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Comunicado 92

Tcnico ISSN 1517-1469


Planaltina, DF
Abril, 2003

Metodologia para
Foto: Fbio Gelape Faleiro

Operacionalizar a
Extrao de DNA de
Espcies Nativas do
Cerrado Visando a
Anlises Moleculares

Fbio Gelape Faleiro1


Alessandra Silva Gelape Faleiro2
Maria Cristina Rocha Cordeiro3
Cludio Takao Karia4

Marcadores moleculares do DNA, especialmente, aqueles obteno de padres ntidos e reprodutveis de bandas de
baseados na PCR (Polymerase Chain Reaction), esto DNA (Ferreira & Grattapaglia, 1995). Determinadas
sendo utilizados como ferramenta muito til em diferentes espcies de planta, incluindo algumas nativas do bioma
estudos genticos, como avaliao de diversidade Cerrado, apresentam alto nvel de polifenis e a presena
gentica intra e interespecfica, construo de mapas de mucilagens foliares, o que torna o procedimento de
genticos, mapeamento de QTL (Quantitative Trait Loci), extrao e de amplificao de DNA mais complexo,
seleo de plantas assistidas por marcadores, entre outras necessitando de otimizaes que possam facilitar a
(Ferreira & Grattapaglia, 1995). A etapa bsica para tais operacionalizao (Couch & Fritz, 1990).
estudos a extrao de DNA genmico em quantidade e
qualidade adequadas para que a PCR permita a obteno Na Embrapa Cerrados, tem-se trabalhado com a
de marcas moleculares ntidas e reprodutivas (Williams et caracterizao da variabilidade gentica de espcies
al., 1990; Welsh & McClelland, 1990). nativas do bioma Cerrado com base em caractersticas
morfolgicas, ecolgicas, agronmicas e moleculares. As
Os procedimentos utilizados na extrao e na purificao caractersticas moleculares utilizadas so aquelas
do DNA influenciam a quantidade, a estabilidade e a baseadas no cido desoxirribonuclico (DNA). Para
qualidade dele. Diferentes mtodos de extrao de DNA a analisar essas caractersticas, foi necessrio
partir de tecido foliar, como os baseados no CTAB e no operacionalizar o processo de extrao de DNA dessas
SDS tm sido utilizados e esto bem estabelecidos para espcies visando obteno de amostras de DNA de
diferentes espcies. Entretanto, dependendo da espcie qualidade, estabilidade e em quantidade suficiente para
em estudo e das condies laboratoriais, so necessrias realizao de anlises genticas com base em marcadores
algumas modificaes e adaptaes nos protocolos para a moleculares.

1
Eng. Agrn, D.Sc., Gentica e Melhoramento, Embrapa Cerrados, ffaleiro@cpac.embrapa.br
2
Econ. Doms., Esp. Gentica e Biologia Molecular, Universidade Estadual de Santa Cruz, ale@cpac.embrapa.br
3
Biomdica, D.Sc., Biologia Molecular, Embrapa Cerrados, cristina@cpac.embrapa.br
4
Eng. Agrn., M.Sc., Gentica e Melhoramento, Embrapa Cerrados, karia@cpac.embrapa.br
2 Metodologia para Operacionalizar a Extrao de DNA...

Para essa operacionalizao, foi desenvolvido um Para a extrao do DNA, foram coletadas folhas de cada
protocolo otimizado nico, com base na metodologia de uma dessas espcies em estdio intermedirio de
extrao descrita por Doyle & Doyle (1990) e modificada maturao. Essas folhas foram coletadas no campo e
por Faleiro et al. (2002) para obteno de amostras de transportadas em sacos de papel at o laboratrio.
DNA a partir de tecido foliar de cacaueiro o qual Aproximadamente 1 g de tecido foliar foi macerado em
apresenta srios problemas relacionados com o alto teor cadinho de porcelana em contato com N2 lquido.
de polifenis e muscilagem (Andebrhan, 1993). As
otimizaes feitas esto relacionadas com o aumento da Parte do macerado foi colocado em um tubo plstico de
concentrao do CTAB, diminuio da quantidade de 2,0 mL, ocupando 1/5 do seu volume. Em seguida,
tecido foliar e aumento do perodo de desproteinizao. foram adicionados 800 L de tampo de lise constitudo
por Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, EDTA
Para representar as espcies nativas do Cerrado com (Ethylenediaminetetraacetic Acid) 20 mM, CTAB
importncia econmica atual ou potencial, foram (hexadecyltrimethylammonium bromide) 2,8%,
selecionadas 10 espcies com diferenas marcantes em NaCl 1,3 M, Polivinilpirrolidona 1% e 2-mercaptoetanol
seus tecidos foliares, como a quantidade de plos e 0,2%. O macerado foi misturado ao tampo de lise, e os
nervuras, presena de mucilagens, produo de ltex, tubos foram mantidos em banho-maria (70 oC) por uma
entre outras (Almeida et al., 1998). As espcies hora, sendo agitados a cada 10 minutos. Feita a
utilizadas foram: Stylosanthes guianensis e incubao, fez-se a desproteinizao, adicionando-se 700
S. macrocephala (leguminosas forrageiras), Baru l de clorofrmio-lcool isoamlico (24:1 v/v). Em
Dypterix alata, Pequi Caryocar brasiliense, Mangaba seguida, as amostras foram agitadas, com suaves
Hancornia speciosa, Cagaita Eugenia dysenterica, inverses, durante 10 minutos e centrifugadas a 4 oC, a
Araticum Annona crassiflora (fruteiras), Macaba 18845 g por 10 minutos. O sobrenadante de cada
Acrocomia aculeata (produo leo), Faveira amostra foi transferido para tubos de 2,0 mL limpos,
Dimorphrandra mollis e Barbatimo Stryphnodendron adicionando-se 55 L de CTAB 7%, e o processo de
barbadetimam (plantas medicinais) (Figura 1). desproteinizao foi repetido.

Fotos: A e B: Fbio Gelape Faleiro, C a J: Jos Felipe Ribeiro

Figura 1. Espcies utilizadas para extrao do DNA. Stylosanthes guianensis (A), S. macrocephala (B) [Leguminosas forrageiras];
Baru- Dypterix alata (C), Pequi - Caryocar brasiliense (D), Mangaba - Hancornia speciosa (E), Cagaita - Eugenia dysenterica (F),
Araticum - Annona crassiflora (G) [fruteiras]; Macaba - Acrocomia aculeata (H) [produo leo], Faveira - Dimorphrandra mollis (I)
e Barbatimo - Stryphnodendron barbadetimam (J) [plantas medicinais].

Para a precipitao do DNA, adicionou-se ao sobrenadante ambiente. Em seguida, os cidos nuclicos totais foram
final isopropanol gelado na quantidade de 700 L. ressuspendidos em 150 L de gua contendo RNAse
Os tubos foram mantidos a 20 oC por duas horas e, a na concentrao de 40 g/mL e colocados em banho-maria
seguir, centrifugados como anteriormente descrito. a 37 oC para a completa ressuspenso. Passado esse
O sobrenadante foi descartado, e o precipitado foi lavado perodo, o DNA foi novamente precipitado, centrifugado e
duas vezes com etanol 70% (v/v) e secado temperatura ressuspendido em 150 L de gua, como j descrito.
Metodologia para Operacionalizar a Extrao de DNA... 3

A quantidade do DNA foi estimada por espectrofotometria nm e como output a relao A260/A280, a concentrao do
a 260 nm (Sambrook et al., 1989). A relao A260/A280 foi DNA extrado em ng/l, a quantidade total de DNA em ng e
utilizada para avaliar a pureza do DNA. Bandas de DNA o volume de DNA concentrado e de gua para o preparo de
genmico total, separadas por eletroforese, em gel de 300 L de DNA na concentrao de 10 ng/L(Figura 2).
agarose 0,8%, foram usadas como indicadoras da
integridade do DNA extrado. Para cada espcie avaliada Analisando as leituras mdias de absorbncia a 260 nm e as
no trabalho, o processo de extrao e as avaliaes de estimativas da quantidade do DNA extrado de tecidos
quantidade e qualidade do DNA extrado foram repetidos foliares de cada espcie estudada neste trabalho (Tabela 1),
pelo menos duas vezes. verifica-se que foi possvel, com base no protocolo nico
desenvolvido, extrair mais de 37 g de DNA de cada
Para facilitar o processo de avaliao da pureza, amostra. Essa quantidade suficiente para a realizao de
quantificao e diluio do DNA elaborou-se um programa mais de 2000 PCRs para a obteno de marcadores RAPD
dentro do aplicativo Excel for Windows. Esse programa (Random Amplified Polymorphic DNA), por exemplo
tem como input as leituras de absorbncia a 260 e 280 (Williams et al., 1990; Welsh & McClelland, 1990).

Figura 2. Programa do aplicativo Excel for Windows para anlise de pureza, concentrao e diluio de DNA com base nas
leituras de absorbncia a 260 e 280 nm.

Tabela 1. Quantificao e anlise de pureza de amostras de DNA, extradas de tecido foliar de 10 espcies nativas do
bioma Cerrado, utilizando-se leituras de absorbncia a 260 e 280 nm.

Espcie A260* A280* A260 / A280 [DNA] ng/ L** Total DNA (g)

S. guyanensis 0,113 0,073 1,548 565 84,75


S. macrocephala 0,103 0,059 1,746 515 77,25
Baru 0,076 0,041 1,854 380 57,00
Pequi 0,100 0,053 1,887 500 75,00
Mangaba 0,053 0,031 1,710 265 39,75
Cagaita 0,075 0,042 1,786 375 56,25
Araticum 0,111 0,063 1,762 555 83,25
Macaba 0,118 0,07 1,686 590 88,50
Faveira 0,050 0,034 1,471 250 37,50
Barbatimo 0,084 0,050 1,680 420 63,00

* Mdia de pelo menos duas repeties.


** a ressuspenso do DNA foi feita com 150 L de gua.
4 Metodologia para Operacionalizar a Extrao de DNA...

Na anlise de pureza do DNA extrado, verificada pela Referncias


relao A260 / A280, constatou-se que foram obtidas Bibliogrficas
amostras de boa qualidade (Tabela 1). Apenas o DNA
obtido da faveira apresentou relao A260 / A280 menor que
ALMEIDA, S. P.; PROENA, C. E. B.; SANO, S. M.;
1,5, indicando a presena de maior teor de protenas nas
RIBEIRO, J. F. Cerrado: espcies vegetais teis. Planaltina:
amostras de DNA, o que no tem inviabilizado a obteno
Embrapa CPAC, 1998. 464 p.
de padres ntidos e reprodutveis de produtos de
amplificao via PCR (Faleiro et al., 1996).
ANDEBRHAN, T. Identificao de gentipos do cacau
resistentes a Crinipellis perniciosa, agente causador da
A anlise da integridade do DNA, verificada pela
vassoura-de-bruxa do cacaueiro, atravs de RAPD e Uso
eletroforese em gel de agarose 0,8%, apresentada na
de PCR na classificao dos isolados de Crinipellis
Figura 3. Foram obtidas amostras ntegras de DNA de
perniciosa. Ilhus: CEPEC: CEPLAC, 1993. 22 p. Relatrio
todas espcies analisadas neste trabalho. A integridade do
tcnico.
DNA fundamental para a nitidez e reprodutibilidade dos
produtos de amplificao via PCR (Ferreira & Grattapaglia,
COUCH, J. A.; FRITZ, P. J. Isolation of DNA from plants
1995).
high in polyphenols. Plant Molecular Biology Reporter,
Tucson, v. 8, p. 8-12, 1990.

DOYLE, J. J.; DOYLE, J. L. Isolation of plant DNA from


fresh tissue. Focus, Gaithesburg, v. 12, p. 13-15, 1990.

FALEIRO, F. G.; BARROS, E. G.; VILARINHOS, A. D.;


CORRA, R. X.; PAULA JNIOR, T. J.; MOREIRA, M. A.
Otimizao da extrao de DNA de esporos de Uromyces

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 appendiculatus. Fitopatologia Brasileira, Braslia, v. 21, n.


2, p. 304-307, jun.1996.

Figura 3. DNA genmico extrado de 10 espcies nativas do


Cerrado: 1. Stylosanthes guianensis; 2. S. macrocephala; 3. FALEIRO, F. G.; ARAJO, I. S.; BAHIA, R. C. S.;
Baru; 4. Pequi; 5. Mangaba; 6. Cagaita; 7. Araticum; SANTOS, R. F.; YAMADA, M. M.; ANHERT, D.
8. Macaba; 9. Faveira e 10. Barbatimo. Otimizao da extrao e amplificao de DNA de
Theobroma cacao L. visando obteno de marcadores
RAPD. Agrotrpica, Ilhus, 2002. No prelo
Recomendaes
FERREIRA, M. E.; GRATTAPAGLIA, D. Introduo ao uso
A metodologia desenvolvidada pode ser utilizada para de marcadores RAPD e RFLP em anlise gentica. Braslia:
obteno de amostras de DNA de todas as 10 espcies EMBRAPA-CENARGEN. 1995. 220 p.
nativas do bioma Cerrado em quantidade e qualidade
satisfatrias para anlises genticas, com base em SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANIATS, T. Molecular
marcadores moleculares. Considerando a diversidade dos cloning: a laboratory manual. 2. ed. New York: Cold
tecidos foliares das 10 espcies analisadas neste Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory. 1989.
trabalho, acredita-se que ser possvel, com base no 653 p.
mesmo protocolo, a extrao de DNA de amostras de
tecidos foliares de outras espcies. A utilizao de WELSH, J.; McCLELLAND, M. Fingerprinting genomes
protocolo nico de extrao de DNA e de aplicativos using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Research,
especficos esto sendo importantes para operacionalizar London, v. 18, p. 7213-7218, 1990.
o processo de extrao de DNA, aumentar a qualidade
das amostras, diminuir o tempo gasto em cada extrao, WILLIAMS, J. G.; KUBELIK, A. R.; LIVAK, K. J.;
otimizar o uso de reagentes e equipamentos e melhorar a RAFALSKI, J. A.; TINGEY, S. V. DNA polymorphism
reprodutibilidade das anlises moleculares realizadas no amplified by arbitrary primers are useful as genetic
Laboratrio de Gentica e Biologia Molecular da Embrapa markers. Nucleic Acids Research, London, v. 18, p. 6531-
Cerrados. 6535, 1990.
Metodologia para Operacionalizar a Extrao de DNA... 5

DNA extraction methodology from leaves of native


central brazilian region species to operate molecular
analysis

Abstract - DNA extraction methodology was developed from another previously described but, with some
original and important adaptations as the reduction of started foliar tissue, increase of cetyl trimethylammonium
bromide (CTAB) concentration in cell disruption buffer, as well as the time for chloroform-isoamyl alchool protein
extraction stage. It was tested successfully for different species as leguminosae forrages (Stylosanthes guianensis
and S. macrocephala), fruit plants ( Dipteryx alata Vog., Caryocar brasiliense Camb., Hancornia speciosa Gomez,
Eugenia dysenterica Mart. ex DC. and Annona crassiflora Mart.), species for oil production (Acrocomia aculeata
(Jacq.) Lodd and, medicinal uses (Dimorphandra mollis Benth. and Stryphnodendron barbadetimam (Vell.)
Forrero). For all tested species, it was obtained high quality and quantity DNA for molecular markers analysis.
Excel for Windows Software was utilized to study the purity and quantity of the obtained DNA by the relation of
optic density in 260 and 280 nanometers wave length absortion data and, estimed using basic methods
previously described. The developed methodology is considered an operational DNA extraction protocol as it
improves the process increasing the recover and quality of extracted DNA in each sample for better reproducible
molecular analysis with reduction of working time and minimal use of chemicals and equipment.

Index terms: Stylosanthes guianensis, macrocephala, Dipterix alata, Caryocar brasiliense, Hancornia speciosa,
Eugenia dysenterica, Annona crassiflora, Acrocomia aculeata, Dimorphandra mollis, Stryphnodendron
barbadetimam.

Comunicado Exemplares desta edio podem ser adquiridos na: Comit de Presidente: Dimas Vital Siqueira Resck.
Tcnico, 92 Embrapa Cerrados Publicaes Editor Tcnico: Carlos Roberto Spehar.
Endereo: BR 020 Km 18 Rod. Braslia/Fortaleza Secretria Executiva: Nilda Maria da Cunha Sette.

Ministrio da Agricultura, Caixa postal: 08223 CEP 73301-970


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Fax: (61) 388-9879 Reviso de texto: Maria Helena Gonalves Teixeira
E-mail: sac@cpac.embrapa.br Jaime Arbus Carneiro.
Normalizao bibliogrfica: Rosngela Lacerda de Castro
Impresso no Servio Grfico da Embrapa Cerrados
Shirley da Luz Soares.
1a edio Editorao eletrnica: Leila Sandra Gomes Alencar.
1a impresso (2003): 100 exemplares Impresso e acabamento: Divino Batista de Souza
Jaime Arbus Carneiro.