1.

INTRODUO

1.1.

Identificao e justificativa do problema de pesquisa

Apesar dos avanos recentes em biotecnologia alimentar com a implementao

de modernas tecnologias e conceitos de segurana, uma eficaz conservao dos
alimentos representa um enorme desafio a ser resolvido. Dados confirmam que nos
ltimos 12-13 anos, pessoas acometidas com doenas de origem alimentar e
intoxicaes vem aumentando e maiores so os ndices de doenas transmitidas por
alimentos (listeriose, salmonelose e colite hemorrgica) [1].
Desde o sculo XVIII, h uma grande necessidade da populao mundial em
controlar micro-organismos de carter patognico e/ou deteriorantes [2].
Para alcanar tal fim, tendo destaque nas ltimas dcadas, a adio e o uso
indiscriminado de insumos qumicos, tais como pesticidas, herbicidas e fertilizantes tm
sido largamente empregados na agricultura [2, 3].
Contudo, esforos governamentais agem no sentido de firmar rgidas medidas de
controle para minimizar os impactos causados ao meio ambiente e aos consumidores
pela prtica adotada por parte dos agricultores para alcanar os objetivos anteriormente
citados [2].
Alm do que, em pases com normas de segurana inadequadas, a utilizao de
pesticidas na agricultura gera graves conseqncias para a sade dos trabalhadores
envolvidos no preparo da plantao [3]. Portanto, h uma necessidade cada vez maior
na busca de alternativas sustentveis, que demonstrem ser mais amigveis ao meio
ambiente e de fcil obteno.
Dessa forma, a populao tem se tornado mais consciente do emprego de
conservantes alimentares, bem como tambm sobre os benefcios desfrutados de uma
alimentao natural, a qual caracterizada pelo o consumo de produtos alimentcios
ausentes de aditivos sintticos e minimamente processados [2].
Nesse contexto, ferramentas biotecnolgicas emergem como uma opo
interessante sustentabilidade das redes agrcolas, uma vez que reduzem a necessidade
de insumos qumicos [3]. Assim, a biotecnologia possui a capacidade de gerar produtos
considerados naturais, provenientes de fontes renovveis e virtualmente inextinguveis,

alm de no produzirem resduos txicos. Tal fato tem provocado nos ltimos anos uma
intensa corrida cientfica por materiais resultantes de bioprocessos.
O presente projeto busca propor a melhora do processo de purificao de um
novo composto antimicrobiano (Pochaecin PI80) que possa ser aplicado em produtos
alimentares e na agricultura de forma a combater micro-organismos patognicos,
contornando os problemas para sade publica e agricultura aqui citados. Este seria,
portanto, mais um avano na busca por meios sustentveis e economicamente viveis e
para a produo de alimentos seguros.

2.

REVISO DA LITERATURA

2.1 Segurana alimentar

Apesar dos avanos no setor tecnolgico, a preservao dos alimentos ainda

uma questo fortemente debatida, no s nos pases em desenvolvimento - em que
polticas de controle so claramente necessrias mas tambm em pases
industrializados, destacadamente na Europa [4].
A extenso em torno dos aspectos microbiolgicos relacionados a conservao de
produtos alimentcios foram refletidos na reunio de planejamento estratgico da OMS
em 2002. Os seguintes pontos foram discutidos: (i) surgimento de patgenos e agentes
patognicos que no eram associados ao consumo de alimentos emergiram como uma
grande causa de preocupao e (ii) a capacidade de adaptao e mudana apresentada
pelos micro-organismos em relao aos modos de produo dos alimentos, preservao
e armazenamento, resultou em claros riscos para a segurana alimentar [4, 5].
Segundo Cleveland et al (2001), a partir de dados do Centers for Disease Control
and Prevention nos Estados Unidos, a cada ano nesse mesmo pas, so identificados
76 milhes de casos de doenas provocadas pelo consumo de alimentos contaminados,
o que por sua vez, resulta em cerca de 5000 bitos [6].
Em termos financeiros, o custo despendido pelo governo americano para arcar
com doenas provenientes de alimentos so estimados em torno de U$ 6,5 e
34,9 bilhes de dlares. Os principais micro-organismos responsveis por associarem-se
s estatsticas anteriormente mencionadas so: Campylobacter jejuni, Clostridium

perfringens,

Escherichia

coli

O157:H7,

Salmonella,

Staphylococcus

aureus,

Toxoplasma gondii e Listeria monocytogenes [6].

De origem alimentar, a listeriose transmitida pela bactria Lysteria
monocytogenes.

Compromete significativamente a segurana dos alimentos, por

desenvolver-se em baixas temperaturas e em altos teores de sal [7-9].

A listeriose caracterizada por ser uma doena grave. Afeta predominantemente,
recm nascidos, idosos, imunodeprimidos e mulheres grvidas. Sendo que esse ltimo
grupo, dados informam que em relao a populao geral, apresentam uma
predisposio 12 vezes maior de contrair a doena quando da ingesto de alimentos
contaminados. E as consequncias dessa patologia para tal grupo so bastante
significativas, podendo ocorrer aborto espontneo, parto prematuro ou natimorto [7, 8].
Contudo, mulheres grvidas podem ser assintomticas mesmo infectadas com
Lysteria monocytogenes, elevando os riscos de transmitirem a infeco para o feto,
tendo em vista que no se faz possvel o diagntisco da doena. Ainda, recm-nascidos
acometidos com listeriose e que sobrevivem podem vir a apresentar srias
complicaes, principalmente granulomatose sptica e retardo fsico [7-9].
Nos anos de 2001 e 2008, na Inglaterra e no Pas de Gales foram identificados
1.510 casos de listeriose, sendo que 12% estavam relacionados a mulheres grvidas.
Segundo estimativas atuais, sugere-se que no Reino Unido, a listeriose responsvel
pelor maior nmero de bitos relacionados com a ingesto de alimentos [8]. Em geral,
30% das pessoas que manisfestam a doena possuem risco de morte [7].
Assim, pesquisas confirmam que cada vez mais urgente rgidos controles e
instauraes de polticas de segurana alimentar para evitar a maior vulnerabilidade dos
grupos de riscos, bem como tambm a busca por novas alternativas teraputicas que
determinem um tratamento mais eficaz e satisfatrio da listeriose (Hof, Nichterlein et al.
1997).
Nesse contexto, nos tlimos anos, estudos direcionam-se para a descoberta e o
desenvolvimento de novos mtodos de conservao de alimentos [10], principalmente
no que diz respeito a produo de peptdeos com propriedades antimicrobianas para tal
fim [6, 11].

2.2 Peptdeos com propriedades antimicrobianas (PAMs)

A produo de peptdeos com propriedades antimicrobianas (PAMs)

identificada tanto em organismos eucariotos e procariotos e servem como componentes
importantes da linha de defesa primria em inmeras espcies, compreendendo a
imunidade inata [6, 12].
O hospedeiro obtm proteo pela atuao dos peptdeos antimicrobianos por
diferentes mecanismos, principalmente atravs da permeabilizao membranar da
clula-alvo, provocando o extravasamento do material gentico irreversivelmente e
consequentemente a morte celular. Peptdeos podem agir contra um grupo especfico de
micro-organismos semelhantes ou por um amplo espectro de ao, caracterizando uma
linha de defesa mais geral [6, 12].
Os organismos eucariotos produzem inmeros peptdeos microbianos com
diferentes nveis de toxicidade. Um exemplo so as defensinas humanas, excretadas por
neutrfilos, as quais apresentam alto grau de toxicidade quando produzidas em
concentraes elevadas. Porm, a elevada citotoxidade dos peptdeos antimicrobianos
produzidos por eucariotos os torna completamente inviveis para a utilizao em
alimentos [6].
Os peptdeos antimicrobianos podem ser dividos em duas classes principais,
diferenciados pela localizao nas quais podem ser sintetizados, assim: (i) classe dos
peptdeos produzidos a nvel no-ribossomal e (ii) a nvel ribossomal [13, 14].
O primeiro grupo, excretados a nvel no-ribossomal,

so geralmente

denominados de antibiticos, como por exemplo, gramicidinas, polimixinas e

bacitracinas. Apresentam extensa aplicao clnica, sendo de grande destaque para o
sucesso da medicina no controle e tratamento de enfermidades ao longo dos anos. So
produzidos exclusivamente por bactrias e desde a segunda metade do sculo XIX tm
sido largamente descritos na literatura [13].
J o segundo grupo, sintetizados a nvel ribossomal, so excretados por todas as
espcies de vida (inclusive as bactrias). E como j foi anteriormente mencionado,
funcionam como um importante componente das molculas de defesa natural de um
organismo [4, 6, 12, 13].
As protenas ou peptdeos com propriedades antimicrobianas produzidas por
bactrias so denominadas de bacteriocinas [2, 6, 11, 15].

Atualmente, essa nova classe de biomolculas tm despertado grande interesse da

comunidade cientfica, principalmente pelo grande potencial associado conservao de
alimentos, contribuindo intensamente para o fortalecimento do conceito de
sustentabilidade e abrindo novas possibilidades para o crtico problema da sade pblica
em relao a segurana alimentar.

2.3 As bacteriocinas

Em 1925, atravs de trabalhos desenvolvidos por Gratia et al, descreveu-se pela

primeira vez um peptdeo com propriedade antimicrobiana excretado por uma linhagem
de bactria. Essa bacteriocina foi denominada de colicina. Porm, essa toxina que foi
observada como instvel ao calor e produzida por determinada estirpe de
Escherichia coli s foi posteriormente caracterizada como produto proteico por
Fredericq em 1946 [1, 14-16].
Em 1952, Jacob et al props que a denominao genrica bacteriocina deveria ser
usada somente para protenas com propriedades antimicrobianas, produzidas por cepas
de bactrias [1, 15]
As bacteriocinas so marcadas por ser uma famlia extensa de potentes proteinas
com propriedades antimicrobianas especficas e funcionalmente diversificadas, podendo
ser verificadas a produo de pelo menos uma bacteriocina em 99% das linhagens
bacterianas. Tais toxinas proteicas desempenham papel fundamental na dinmica
competitiva entre estirpes de bactrias e entre as espcies intimamente relacionadas [14,
15].
A diversidade encontrada nas famlias de bacteriocinas referem-se ao tamanho,
alvo microbiano, modo de ao e liberao, bem como mecanismos de imunidade
desenvolvidos por cada estirpe produtora [14].
Segundo Desriac et al (2010), a aplicabilidade e as potencialidades mdicas e
veterinrias de tais micro-organismos produtores de compostos antimicrobianos so
enormes.
Bacteriocinas tm despertado um grande interesse da comunidade cientfica,
resultando em aumentos exponenciais na quantidade de publicaes refletindo-se na
requisio

de

inmeras

patentes

nos

ltimos

anos

(http://www.freepatentsonline.com/result.html?query_txt=bacteriocin&sort=relevance&
srch=top&search=).
A grande maioria dos pedidos refere-se a conservao de alimentos, contudo, so
sugeridas tambm para proteo fitossanitria de plantas, uso teraputico mdico ou
veterinrio e mais recentemente na aquicultura para a conservao de frutos do mar [11,
16]
Aplicadas na biopreservao de alimentos, as bacteriocinas deve favorecer
significativas redues no emprego de nitritos potencialmente txicos na conservao
de alimentos [10, 12, 17]. Desse modo, segundo Cotter et al (2005) citado por Settanni
et al (2008) : "bacteriocinas podem ser empregadas para conferir uma forma rudimentar
de imunidade inata aos gneros alimentcios" [2].
Nos ltimos anos, o acmulo de pesquisas apontam de forma clara que o emprego
de bacteriocinas na biopreservao alimentar pode oferecer inmeros benefcios, a
citar : (i) prolongamento da vida til dos alimentos, (ii) capacidade de proporcionar
proteo extra em situaes de temperatura elevada, (iii) reduo do risco de
transmisso de patgenos originados em alimentos e dissipados na cadeia alimentar
(iv) melhoramento das perdas econmicas devido deteriorao de alimentos,
(v) reduo do emprego de conservantes qumicos, (vi) possibilita menor aplicao de
tratamentos trmicos, proporcionando assim, melhor conservao dos nutrientes e
vitaminas, assim como as propriedades organolpticas dos alimentos, (vii) permite a
comercializao de "novos" alimentos, isto , menos cidos, com menor teor de sal e
maior quantidade de gua [4].
Portanto, a aplicao de um ou mais benefcios anteriormente mencionados
podem atender demandas comerciais, de segurana pblica ou anseios dos
consumidores.

2.3.1 Bacteriocinas e os antibiticos

Na literatura, bacteriocinas so usualmente confundidas com antibiticos [6].

Segundo Hurst (1981), citado por Cleveland et al (2001), bacteriocinas se
distinguem dos antibiticos, tendo em vista que esses compostos biolgicos so

conservantes de alimentos e os antibiticos no podem ser aplicados para esse fim,

devido ao nvel de toxicidade apresentada por essa ltima classe [6, 14] .
Alm do que, uma das caractersticas que distinguem claramente uma bacteriocina
de um antibitico o estreito espectro de ao das mesmas [1, 14, 18].

Caractersticas

Bacteriocinas

Antibiticos

Aplicao

Alimentos

Clnica

Sntese

Ribossomal

Metablito secundrio

Atividade

Reduzido espectro

Amplo espectro

Imunidade da clula produtora

Sim

No

Modo de ao

Geralmente, formao de poros.

Alvo especfico

Toxicidade/efeitos colaterais

No muito bem sabido

Bem descrito

Adaptado de Cleveland et al, 2001.

2.3.2 Bacteriocinas: classificao

Estudos diferenciados demonstram que bacteriocinas possuem traos de

carboidratos (menor que 1%) e fsforo (inferior a 0,1%) [1].
Podem ser produzidas por bactrias Gram-negativas (protenas maiores que 20
kDa) e Gram-positivas (peptdeos menores que 6 kDa) [12, 14].
Baseando-se em propriedades bioqumicas e genticas, as bacteriocinas
produzidas podem ser subdivididas em trs ou quatro classes principais : (i) classe I :
lantibiticos, que so bacteriocinas modificadas e contm a lantionina, que um
aminocido incomum, (i) classe II : no-lantibiticos, que so termicamente estveis e
no-modiicados (i) classe III : bacteriocinas termo-lbeis e o quarto grupo, que so
molculas complexas, apresentando uma cadeia que apresenta metade da composio de
lipidios e metade de carboidratos [12].

Grupo
I

II

Classificao
Ia

Lantibioticos. Peptideos de baixo peso molecular (< 5kDa). Contm lantionina e

-metil-lantionina. So molculas flexveis como Ib.

Ib

Peptdeos globulares com carga neutra ou negativa.

IIa

Pequenos peptdeos estaveis ao calor.

IIb

Dois sistemas componentes: dois peptdeos diferentes so necessrios para

formar o complexo ativo de formao de poros.
Molculas grandes, sensveis ao calor.

III

Adaptado de Cleveland et al, 2001.

2.3.3 Bacteriocinas: mecanismo de atuao

As bacteriocinas podem apresentar efeito bacteriocida ou bacteriosttico sobre

outras bactrias [2, 19]
O efeito bactericida atribudo permeabilizao da membrana da clula. Os
peptdeos em contato com a membrana celular formam uma estrutura helicoidal, que
incorpora e atravessa a membrana induzindo a formao de um poro. Tal fato provoca o
extravasamento de ons K+, dissipao do potencial de membrana e inibio da captao
de aminocidos, levando consequentemente morte celular [1, 2, 6, 17-19]
relevante destacar o fato de que bacteriocinas so capazes de matar bactrias
especficas concorrentes com pouco ou nenhum prejuzo clula produtora, fato
atribudo modificaes ps-transcricionais e/ou mecanismos de imunidade especfica
[13].
As clulas produtoras de bacteriocinas protegem-se de seus prprios compostos
antibacterianos por meio de um sistema conhecido como imunidade, o qual expresso
concomitantemente com o peptdeo antimicrobiano [19]. Cleveland et al (2001)
menciona que um gene capaz de codificar a protena de imunidade, a qual apresenta
entre 50 e 150 resduos de aminocidos e est associada a membrana.

2.3.4 Biopreservao de alimentos

O termo biopreservao est intimamente relacionado potencializao da

segurana dos alimentos e na maior extenso do perodo de vida til desses produtos.
Para tal, emprega-se micro-organismos e/ou seus metablitos [2].
O uso emprico de micro-organismos e/ou seus produtos naturais para a
bioproteo dos alimentos tem sido uma prtica comum na histria da humanidade [19].
Durante muitos milnios, bactrias produtoras do cido ltico (BAL) desempenham

papel fundamental em relao aos alimentos fermentados e no fermentados. Tal

caracterstica atribuda aos produtos metablicos produzidos pelas mesmas, os quais
contribuem significativamente para o sabor, textura e muitas vezes, por agregarem valor
nutricional aos alimentos [2].
Ademais, BAL exercem um importante papel na preservao e segurana
microbiolgica dos alimentos fermentados, promovendo dessa forma, a estabilidade
microbiolgica do produto final da fermentao. Tais caractersticas advm da produo
de cidos orgnicos, dixido de carbono, etanol, perxido de hidrognio e diacetil,
compostos antifngicos, tais como cidos graxos ou cidos fenilticos, bacteriocinas e
antibiticos como reutericiclina [2, 14].
BAL compem parte da flora microbiana natural dos mamferos, incluindo os
seres humanos. Devido a esse fato, bacteriocinas provenientes de BAL so consideradas
seguras para a conservao de alimentos. Outras propriedades tambm contribuem para
embasar esse tipo de afirmao, entre as quais: (i) no so ativas ou txicas em clulas
eucariticas, (ii) so inativadas por proteases digestivas, tendo pouco influncia sobre a
microbiota do intestino, (iii) mostram modo de ao bactericida, normalmente agindo
sobre a membrana citoplasmtica bacteriana: nenhuma resistncia cruzada com
antibiticos, e (iv) os seus determinantes genticos so geralmente plasmdeo
codificado, facilitando a manipulao gentica [4, 6, 11, 17]
Stettanni e Corsetti (2008) relata que as fontes as quais as bacteriocinas podem ser
extradas so muitas, entre as quais, Lactobacillus spp, seguida por Enterococcus,
Pediococcus e Leuconostoc spp. Atualmente, podem tambm ser extradas de
Lactococcus, Streptococcus e Carnobacterium [2, 9].
A nisina, conhecida desde de 1928, um exemplo clsssico de um agente inibidor
naturalmente produzido e j consagrado. Foi caracterizada em 1971, sendo identificada
como uma lantionina. produzida por linhagens de Lactococcus lactis e de longe a
bacteriocina mais conhecida, caracterizada e estudada. a nica empregada
comercialmente na maior parte dos pases produtores de alimentos para a conservao
de alimentos, especialmente produtos lcteos. Devido ao seu grande sucesso, muitos
grupos de pesquisa foram estimulados a investigar as bacteriocinas nos ltimos anos [4,
6, 12].

Ao ser verificado que linhagens de bactrias de Lactococcus lactis esto

naturalmente presentes em alimentos durante o processamento e que no apresentam
nenhum efeito adverso quando ingerido, levou a Food and Drug Administration (FDA)
dos EUA a elev-la ao status de GRAS (reconhecida como segura) para a nisina, tendo
uso aprovado em mais de 40 pases h cerca de 50 anos [2, 6, 17].

2.3.4.1 Biopreservao de alimentos: alternativas e novos avanos

As potencialidades das bacteriocinas aliadas aos tratamentos qumicos tradicionais

aplicados na indstria alimentcia oferecem um excelente efeito sinrgico para a
conservao dos alimentos [2, 6].
Um exemplo ilustra bem esse tipo de possibilidade : os nitratos so usados para
impedir o crescimento de clostrdios em carne, no entanto, preocupaes de segurana
sobre a presena de nitritos levaram a indstria alimentcia a procurar mtodos
alternativos de preservao. Desse modo, a nisina, ou sua combinao com baixos
nveis de nitrato pode impedir o crescimento de Clostridium [6].
Outra alternativa o uso combinado desses compostos biolgicos, para minimizar
o desenvolvimento de cepas resistentes [4].
Alm do que, a combinao de bacteriocinas a tratamentos fsicos, como por
exemplo, processamento a alta presso e campos eltricos pulsados, elevam a
capacidade de preservao alimentar. Isso porque, possibilitam um obstculo maior para
o desenvolvimento de formas mais refratrias, como os endsporos bacterianos [4].
No decorrer dos ltimos anos, o emprego de bacteriocinas tm recebido avanos
no campo tecnolgico [4].
Algumas patentes j foram requeridas, inovando o uso das bacteriocinas. Assim,
esses peptdeos com propriedades antimicrobianas podem ser ligados embalagens
polimricas atravs da adsoro, sendo denominadas de embalagens ativas .
definido como um sistema inteligente que tem a capacidade de proporcionar
prolongados perodos de vida til aos alimentos, otimizando a qualidade e a segurana.
Tal mtodo tem sido direcionado para produtos crneos embalados a vcuo e alimentos
de origem animal [2, 4, 9, 10]

10

Novos esforos tm sido canalizados para aplicar esse tipo de proteo inteligente
nos alimentos vegetais [2].
Portanto, como cita Galvez et al (2007) em seu trabalho, desenvolvimentos na
ecologia microbiana molecular pode auxiliar de maneira eficaz a compreenso dos
efeitos globais de bacteriocinas em sistemas alimentares e a pesquisa de genomas
bacterianos pode revelar novas fontes de bacteriocinas [4].

2.3.5 Bacteriocinas e restries de uso

A eficcia de bacteriocinas muitas vezes ditada por fatores ambientais como pH,
composio dos alimentos, temperatura e estrutura, bem como a microbiota alimentcia.
Os alimentos devem ser considerados como ecossistemas complexos nos quais as
interaes microbiana pode ter uma grande influncia sobre o equilbrio microbiano [4,
9].
Alm do que, bacteriocinas podem ser eficientes em uma estreita faixa de pH, o
que inviabiliza a sua utilizao em inmeros produtos alimentares [2].
Alm dos fatores que influenciam a eficcia de bacteriocinas como agentes
antimicrobianos nos sistemas de alimentao, outros fatores que contribuem para a
produo de bacteriocinas so da maior importncia quando se utiliza culturas
bacteriocinognicas. O uso de culturas bacteriocinognicas enfrenta vrias limitaes
diretamente relacionada com a cepa produtora, tais como (i) a perda espontnea do trao
bacteriocinognico, (ii) a susceptibilidade da cepa produtora de infeco por
bacterifagos, (iii) o antagonismo de outras bactrias com a cepa produtora, (iv)
inadequao da cepa produtora como um fermento, (v) as dificuldades para a
manipulao gentica e a transferncia de trao bacteriocinognico para iniciantes
adequados, e, o mais importante, (vi) a capacidade de uma baixa produo de
bacteriocina no sistema alimentar (que vai depender muito das condies de
armazenamento de alimentos, a capacidade da cepa produtora de implantao e
proliferao, ou a induo da produo de bacteriocinas) [4].

2.4

Um exemplo de bacteriocina: Phocaecin PI80

11

Kumar et al (2009) caracterizaram e purificaram uma bacteriocina denominada de

Phocaecin PI80.
Essa bacteriocina foi produzida por bactrias da espcie Strepctococcus phocae.
Tal estirpe bacteriana foi isolada do intestino de um camaro, denominado
cientificamente de Peneaus indicus. Esse ltimo encontrado em mares indianos [20].
Alguns processos de purificao foram empregados para obteno

caracterizao desse produto biotecnolgico entre os quais; centrifugao, ultrafiltrao,

SDS-PAGE (electroforese em gel de SDS-poliacrilamida), HPLC (cromatografia de alta
eficincia), espectroscopia de massa e ICP-OES (espectroscopia de emisso ptica com
plasma acoplado indutivamente) [20].
O interesse por essa bacteriocina relevante, por apresentar atividade
antimicrobiana contra importantes patgenos que ameaam a segurana alimentar como
Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus e V. Fischeri. Ademais, apresenta
resistncia a tratamentos trmicos moderados (70 por 10 min) e mostra-se estvel a
solventes como acetona, etanol e butanol [20].
Desse modo, devido aos fatores anteriormente mencionados, o emprego de
eficientes mtodos de purificao desse peptdeo antimicrobiano merece especial
ateno, tendo em vista que bons rendimentos durante o processo de isolamento de tal
bacteriocina podem contribuir para a viabilizao desse produto. Esse fato de grande
importncia, j que eventualmente, o mesmo poder ser empregado para a
biopreservao de alimentos e dirimir em partes os srios problemas enfrentados pela
sociedade global com relao segurana alimentar.

2.5

Isolamento e purificao de bacteriocinas

A identificao de bacteriocinas a nvel laboratorial sempre um processo

delicado, geralmente de difcil execuo e caro. A simulao de condies ideais faz-se
necessrio, tendo em vista que condies de temperatura, pH e meios quimicamente
definidos, entre outros parmetros; so fundamentais para otimizar a interao com o
micro-organismo sensvel a tal peptdeo [21].
Mtodos estabelecidos por protocolos de purificao e recuperao so em sua
maioria bastante complexos e adotam precipitao com sulfato de amnio e,

12

sequencialmente o emprego de cromatografia lquida de troca inica, interao

hidrofbica ou cromatografia de fase reversa. Contudo, diversos relatos na literatura
indicam que esses mtodos podem proporcionar efetivos resultados de purificao,
porm, na maior parte das vezes, tornam-se inviveis para serem empregados em larga
escala. Esses problemas so devidos a alta complexidade do processo e custos
relacionados s tcnicas, alm da perda da atividade biolgica do produto de interesse
[21-23].
Inmeros so os fatores que prejudicam a obteno e a recuperao de PAMs
para uso comercial. Conclui-se que para cada tipo/classe de bacteriocinas so
observadas muitas particularidades, mesmo para aquelas que demonstram grande
semelhana entre si. Desse modo, a adoo de protocolos universais torna-se
completamente invivel.
A grande maioria dos pesquisadores aplica como primeira parte do processo de
purificao, a precipitao com solventes ou sais ao sobrenadante da cultura. Segundo
esses autores, sais podem promover tanto a dissociao da bacteriocina bruta em
monmeros mais ativos quanto a alterao de sua conformao [24, 25].
A aplicao de cromatografia por troca inica tem viabilizado bons rendimentos
de obteno de algumas bacteriocinas, porm, esse mtodo no se aplica a todos os
tipos de peptdeos, j que afeta drasticamente a recuperao da atividade biolgica das
mesmas [26, 27].
A cromatografia de interao hidrofbica pode ser empregada com sucesso na
recuperao de lantibiticos, como por exemplo, a nisina. Contudo, a utilizao desse
mtodo para a purificao de bacteriocinas de carter altamente hidrofbico mostra-se
invivel por reagirem de forma espontnea com a matriz do gel quando da ausncia de
sal [28, 29].
A recuperao de bacteriocinas atravs da cromatografia de fase reversa
utilizada muitas vezes em casos especficos, sendo a cromatografia de troca inica
mostrando melhor adaptao s molculas hidrofbicas [30, 31].
Tendo em vista todos os fatores anteriormente expostos, possvel inferir que a
adoo de protocolos de purificao envolve inmeras etapas de tentativa e erro, j que
o comportamento de proteinas ao longo dos processos de purificao so bastante

13

imprevisveis, podendo ocorrer mudanas nas estruturas conformacionais das mesmas,

levando consequentemente perda da atividade biolgica.
Desse modo, fica evidente o quo exaustivo encontrar as melhores estratgias
para o processo de purificao de proteinas, garantindo que o produto final apresente
todas as caractersticas necessrias para o fim devido.

3.
3.1.

OBJETIVO
Objetivo geral:

O objetivo do presente trabalho foi sugerir uma maneira mais eficaz de isolar e
purificar a bacteriocina Phocaecin PI80 produzida por Streptococcus phocae a ser
empregada contra a proliferao de micro-organismos, principalmente Listeria
monocytogenes.

4.

METODOLOGIA

4.1 Micro-organismo produtor

O micro-organismo utilizado como produtor do peptdeo antimicrobiano ser

obtido do banco de cepas - Streptococcus phocae (ATCC 51973T).

4.2 Micro-organismo indicador

Os micro-organismo contra os qual se testar o antimicrobiano (micro-organismo

alvo) ser adquirido em bancos de cepas Listeria monocytogenes (ATCC 35152).

4.3 Manuteno do micro-organismo

Tanto o micro-organismo produtor quanto o indicador sero congelados para

preservao da cepa e garantia da reprodutibilidade dos resultados. Para evitar a perda

14

da viabilidade durante o descongelamento ser adicionado um criopreservante. As

culturas utilizadas nesse trabalho tero como inculo s clulas criopreservadas.

4.4 Determinao do nmero de clulas viveis

A determinao das clulas viveis ser feita com a contagem de unidades

formadoras de colnia em placas com o gar adequado ao crescimento do microorganismo em questo, Streptococcus phocae ou Listeria monocytogenes . Uma srie de
diluies de 10 a 10 8 vezes ser realizada com soluo fisiolgica (0,85%). As placas
sero inoculadas com um volume da diluio, trs placas para cada diluio. Aps
incubadas a 37 pelo tempo necessrio para o aparecimento das colnias, espera-se de
24 a 48 horas, as unidades formadoras de colnia sero contadas e a concentrao
inferida aps considerar o volume do inculo e as diluies.

4.5 Obteno do sobrenadante da cultura

4.5.1 Preparao do pr-inculo

A cultura de Streptococcus phocae (ATCC 51973T) ser cultivada em frascos

cnicos de 250 mL contendo 50 mL de Caldo Nutriente por 24 h a 30C e 150 rpm.

4.5.2 Obteno do sobrenadante bruto

Aps o estmulo do crescimento da cultura de Streptococcus phocae (ATCC

51973T) , o meio de cultivo ser centrifugado a 10.000 g por 10 min e o sobrenadante
ser filtrado em membrana de 0,22 m. O filtrado resultante (extrato antimicrobiano
bruto) ser empregado para avaliar a atividade antimicrobiana, conforme mostrado na
seqncia (adaptado de Motta et al, 2004).

4.6 Determinao das unidades arbitrrias por mililitro

15

O mtodo de difuso em gar ser empregado para a determinao das unidades

arbitrrias por mL. Assim, placas de gar Nutriente (15 mL) sero preparadas, mantidas
em estufa a 37C por 30 min para completa secagem da superfcie, sendo
posteriormente inoculadas (~106 UFC, suspensas em soluo 8,75 g.L-1 NaCl) com o
microrganismo alvo. Quando a superfcie do gar estiver completamente seca, ser
aplicado disco de papel de filtro estreis com ~5 mm previamente embebidos (20 L) na
soluo a ser avaliada (extrato antimicrobiano bruto) (Motta & Brandelli, 2002;
Wilkinson et al, 2003). O ttulo da atividade antimicrobiana, expresso como unidades
arbitrrias (UA) por mL, ser determinado por meio de uma curva padro da relao
linear entre o dimetro de inibio e o logaritmo da dose construda a partir de diluies
seriadas (razo 2) da soluo a ser testada. Uma UA ser definida como a recproca da
maior diluio capaz de mostrar halo de inibio definido (Krier et al, 1998). Todas as
amostras sero testadas em trs repeties independentes.

4.7 Curva de crescimento e produo

O crescimento do Streptococcus phocae e a produo do antimicrobiano sero

acompanhados para determinao da variao com o tempo e verificao da
dependncia da produo com a fase de crescimento. O meio de cultura ser inoculado
com uma baixa concentrao para determinar o incio da curva e posteriormente
incubado a 37C sob agitao. Alquotas em perodos de 6 horas sero retiradas para
contagem de clulas conforme 4.4 e de unidades arbitrrias conforme 4.6. Aps a coleta
dos dados, sero construdas curvas que retratem os eventos no decorrer do tempo.

4.8 Caracterizao inicial do sobrenadante

4.8.1Atividade antimicrobiana

A atividade da bacteriocina contra Listeria monocytogenes ser testada pelo mtodo de

difuso em Agar com discos. Desse modo, uma suspenso de clulas indicadoras com
alta concentrao celular em soluo fisiolgica ser espalhada por toda superfcie de
placas, de meio BHI, com auxlio de um suabe estril. Aps a secagem, pequenos discos

16

de celulose sero espalhados pelas placas e sobre eles inoculado o sobrenadante bruto.
As placas sero incubadas a 37C. Espera-se que haja formao de halos, que sero
medidos com uma rgua milimetrada.

4.8.2 Estabilidade trmica

Conhecer a estabilidade dos compostos antimicrobianos frente a diferentes

condies de pH e temperatura essencial para o desenvolvimento de processos de
produo e aplicao do composto de interesse. Para monitorar a estabilidade trmica, 1
mL do extrato bruto obtido da cultura de Streptococcus phocae (ATCC 51973T)ser
mantida a 20, 30, 40 e 50C por 30 min, 100C e 121C por 15 min e 18C e 4C por
sete dias (Motta & Brandelli, 2002).

4.8.3 Estabilidade frente ao pH e ao em diferentes pHs

Para o teste de estabilidade frente a diferentes valores pH, as amostras tero o pH

ajustado para valores de 3 a 11, empregando diferentes tampes para a diluio da
amostra. A atividade residual de cada amostra ser determinada (Motta & Brandelli,
2002).

4.8.4 Estabilidade frente a enzimas proteolticas, detergentes e solventes.

Os testes consistem na incubao do sobrenadante bruto com enzimas

proteolticas, detergentes e solventes e posterior anlise da atividade como descrito
anteriormente.
As enzimas a serem testados so papana, tripsina, pepsina e proteinase K e o
tempo de incubao de 60 minutos a 37C. O controle das enzimas ser feito com PBS,
evitando um falso negativo.
O solventes acetona, etanol, butanol e clorofrmio e os detergentes Tween-20,
Tween-80 e Triton X-100 sero igualmente testados.
O controle do sobrenadante bruto ser feito com icubao com PBS e posterior
teste da atividade.

17

4.8.6 Cromatografia de gel filtrao

Para caracterizao do padro de eluio um volume do sobrenadante bruto ser

injetado em uma coluna de gel-filtrao, gel Sephadex G-25, pr equilibrada com um
tampo 10 mM de acetato de amnio (pH 6,0). A eluio ser feita em vrias alcotas
correspondentes a diferentes tempos. Cada alcota ser analisada quanto a quantidade de
protena atravs da absorbncia e quanto a recuperao da atividade atravs do teste de
atividade com determinao das unidades arbitrrias.

4.9 Determinao do efeito contra Listeria monocytogenes

O efeito do antimicrobiano no crescimento micro-organismo indicador foi testado

atravs da produo de uma curva de crescimento. No tempo zero o meio BHI ser
inoculado de modo a possuir uma baixa concentrao de clulas e incubado com
agitao a 37C. Aps algumas horas, iniciado o crescimento, um volume do
sobrenadante com concentrao de UA conhecida ser adicionado. O acompanhamento
do crescimento em meio contendo antimicrobiano ser realizado com determinao de
UFCs em perodos de seis horas. Esse procedimento poder ser realizado para vrias
concentraes de UAs.

4.10 Purificao

4.10.1 Precipitao com sulfato de amnio

A separao da bacteriocina, dos peptdeos de modo geral, e das protenas do

restante das molculas do sobrenadante ser feita por precipitao fracionada com
sulfato de amnio. A precipitao ocorrer sob agitao e refrigerao. As faixas de
saturao sero determinadas por testes prvios considerando a quantidade PE protenas
totais e a atividade do antimicrobiano. Os testes de protenas totais devem ser feitos pelo
mtodo de Lowry et al. A frao do precipitado com maior recuperao da atividade
ser resuspendido em tampo 10 mM de acetato de amnio (pH 6,0).

18

4.10.2 Cromatografia de gel filtrao

A Cromatografia de gel filtrao uma escolha pertinente devido ao tamanho da

bacteriocina versus o tamanho que se espera dos contaminantes. As bacteriocinas so
pequenos peptdeos com estrutura simples enquanto que as protenas constituintes do
meio de cultura ou produzidas pelo micro-organismo so muito maiores e com estrutura
mais complexa. A soluo de protenas resespensas deve ser aplicada a um gel
Sephadex G-25. A coluna de gel deve ser previamente equilibrada com um tampo 10
mM de acetato de amnio (pH 6,0). 1,0 ml da amostra deve ser eluda usando 10 mM
de tampo acetato de amnio (pH 6,0) contendo 0,01 M de cloreto de sdio. O fluxo da
alquota deve ser de 0,5 ml / min e o tamanho de cada frao de 1,0 ml. Para cada
frao, devem ser determinadas protenas totais e unidades arbitrrias. Alm disso,
devem ser feitos outros ensaios para determinao dos perfis das protenas
contaminantes na poro da eluio que concentra a bacteriocina, como por exemplo gel
de eletrofose SDS-PAGE.

4.10.3 Outras tcnicas Cromatogrficas

Caso a pureza adequada no tenha sido alcanada, outra tcnica cromatogrfica

deve ser aplicada. Para isso preciso avaliar o perfil dos contaminantes para escolher a
tcnica seguinte que mais se adqua.

4.11 Caracterizao do purificado

O produto da purificao deve ser analisado para verificao da eficincia da

cromatografia e para confirmao de que o produto purificado o de interesse. Para
isso vrias tcnicas podem vir a ser utilizadas conforme a disponibilidade de recursos.
Dentre a quais, eletroforese em gel de poliacrilamida, eletroforese capilar,
espectroscopia de infra-vermelho, HPLC e Espectroscopia de massas.

4.12 Efeito contra Listeria monocytogenes

19

4.11.1 Determinao da concentrao inibitria mnima

O mtodo de diluio em gar consiste em dispersar ou dissolver o material a ser

testado em um meio de cultivo empregado para o crescimento do microrganismo alvo
em placa de Petri. O extrato antimicrobiano bruto ser incorporado diretamente ao meio
gar Nutriente (45C) at a concentrao final desejada. Placas com diferentes
concentraes da substncia a ser testada sero feitas para se obter uma diluio seriada
de razo 2. Assim, cada placa ser inoculada (~104 UFC) com as diferentes culturas de
microrganismo alvo e incubada a 30C por 24 h. A Concentrao Inibitria Mnima
(sigla em ingls: MIC) ser definida como a menor concentrao capaz de inibir
completamente o crescimento microbiano (Hammer et al, 1999; Pintore et al, 2002).
Dois controles sero considerados: um controle negativo, com presena do composto a
ser testado mas sem inculo, para verificar a presena de possveis contaminantes, e um
controle positivo, envolvendo a presena do microrganismo alvo mas sem a presena de
antimicrobianos.

4.12.2 Determinao da concentrao bactericida mnima

Uma alada de Listeria monocytogenes ser retirada dos halos de inibio e

inoculada em uma nova placa de gar Nutriente. Caso a cultura de Listeria
monocytogenes (ATCC 35152) apresente crescimento no novo meio ser considerada
vtima de um efeito citosttico, enquanto que o efeito citocida ser referente ao no
crescimento no novo meio de Listeria monocytogenes (ATCC 35152) retirada do halo
de inibio (Khalisanni & Lee Hung, 2009).

5. PLANO DE TRABALHO
Todo trabalho prtico ser desenvolvido no Laboratrio de Microbiologia do
Campus Alto Paraopeba (UFSJ), em outros laboratrios do Campus e se possvel e
necessrio em outros laboratrios adequados. Cada uma das etapas do projeto descrita
a seguir.

20

Etapa 1: Reviso da literatura:De forma a garantir a interao com o sujeito

da pesquisa e o melhor esclarecimento acerca das tcnicas a serem empregadas,
pesquisas constantes na literarura de referncia ser feita, garantindo a atualizao
terica necessria para o bom andamento do projeto. Esta etapa estar presente em todo
perodo do projeto.

Etapa 2: Obteno da cultura de Streptococcus phocae (ATCC 51973T) e

Listeria monocytogenes (ATCC 35152): Nesta fase do projeto, sero adquiridas as
cepas padres para serem empregadas no projeto de pesquisa em questo. Ser feita a
verificao da pureza das colnias, manuteno das culturas e sua estocagem em local
apropriado.
Etapa 3: Efeito contra Listeria monocytogenes (ATCC 35152): Depois da
caracterizao feita na etapa 3 ser testada a atividade Streptococcus phocae (ATCC
51973T) frente as espcies de Listeria monocytogenes (ATCC 35152)
Esta uma tcnica bastante simples, ilustrativa e ao mesmo tempo eficiente
para determinar o potencial antimicrobiano.

Etapa 4: Avaliao do andamento do projeto e delineamento das

prximas estratgias de trabalho: Ao final da primeira parte do projeto (primeiros
cinco meses), o professor coordenador do projeto e o aluno de iniciao cientfica faro
um balano sobre o andamento do projeto, destacando as principais limitaes e
avanos conquistados. As prximas fases do trabalho sero detalhadas para guiar o
aluno na parte final do projeto. Nesse perodo tambm haver a elaborao de um
relatrio parcial.

Etapa 5: Produo do extrato antimicrobiano bruto: Nesse momento o

aluno j dever estar bem habituado ao trabalho com microbiologia. Nessa etapa, novos
conceitos e tcnicas sero introduzidos e o aluno se tornar apto a efetuar processos
fermentativos. Dessa forma, o aluno ir desenvolver o trabalho prtico de fermentao
em estado lquido (preparo do material, inoculao, acompanhamento do processo,
monitoramento do crescimento, avaliao de contaminaes etc) e produo do

21

antimicrobiano. O aluno dever ainda executar a purificao parcial do extrato bruto

(centrifugao, filtragem) e seu acondicionamento em local adequado.

Etapa 6: Determinao quantitativa da atividade antimicrobiana do

estrato

antimicrobiano

bruto:

determinao

quantitativa

da

atividade

antimicrobiana, sob o ponto de vista prtico, consiste em simplesmente repetir o

procedimento de seleo dos micro-organismos produtores de antimicrobianos e de
produo do extrato antimicrobiano bruto. A diferena encontra-se na variao da
concentrao da substncia a ser testada e na interpretao dos resultados. Nesse caso o
aluno j estar bem treinado com as tcnicas exigidas para esta etapa.

Etapa 7: Caracterizao do extrato antimicrobiano bruto: Nessa etapa o

aluno efetuar um trabalho sob um ponto de vista bioqumico. Com tcnicas simples de
variao do pH e da temperatura, o aluno ser capaz de monitorar a atividade
antimicrobiana residual e determinar a faixa de estabilidade e ponto timo de atividade.
Esse tipo de avaliao essencial para propor trabalhos futuros de aplicao do
composto obtido. Depois de obtidos, os resultados sero avaliados pelo professor, em
conjunto com o aluno, que aprender como tratar os dedos obtidos.

Etapa 8: Elaborao do relatrio final e de psteres para apresentao em

eventos cientficos: O professor coordenador orientar o aluno na interpretao dos
resultados e na elaborao de um relatrio final nos padres cientficos. Este trabalho
ser apresentado na forma de psteres em congressos e em forma de artigo a ser
publicado em peridicos especficos. Assim, como conseqncia, o aluno tambm ir
aprender a escrever um texto cientfico e apresentar seu trabalho para a comunidade
acadmica.

6. CRONOGRAMA
Seguindo o plano de trabalho, o projeto o cronograma de execuo do projeto
ser feito conforme proposto na Tabela 1.

22

Tabela 1. Cronograma de atividades do bolsista de iniciao cientfica para o presente

projeto.
1 trimestre

2 trimestre

3 trimestre

4 trimestre

Etapa 1

Etapa 2

X
X

Atividade*

Etapa 3
Etapa 4
Etapa 5
Etapa 6
Etapa 7
Etapa 8

X
X

* Cada uma das etapas encontra-se descrita no item 5 (Plano de Trabalho).

7. CONCLUSO

De acordo com o objetivo proposto, um protocolo de obteno e recuperao para

a bacteriocina Phocaecin PI80 extrada da espcie de Streptococcus phocae (ATCC
51973T) foi feito.
Tendo em vista que a metodologia empregada fez uso de mtodos considerados
mais baratos e menos complexos, a viabilizao comercial desse produto apresenta
maior possibilidade de ser feita, bem como tambm a ampliao de escala. Sendo esse
ltimo quesito, um dos fatores imprescindveis para a disponibilizao concreta de
produtos biotecnolgicos.
Contudo, o scale-up, bem como o rendimento e atividade do produto
biotecnolgico obtido deve ser investigado em ensaios futuros atravs da construo de
uma planta piloto.

23

8. REFERNCIA BIBLIOGRFICA
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