Quim. Nova, Vol. 30, No.

1, 99-105, 2007

Carlos A. B. De Maria* e Ricardo F. A. Moreira

Departamento de Cincias Fisiolgicas, Instituto Biomdico, Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro,
Rua Frei Caneca, 94, 20211-040 Rio de Janeiro RJ, Brasil
Recebido em 19/8/05; aceito em 24/3/06; publicado na web em 30/8/06

Reviso

CAFENA: REVISO SOBRE MTODOS DE ANLISE

ANALYTICAL METHODS FOR CAFFEINE. Gravimetric and Bailey-Andrew methods are tedious and provide inflated results.
Spectrofotometry is adequate for caffeine analysis but is lengthy. Gas chromatography also is applied to the caffeine analysis but
derivatization is needed. High performance liquid chromatography with ultraviolet detection (HPLC-UV) and reversed phase is simple
and rapid for xanthine multianalysis. In HPLC-UV-gel permeation, organic solvents are not used. HPLC-mass spectrometry provides
an unequivocal structural identification of xanthines. Capillary electrophoresis is fast and the solvent consumption is smaller than in
HPLC. Chemometric methods offer an effective means for chemical data handling in multivariate analysis. Infrared spectroscopy alone
or associated with chemometries could predict the caffeine content in a very accurate form. Electroanalytical methods are considered of
low cost and easy application in caffeine analysis.
Keywords: caffeine; methylxanthines; analytical methods.

INTRODUO
A cafena um alcalide, identificado como 1,3,7-trimetilxantina,
cuja estrutura contm um esqueleto de purina (Figura 1). Este alcalide
encontrado em grande quantidade nas sementes de caf (Coffee
sp.)1 e nas folhas de ch verde (Camilla sinensis)2. Tambm pode ser
achado em outros produtos vegetais, particularmente no cacau
(Theobroma cocoa)3, no guaran (Paullinia cupana) e na erva-mate
(Ilex paraguayensis)2. Embora uma parcela pequena da populao
consuma cafena na forma de frmacos, como por ex. antigripais,
grande parte deste alcalide ingerida na forma de bebidas. Uma
xcara de caf pode conter em mdia cerca de 80 mg de cafena,
enquanto uma lata de coca-cola em torno de 34-41 mg4.
A cafena um dos alcalides com atividade biolgica mais
ingeridos no planeta. Apresenta ao farmacolgica variada provocando, dentre outros efeitos, alteraes no sistema nervoso central,
sistema cardiovascular e homeostase de clcio. Os efeitos da cafena sobre o comportamento humano tm sido objeto de estudos a
algumas dcadas. Esses efeitos podem ser descritos como5-7 aumento da capacidade de alerta e reduo da fadiga, com concomitante
melhora no desempenho de atividades que requeiram maior vigilncia. Em contrapartida, o consumo de cafena pode afetar negativamente o controle motor e a qualidade do sono, bem como causar
irritabilidade em indivduos com quadro de ansiedade6. O efeito da
ingesto de cafena sobre o sistema cardiovascular ainda motivo
de grande controvrsia8,9. Seu consumo regular parece elevar a presso arterial de forma persistente e, desta forma, indivduos com
hipertenso, doena coronariana e arritmia cardaca deveriam ser
encorajados a reduzir seus nveis de ingesto de cafena10-12. Com
relao homeostase de clcio, dados compilados em uma reviso
indicam que a cafena no prejudicial ao metabolismo sseo de
indivduos cujo consumo de clcio adequado as suas necessidades
metablicas13. Um estudo sobre os efeitos da cafena na sade humana indicou que seu consumo moderado (mximo de 4,6 mg/kg
de peso), praticado por adultos saudveis em idade reprodutiva,
no est associado a efeitos adversos14.
*e-mail: carreb@uol.com.br

Figura 1. Estrutura qumica da cafena e de outras metilxantinas

Em face do seu largo espectro de ao fisiolgica, existe, de

fato, um grande interesse da comunidade cientfica no estabelecimento de nveis seguros de ingesto de cafena para diversos
subgrupos populacionais humanos. Alm disso, a cafena uma droga
estimulante que pode ser usada indevidamente em atividades esportivas oficiais e, portanto, necessita ser monitorada continuamente
durante as competies. Evidentemente o conhecimento das tcnicas para anlise de cafena em matrizes alimentcias e fluidos biolgicos, bem como suas vantagens e limitaes, um fator primordial para monitorar os nveis de cafena no organismo. O objetivo
deste trabalho apresentar uma reviso crtica sobre os principais
mtodos descritos na literatura para anlise de cafena.
MTODOS ANALTICOS
Gravimetria e determinao de nitrognio
A gravimetria foi o primeiro mtodo desenvolvido para anlise de
cafena em produtos alimentcios. Durante muitos anos foi o mtodo
oficial da Association of Official Analytical Chemists (AOAC) para
anlise de cafena em semente de caf15. A tcnica consistia na extrao do produto com gua ou etanol, limpeza do filtrado com xido de
magnsio e extrao subseqente com clorofrmio. Aps a evaporao
do clorofrmio, o contedo de cafena era determinado por gravimetria.
Esse mtodo consumia muito tempo e nem todos os interferentes eram
removidos, o que causava uma superestimativa dos nveis de cafena
no produto. Em 1947, o mtodo denominado Bailey-Andrew, adotado pela AOAC somente para anlise de cafena em ch, passou a ser
adotado oficialmente pela AOAC para anlise de cafena em produtos

100

De Maria e Moreira

do caf16. Neste mtodo, as etapas de extrao e limpeza foram

otimizadas para reduo do tempo de anlise. A principal diferena
entre este mtodo e o gravimtrico era a determinao de nitrognio
total, no extrato clorofrmio, pelo aparato de Kjeldahl e a converso
do teor de nitrognio para cafena. Embora o mtodo Bailey-Andrew16
consumisse menos tempo que o mtodo gravimtrico15, apresentava
uma limitao importante que era a contabilizao de outros compostos nitrogenados, presentes no extrato clorofrmio, causando uma
superestimativa nos valores de cafena.
Espectrofotometria
A absoro de radiao eletromagntica na regio do ultravioleta
(UV) pela cafena foi descrita no incio do sculo 20 por Hartley17.
Posteriormente, Holiday18 descreveu que a cafena apresentou um
limite mximo de absoro no UV entre os comprimentos de onda de
271 e 275 nm. Ishler et al. 19 desenvolveram um mtodo
espectrofotomtrico de baixo custo para anlise de cafena em produtos do caf. O extrato aquoso da matriz foi tratado com xido de
magnsio e ferrocianeto de zinco para remoo de trigonelina e outros compostos interferentes. A quantificao da cafena foi conduzida
com base na anlise da absorvncia no comprimento de onda de 272
nm. Este mtodo mais rpido, simples e preciso que as tcnicas
gravimtricas15 e de anlise do nitrognio total16, porm os resultados
ainda podem ser superestimados pela presena de interferentes.
Cromatografias de adsoro e camada delgada
A partir da dcada de 60, foram publicados alguns artigos
enfocando o uso da cromatografia lquida clssica para anlise de
cafena em bebidas20-23. Este mtodo permitiu uma limpeza mais
eficiente dos extratos, o que propiciou anlises mais exatas do teor
de cafena nas matrizes analisadas. Posteriormente, um trabalho
colaborativo24, envolvendo 9 laboratrios, comparou o mtodo
cromatogrfico, com quantificao da cafena pela anlise da
absorvncia na regio do UV, com o mtodo Bailey-Andrew16. De
modo geral, o estudo colaborativo indicou uma correlao satisfatria
entre os 2 mtodos, entretanto o mtodo Bailey-Andrew16 apresentou resultados superestimados para o caf descafeinado. O mtodo cromatogrfico-espectrofotomtrico24 consistiu na passagem do
extrato em uma coluna de celite bsica. Em seguida, a cafena juntamente com pigmentos foram dessorvidos com ter. O extrato etreo
ento foi passado em uma coluna celite cida, na qual somente a
cafena ficou adsorvida. Por ltimo, a cafena foi eluda da coluna
com clorofrmio e quantificada pela anlise da absorvncia no comprimento de onda de 276 nm. A partir da dcada de 80, o mtodo
cromatogrfico-espectrofotomtrico24 foi adotado oficialmente pela
AOAC, em substituio ao mtodo Bailey-Andrew16, para anlise de cafena em produtos do caf.
A cromatografia em camada delgada tambm foi usada para
deteco de cafena em matrizes alimentcias25,26. Abourashed e Mossa26 determinaram o contedo de cafena em alguns chs e bebidas
energticas, atravs da cromatografia em camada delgada de alta
eficincia, sobre placas de slica gel, com anlise densitomtrica na
regio do UV. A fase mvel consistiu de acetato de etila e metanol
(85:15, v/v) e a deteco foi conduzida no comprimento de onda de
275 nm. O mtodo foi testado quanto repetibilidade, recuperao
e exatido, mostrando resultados satisfatrios.
Cromatografia gasosa (CG)
A partir da dcada de 70, houve a necessidade de se desenvolver
mtodos que oferecessem maior reprodutibilidade e sensibilidade e

Quim. Nova

pudessem ser aplicados para anlise de cafena em pequenos volumes

de amostra. A CG foi um dos mtodos testados para este propsito,
sendo a deteco realizada com o auxlio de um detector de ionizao
de chama (DIC) e a separao conduzida, principalmente, em coluna
de vidro recheada com 2% de polietilenoglicol27 ou 2,5% de SE-3028.
Segundo Strahl et al.28, a tcnica de CG permitiu a determinao rpida, e com alta reprodutibilidade, de pequena quantidade de cafena em
um volume reduzido de amostras de ch e caf. Recentemente, Thomas
e Foster29 usaram CG acoplada espectrometria de massas (EM) para
analisar uma srie de compostos, dentre eles a cafena, em efluentes
oriundos de uma unidade de tratamento de resduos aquosos. Os compostos foram isolados em um sistema de extrao em fase slida e
separados em coluna capilar de slica fundida. O mtodo apresentou
tima especificidade e sensibilidade, sendo possvel determinar o contedo de cafena na ordem de grandeza de ng L-1.
Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE)
CLAE-UV
A CLAE foi usada na anlise de cafena, pela primeira vez, no
ncio da dcada de 70. Inicialmente, Murgia et al. 30 usaram
cromatografia de troca inica para separar a cafena de outros compostos orgnicos em caf. Esses autores empregaram uma resina de
poliestireno sulfonado com 4% de ligaes cruzadas, tendo como
contra-on o ction amnio. O maior incoveniente foi a baixa estabilidade mecnica da resina presso de trabalho acima de 3 MPa,
o que limitou a vazo da fase mvel. Com a introduo da coluna de
fase reversa, houve um grande avano na anlise de compostos de
baixa massa molar (MM) por CLAE. Este tipo de coluna consistiu
de slica, inicialmente com partculas de 40 m, modificada pela
ligao covalente com octadecilsilano, o qual conferiu apolaridade
e maior estabilidade mecnica ao suporte. Mais tarde, o desenvolvimento de fases estacionrias, contendo micropartculas (5 m),
permitiu melhor resoluo e um menor tempo de anlise, contribuindo para a maior difuso da CLAE. Desta forma, a cromatografia
de fase reversa foi aplicada para anlise de cafena em diferentes
matrizes alimentcias, como caf31, chocolate32 e ch33. Em ambos
os casos, os extratos contiveram uma grande carga de interferentes
que dificultou a anlise cromatogrfica. Trugo et al.34 desenvolveram um mtodo simples e rpido para a anlise simultnea de
trigonelina, cafena e outras metilxantinas em cafs solveis e outras bebidas. Esses autores usaram soluo aquosa saturada de
acetato de chumbo bsico para clarificar as amostras. O precipitado
foi removido por filtrao simples, obtendo-se extratos bem mais
lmpidos que aqueles obtidos por tratamento com solvente orgnico. Uma outra inovao foi o emprego do sistema gradiente para
separao da cafena de outras metilxantinas. A fase mvel consistiu de metanol em soluo aquosa de citrato de tri-potssio 0,015
mol L-1, pH = 6, na qual a concentrao de metanol aumentou linearmente de 0 a 60% em 10 min. Essa inovao permitiu uma reduo no tempo de anlise sem comprometer a resoluo dos analitos.
Muhtadi et al.35 compararam a CLAE de fase reversa com a CG
para determinao de metilxantinas em diversos produtos alimentcios. Concluram que a resoluo da cafena e de outras metilxantinas
foi efetivamente superior com o uso da CLAE de fase reversa.
Nakakuri et al.36 desenvolveram um mtodo para remover compostos polifenlicos a fim de facilitar a anlise de metilxantinas. A
tcnica foi baseada no uso de uma pr-coluna preenchida com
polivinilpolipirrolidona pulverizada. Horie et al.37 concluram que,
de fato, a frao polifenlica interfere na determinao de cafena,
sendo importante o uso desta pr-coluna para sua remoo em folhas de ch com baixissmos teores de cafena.
O emprego do sistema DAD (detector de arranjo de diodos), o

Vol. 30, No. 1

Cafena: reviso sobre mtodos de anlise

qual permitiu a anlise da absorvncia em todos os comprimentos

de onda da regio do UV simultaneamente, aumentou a preciso e a
exatido na multianlise de compostos pela CLAE. Casal et al.38,39
usaram a cromatografia de fase reversa com DAD para anlise simultnea de trigonelina, niacina e cafena em amostras de caf. As
matrizes foram extradas com gua quente e os respectivos extratos
foram filtrados em membranas com porosidade de 0,2 m. A fase
mvel, no modo gradiente, foi composta de metanol em soluo
aquosa de tampo fosfato 0,1 mol L-1, pH = 4.
A CLAE-UV usada freqentemente para anlise de cafena e
seus metablitos em fluidos biolgicos. Esta abordagem importante para o estabelecimento de nveis seguros de ingesto da cafena,
bem como para inibir seu uso indevido em modalidades esportivas.
Ventura et al.40 monitoraram a estabilidade da cafena em amostras
de urina. A cafena foi isolada por extrao lquido-lquido em pH
alcalino com sistema binrio de solventes composto de clorofrmio e
2-propanol (9:1, v/v). Tanto a urina estocada a 37 oC por 7 dias como
tambm aquela estocada a 20 oC por 18 meses no apresentaram
perdas significativas de cafena. Emara41 usou uma pr-coluna de slica
modificada com grupamento cianeto para limpeza de amostras de
plasma. A cafena e seus metablitos foram dessorvidos da pr-coluna com a prpria fase mvel do sistema cromatogrfico composta de
metanol e tampo fosfato 0,01 M, pH = 5 (30:70, v/v). Zydron et al.42
usaram uma coluna de extrao em fase slida de octadesilsilano, de
composio idntica da coluna analtica, para isolar cafena e teofilina
da urina de pacientes com asma crnica ou saudveis. Os compostos
foram separados por cromatografia de fase reversa com fase mvel,
modo gradiente, composta de soluo aquosa de cido trifluoractico
0,05% e acetonitrila. A CLAE-UV/DAD com coluna de fase reversa
foi usada para multianlise de cafena e seus metablitos na urina43.
A fase mvel consistiu de uma mistura de metanol e tampo (20:80,
v/v). O tampo foi composto de cido ctrico 5 mmol L-1 ajustado a
pH = 5 com trietilamina. O mtodo alcanou grande exatido, j que
cada composto foi analisado no comprimento de onda especfico onde
ocorreu o seu mximo de absoro.
CLAE-UV e CLAE-IR (ndice de refrao) com coluna de
permeao em gel
Na dcada de 90, foram publicados alguns artigos cientficos
enfocando a multianlise de compostos de baixa MM, atravs da
CLAE com coluna de permeao em gel do tipo TSK. O avano na
tecnologia de produo de fases estacionrias usadas em colunas de
permeao em gel propiciou o desenvolvimento de fases mecanicamente estveis s presses exercidas na CLAE. Embora este tipo
de coluna seja adequado para separar compostos com MM acima de
1000, foi possvel separar compostos com MM em torno de 100700. A interao hidrofbica seria o fenmeno fsico responsvel
pela adsoro dos compostos de baixa MM, o que permitiu que a
resoluo entre eles fosse satisfatria.
Mller e Jork44 usaram a cromatografia de permeao em gel com
coluna TSK HW-40 (S) para separar sacarina, aspartame e cafena em
bebidas no alcolicas. Foi usado o modo isocrtico com gua como
fase mvel, sendo obtida uma boa resoluo dos compostos e
repetibilidade satisfatria. Na mesma poca, um grupo de pesquisadores do Brasil, trabalhando de maneira independente, publicou alguns
artigos sobre o uso da coluna TSK G3000SW na anlise simultnea de
compostos de baixa MM em extratos aquosos de caf1,45,46. O objetivo
foi desenvolver um mtodo multianaltico que pudesse ser automatizado
para uso no controle de qualidade de produtos do caf. Foi possvel
analisar cafena, trigonelina, sacarose e cido clorognico total nesses
produtos com preciso e exatido adequadas47. Embora esses autores
tenham feito as anlises em sistemas separados, possvel usar os
detectores UV e IR em srie para execuo da multianlise.

101

CLAE-EM
A partir da dcada de 80, ocorreu um crescimento rpido na
multianlise de compostos no volteis em fluidos biolgicos, particularmente, sangue e urina. Em alguns setores, como por ex. em medicina forense, havia a necessidade de se usar um mtodo que possibilitasse a identificao inequvoca de um determinado composto. A
CLAE-UV no atendia integralmente a essa exigncia, em funo da
possibilidade de co-eluio de interferentes com o analito, que poderia passar despercebido, alterando o resultado final. Isto certamente
produziu conflitos que geraram recursos administrativos e at judiciais. O maior avano da CLAE foi seu acoplamento EM. Esta tcnica hifenada permitiu a anlise simultnea de compostos no volteis
atravs dos seus espectros de massas. O uso da CLAE-EM possibilitou a anlise de quantidades diminutas de metilxantinas, com boa
preciso e exatido, em plantas e fluidos biolgicos, fornecendo um
diagnstico da estrutura qumica desses compostos.
Setchell et al.48 descreveram um mtodo para anlise de cafena
na saliva e no soro baseado na CLAE-EM. A cafena foi isolada por
extrao em fase slida em um cartucho com fase C18, sendo eluda
com metanol. A separao cromatogrfica foi conduzida em coluna
de fase reversa, no modo isocrtico, com fase mvel constituda de
acetato de amnio 0,1 M, pH = 4,6 e acetonitrila (85:15, v/v). Sakairi
e Kambara49 usaram a CLAE-EM com uma interface de ionizao
qumica presso atmosfrica (IQPA) para a multianlise de diversas classes de compostos no volteis, dentre elas as metilxantinas.
O mtodo IQPA tem uma sensibilidade moderada devido fragmentao reduzida, o que resultado das condies brandas de ionizao.
A cafena mostrou o on pseudo-molecular m/z 195, enquanto a teofilina
e a teobromina mostraram o on pseudo-molecular (MH+, m/z 181).
Gardinali e Zhao50 tambm usaram a CLAE-IQPA/EM para analisar
cafena em guas superficiais de alguns sistemas costeiros localizados na Flrida. O mtodo permitiu a determinao de cafena no limite de deteco de 4,0 ng L-1. Hieda et al.51 analisaram metilxantinas
em plasma e urina atravs da CLAE/EM. As metilxantinas foram
isoladas por extrao em fase slida com coluna do tipo extrelutR 1.
Esses autores usaram um cromatgrafo lquido acoplado a um EM
com bombardeamento de tomos do tipo frit-fast. Este sistema possibilitou uma anlise menos sensvel, alcanando nveis de deteco
da ordem de 5 g L-1. A teobromina e a teofilina mostraram o mesmo
on pseudo-molecular m/z 181, porm somente a teofilina apresentou
o fragmento minoritrio m/z 124. A CLAE-DAD-ionizao por
electrospray (IES)/EM foi aplicada para multianlise de alcalides
purnicos e compostos fenlicos em amostras de ch52. O uso deste
sistema com informao multidimensional permitiu a anlise simultnea de compostos com estruturas qumicas diferentes, sem a necessidade de pr-tratamento da amostra. O contedo de teanina e
catequinas foi medido pelo uso do DAD, enquanto cido clorognico,
cafena e outras metilxantinas pela IES/EM.
Mais recentemente, a CLAE-EM/EM foi usada para determinao de metablitos da cafena em urina, sem preparao prvia da
amostra53. Cerca de 11 compostos foram analisados, dentre estes
teofilina e cido 1-metilrico. A ausncia de um mtodo de extrao
simplificou e acelerou a multianlise de diversos compostos, sem
prejudicar parmetros como preciso e exatido. Weimann et al.54
tambm aplicaram a CLAE-EM/EM para anlise de cafena e seus
metablitos em urina. Todavia, esses autores procederam diluio
e centrifugao da amostra antes da injeo no cromatgrafo. Del
Rio et al. 55 usaram a CLAE-EM/EM para anlise de cafena,
teobromina e 30 compostos fenlicos em chs verde e preto. As infuses de ch foram filtradas e injetadas em coluna de fase reversa sem
qualquer tipo de extrao prvia dos compostos. A ausncia de prtratamento da amostra particularmente importante, quando se necessita de um mtodo de rotina para analisar uma quantidade expres-

102

De Maria e Moreira

siva de amostras, tornando a CLAE-EM/EM uma tcnica conveniente em laboratrios de rotina. Entretanto, a ausncia de pr-tratamento das amostras diminui consideravelmente o tempo de vida das
colunas, aliado ao fato de que o custo de um equipamento de CLAEEM/EM inviabiliza sua aquisio em laboratrios de pequeno porte.

Quim. Nova

Com relao aos parmetros de sensibilidade, preciso e especificidade,

os mtodos so equivalentes. Todavia, o tempo de anlise da eletroforese
capilar 2 vezes menor que o da CLAE. Alm do mais, o consumo de
solvente na CLAE 100 vezes maior.
Quimiometria

Eletroforese capilar
A eletroforese capilar uma tcnica valiosa para a multianlise
de compostos de baixa MM em diferentes matrizes. Este mtodo
preciso e exato, a resoluo dos compostos excelente devido alta
eficincia de separao e requer um volume de amostra da ordem de
alguns nanolitros. Jimidar et al.56 usaram a eletroforese capilar de
zona (ECZ) para determinar cafena e edulcorantes em bebidas
dietticas. A fase mvel consistiu de tampo fosfato a pH = 11. A
deteco foi conduzida pela anlise da absorvncia na regio do UV.
Esses autores compararam a ECZ com a CLAE e concluram que a
ECZ mostrou uma eficincia de separao 60 vezes maior, enquanto
a CLAE foi mais sensvel, apresentando um limite de deteco 10
vezes maior. Jin et al.57 tambm usaram a ECZ para determinao de
cafena em soro e bebidas. A fase mvel foi composta de tampo
fosfato produzido pela mistura de di-hidrogenofosfato de sdio 0,152
mmol L-1 e hidrogenofosfato de sdio 0,648 mmol L-1 a pH 7,8 e a
deteco foi conduzida por anlise potenciomtrica.
A eletrocromatografia capilar micelar, tambm chamada de
cromatografia capilar eletrocintica micelar (CCEM), o tipo de
eletroforese capilar mais usada para multianlise de metilxantinas. a
tcnica geralmente usada para separao de compostos neutros. A CCEM
inclui a adio de um surfactante, como o dodecil-sulfato de sdio,
sendo o analito separado pela sua partio entre as micelas e o tampo.
A CCEM foi usada para separar cafena e outros derivados da purina
em amostras de saliva, soro e urina58. A fase mvel foi constituda de
tampo borato-fosfato a pH 9 contendo 75 mmol L-1 de dodecil-sulfato de sdio. Os resultados foram bem satisfatrios, inclusive alquotas
da saliva ou do soro foram aplicadas diretamente sem qualquer prtratamento da amostra. Korman et al.59 usaram a CCEM para monitorar
a qualidade de formulaes farmacuticas compostas de derivados da
xantina. Esses autores obtiveram resultados satisfatrios na determinao de impurezas, como cafena e xantina em preparaes contendo
efedrina e mebrofenoidramina. Zhao e Lunte60 avaliaram a eficincia
de separao da cafena e de seus metablitos teofilina, teobromina e
paraxantina atravs da CCEM. A resoluo e a reprodutibilidade foram satisfatrias e somente 2 min foram consumidos para se efetuar a
anlise. Lai e Dabek-Zlotorzynska61 testaram vrias composies de
fase mvel para separao de metilxantinas e outros compostos purnicos
atravs da CCEM. Uma separao tima foi obtida com o uso de uma
fase ternria constituda de isopropanol/hexano/TRIS 1 mmol L-1
(52:40:8, v/v, pH = 8). Pomilio et al.62 usaram a CCEM para anlise
simultnea de metilxantinas e cido clorognico em 30 amostras de
erva-mate. Os compostos alvo foram detectados pela anlise da
absorvncia na regio do UV atravs do DAD. Em adio, cada composto foi coletado separadamente e analisado por EM. A CCEM foi
otimizada para anlise simultnea de cafena, paracetamol e cido
acetilsaliclico em formulaes farmacuticas63. A mistura de formiato
de amnio (25 mmol L-1, pH = 3) e acetonitrila (30:70, v/v) foi usada
como fase mvel. A deteco foi conduzida no comprimento de onda de
210 nm. A CCEM tambm foi aplicada na multianlise de flavonides
monomricos (catequina e epicatequina) e metilxantinas (cafena e
teobromina) em chocolate e cacau64. Devido baixa estabilidade das
catequinas em pH alcalino, o procedimento analtico foi conduzido em
pH cido (pH = 2,5).
Sombra et al.65 realizaram um estudo comparativo entre eletroforese
capilar e CLAE para anlise de cafena e outros compostos no guaran.

A quimiometria uma ferramenta matemtica valiosa que, em

combinao com diferentes mtodos qumicos, possibilita a anlise
de um grande nmero de variveis em uma nica amostra. Nos ltimos 20 anos, com o interfaceamento de instrumentos aos computadores, houve um crescente interesse pela aplicao da calibrao
multivariada para resoluo de problemas decorrentes da multianlise
de analitos. Nesse contexto, os mtodos de regresso de mnimos
quadrados parciais (PLS) e de componentes principais (PCR) tm
recebido maior ateno como tcnicas de calibrao, j que simplificam consideravelmente a manipulao da amostra66. Com relao ao
tratamento de dados multivariados, a anlise de componentes principais (PCA) o mtodo quimiomtrico mais importante, porque permite que a natureza multivariada dos dados seja visualizada em poucas dimenses67. Embora a abordagem quimiomtrica seja usada na
multianlise de analitos em diferentes matrizes, ela aplicada
freqentemente na anlise de formulaes farmacuticas contendo 2
ou mais compostos cujos espectros esto sobrepostos.
Dinc e Baleanu68 usaram o PCR e o mtodo clssico de mnimos
quadrados (CLS) para multianlise de formulaes farmacuticas contendo acetaminofeno e cafena. As calibraes quimiomtricas foram
preparadas pela medio de valores de absorvncia na regio espectral
de 215-285 nm. Esses autores compararam seus resultados com aqueles obtidos previamente com a CLAE. Os mtodos apresentaram resultados similares, porm o uso da CLAE exigiu a aplicao prvia de um
mtodo qumico de separao, enquanto o mtodo espectrofotomtrico
com calibrao multivariada no. Tanto o PCR como o PLS e o mtodo
dos mnimos quadrados invertidos (ILS) foram aplicados para
multianlise e teste de dissoluo de comprimidos contendo uma mistura de paracetamol, propilfenazona e cafena69. Nenhum mtodo de
separao dos analitos foi usado na matriz. Os resultados da absorvncia
da matriz foram obtidos na regio espectral de 210-310 nm. Todos os
trs mtodos quimiomtricos apresentaram resultados satisfatrios, tanto
para o teste de dissoluo como para multianlise. A anlise simultnea do cido acetilsaliclico (AAS) e da cafena em matrizes slidas foi
conduzida pelo uso da espectrofluorimetria acoplada tcnica da
calibrao multivariada PLS-1, a qual uma variante da PLS70. Embora o AAS e a cafena apresentem bandas espectrais sobrepostas, a aplicao do mtodo espectrofluorimtrico para anlise desses 2 compostos em formulaes farmacuticas produziu resultados satisfatrios em
menor tempo e com boa preciso. Uma vez que os parmetros de
calibrao so estabelecidos, necessrio apenas proceder leitura do
espectro de fluorescncia na matriz slida, a qual no precisa ser submetida a qualquer mtodo prvio de separao qumica70.
Espectroscopia de infravermelho (IV)
Nos ltimos anos, a tcnica de espectroscopia na regio do IV
tem apresentado resultados muito interessantes quando aplicada nas
reas farmacutica e de alimentos. Nesse contexto, deve-se destacar
o uso dos espectrmetros de IV com transformadas de Fourier (IVTF)
e seu emprego na identificao e dosagem de cafena em medicamentos, chs e caf. Bouhsain et al.71 usaram a IVTF para determinao simultnea de propifenazona e cafena em frmacos. O mtodo
consistiu na dissoluo dos princpios ativos em clorofrmio, seguida
pela filtrao das solues para remoo dos excipientes. A
propifenazona foi determinada por medidas de absorvncia a 1595

Vol. 30, No. 1

Cafena: reviso sobre mtodos de anlise

cm-1, com uma linha de base estabelecida entre 2000 e 890 cm-1, e a
cafena atravs do emprego dos valores da primeira derivada a 1712
cm-1. Foram usadas, em ambos os casos, solues independentes dessas duas substncias para calibrao externa. J Ohnsmann et al.72
utilizaram a tcnica de IVTF para determinao de cafena em extratos de folhas de ch. O mtodo baseou-se na extrao com amnia e
clorofrmio e na determinao direta do teor de cafena nos extratos
de clorofrmio, pelo uso das medidas de absorvncia associadas s
alturas dos picos obtidos a 1658,5 cm-1 e por calibrao externa. O
mtodo apresentou um limite de deteco de 1 mg L-1, correspondendo
a 0,002% (m/m) de cafena nas folhas de ch. O tempo necessrio
para realizao da anlise de uma nica amostra foi de apenas 15
min. Paradkar e Irudayaraj73 usaram a espectroscopia de IVTF para
determinar o contedo de metilxantinas no ch e no caf pelo uso de
um modelo de calibrao nico. O espectro de IVTR da cafena pura
foi caracterizado e as regies espectrais de 1500-1800 e de 28003000 cm-1 foram usadas para as determinaes quantitativas com o
auxlio dos mtodos de regresso PLS e PCR. A utilizao dessa tcnica de espectroscopia associada quimiometria permitiu a determinao do contedo de cafena de modo acurado com um valor de R2
superior a 0,99. Anteriormente, a espectroscopia de IVTF em associao com a quimiometria j havia sido explorada por Briandet
et al.74, como um mtodo alternativo aos mtodos qumicos midos
para discriminao e quantificao do contedo dos cafs Arbica e
Robusta em misturas de caf instantneo seco por liofilizao. Os
espectros foram obtidos atravs de duas tcnicas: IVTR por reflexo
difusa e por reflexo total atenuada. A anlise do PCA foi aplicada
sobre esses espectros, permitindo a discriminao entre as espcies
de caf Arbica e Robusta. Os autores concluram que essa discriminao foi baseada, principalmente, nos contedos diferentes de cafena e cido clorognico em cada espcie. A cafena foi responsvel
pelas bandas na regio entre 1550-1750 cm-1 e o cido clorognico
apresentou suas principais bandas na regio entre 1150-1300 cm-1.
Em um outro estudo75, foi descrito o uso da espectroscopia de reflexo difusa no IV prximo associada PLS para multianlise de cafena, trigonelina e cido clorognico em amostras de caf verde. Os
resultados obtidos com essa tcnica espectroscpica foram comparados com aqueles obtidos com o mtodo de CLAE com coluna de
permeao em gel descrito previamente na literatura46. A tcnica de
espectroscopia do IV associada quimiometria apresentou algumas
vantagens, tais como pouca manipulao da amostra, no destruio
da matriz e no produo de resduos qumicos durante a anlise.
Eletroanlise
Dentre os processos eletroanalticos j descritos na literatura com
o objetivo de dosar cafena, a voltametria/polarografia de pulso diferencial e a de onda quadrada merecem destaque. Na polarografia de
pulso diferencial, todos os pulsos tm a mesma magnitude e a corrente
medida antes da aplicao do pulso e no final do perodo de cada
pulso. A primeira corrente subtrada da segunda, o que gera uma
curva derivativa, em forma de sino. Esse tipo de tcnica foi utilizado
por Sontag e Kral76 para determinao de cafena em bebidas de cola,
caf e ch, aps sua oxidao em um eletrodo de carbono vtreo em pH
1,2. Os resultados da voltametria mostraram-se bem semelhantes aos
obtidos atravs da CLAE. Posteriormente, Kral77 criou um mtodo para
determinao de cafena em bebidas, utilizando a polarografia de pulso diferencial. A anlise foi conduzida por voltametria andica de pulso diferencial em um eletrodo de carbono vtreo. O limite de deteco
foi de 0,5 mg L-1 em pH 1,2. J Lau et al.78 empregaram a voltametria
de pulso diferencial como um mtodo simples, rpido e acurado para
anlise simultnea de cido ascrbico, cafena e paracetamol em
frmacos. As correntes de pico para cido ascrbico, paracetamol e

103

cafena foram medidas com um eletrodo de carbono vtreo a +0,350;

+0,618 e +1,425 V, respectivamente, contra um eletrodo de calomelano
saturado. Uma mistura contendo cido perclrico (0,1 M) e metanol,
na mesma razo, foi usada como solvente e eletrlito de suporte. A
amplitude de modulao tima, o tempo de repetio do pulso e a taxa
de varredura do analisador polarogrfico foram, respectivamente, 50
mV, 0,5 s e 5 mV s-1. As faixas de calibrao linear para cido ascrbico,
cafena e paracetamol foram, respectivamente, de 0 35, 0 50 e 0
55 mg mL-1. A voltametria de onda quadrada uma tcnica que permite
varreduras rpidas, com excelente distino entre as correntes capacitiva
e faradaica. Normalmente, apresenta sensibilidade um pouco superior
obtida na polarografia de pulso diferencial, com a vantagem adicional de permitir medies com altas velocidades. Esse tipo de tcnica
foi utilizada por JyhMyng et al.79 para determinao de cafena em
bebidas de ch, caf e cola com um eletrodo quimicamente modificado
(EQM) de Nafion/pirocloro-xido de rutnio. O termo EQM usado
em eletroqumica para designar eletrodos com espcies quimicamente
ativas convenientemente imobilizadas em sua superfcie80. No caso em
questo, o uso desse EQM produziu um incremento marcante na resposta da corrente quando comparado com o eletrodo de carbono vtreo
no revestido79. Uma curva analtica linear foi obtida sobre a faixa de 5
200 M em uma soluo de HClO4 0,05 M com um limite de deteco
de 2 M. Em outro estudo81, foi usado um eletrodo comercial simples
de grafite (GPE) para monitorar cafena atravs de um mtodo de
voltametria de onda quadrada de redissoluo andica. De modo geral,
devido a sua alta sensibilidade e baixo limite de deteco, a eletroanlise
de redissoluo particularmente til e popular nas determinaes de
compostos em baixas concentraes82-85. No exemplo em questo81, esse
mtodo foi aplicado para determinar os nveis de cafena em vrias
amostras de ch, o que rendeu um erro relativo de 1% na concentrao.
A cafena foi depositada a zero Volts (contra Ag/AgCl), depois reduzida a +1,40 V para remov-la do GPE. As condies experimentais
timas para a anlise foram as seguintes: meio com pH = 9, potencial
de deposio de zero Volts, tempo de deposio de 120 s, freqncia de
onda quadrada de 25 Hz, amplitude de onda quadrada de 45 mV e
potencial de etapa de 6 mV. Nessas condies timas, uma faixa linear
foi observada dentro das concentraes de 0 500 mg L-1. O limite de
deteco foi 9,2 mg L-1, que comparvel com o resultado obtido usando-se um eletrodo de pasta de carbono (8,2 mg L-1). Por ltimo, devemos mencionar o uso de biossensores enzimticos para dosagem de
cafena. Um biossensor um dispositivo capaz de fornecer informao
analtica quantitativa ou semiquantitativa, usando um elemento de reconhecimento de origem biolgica, o qual est em contato direto com
um elemento de transduo. O elemento de transduo deve ser capaz
de converter a resposta qumica em um sinal mensurvel apropriado86.
Nesse contexto, Pizzariello et al.87 desenvolveram um mtodo de
biossensor prtico e de baixo custo para deteco de cafena em caf.
Nesse caso, um eletrodo potenciomtrico sensvel a variaes de pH
foi usado para detectar mudanas de pH resultantes da inibio, pela
cafena, da ao da fosfodiesterase de nucleotdeo 3,5-cclico sobre a
hidrlise do AMP cclico. O mtodo foi efetivo na deteco de cafena
em concentraes de 0 4 mg L-1 e o desvio padro para 5 medidas de
uma soluo de cafena a 0,2 mg mL-1 foi de 7,1 g mL-1. O limite de
deteco foi de 0,6 mg mL-1. Os resultados da anlise de amostras de
caf expresso com o mtodo do biossensor mostraram-se similares aos
valores obtidos usando-se a CLAE.
CONCLUSO
Os mtodos gravimtricos e Bailey-Andrew16 so de custo baixo, porm tediosos e de padronizao muito difcil, sendo considerados como mtodos semi-quantitativos. Contudo, a maior limitao desses mtodos est no fato de produzirem resultados superes-

104

De Maria e Moreira

timados, j que compostos interferentes, presentes no extrato clorofrmio, so contabilizados como cafena. Ambas as tcnicas esto em desuso h algum tempo.
O desenvolvimento do mtodo espectrofotomtrico de absoro
na regio do UV propiciou um salto qualitativo na anlise de cafena em comparao aos 2 mtodos supracitados. Primeiro, porque
os extratos foram tratados com agentes clarificantes, o que reduziu
o contedo de interferentes. Segundo, porque anlise da cafena no
comprimento de onda especfico de 272 nm aumentou a seletividade
do mtodo e, portanto, sua preciso e exatido. Entretanto, no foi
possvel eliminar todos os interferentes, particularmente compostos fenlicos, que tambm absorvem no comprimento de 272 nm.
O mtodo cromatogrfico-espectrofotomtrico alm de ter alta
preciso e exatido, como demostrado por estudos inter-laboratoriais,
permite a obteno de extratos mais lmpidos, j que a cromatografia
lquida clssica usada para clarificar os extratos. Este mtodo
barato, simples e tem preciso satisfatria, porm consome muito
tempo. Ele o mtodo apropriado para anlise de cafena quando
no se tem acesso a mtodos que utilizam equipamentos de custo
elevado, como por ex., a CLAE e a eletroforese capilar.
A tcnica de cromatografia em camada delgada de alta eficincia
para anlise de cafena rpida e com boa preciso, porm no foi,
ainda, validada por anlises inter-laboratoriais. Tambm seria importante comparar seus resultados com aqueles de outros mtodos
comumente usados para anlise de cafena. O mtodo de cromatografia
em camada delgada de alta eficincia ainda pouco difundido, o que
pode ser constatado pelo menor nmero de publicaes cientficas.
A CG rpida e tem alta preciso e sensibilidade, particularmente, a CG/EM. Entretanto, o nmero de trabalhos cientficos que
aborda a anlise de cafena pela CG muito baixo. O custo elevado
para aquisio de um equipamento de CG, principalmente a CG/
EM, o primeiro fator limitante para seu uso. Por outro lado, o
extrato obtido das amostras tem uma frao no voltil, rica em
macromolculas, como no caso do caf processado. Desta forma, a
etapa de limpeza torna-se complexa, j que a presena desses compostos nos sistemas de injeo e separao do CG provoca interferncias srias na anlise, bem como reduz o tempo de vida til desses sistemas. Alm do mais, a cafena e outras metilxantinas necessitam de um passo prvio de derivatizao antes da anlise por CG.
Certamente este ltimo o fator determinante para o menor uso
desta tcnica na anlise de cafena.
O uso da cromatografia de troca inica para anlise de cafena
mostrou resultados satisfatrios. Entretanto, o mtodo consome muito
tempo e as condies cromatogrficas podem variar consideravelmente, em funo da composio qumica das matrizes a serem analisadas.
O emprego da CLAE-UV para determinao de cafena foi um
salto qualitativo importante no que diz respeito aos parmetros de
preciso, exatido e rapidez na anlise. Tambm permitiu pela primeira vez a multianlise de metilxantinas, como cafena, teofilina
(1,3-dimetilxantina) e teobromina (3,7-dimetilxantina). Com o desenvolvimento da CLAE-UV/DAD a multianlise de metilxantinas
melhorou em termos de preciso e exatido, j que cada alcalide
foi analisado no seu comprimento de onda mximo de absoro.
Embora o equipamento tenha custo elevado, a tcnica usada
comumente para anlise de cafena em alimentos e fluidos biolgicos. A principal limitao da CLAE-UV a necessidade de uma
preparao extensiva da amostra. Esta estratgia essencial para
se eliminar interferentes nas matrizes, particularmente nos fludos
biolgicos, que co-eluem com a cafena e, tambm, absorvem na
mesma faixa de comprimento de onda.
A CLAE com coluna de permeao em gel acoplada com detector
de UV ou de IR um poderoso mtodo analtico, que permite a anlise simultnea de compostos de baixa MM. O mtodo usa gua como

Quim. Nova

fase mvel, o que reduz o custo com manuteno do equipamento e

a contaminao por solventes orgnicos. Alm disso, o mtodo
preciso, exato e de fcil reproduo, podendo ser usado em anlises
de rotina. Entretanto, o preo deste tipo de coluna ainda alto. Alm
disso, a validao completa do mtodo no foi implementada, o que
pode ser constatado pela ausncia de anlises inter-laboratoriais.
Uma das vantagens da CLAE/EM permitir a multianlise de
compostos no volteis, com estruturas qumicas diferentes, sem a
necessidade de derivatizao dos analitos, como no caso da CG/EM.
Um segundo ponto relevante desta tcnica permitir o uso de mtodos mais simples para pr-tratamento da amostra, sendo possvel, em
alguns casos, a eliminao completa de qualquer mtodo de extrao
dos analitos. Desta forma, o mtodo rpido e fornece uma identificao inequvoca da cafena, com alta preciso, exatido e sensibilidade. Em setores cuja anlise quantitativa da cafena precisa ser acompanhada da identificao inequvoca de sua estrutura qumica, como
o caso da medicina forense, a CLAE/EM essencial. Embora o
custo do equipamento ainda seja bastante elevado, certamente esta
tcnica dever se constituir em uma das mais importantes ferramentas para anlise de cafena e de outras metilxantinas.
A eletroforese capilar, com deteco na regio do UV, uma ferramenta valiosa na separao simultnea de metilxantinas e outros
compostos com funes qumicas diversas. Apresenta sensibilidade,
preciso e exatido satisfatrias. O tempo de anlise e o consumo de
solventes orgnicos geralmente menor que os obtidos com a CLAE.
Muito embora a eletroforese capilar acoplada EM j esteja comercialmente disponvel, seu uso ainda pouco difundido.
A combinao da quimiometria com diferentes tcnicas
espectroscpicas permite a anlise de dados qumicos de natureza
multivariada. Certos compostos apresentam espectros sobrepostos ao
da cafena, o que dificulta apreciavelmente a anlise espectrofotomtrica
quantitativa. Nesse caso, a abordagem quimiomtrica usada na resoluo desses problemas. Um aspecto importante a dispensa do uso de
passos prvios de separao e derivatizao qumica. Isto reduz consideravelmente o tempo de anlise e o consumo de reagentes, sem afetar
a preciso, sendo atrativo para anlises em larga escala, particularmente, de formulaes farmacuticas.
A espectroscopia de IV vantajosa porque possibilita que a anlise dos analitos ocorra com pouca manipulao da amostra, inclusive no havendo destruio da matriz. Em alguns setores, como
por ex. na medicina forense e na rea criminal, a no destruio da
amostra um aspecto relevante a ser considerado durante a execuo do processo analtico. Uma outra vantagem da espectroscopia
de IV que no h produo de resduos qumicos durante a anlise. Alm disso, permite a obteno de espectros de ps, slidos e
espcies qumicas adsorvidas em slidos. A espectroscopia de IV
permite a identificao e dosagem acurada de vrios compostos em
matrizes farmacolgicas e alimentares complexas. O estabelecimento
do teor de alguns desses compostos pode servir como ferramenta
para controle de qualidade e caracterizao desses produtos. Sua
associao com a quimiometria tem mostrado ser uma importante
ferramenta na multianlise de compostos nas mais diversas matrizes, por sua preciso e praticidade.
Os mtodos eletroanalticos para dosagem de cafena e compostos anlogos em matrizes complexas, como alimentos e drogas, so
considerados de menor custo, de rpida execuo e, geralmente,
no necessitam de um pr-tratamento da amostra. Apesar disso, os
mtodos eletroanalticos tm sido pouco utilizados na anlise de
cafena quando comparados CG e CLAE. Recentemente, o uso de
EQM e biossensores enzimticos tem se mostrado muito til em
aplicaes analticas. A modificao qumica do eletrodo visa controlar a natureza fsico-qumica da interface eletrodo/soluo como
uma forma de alterar a reatividade e seletividade do sensor base,

Vol. 30, No. 1

Cafena: reviso sobre mtodos de anlise

favorecendo assim o desenvolvimento de eletrodos para vrios fins

e aplicaes, desde a catlise de reaes orgnicas e inorgnicas
at a transferncia de eltrons em molculas de interesse. J no
caso dos biossensores enzimticos, a combinao da seletividade e
sensibilidade da enzima com a simplicidade dos transdutores
eletroqumicos altamente vantajosa. O desenvolvimento dessas
duas ltimas tcnicas, provavelmente, dever incrementar a utilizao desses mtodos eletroanalticos na anlise de cafena e outros compostos qumicos em diferentes matrizes nos prximos anos.
REFERNCIAS
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.

13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.

De Maria, C. A. B.; Trugo, L. C.; Cora, G.; Quim. Nova 1996, 19, 350.
Bucci, L. R.; Am. J. Clin. Nutr. 2000, 72, 624S.
Caudle, A. G.; Yifang, G.; Bell, L. N.; Food Res. Int. 2001, 34, 599.
de Andrade, J. B.; Pinheiro, H. L. C.; Lopes, W. A.; Martins, S.; Amorim,
A. M. M.; Brando, A. M.; Quim. Nova 1995, 18, 379.
Castellanos, F. X.; Rapoport, J. L.; Food Chem. Toxicol. 2002, 40, 1235.
Smith, A.; Food Chem. Toxicol. 2002, 40, 1243.
Lorist, M. M.; Brain Cogn. 2003, 53, 82.
Frishman, W. H.; Del Vecchio, A.; Sanal, S.; Ismail, A.; Heart Dis. 2003,
5, 253.
Richardson, T.; Rozkovec, A.; Thomas, P.; Ryder, J.; Meckes, C.; Kerr, D.;
Diabetes Care 2004, 27, 1127.
James, J. E.; Psychosom. Med. 2004, 66, 63.
Lovallo, W. R.; Wilson, M. F.; Vincent, A. S.; Sung, B. H.; Mckey, B. S.;
Whitsett, T. L.; Hypertension 2004, 43, 760.
Karatzis, E.; Papaioannou, T. G.; Aznaouridis, K.; Karatzi, K.;
Stamatelopoulos, K.; Zampelas, A.; Papamichael, C.; Lekakis, J.;
Mavrikakis, M.; Int. J. Cardiol. 2005, 98, 425.
Heaney, R. P.; Food Chem. Toxicol. 2002, 40, 1263.
Nawrot, P.; Jordan, S.; Eastwood, J.; Rotstein, J.; Hugenholtz, A.; Feeley,
M.; Food Addit. Contam. 2003, 20, 1.
A.O.A.C.; Official and Tentative methods of Analysis, Association of
Official Agricultural Chemists, 6th ed., Pennsylvania, 1945.
A.O.A.C.; J. Assoc. Off. Agr. Chem. 1947, 30, 70.
Hartley, W. N.; J. Chem. Soc. Trans. 1905, 87, 1796.
Holiday, E. R.; Biochem. J. 1930, 24, 619.
Ishler, N. H.; Finucane, T. P.; Borker, E.; Anal. Chem. 1948, 20, 1162.
Yeransian, J. A.; Kadin, H.; Borker, E.; Stefanucci, A.; J. Assoc. Off. Ana.
Chem. 1963, 46, 315.
Borker, E.; J. Assoc. Off. Ana. Chem. 1963, 46, 319.
Levine, J.; J. Assoc. Off. Ana. Chem. 1962, 45, 254.
Smith, R. F.; Rees, D. I.; Analyst 1963, 88, 310.
Newton, J. M.; J. Assoc. Off. Ana. Chem. 1979, 62, 705.
Harlos, H.; Lebensm. Ind. 1973, 20, 412.
Abourashed, E. A.; Mossa, J. S.; J. Pharm. Biomed. Anal. 2004, 36, 617.
Vitzthum, O. G.; Barthels, M.; Kwasny, H.; Z. Lebensm. Unters. Forsch.
1974, 157, 135.
Strahl, N. R.; Lewis, H.; Fargen, R.; J. Agric. Food Chem. 1977, 25, 233.
Thomas, P. M.; Foster, G. D.; J. Environ. Sci. Health, Part A: Toxic/Hazard.
Subst. Environ. Eng. 2004, 39, 1969.
Murgia, E.; Richards, P.; Walton, H. F.; J. Chromatogr. 1973, 87, 52331.
Madison, B. L.; Kozarek, W. J.; Damo, C. P.; J. Assoc. Off. Ana. Chem.
1976, 59, 1258.
Kreiser, W. R.; Martin Jr, R. A.; J. Assoc. Off. Ana. Chem. 1978, 61, 1424.
Ashoor, S. H.; Seperich, G. J.; Monte, W. C.; Welty, J.; J. Assoc. Off. Ana.
Chem. 1983, 66, 606.
Trugo, L. C.; Macrae, R.; Dick, J.; J. Sci. Food Agric. 1983, 34, 300.
Muhtadi, F. J.; El-Hawary, S. S.; Hifnawy, M. S.; J. Liq. Chromatogr. 1990,
13, 1013.
Nakakuri, H.; Horie, H.; Yamauchi, Y.; Kohata, K.; J. Chromatogr., A 1999,
848, 523.
Horie, H.; Nesumi, A.; Ujihara, T.; kohata, K.; J. Chromatogr., A 2002, 942,
271.
Casal, S.; Oliveira, M. B.; Ferreira, M. A.; Food Chem. 1998, 21, 3187.
Casal, S.; Oliveira, M. B.; Ferreira, M. A.; Food Chem. 2000, 68, 481.
Ventura, R.; Jimenez, C.; Closas, N.; Segura, J.; De la Torre, R.; J.
Chromatogr., B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2003, 795, 167.
Emara, S.; Biomed. Chromatogr. 2004, 18, 479.

105

42. Zydron, M.; Baranowski, J.; Baranowska, I.; J. Sep. Sci. 2004, 27, 1166.
43. Zambonin, C. G.; Aresta, A.; Palmisano, F.; J. Pharm. Biomed. Anal. 2004,
36, 621.
44. Mller, E.; Jork, H.; Deut. Lebensm-Rundsch. 1990, 86, 243.
45. Trugo, L. C.; De Maria, C. A. B.; Werneck, C. C.; Food Chem. 1991, 42,
81.
46. De Maria, C. A. B.; Trugo, L. C.; Moreira, R. F. A.; Petracco, M.; Food
Chem. 1995, 52, 447.
47. De Maria, C. A. B.; Moreira, R. F. A.; Quim. Nova 2004, 27, 586.
48. Setchell, K. D. R.; Welsh, M. B.; Klooster, M. J.; Balistreri, W. F.; Lim, C.
K.; J. Chromatogr., A 1987, 385, 267.
49. Sakairi, M.; Kambara, H.; Anal. Chem. 1988, 60, 774.
50. Gardinali, P. R.; Zhao, X.; Environ. Int. 2002, 28, 521.
51. Hieda, Y.; Kashimura, S.; Hara, K.; Kageura, M.; J. Chromatogr., A 1987,
385,267.
52. Zhu, X.; Chen, B.; Ma, M.; Luo, X.; Zhang, F.; Yao, S.; Wan, Z.; Yang, D.;
Hang, H.; J. Pharm. Biomed. Anal. 2004, 34, 695.
53. Schneider, H.; Ma, L.; Glatt, H.; J. Chromatogr., B: Anal. Technol. Biomed.
Life Sci. 2003, 789, 227.
54. Weimann, A.; Sabroe, M.; Poulsen, H. E.; J. Mass Spectrom. 2005, 40, 307.
55. Del Rio, D.; Stewart, A. J.; Mullen, W.; Burns, J.; Lean, M. E. J.; Brighenti,
F.; Crozier, A.; J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 2807.
56. Jimidar, M.; Hamoir, T. P.; Foriers, A.; Massart, D. L.; J. Chromatogr., A
1993, 636, 179.
57. Jin, W.; Yu, D.; Dong, Q.; J. Chromatogr. Sci. 2000, 38, 11.
58. Thormann, W.; Minger, A.; Molteni, S.; Caslavska, J.; Gebauer, P.; J.
Chromatogr., A 1992, 593, 275.
59. Korman, M.; Vindevoguel, J.; Sandra P.; Electrophoresis 1994, 15, 1304.
60. Zhao, Y.; Lunte, C. E.; J. Chromatogr., B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci.
1997, 688, 265.
61. Lai, E. P.; Dabek-Zlotorzynska, E.; Electrophoresis 1999, 20, 2366.
62. Pomilio, A. B.; Trajtemberg, S.; Vitale, A. A.; Phytochem. Anal. 2002, 13,
235.
63. Pucci, V.; Mandrioli, R.; Raggi, M. A.; Fanali, S.; Electrophoresis 2004,
25, 615.
64. Gotti, R.; Fiori, J.; Mancini, F.; Cavrini, V.; Electrophoresis 2004, 25, 3282.
65. Sombra, L. L.; Gomez, M. R.; Olsina, R.; Martinez, L. D.; Silva, M. F.; J.
Pharm. Biomed. Anal. 2005, 36, 989.
66. Bautista, R. D.; Aberasturi, F. J.; Jimenez, A. I.; Jimenez, F.; Talanta 1996,
43, 2107.
67. Ferreira, M. M. C.; Antunes, A. M.; Melgo, M. S.; Volpe, P .L. O.; Quim.
Nova 1999, 22, 724.
68. Dinc, E.; Baleanu, D.; Farmaco 2002, 57, 33.
69. Dinc, E.; Serin, C.; Tugcu-Demiroz, F.; Doganay, T.; Int. J. Pharm. 2003,
250, 339.
70. Moreira, A. B.; Dias, I .L. T.; Neto, G. O.; Zagatto, E. A. G.; Ferreira, M.
M. C.; Kubota, L. T.; Talanta 2005, 67, 65.
71. Bouhsain, Z.; Garrigues, S.; de la Guardia, M.; Analyst 1997, 122, 441.
72. Ohnsmann, J.; Quintas, G.; Garrigues, S.; de la Guardia, M.; Anal. Bional.
Chem. 2002, 374, 561.
73. Paradkar, M. M.; Irudayaraj, J.; J. Food Sci. 2002, 67, 2507.
74. Briandet, R.; Kemsley, E. K.; Wilson, R. H.; J. Agric. Food Chem. 1996,
44, 170.
75. Morgano, M. A.; Camargo, C.; Pagel, A. P.; Ferro, M. F.; Bragagnolo, N.;
Ferreira, M. M. C.; II Simpsio de Pesquisa dos Cafs do Brasil, Braslia,
Brasil, 2001.
76. Sontag, G.; Kral, K.; Mikrochim. Acta 1979, 229.
77. Kral, K.; Dissertation Abstracts International, C., 1982, 43, 564.
78. Lau, O. W.; Luk, S. F.; Cheung, Y. M.; Analyst 1989, 114, 1047.
79. JyhMyng, Z.; YuanShih, T.; Ying, S.; Analyst 1998, 123, 1145.
80. Moses, P. R.; Wier, P.; Murray, R. W.; Anal. Chem. 1975, 47, 1882.
81. Ly, S. Y.; Jung, Y. S.; Kim, M. H.; Han, I. K.; Jung, W. W.; Kim, H. S.;
Microchim. Acta 2004, 146, 207.
82. Safavi, A.; Maleki, N.; Shams, E.; Shahbaazi, H. R.; Electroanalysis, 2002,
14, 929.
83. Prado, C.; Wilkins, S. J.; Marten, F.; Compton, R. G.; Electroanalysis 2002,
14, 262.
84. Khodari, M.; Electroanalysis 1998, 10, 1061.
85. Desimoni, E.; Brunetti, B.; Bacchella, R.; Electroanalysis 2002, 14, 459.
86. Pereira, A. C.; Santos, A. S.; Kubota, L. T.; Quim. Nova 2002, 25, 1012.
87. Pizzariello, A.; Svorc, J.; Stredansky, M.; Miertus, S.; J. Sci. Food Agric.
1999, 79, 1136.