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RESUMO
APLICAO DE DIVERSOS MTODOS QUMICOS PARA DETERMINAR ATIVIDADE ANTIOXIDANTE EM POLPA DE FRUTAS. Considerado
um dos principais paises produtores de sucos de frutas, o Brasil o terceiro maior produtor de frutas tropicais. A diversidade de frutas
no mercado cada vez maior e, a cada dia, se introduz uma nova fruta tropical, cujas propriedades e caractersticas ainda no foram
totalmente estudadas. O governo brasileiro tem apoiado o comrcio exterior, investindo em feiras que promovem e inserem novos
produtos em dezoitos pases do mercado Europeu, como a Brazilian Fruit Festival que tem por objetivo divulgar frutas in natura, polpas
congeladas e sucos processados. A cada dia se publicam novas pesquisas, associando o consumo de frutas com os efeitos benficos
sade humana. Este trabalho teve por objetivo determinar o contedo de compostos fenlicos totais (FT), estimar as antocianinas
totais (AT) e a capacidade antioxidante de polpa de frutas comercializadas congeladas, aplicando os mtodos espectrofotomtricos
mais citados para determinar a atividade antioxidante (ABTS, DPPH e DMPD). Determinou-se a atividade antioxidante das polpas de
frutas de maior consumo no mercado sul brasileiro (amora, uva, aa, goiaba, morango, acerola, abacaxi, manga, graviola, cupuau e
maracuj), aplicando mtodo ABTS com medidas em dois tempos (1 e 7 minutos), DPPH (30 e 60 minutos) e DMPD (10 minutos). Os
valores TEAC (atividade antioxidante equivalente ao Trolox) obtidos oscilam entre valores mnimos e mximos de 2,0 e 67,2 mol/g
aplicando mtodo ABTS, 1,02 e 67,0 mol/g aplicando DPPH e 4,2 e 46,6 mol/g aplicando DMPD. A capacidade antioxidante obtida
para os mtodos ABTS e DPPH est correlacionada com o teor de compostos fenlicos e antocianinas.
Palavras-chave: compostos fenlicos, ensaios antioxidantes, polpa de frutas tropicais.
RESUMEN
El Brazil es considerado un de los principales pases productores de zumos de frutos, ocupando en concreto la tercera posicin
respecto a esto. La diversidad de frutos en el mercado es cada vez mayor, introducindose diariamente nuevos frutos tropicales
cuyas propiedades y actividades no estn an totalmente determinadas. El gobierno brasileo apoya el comercio exterior de frutos,
invirtiendo fondos en exposiciones que promueven y sitan a los nuevos productos en los pases de la Unin Europea, tal como la
Brazilian Fruit Festival que promociona frutos in natura, pulpas congeladas y zumos procesados. Se publican cada vez en mayor
nmero nuevas investigaciones que asocian el consumo de frutas con efectos beneficiosos para la salud humana. Este trabajo tiene
por objeto la determinacin del ndice de fenoles totales (FT), antocianos totales (AT) y la capacidad antioxidante de las pulpas de
frutos comerciales congelados, aplicando los mtodos espectrofotomtrico qumicos mas en boga para la determinacin de la actividad
antioxidante (ABTS, DPPH y DMPD). Se ha determinado la capacidad antioxidante de las pulpas de los frutos tropicales de mayor
consumo en el mercado del sur de Brazil (mora, uva, aa, guayaba, fresa, acerola, pia, mango, graviola, cupuau y maracuy)
aplicando el mtodo ABTS con medidas a dos tiempos (1 y 7 minutos), DPPH (30 y 60 minutos) y DMPD (10 minutos). Los valores
TEAC (capacidad antioxidante equivalente al Trolox) obtenidos de las pulpas oscilan entre mnimos y mximos de 2,0 y 67,2 mol/g
aplicando el ensayo ABTS, 1,02 y 67,0 mol/g aplicando DPPH y 4,2 y 46,6 mol/g aplicando DMPD. La capacidad antioxidante
obtenida por los mtodos ABTS y DPPH se encuentra correlacionada con el contenido de compuestos fenlicos y antocianos.
Palabras clave: compuestos fenlicos, ensayos antioxidantes, pulpas de frutos tropicales.
como reactivo una mezcla de cidos fosfowolfrmico y fosfomolib dificaciones el mtodo descrito por KIM et al.[23], se basa
dco en medio bsico, que se reducen al oxidar los compuestos en la medida de la absorbancia del radical DPPH 100 M
fenlicos, originando xidos azules de wolframio (W8O23) y molibde- (3,9 mL) disuelto en metanol al 80%, a la longitud de onda de
no (Mo8O23). La absorbancia del color azul desarrollado se mide a 517 nm. Se aade 0,1 mL de la muestra o patrn, la mezcla
765 nm. Los resultados se expresan en mg de cido glico por se homogeniza cuidadosamente, y se mantiene en la oscuridad
100 g de pulpa de frutos. durante 30 minutos. Las medidas de absorbancia a 517 nm
se realizan antes de aadir la muestra (A0) y pasados los 30
y 60 minutos (Af). La concentracin de DPPH en el medio
2.4 - Actividad antioxidante de reaccin se calcula a partir de una curva de calibrado
obtenida por regresin lineal. Los resultados se expresan
2.4.1 - Mtodo ABTS en TEAC, o sea, actividad equivalente a Trolox (M/g de
Segn la metodologa desarrollada por RE et al. [38] muestra peso fresco). El antioxidante sinttico de referencia
y descrita por KUSKOSKI et al. [25] el radical ABTS+ se Trolox, a una concentracin de 0,08-1,28 mM en disolucin
obtiene tras la reaccin de ABTS (7 mM) con persulfato de metanol al 80%, se ensaya en las mismas condiciones,
potsico (2,45 mM, concentracin final) incubados a tem- expresndose los resultados en TEAC y VCEAC.
peratura ambiente (25C) y en la oscuridad durante 16 h.
Una vez formado el radical ABTS+ se diluye con etanol 2.4.3 - Mtodo DMPD
hasta obtener un valor de absorbancia comprendido entre Se determina la actividad antioxidante aplicando el m-
0,70 (0,1) a 754 nm (longitud de onda de mxima absor- todo propuesto por FOGLIANO et al. [11]. Este se basa en
cin). Las muestras filtradas (antocianos) se diluyen con aadir 1 mL de la disolucin de DMPD 100 mM a 100 mL
etanol hasta que se produce una inhibicin del 20 al 80%, de disolucin tamponada con cido actico/ acetato de sodio
en comparacin con la absorbancia del blanco, tras aadir 0,1 M (pH 5,25). Tras la adicin de 0,2 mL de una disolucin
20 L de la muestra. A 980 L de dilucin del radical ABTS+ de cloruro frrico 0,05 M (concentracin final de 0,1 mM) se
as generado se le determina la A754 a 30C, se aade 20 L forman radicales cationes coloreados (DMPD). Un mililitro
de la muestra (dilucin de antocianos) y se mide de nuevo de esta disolucin se traslada a una cubeta midindose su
la A754 pasado 1 minuto. La absorbancia se mide de forma absorbancia, comprendida entre 0,90 (0,1), a 506 nm. Se
continua transcurridos 7 minutos. El antioxidante sint- aade 50 L de una disolucin patrn de antioxidante o de
tico de referencia, Trolox, se ensaya a una concentracin muestras diluidas y transcurridos diez minutos (a 25C) se
de 0-15 M (concentracin final) en etanol, en las mismas hace otra medida de absorbancia a 506 nm. La disolucin
condiciones, lo que se hace tambin con cido ascrbico tamponada de acetato se utiliza como blanco de referencia.
(0-20 mg/100 mL). Los resultados se expresan en TEAC Los resultados se expresan en TEAC, o sea, actividad equi-
(actividad antioxidante equivalente a Trolox) y en VCEAC valente a Trolox (en mM o M) o bien en VCEAC, actividad
(actividad antioxidante equivalente a vitamina C), en este equivalente a vitamina C (mg/L o mg/100 g).
ltimo caso por tratarse de alimentos.
3 - RESULTADOS Y DISCUSIN
2.4.2 - Mtodo DPPH
Este mtodo, desarrollado por BRAND-WILLAMS et 3.1 - Antocianos y fenoles totales
al.[6], se basa en la reduccin de la absorbancia medida El contenido total de antocianos y de polifenoles se
a 515 nm del radical DPPH, por antioxidantes. Con mo- recoge en la Tabla 1. La cantidad de antocianos totales en
TABLA 1 Determinacin de antocianos totales (AT), fenoles totales (FT) y VCEAC (actividad antioxidante equivalente a vitamina C)
de pulpa de frutos aplicando los mtodos DPPH, ABTS y DMPD (media DE, n =3)
FTa ATa VCEAC (mg/100 g)
Muestras
(mg/100 g) (mg/100 g) DPPH (30 min) ABTS (1 min) DMPD (10 min)
Mora 118,92,1 41,81,8 82,62,6 125,83,2 58,80,4
las pulpas de mora, uva, fresa, aa, acerola y guayaba es muestras ensayadas son alimentos, y la vitamina C es un nu-
de 41,8; 30,9; 23,7; 22,8; 16,0 y 2,7 mg/100 g peso fresco, triente que se encuentra diariamente en nuestra dieta [23].
respectivamente. Mora y uva presentan el mayor contenido
Entre los mtodos utilizados para determinar la ca-
de antocianos y las pulpas de acerola y guayaba el menor,
pacidad de un antioxidante para captar radicales libres,
mientras que pia, mango, graviola, cupuau y maracuy
el radical ABTS+ es uno de los ms aplicados, al conside-
no lo contienen. Los contenidos totales de flavonoides, an-
rarse un mtodo de elevada sensibilidad, prctico, rpido
tocianos y compuestos fenlicos no flavonoides se obtienen
y muy estable [3]; a pesar de esto los valores actividad
tras la determinacin de fenoles totales que se encuentran
antioxidante pueden depender del tiempo escogido para
compilados en la Tabla 1. Los extractos de pulpa de ace-
efectuar la medida. La absorbancia medida por el mtodo
rola contienen un elevado contenido de polifenoles totales
ABTS se determinada a los 1 y 7 minutos; los resultados
(580,1 mg/100 g) al igual que la pulpa de mango (544,
obtenidos por algunos investigadores indican que la reac-
9 mg/100 g), mientras que las pulpas de aa (136,8 mg/100 g),
cin con el radical ABTS+ no se completa hasta pasado 1
fresa (132,1 mg/100 g), mora (118,9 mg/100 g) y uva
minuto, y segn RE et al. [38] el tiempo de 4 minutos es
(117,1 mg/100 g) muestran contenidos ms bajos, aunque
el ms apropiado. No obstante, SELLAPPAN et al. [45],
tambin elevados.
sugieren tiempos de medida de 6 minutos para los patrones
de referencia y de 7 minutos para los compuestos puros,
3.2 - Actividad antioxidante extractos de plantas o de alimentos.
Los resultados obtenidos en la determinacin de la
Dadas las diferencias descritas en los tiempos de me-
actividad antioxidante por los mtodos indicados (Tabla 1 y
dida, en este trabajo se realiza una comparacin entre las
2) se han expresado en equivalentes a vitamina C (VCEAC),
medias de los valores TEAC obtenidos a los 1 y 7 minutos.
o equivalentes a Trolox (TEAC), para las distintas muestras
Aunque se observa un aumento en los valores TEAC, ob-
de pulpas de frutos. De todas las muestras ensayadas,
tenidos a los 7 minutos (Tabla 2), la diferencia entre los
los valores VCEAC encontrados varan entre mximos y
resultados obtenidos a 1 minuto no es significativa al nivel
mnimos de 1198,9 y 37,0 mg/100 g para los ensayos con
de confianza de 95% (p=0,05), por lo que se considera
ABTS, 959,1 y 43,18 para los ensayos con DPPH, y entre
que el tiempo de 1 minuto es suficiente para determinar
789,3 y 83,7 mg/100 g para los ensayos desarrollados con
la reactividad de las pulpas de frutos congelados. Este
DMPD (Tabla 1).
hecho es muy oportuno, dado que posibilita la medicin
La actividad antioxidante es dependiente de la concen- de un gran nmero de muestras. Considerando que los
tracin del extracto [21, 36]. La mejor respuesta obtenida, radicales libres tienen vida media cortas, y dado que en la
teniendo en cuenta los disolventes aplicados, es una con- evaluacin de la actividad antioxidante de un compuesto
centracin prxima a 0,04 g/mL para la mayor parte de no slo reviste importancia la estructura qumica y la con-
las pulpas, exceptuando la pulpa de acerola con la que se centracin, sino tambin el tipo de productos de reaccin
obtiene una concentracin de 0,004 g/mL. La media de los formados, VILLANO et al., [51] realizan un estudio acerca
mayores valores de TEAC 67,6; 13,2; 12,0; 9,4 y 9,2 M/g, de la influencia de la dilucin y el tiempo sobre la actividad
determinados por ABTS, corresponden a las pulpas de ace- oxidante de los vinos, observando que los valores obtenidos
rola, mango, fresa, aa y uva, respectivamente. Los datos, a los 2 minutos se correlacionan mas con los valores de FT
cuando se expresan en VCEAC (1198,9; 224,7; 202,0; 163,4 (r=0.9012) que a los 15 minutos (r=0.8462) adoptando, por
y 161,5 mg/100 g) conservan el mismo orden de prelacin. tanto, 2 minutos como el tiempo ptimo para determinar
Se justifica expresarlo de esta ltima manera dado que las la actividad antioxidante de vinos.
TABLA 2 Determinacin de la actividad antioxidante (TEAC), equivalente a Trolox, de pulpa de frutos tropicales aplicando mtodos
DMPD, DPPH y ABTS (mediaDE, n=3)
En la metodologa que aplica la DPPH, los tiempos de las muestras sin antocianos (pia, mango, graviola,
medida empleados son, en su mayora, de 30 minutos [4, 6, cupuau y maracuy).
23], y en algunos casos de 20 minutos [33, 46]. En el presente
Muchos trabajos relacionan la capacidad antioxidante
trabajo se miden las muestras a los 30 y 60 minutos, con
con el contenido de fenoles totales y los antocianos [12, 19,
objeto de comprobar la influencia del tiempo de medida en
33, 37, 47, 49]; cada componente fenlico puede contribuir
los valores actividad antioxidante. De acuerdo con los datos
de forma y proporcin diferente. Sin embargo en algunos
representados en la Tabla 2 los valores TEAC a los 60 minu-
trabajos se ha encontrado una correlacin baja [17] y en
tos son ms elevados, llegando a aumentar entre un 10 y un
una publicacin reciente HASSIMOTO et al., [15], verifican
50%. El anlisis estadstico revela diferencias significativas
la actividad antioxidante de pulpas congeladas de frutas
entre los tiempos de 30 y 60 minutos, especialmente en el
consumidas en Brazil, haciendo uso de la inhibicin de la
caso de las muestras de graviola, guayaba y acerola. Consi-
peroxidacin inducida y la inhibicin de la co-oxidacin
derando que los valores obtenidos reflejan la cantidad y la
del beta-caroteno, no encontrando relacin alguna entre
reactividad de los antioxidantes presentes en la muestra en
el contenido total de fenoles y la vitamina C con la capa-
determinado tiempo, se torna difcil establecer una relacin
cidad antioxidante. No obstante los autores observan que
estructura-actividad y determinar los tiempos de reaccin,
las muestras ricas en antocianos son las que presentan la
toda vez que las muestras poseen una composicin compleja. mayor capacidad antioxidante. Es necesario considerar que
Se hace necesario, por consiguiente, un estudio debidamente dicha correlacin no solo depende de la concentracin y la
extenso y especfico en este sentido. calidad antioxidante, sino tambin de su interaccin con
El tiempo de medida necesario para realizar las medi- otros componentes y la metodologa aplicada.
das de DPPH (30 minutos) en comparacin con el mtodo
ABTS (1 minuto), supone una desventaja en su aplicacin, 4 - CONCLUSIN
en adicin tambin al elevado coste de la DPPH. Debe
Entre los mtodos qumicos utilizados para determinar
sealarse que, a pesar de las diferencias metodolgicas,
la capacidad antioxidante (captacin de radicales libres),
los resultados obtenidos con los mtodos ABTS y DPPH
el radical ABTS+ es uno de los ms rpidos, originando
permiten alcanzar conclusiones prcticamente similares.
resultados reproducibles y coherentes. Adems, el ABTS
Los resultados obtenidos con el mtodo DMPD, ya sean
presenta importantes ventajas; muestra varios mximos de
expresados en TEAC o VCEAC, no son consistentes con
absorcin y una buena solubilidad, permitiendo el ensayo de
los obtenidos mediante los ensayos de la ABTS y DPPH.
compuestos tanto de naturaleza lipoflica como hidroflica.
Dichos valores son bajos, poco reproducibles y en algunos
El tiempo de 1 minuto, para el mtodo ABTS, puede ser
casos incoherentes (Tablas 1 y 2).
suficiente para medidas de pulpas de frutos mientras que
El orden decreciente de la capacidad antioxidante para el mtodo DPPH se requiere un tiempo de 60 minutos,
obtenida, determinada por el mtodo ABTS, es de acerola presentndose en algunas muestras diferencias significativas
>mango >fresa >aa >uva >mora >guayaba >graviola en los resultados, lo que sugiere la realizacin de estudios
>pia >maracuy >cupuau; y de acerola >mango >fresa adicionales. Los resultados obtenidos con el mtodo DMPD
>aa >uva >guayaba >mora >graviola >maracuy >cupu- han sido poco reproducibles y en algunos casos incoherentes.
au >pia, cuando se aplica DPPH, observase prcticamente En conclusin, las pulpas de frutos tropicales congeladas
igual prelacin para los mtodos ABTS y DPPH, a excepcin comercializadas en el sur de Brazil poseen elevados valores
de la pia y la guayaba. Sin embargo, cuando se aplica el de capacidad antioxidantes, destacando en este sentido los
ensayo DMPD el orden coincide tan solo para las dos pri- frutos de la acerola y el mango. A los compuestos fenlicos
meras muestras: acerola >mango >cupuau >maracuy y los antocianos se atribuyen esta capacidad antioxidante,
>graviola >aa >fresa >guayaba >uva >mora. observndose una correlacin directa entre los valores de fe-
noles y antocianos totales con los valores TEAC y VCEAC.
Se observa correlacin entre la determinacin de
fenoles totales (FT) y la actividad antioxidante para los
mtodos ABTS y DPPH, as como una respuesta lineal 5 - REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
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