concentrao da

enzima lactase 2.
A Figura 13 mostra o valor estimado de lactose final com o uso da enzima 2, que foi
inferior na faixa de temperatura 15 a 33 C e com concentraes de enzima de 0,59 a 0,99 g/L.
Observando-se as Figuras 12 e 13, pode-se perceber que os menores valores de lactose final
estimados foram em temperaturas mdias a elevadas e em concentraes elevadas de enzima.
A quantidade de lactose final encontrada foi inferior a que havia sido estimada e foi
calculada atravs de estequiometria pela quantidade de glicose originada (por tratamento) a
partir da reao de hidrlise da lactose. Obtiveram-se por este clculo os valores de hidrlise
por tratamento, e calculou-se a mdia, que foi de 72,3% com o uso da enzima 1 e de 88,6%
com o uso da enzima 2. Portanto, os valores de lactose encontrados aps a reao de hidrlise
foram, respectivamente, 1,4 e 0,5 g/100g, com as enzimas 1 e 2. A faixa de variao dos
teores de lactose do leite situa-se entre 4,5 e 5,2%, valor este influenciado pela alimentao e
pelos intervalos de lactao (Kaufmann, Hagemeister apud SCHLIMME, BUCHHEIM,
2002). Este valor aumenta na fase colostral e permanece no leite a um nvel muito constante,
ao redor de 4,7% (SCHLIMME, BUCHHEIM, 2002). Este foi o valor aproximado de lactose
encontrado na matria-prima utilizada no presente experimento, permitindo verificar-se a
grande reduo do teor de lactose atravs da hidrlise, de 3,4 e 4,3 g/100g, com a utilizao
42
das enzimas 1 e 2, respectivamente. Estes valores foram calculados atravs das mdias dos
tratamentos, porm, observando-se os grficos de superfcie de resposta (Figuras 14, 15, 16 e
17) percebe-se que a determinadas temperaturas e concentraes de enzima, atingiu-se quase
100% de hidrlise da lactose. Segundo uma das empresas fornecedoras da enzima (apud
LONGO, 2006), na produo de leite com teor reduzido de lactose necessria a hidrlise na
quantidade mnima de 90%. J segundo Holsinger e Kligerman (1991), os sintomas da
intolerncia podem ser eliminados com uma hidrlise de 70%. Segundo Brasil (1998),
alimentos para dietas com restrio a alguns mono e/ou dissacardeos, especialmente
formulados para atender s necessidades de portadores de intolerncia sua ingesto e/ou
portadores de erros inatos do metabolismo de carboidratos, podem conter no mximo 0,5g do
nutriente em referncia por 100 g ou 100 mL do produto final a ser consumido. Portanto, o
leite hidrolisado pela enzima 2 se enquadraria como um alimento pra fins especiais. Porm, a
quantia de lactose que pode ser ingerida varia de acordo com a tolerncia individual
(FARIAS, FAGUNDES NETO, 2004), sendo que cada caso deve ser avaliado parte.
80
60
Figura 14 Percentual de hidrlise encontrada, conforme temperatura e concentrao

da enzima lactase 1.
43
90
80
70
60
Figura 15 Percentual de hidrlise encontrada, conforme temperatura e concentrao

da enzima lactase 2.
As Figuras 14 e 15 mostram as porcentagens de hidrlise encontradas com o uso das

enzimas 1 e 2, respectivamente. Pode-se perceber que com a utilizao da enzima 2 foram
alcanados valores superiores de hidrlise da lactose. Os maiores valores foram verificados
com o uso de concentraes elevadas de enzima, prximo a 1,0 g/L para a enzima 1 e entre
0,9 e 1,0 g/L para enzima 2. As faixas de temperatura que colaboraram para uma maior
porcentagem de hidrlise foram de 17 a 24 C, com o uso da enzima 1 e de 23 a 30 C, com o
uso da enzima 2. Carminatti (2005), avaliando a hidrlise enzimtica da lactose em reator a
membrana utilizando-se Kluyveromyces lactis, observou o maior grau de hidrlise, de
aproximadamente 100 %, a uma temperatura de 30C, pH 6 e concentrao de enzima de
1250 mg/l.
44
2,5
2
1,5
1
0,5
Figura 16 Valor encontrado de lactose, conforme temperatura e concentrao da

enzima lactase 1.
A Figura 16 apresenta o grfico de superfcie de resposta dos valores de lactose

encontrados com a utilizao da enzima 1. Percebe-se, observando-se o grfico, e
comparando-se os valores de lactose a uma mesma concentrao de enzima, que os menores
foram verificados em temperaturas intermedirias, enquanto os maiores, nos valores
extremos, revelando um menor grau de hidrlise nestas temperaturas. Os menores valores de
lactose final podem ser percebidos em temperaturas de 17 a 25 C e em concentraes de
enzima prximas a 1,0 g/L.
45
2
1,5
1
0,5
Figura 17 Valor encontrado de lactose, conforme temperatura e concentrao da

enzima lactase 2.
A Figura 17 apresenta o grfico de superfcie de resposta dos valores de lactose

encontrados com a utilizao da enzima 2. Percebe-se, observando-se o grfico, que em
temperaturas elevadas verificaram-se as menores redues dos nveis de lactose. Os menores
valores de lactose final podem ser percebidos em temperaturas de 23 a 30 C e em
concentraes de enzima de 0,9 a 1,0 g/L.
Atravs dos grficos de superfcie de resposta apresentados foi possvel analisar vrios
parmetros que nos permitem verificar a eficincia da reao de hidrlise da lactose com o
uso de diversas concentraes de enzima e temperaturas. Pde-se perceber que a enzima
apresentou uma boa atividade a temperaturas inferiores s preconizadas pela literatura, que
seriam, segundo Segel apud Andrade (2005), de 35C, segundo Carminatti (2001), de 30 a
40C e segundo Longo (2006), de 40C. Isto mostra que seria vivel o uso de temperaturas
inferiores, visando a no proliferao de microrganismos patognicos no leite e possivelmente
uma reduo do teor de lactose sob temperaturas de refrigerao, o que seria interessante a
nvel industrial. Em alguns casos percebeu-se, porm, que uma maior hidrlise foi verificada
com o uso de maiores concentraes de enzima, fato este que exigiria um estudo de
viabilidade e custo x benefcio na prpria indstria, devido ao custo elevado da enzima
46
lactase. Segundo Foda e Lopez-Leiva apud Carminatti (2001), a enzima pode ser utilizada de
trs maneiras: em batelada, onde ela perdida aps a hidrlise, recuperada por membrana e
imobilizada. Nos dois ltimos mtodos a enzima no perdida, sendo estes os mais
recomendveis para o uso em maiores concentraes, visando um menor custo do processo.
A seguir sero apresentados, atravs das Figuras 18, 19, 20 e 21 , os valores de lactose
estimados a partir da crioscopia, ao longo de todo o perodo de durao da reao de hidrlise.
J na Tabela 6, sero apresentados os valores finais estimados de lactose. Pode-se perceber
que estes valores variaram conforme a enzima utilizada (1 e 2), a concentrao desta enzima
(0,1; 0,2; 0,5; 0,8 e 0,9 g/L) e a temperatura utilizada durante a reao (7,9C, 12C, 22C,
32C e 36,1C).
Tabela 6 Quantidades de lactose final estimadas para cada temperatura, enzima e

concentrao utilizadas.
Temperatura (C)
Concentrao da
Enzima 1
Enzima 2
enzima (g/L)
a
1,2
3,0
2,1
0,8
1,4
0,9
0,1
3,1
2,1
0,5
1,7
0,9
0,9
1,1
0,7
0,2
3,3
1,8
0,8
1,6
0,7
0,5
2,4
1,1
7,9
0,5
2,1 *
12
0,2
22
32
36,1
* Mdias na coluna seguidas por uma mesma letra no diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey
em nvel de 5% de probabilidade de erro.
Lactose (g/100g)
47
6
Enzima 1 - 22C
e 0,1 g/L
Enzima 1 - 22C
e 0,5 g/L
Enzima 1 - 22C
e 0,9 g/L
Enzima 2 - 22C
e 0,1 g/L
Enzima 2 - 22C
e 0,5 g/L
Enzima 2 - 22C
e 0,9 g/L
5
4
3
2
1
0
0
9 10 11 12 13 14 15
Tempo de hidrlise (horas)
Figura 18 Valor estimado de lactose durante a hidrlise, para as enzimas 1 e 2, na
Lactose (g/100g)
temperatura de 12 C e nas concentraes de enzima de 0,2 e 0,8 g/L.
5
4,5
Enzima 1 -12C
e 0,2 g/L
4
3,5
3
Enzima 1 - 12C
e 0,8 g/L
2,5
Enzima 2 - 12C
e 0,2 g/L
2
1,5
1
Enzima 2 - 12C
e 0,8 g/L
0,5
0
0
9 10 11 12 13 14 15

temperatura de 22 C e nas concentraes de enzima de 0,1; 0,5 e 0,9 g/L.
Lactose (g/100g)
48
5,5
5
4,5
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Enzima 1 - 32C
e 0,2 g/L
Enzima 1 - 32C
e 0,8 g/L
Enzima 2 - 32C
e 0,2 g/L
Enzima 2 - 32C
e 0,8 g/L
5
6
7
8

temperatura de 32 C e nas concentraes de enzima de 0,2 e 0,8 g/L.
Observando-se as Figuras 18, 19, 20 e a Tabela 6, comparando-se as enzimas, pode-se

perceber que, para as mesmas temperaturas, em uma mesma concentrao, a enzima 2
revelou-se mais eficaz, pois provocou um maior decrscimo do teor de lactose das amostras
quando comparada a enzima 1. Isto demonstra que existem diferenas entre a hidrlise com o
uso das enzimas das duas diferentes empresas, apesar de elas serem provenientes do mesmo
microrganismo, a levedura Kluyveromyces lactis.
J comparando-se as concentraes de enzima, percebe-se que utilizando-se as 2
enzimas nas 3 temperaturas (12 C, 22 C e 32 C), a menor concentrao (0,1 e 0,2 g/L)
provocou uma menor reduo da lactose, o que j era esperado, e que segundo Carminatti
(2001) ocorre devido a menor quantidade de stios ativos disponveis para ocorrer a hidrlise,
diminuindo o grau de converso da lactose em glicose e galactose.
Longo (2006) verificou uma maior hidrlise na segunda maior concentrao de
enzima testada no seu experimento, de 0,8 g/L, alcanando um valor de 88,07% de hidrlise
em 4 horas de ensaio. Andrade (2005) avaliou, entre outros parmetros, 2 concentraes de
enzima, 0,2 e 0,4 g/L, porm para a fermentao de soro de leite, e verificou que a quantidade
foi determinante na reduo do tempo de fermentao e no aumento da produtividade, sendo a
maior concentrao a mais eficaz. Carminatti (2001) verificou que a concentrao tima de
enzima se estabeleceu em 1250 mg/L, sendo que o grau de hidrlise manteve-se praticamente
igual para a concentrao de 2000 mg/L e reduziu-se acentuadamente para 400 mg/L.
49
As reaes enzimticas so fortemente dependentes de uma temperatura tima. Esta

temperatura tima influencia diretamente a atividade da enzima, aumentando a velocidade da
reao e, por consequncia, a converso do substrato em produtos. Temperaturas abaixo ou
acima desta faixa inibem a atividade enzimtica e, a temperaturas muito superiores, ocorre a
inativao da enzima, devido a sua desnaturao. Por isto, o conhecimento da faixa de
atividade tima para cada enzima fundamental (CARMINATTI, 2001).
Comparando-se as Figuras 18 e 20, nos quais foram utilizadas as mesmas
concentraes de enzima (0,2 e 0,8 g/L), porm a temperaturas diferentes, e observando-se a
Tabela 6, pode-se perceber o efeito da temperatura na reduo do teor de lactose das amostras.
Para ambas as enzimas e concentraes, a temperatura mais alta favoreceu uma reduo maior
da lactose, com exceo na utilizao da enzima 1 a 0,8 g/L, que alcanou um teor de lactose
final mais baixo a 12 C. Tambm se pode perceber a diferena entre o tempo de hidrlise
para alcanar os nveis mais baixos de lactose, que com a temperatura inferior ficou em torno
Lactose (gramas/100g)
de 14 horas e com a temperatura superior (32 C), em torno de 7 horas.
6
Enzima 1 - 7,9C e
0,5 g/L
5
4
Enzima 1 - 36,1C
e 0,5 g/L
3
2
Enzima 2 - 7,9C e
0,5 g/L
1
Enzima 2 - 36,1C
e 0,5 g/L
0
0
9 10 11 12 13 14 15 16
Figura 21 Valor estimado de lactose durante a hidrlise, para as enzimas 1 e 2, nas

temperaturas de 7,9 e 36,1 C e na concentrao de enzima de 0,5 g/L.
Tambm se pode perceber o efeito da temperatura visualizando-se a Figura 21, que

apresenta os valores de lactose das amostras com o uso de ambas as enzimas a uma mesma
concentrao, porm submetidas s duas temperaturas extremas (7,9 C e 36,1C). A
temperatura que provocou o maior grau de hidrlise foi a de 7,9C para a enzima 1 e a de 36,1
50
C para a enzima 2. Porm, os valores finais de lactose alcanados foram muito semelhantes,
indicando a possibilidade de utilizar-se a menor temperatura.
Carminatti (2001) realizou ensaios a vrias temperaturas (30 C, 35 C, 40 C, 45 C e
50 C) para determinar a faixa de temperatura tima para a atuao da lactase. Observou que
foi na faixa entre 30 C e 40 C que ocorreram as melhores converses da lactose em glicose e
galactose, obtendo-se valores prximos a 100% de hidrlise. Com o aumento da temperatura,
a converso da lactose reduziu sensivelmente, sendo que 45C a converso mxima obtida
foi de aproximadamente 70%, e a 50 C foi de apenas 35%. J Andrade (2005), optou por
afixar a temperatura em 30 C em todo o experimento, variando apenas outros parmetros,
como quantidade de enzima. Longo (2006) tambm optou por manter uma temperatura
constante, porm de 40 C.
Observando as Figuras 18, 19, 20 e 21, percebe-se que quanto maiores as temperaturas
com o uso de uma mesma enzima a uma mesma concentrao, maior a reduo da lactose
na primeira hora de hidrlise. Isto tambm ocorre quanto maiores as concentraes da enzima,
com o uso de uma mesma enzima a uma mesma temperatura. Isto tambm foi verificado por
Carminatti (2001), que comenta que o grau de hidrlise obtm seu mximo em
aproximadamente 60 minutos. Porm, ele observou que o grau permanecia constante no resto
do ensaio, que teve durao de 4 horas, o que no foi observado no presente experimento,
onde o grau de hidrlise continuou aumentando com o passar das horas, embora a uma menor
taxa.
5.2 Anlise microbiolgica

Na Tabela 7 so apresentadas as mdias dos valores de contagem total de
microrganismos das matrias-primas e das amostras aps serem submetidas reao de
hidrlise.
Tabela 7 Contagem total da matria-prima e das amostras aps a reao de hidrlise.

Parmetro
Enzima (lactase)
Matria-prima
Leite aps hidrlise
Contagem total
6,67 . 104
232. 104
(UFC/mL)
5,33 . 104
81,7 . 104
aA
aA
* Mdias na linha seguidas por uma mesma letra (minscula) no diferem significativamente entre si pelo teste
de Tukey em nvel de 5% de probabilidade de erro.
** Mdias de um mesmo parmetro na coluna seguidas por uma mesma letra (maiscula) no diferem
significativamente entre si pelo teste de Tukey em nvel de 5% de probabilidade de erro.
51
Pode-se visualizar, atravs da Tabela 7, o aumento da mdia da contagem de

microrganismos aps a hidrlise, j comentado anteriormente, apesar de no ter sido
considerado significativo estatisticamente. Pode-se perceber que a mdia de UFC/mL
encontrada aps a hidrlise ultrapassou o limite estabelecido pela legislao (3. 105), porm,
na Tabela 8 so apresentados os valores da contagem total de microorganismos presentes por
amostra de leite e ento se percebe que com o uso da enzima 1, trs tratamentos (1, 2 e 5) no
excederam esse limite e com o uso da enzima 2, sete (1, 2, 5, 6, 8, 11 e 12). Essa diferena na
contagem entre tratamentos iguais (mesma temperatura e concentrao da enzima) com o uso
de enzimas diferentes pode ser explicada pela maior eficincia demonstrada pela enzima 2,
que alcanou valores superiores de hidrlise em tempos inferiores, reduzindo, portanto, a
multiplicao dos microrganismos.
Tabela 8 Contagem total de microrganismos presentes nas amostras e perodo por

tratamento e enzima utilizada.
Tratamento
Temp.
Conc.
(C)
enzima
(g/L)
Com enzima 1
CT
Perodo (h)
(UFC/mL)
CT
Perodo
(UFC/mL)
(h)
14
8,32.104
14
4,75.104
14
4,67.104
11
0,2
5,00.106
4,77. 106
32
0,8
6,32. 105
4,75. 105
22
0,5
2,15. 105
11
2,62.104
10
22
0,5
3,85. 105
11
3,37.104
10
36,1
0,5
3,85.106
1,77.106
7,9
0,5
3,67. 105
15
2,47. 105
14
22
0,9
6,72. 105
11
5,22. 105
10
22
0,1
1,57.107
14
1,77.106
14
11
22
0,5
5,32. 105
11
2,80.104
10
12
22
0,5
3,60. 105
11
2,15.104
10
12
0,2
12
0,8
32
5,05.104
Com enzima 2
* Mdias na coluna seguidas por uma mesma letra no diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey
em nvel de 5% de probabilidade de erro.
52
Os maiores valores de contagem total foram encontrados nas maiores temperaturas

(22, 32 e 36,1C) e com o uso de menores concentraes de enzimas (0,1; 0,2 e 0,5 g/L).
Segundo Longo (2006), a temperatura tima para a enzima seria de 40C, porm, esta
temperatura ideal para proliferao de microrganismos patognicos no leite, portanto, o
tempo de reao no deve ultrapassar 4 horas, e no presente experimento, as amostras do
tratamento 7 ficaram submetidas a uma temperatura de 36,1C por um perodo de 5 horas, o
que justifica o grande aumento nos valores de contagem total. Isto tambm pode ter
justificado o aumento na contagem total no tratamento 3, onde as amostras ficaram
submetidas a uma temperatura tambm elevada, de 32C, por um perodo de 7 horas. J no
aumento do nmero de microrganismos das amostras submetidas ao tratamento 10,
possivelmente houve influncia da temperatura de 22C, um pouco elevada, mas,
principalmente, do longo perodo de tratamento, 14 horas. Isto pode ser confirmado
visualizando-se o tratamento 8, onde as amostras ficaram submetidas ao tratamento por um
perodo de 15/14 horas, porm a uma temperatura de 7,9C, e a contagem total no aumentou
significativamente em relao ao valor inicial.
5.3 Anlise Sensorial

Foi feito um teste triangular, onde 34 julgadores avaliaram a diferena global entre
duas amostras de leite submetidas a tratamentos diferentes, sendo que apenas 16 deles
perceberam a diferena entre as amostras oferecidas. Destes 16 julgadores, 9 perceberam a
diferena entre amostras com valores extremos de lactose e 7, entre amostras de um valor
extremo com um intermedirio. Em nvel de 5% de significncia, esses 34 julgadores
deveriam ter feito 17 acertos (LYON, 1992), o que no ocorreu, optando-se ento pela no
realizao dos testes de comparao mltipla e de preferncia. A no percepo da diferena
entre as amostras pelos julgadores provavelmente ocorreu devido s comparaes terem sido
feitas todas entre leites com teores de lactose reduzido, que embora diferentes, pois possuam
teores diferentes de lactose (aproximadamente 0,45; 1,15 e 2,03 g/100g), apresentavam
semelhanas, como maior viscosidade e sabor mais doce. Longo (2006) avaliou
sensorialmente iogurtes elaborados a partir de leites com baixo teor de lactose e verificou uma
baixa percepo de acidez e um significativo aumento do sabor doce, o que ocasionou um alto
ndice de preferncia (89,66%) destes iogurtes. Segundo Vinhal (2001) e Louserma apud
Andrade (2005), a reao de hidrlise de fato ocasiona modificaes fsicas e qumicas dos
produtos, e entre elas pode-se citar o aumento da solubilidade, do poder adoante e da
digestibilidade dos acares e da viscosidade, do corpo, da textura e do paladar dos produtos.
53
Longo e Waszczynskyj (2005) tambm verificaram diferenas na comparao sensorial de

leites UHT, na qual o leite com baixo teor de lactose apresentou textura significativamente
mais espessa e sabor doce mais intenso que o leite com teor de lactose normal.
54
6 CONCLUSES
Com base no presente estudo, concluiu-se que, em relao s quantias de lactose
durante a hidrlise, uma mesma temperatura a menor concentrao de enzima provocou
uma menor reduo da lactose. J quando utilizadas as mesmas concentraes de enzima em
diferentes temperaturas, no foi possvel verificar um comportamento padro, sendo que em
alguns casos houve maior reduo temperaturas mais elevadas, enquanto que em outros,
temperaturas menos elevadas. Quanto maiores as temperaturas e as concentraes de enzima,
mantendo-se o outro parmetro constante (concentrao e temperatura, respectivamente), e
com o uso de uma mesma enzima, maior a reduo da lactose na primeira hora de hidrlise.
A hidrlise da lactose estimada por frmula, atravs da crioscopia atingida, alcanou
valores aproximados de 80% e a hidrlise encontrada, calculada por meio de estequiometria,
atingiu valores aproximados de 100%. Com isto, o teor de lactose foi reduzido de 4,79 g/100g
para menos de 1g/100g. Esta reduo possibilitaria a ingesto do leite por indivduos
intolerantes a este carboidrato. As maiores porcentagens de hidrlise e, conseqentemente, os
menores teores de lactose atingidos foram verificados em temperaturas de 15 a 30C e com o
uso de concentraes de enzima de 0,6 a 1,0 g/L.
Existe diferena entre a eficincia das enzimas fornecidas pelos dois fabricantes na
hidrlise da lactose, embora as duas sejam provenientes de uma mesma fonte, a levedura
Kluyveromyces lactis.
A adio da enzima lactase provocou modificaes nas caractersticas e propriedades
fsico-qumicas do leite, como reduo do pH, da crioscopia, dos teores de gordura e de
lactose e aumento da densidade, do extrato seco total (EST), do extrato seco desengordurado
(ESD), dos teores de protena e de glicose.
A mdia de UFC/ml encontrada aps a hidrlise ultrapassou o limite estabelecido pela
legislao, porm, nas contagens realizadas nas amostras de leite, com o uso da enzima 1, trs
tratamentos no excederam esse limite e com o uso da enzima 2, sete. Os maiores valores de
contagem total foram encontrados nas maiores temperaturas (22, 32 e 36,1C) e com o uso de
menores concentraes de enzimas (0,1; 0,2 e 0,5 g/L).
As diferenas entre amostras de leite submetidas a tratamentos diferentes, ou seja, com
teores de lactose diferentes, no foram sensorialmente percebidas atravs do teste triangular.
55
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INFLUÊNCIA de DIFERENTES CONCENTRAÇÕES de Enzima Lactase e Temp Sobre A Hidrolise Da Lactose

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INFLUÊNCIA de DIFERENTES CONCENTRAÇÕES de Enzima Lactase e Temp Sobre A Hidrolise Da Lactose

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA

CENTRO DE CINCIAS RURAIS

INFLUNCIA DE DIFERENTES CONCENTRAES

Ana Paula Trevisan

Santa Maria, RS, Brasil

INFLUNCIA DE DIFERENTES CONCENTRAES DE

Ana Paula Trevisan

Dissertao apresentada ao Curso de Mestrado do Programa

Orientador: Prof. Ernesto Hashime Kubota

Santa Maria, RS, Brasil

Universidade Federal de Santa Maria

A Comisso Examinadora, abaixo assinada, aprova a Dissertao de Mestrado

INFLUNCIA DE DIFERENTES CONCENTRAES DE ENZIMAS

como requisito parcial para obteno do grau de Mestre em Cincia e

Prof. Ernesto Hashime Kubota, Dr.

Prof. Neila S.P.S. Richards, Dra.

Prof. Luisa Helena R. Hecktheuer, Dra. (UFSM)

Prof. Clair Jorge Olivo, Dr. (UFSM)

Santa Maria, 28 de abril de 2008.

Ao meu noivo Douglas, pelo carinho, ateno, compreenso e grande colaborao

Ao professor Ernesto Hashime Kubota e professora Neila S.P.S. Richards (UFSM),

professora Rosane Coradine Noal (UFSM), pela grande disposio em ajudar,

UFSM, por me possibilitar a oportunidade de participar desse mestrado, um sonho

Aos professores do Programa de Ps-Graduao em Cincia e Tecnologia dos

professora Luisa Helena R. Hecktheuer (UFSM) e ao professor Clair Jorge Olivo

A todos os colegas de mestrado, especialmente Diala, pelo auxlio no experimento,

Enfim, a todos que direta ou indiretamente contriburam para a realizao deste

FIGURA 16 Valor encontrado de lactose, conforme temperatura e concentrao da

Estudar a influncia de diferentes concentraes de enzimas lactase e temperaturas

2.2 Objetivos especficos

- Acompanhar a hidrlise da lactose e comparar o mximo percentual de hidrlise

Segundo a legislao brasileira, entende-se por leite, sem outra especificao, o

Tabela 1 Composio aproximada do leite (% em peso).

Extrato seco total

A gua o componente mais abundante, no qual se encontram em soluo os demais

O ndice crioscpico definido como a temperatura em que o leite passa do estado

Como pode ser observado na Tabela 1, a lactose o componente majoritrio do

Figura 1 Estrutura qumica da lactose.

3.2.1 Hidrlise da lactose

uma reao necessria para a digesto da lactose. A lactose hidrolisada pela

Figura 2 Hidrlise da lactose.

Segundo Schlimme e Buchheim (2002), a hidrlise da lactose cada vez mais

possibilidade de alterao dos compostos sensveis ao calor, como as necessidades

3.2.2 Intolerncia lactose

A intolerncia aos alimentos uma reao reproduzvel, desagradvel (adversa) a um

Lactase o nome usualmente utilizado para denominar a enzima -D-galactosidase

Tabela 2 Aplicaes biotecnolgicas da enzima -galactosidase

A enzima lactase encontra-se espalhada na natureza e pode ser isolada a partir de

3.4 Anlise Sensorial

As caractersticas sensoriais de um leite normal so: aspecto lquido, odor e sabor

4.1.2 Enzima Lactase

melhor discutida no item 4.2.5, que trata do planejamento estatstico do experimento. Os

% de Hidrlise alcanada = 350,877 x (Crioscopia final) (Crioscopia inicial)

O tratamento foi encerrado quando a crioscopia estabilizou, ou seja, no aumentou em

4.2.2 Anlises fsico-qumicas

4.2.3 Anlise microbiolgica

4.2.4 Anlise sensorial

4.2.5 Planejamento estatstico

O experimento foi conduzido conforme delineamento central composto rotacional

A Figura 3 apresenta, numa forma grfica, o DCCR para 2 fatores. Os DCCR so

Figura 3 Modelo central composto rotacional para 2 fatores

Tabela 3 Variveis independentes e nveis de variao

X1 = temperatura da reao (C)