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Cincias
Agradecimentos
Ao director clnico da Nephrocare Covilh, o Dr. Jos Maria Montalbn, o meu muito
obrigado por ter concedido a oportunidade da realizao deste estudo.
Gostaria tambm de agradecer ao CICS por terem permitido a utilizao das instalaes e
reagentes.
E por ltimo minha famlia e amigos pela ajuda, apoio e sobretudo compreenso,
demonstrada ao longo deste ano de trabalho.
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Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
Resumo
A nefropatia diabtica (ND) uma complicao comum em doentes diabticos, sendo que a
maioria necessita de ser integrado em terapias de substituio renal, como a hemodilise
(HD). Estes doentes apresentam alteraes no seu Sistema Imunolgico, havendo poucos
estudos que focam os efeitos da HD nos marcadores de activao expressos pelas sub-
populaes de clulas T, e na secreo de citocinas inflamatrias. O principal objectivo deste
estudo consiste na anlise da expresso de marcadores de activao em clulas T CD4+ e
CD8+, bem como a sntese de citocinas inflamatrias, antes e aps a HD.
Este estudo demonstrou que h um aumento da activao celular em clulas T, assim como
um aumento na sntese de IL-10 e IL-6, e uma diminuio de IL-8, aps sesso de hemodilise
em doentes com ND.
Palavras-chave
iii
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
Abstract
Diabetic nephropathy (DN) is a common complication disease in diabetic patients, and most of
them need to be integrated into renal replacement therapy such as hemodialysis (HD). These
patients have changes in their immune system, yet few studies focused in the effect of the
HD on the activation markers expressed by T cell subsets and in the secretion of inflammatory
cytokines. The main objective of this study was to access the expression of activation markers
on CD4+ and CD8+ T cells, as well as the synthesis of inflammatory cytokines, before and
after HD.
After the HD session, there was an increase in CD4/CD8 ratio due to significant alterations in
both subsets. The relative percentage of CD25+ T cells and CD8+CD25+ increased significantly
after the HD session, while the relative percentage of CD69 T cells decreased. The decrease
of the CD25 Mean Fluorescence Intensity values for CD4+ T was statistically different, as well
as in the case of CD71 in T cell sub-populations, after HD the session. Regarding cytokine
synthesis in serum samples, there was a significant increase in the concentration of IL-10 and
IL-6 and a decrease in the concentration of IL-8 after HD session, and no other significant
changes in the other inflammatory cytokines evaluated.
This study showed an increase in the T cell activation, as well as an increase in the synthesis
of IL-10 and IL-6 and a decrease in IL-8 after HD session in patients with DN.
Keywords
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ndice
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1. Introduo 1
1. Imunidade 1
1.1 Imunidade Inata 1
1.2 Imunidade Adaptativa 1
1.2.1 Linfcitos 2
1.2.2 Activao dos linfcitos T 2
1.2.3 Diferenciao dos linfcitos T 3
2. Rim 5
2.1 Anatomia e fisiologia 5
2.2 Doena Renal Aguda 6
2.3 Doena Renal Crnica 7
2.4 Nefropatia Diabtica 8
2.5 Tratamento da doena renal crnica 10
3. Alteraes no Sistema Imunolgico em doentes diabticos hemodialisados 12
2. Materiais e Mtodos 20
1. Seleco da amostra 20
2. Anlise dos marcadores de activao por citometria de fluxo 21
3. Anlise da apoptose celular por citometria de fluxo 24
4. Anlise de citocinas 24
5. Anlise estatstica 26
3. Resultados 27
4. Discusso 31
5. Concluso 35
6. Perspectivas futuras 36
7. Bibliografia 37
8. Cibergrafia 44
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Lista de Figuras
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Figura 1.1 Corte transversal do rim 5
Figura 1.2 Taxa de incidncia da ESRD por milho de pessoas, por seleco de 8
grupos de doena primrios, de 1980 at 2008
Figura 1.4 Alteraes da funo imunolgica em doentes com falha renal crnica 14
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Lista de Tabelas
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Tabela 1.1 Classificao da doena renal crnica baseada na taxa de filtrao 7
glomerular
Tabela 1.2 Principais estudos das clulas envolvidas na imunidade de doentes com 16
ESRD, DN e falha crnica renal que faam tratamento de dilise
Tabela 3.1 Valores de mdia, desvio padro, mediana, mnimos e mximos das 27
percentagens relativas das clulas T, suas sub-populaes (CD4 e CD8)
e razo CD4/CD8, antes e aps hemodilise
Tabela 3.2 Valores de mdia, desvio padro, mediana, mnimos e mximos das 28
percentagens relativas da expresso de CD25, CD69 e CD71 em clulas
T e suas sub-populaes (CD4 e CD8), antes e aps hemodilise
Tabela 3.3 Valores da mdia, desvio padro, mediana, mnimos e mximos da Mean 29
Fluorescence Intensity (MFI) das clulas T e suas sub-populaes (CD4 e
CD8) que expressam os marcadores CD25, CD69 e CD71, antes e aps
hemodilise
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Lista de Grficos
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Grfico 3.1 Percentagens relativas das clulas T, suas sub-populaes (CD4 e CD8) 27
e razo CD4/CD8, antes e aps hemodilise, em 17 doentes diabticos
hemodialisados
Grfico 3.3 Valores da Mean Fluorescence Intensity (MFI) das clulas T e suas sub- 29
populaes (CD4 e CD8) que expressam os marcadores de activao
CD25, CD69 e CD71, antes e aps hemodilise, em 17 doentes
diabticos hemodialisados
Grfico 3.4 Valores de concentrao das citocinas inflamatrias IL-8, IL-1, Il-6, IL- 30
10, TNF- e IL-12p70, antes e aps a sesso de hemodilise, expressos
em pg/mL
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Lista de Acrnimos
APC Allophycocyanin
BD Becton Dickinson
DP Dilise Peritoneal
HD Hemodilise
IL Interleucina
ND Nefropatia diabtica
PE Phycoerythrin
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Captulo 1
Introduo
1- Imunidade
O conjunto de processos fisiolgicos que permite ao organismo reconhecer corpos estanhos ou
anormais, com consequente neutralizao ou eliminao, designa-se por imunidade. Este
processo dividido em dois tipos de respostas inter-relacionadas, a resposta imunolgica
inata e a resposta imunolgica adaptativa [in Arosa et al, 2007].
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1.2.1- Linfcitos
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A proliferao dos linfcitos T naive ocorre com dois sinais. O primeiro sinal vai conferir
especificidade resposta do linfcito T, sendo que ocorre com a ligao do complexo
TCR/CD3 presente nos linfcitos CD4+ e CD8+, pelas molculas de MHC classe II e MHC classe
I, respectivamente. O segundo sinal transmitido pelos co-receptores CD4 e CD8, assim como
pelo receptor CD28. Este receptor interage com dois receptores da famlia B7, o CD80 e o
CD86. Enquanto que este ltimo expresso s por APCs e tem um papel mais relevante
durante os momentos iniciais da activao, o CD80 induzido aps activao e tem um papel
mais tardio, mais concretamente durante a sustentao do processo de activao e
proliferao. Quando os linfcitos T naive so activados proliferam como resposta a um
antignio promovida pela interleucina-2 (IL-2). Esta citocina promove sinais autcrinos s
clulas T activadas, levando expanso dos clones. A IL-2 e outras citocinas produzidas pelas
clulas T e pelas APCs tambm estimulam a diferenciao das clulas T em clulas efectoras
e de memria [Smith-Garvin et al, 2009].
Esta fase inicial de expanso sempre seguida por uma fase de contraco durante a qual
alguns dos linfcitos T naive inicialmente activados sofrem morte celular programada ou
apoptose, enquanto que os outros sobrevivem. Esta fase determinada, em parte, por
alteraes na expresso de receptores superfcie dos linfcitos T aps activao, ou seja, os
linfcitos T naive que no se ligam ao MHC classe I ou classe II, entram em apoptose, sendo
eliminados [in Arosa et al, 2007].
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Devido associao entre a interleucina IL-23 e a expresso de IL-17, uma nova linhagem de
clulas Th, as clulas Th17, foi identificada. Estas clulas no produzem as tpicas citocinas
Th1/Th2, onde as citocinas IL-4 e IFN- suprimem a diferenciao das clulas Th17. So
induzidas na presena de IL-6 e TGF- (Transforming growth factor beta) e produzem
citocinas como a IL-21, IL-22 e duas subpopulaes de IL-17, a IL-17a e a IL-17f. Este tipo de
clulas encontra-se envolvido nas respostas imunolgicas contra bactrias extracelulares e
fungos, e so responsveis pela induo de muitas doenas auto-imunes. A IL-6 produzida
por clulas do Sistema Imunitrio inato e um indutor da diferenciao de clulas Th17,
atravs da TGF-, sendo tambm um indutor na produo de IL-21 e expresso de IL-23R
[Kimura et al, 2011].
Os linfcitos T CD8+ naive, aps activao, passam por uma fase de expanso e contraco,
para a formao de linfcitos de memria. Um dos principais indicadores de diferenciao
deste tipo de linfcitos o receptor CD28. Este receptor encontra-se presente na superfcie
de quase todos os linfcitos T CD8+ naive, sendo que diminui progressivamente com o
processo de diferenciao. Assim sendo, em linfcitos T CD8+ de memria efectores deixam
de ter expresso este tipo de receptor. Alm dos linfcitos T CD8+ de memria efectores, os
linfcitos T CD8+ naive tambm podem dar origem aos linfcitos T CD8+ citotxicos (CTL),
dependendo do tipo de clula apresentadora e da presena, ou no, de determinadas
citocinas no local onde o linfcito T CD8+ activado. Este tipo de linfcitos tem a capacidade
de produzir grnulos citotxicos, com a funo de eliminar clulas-alvo [in Arosa et al, 2007].
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clulas. Para alm desta, a IL-35 e a IL-10 so tambm produzidas por estas clulas, onde so
responsveis pela tolerncia imunolgica, pela regulao das respostas imunolgicas e pela
homeostase dos linfcitos [Zhu et al, 2008]. Os linfcitos Treg CD8+ so caracterizados pela
ausncia do receptor CD28 e tm a capacidade de inibir a proliferao de linfcitos T
especficos para um determinado antignio (linfcitos Th1/Th2) [in Arosa et al, 2007].
2- Rim
2.1- Anatomia e fisiologia
Os rins so dois rgos simtricos situados na parte mais alta e posterior da cavidade
abdominal, em cada lado da coluna vertebral, na regio lombar. Tm uma forma oval
caracterstica, semelhante de um feijo [in Feehally et al, 2007].
O rim quando cortado ao meio divide-se em vrias seces: medula, papila, clice e pelve
renal. A pelve renal encontra-se ligada a ureter, que posteriormente se liga bexiga (figura
1.1) [in Guyton, 2006].
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tbulo proximal, localizado no crtex renal. Do tbulo proximal, o liquido passa pela ansa de
Henle, at ao tbulo distal, que tal como o tbulo proximal fica no crtex renal. A seguir,
ainda no crtex, oito dos tbulos distais juntam-se para formar o tbulo colector, cuja
extremidade se afasta novamente do crtex e se dirige inferiormente para a medula, onde
passa a constituir o canal colector. Os canais maiores lanam-se na pelve renal pelas pontas
da papila renal [in Guyton, 2006].
medida que o filtrado glomerular flui atravs dos tbulos, mais de 99% da sua gua e
quantidades variveis dos seus solutos so reabsorvidos normalmente para o sistema vascular,
e pequenas quantidades de algumas substncias so tambm secretadas para os tbulos. O
restante da gua tubular e das substncias dissolvidas passa a constituir a urina [in Guyton,
2006].
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Doenas que causam hipoperfuso renal e comprometem a funo renal sem leso
parenquimatosa bem definida (insuficincia renal aguda ou azotemia pr-renal);
Doenas que afectam directamente o parnquima renal (insuficincia renal aguda
intrnseca);
Doenas associadas obstruo do trato urinrio (insuficincia renal aguda ps-
renal).
Tabela 1.1: Classificao da doena renal crnica baseada na taxa de filtrao glomerular
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Figura 1.2: Taxa de incidncia da ESRD por milho de pessoas, por seleco de grupos de doena
primrios, de 1980 at 2008 [Adaptado de Gorriz, 2011].
A nvel mundial, a prevalncia da diabetes foi estimada em 2,8 % em 2000 e 4,4% em 2030.
Este nmero tem vindo a aumentar devido principalmente ao crescimento da populao,
idade, urbanizao, e ao aumento da prevalncia da obesidade e sedentarismo [Wild et al,
2004]. O nmero total de pessoas com diabetes est projectado para aumentar de 171
milhes em 2000 para 366 milhes em 2030 [Broumand, 2007]. A nvel global, a prevalncia
da diabetes semelhante nos homens e nas mulheres mas ligeiramente superior em homens
com menos de 60 anos e em mulheres com idades mais avanadas, no entanto existem mais
mulheres com a doena do que homens [Wild et al, 2004].
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Existem dois tipos de diabetes, a diabetes tipo 1 e a diabetes tipo 2. Ambas encontram-se
associadas ao aumento do risco de vrias condies, incluindo arteriosclerose com doena
coronria e falha cardaca, hipertenso, doena vascular perifrica, retinopatia e/ou doena
cerebrovascular. A diabetes mellitus apresenta tambm um envolvimento renal, numa
percentagem elevada de doentes. Uma percentagem de 25-45% de diabticos com diabetes
tipo 1 e tipo 2 tem tendncia para desenvolver doena renal [in Boner et al, 2003].
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exposio aos factores ambientais responsvel pela expresso clnica da doena. Este tipo
de diabetes caracterizado pela resistncia insulina nos msculos, fgado e tecido adiposo.
tambm relativa ou absoluta a deficincia na secreo de insulina, apesar das
concentraes absolutas de insulina se encontrarem normalmente elevadas ou normais no
incio da doena. Uma deteriorao progressiva da funo das clulas ocorre com o
aumento da durao da doena, logo eventualmente as concentraes de insulina sub-normais
prevalecem [in Boner et al, 2003].
A nefropatia diabtica (ND), ou seja, a existncia de danos nos rins em diabticos, ocorre
como o resultado de ambas as aces directas e indirectas da glucose, que activa vrias vias
envolvidas na patognese da DN. Isto inclui stress oxidativo, glicao avanada e activao de
certas citocinas. Outros factores que so precisos ter em conta incluem a hipertenso,
arteriosclerose e os efeitos txicos da exposio das clulas tubulares s protenas [in Boner
et al, 2003]. A nefropatia diabtica tem uma prevalncia de 60% em doentes com diabetes
tipo 1, sendo que em doentes com diabetes mellitus tipo 2 se verifique uma prevalncia mais
baixa, a rondar os 10% [Belchetz et al, 2003].
A nefropatia diabtica eventualmente resulta em doena renal em fase terminal (ESRD) [in
Boner et al, 2003], tendo uma incidncia de 4,3% em doentes com diabetes mellitus tipo 1 e
40,5% com diabetes mellitus tipo 2 [The United States Renal Data System, Annual Data Report
2010]. Nos ltimos anos tm sido aceites mais doentes com nefropatia diabtica em
programas teraputicos de substituio renal. Doentes diabticos nestes programas so
susceptveis de desenvolver complicaes adicionais e requerem tratamento intensivo, no s
no manuseamento destas condies especficas mas tambm no melhoramento da sua
qualidade de vida [in Boner et al, 2003].
Os doentes que apresentem uma doena renal crnica nos ltimos estdios, muitas agncias
passam a design-la como doena renal de fase terminal (ESRD). Inicialmente, doentes com
ESRD comeam com terapia de conservao, mas eventualmente podem precisar de
hemodilise (HD), dilise peritoneal (DP) e/ou transplantao [in Fauci et al, 2009]. Estudos
relativos a 2004, demonstram que mais de 1.7 milhes de pessoas, a nvel mundial, se
encontravam sob tratamento para a ESRD [Grassmann et al, 2005], sendo que a incidncia
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As terapias para as doenas renais no devem ser realizadas quando o doente se encontra
totalmente assintomtico contudo, a dilise e/ou o transplante convm ser iniciada o mais
precoce possvel para prevenir complicaes srias. A mudana do tratamento convencional
para a dilise ou transplante determinado pela qualidade de vida do doente e os riscos que
os tratamentos possam ter [in Fauci et al, 2009].
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a diminuio da activao de clulas T, podendo ser estudada atravs das molculas CD69
[Dietzmann et al, 2002; Meier et al, 2007] e CD25 (receptor da IL-2) [Girndt et al, 2001;
Sester et al, 2000; Girndt et al, 1999], bem como a relao CD4/CD8 [Girndt et al, 1993].
Outro meio para verificar a activao das clulas T atravs da quantificao das citocinas
pr-inflamatrias IL-1, IL-6 e TNF-. Assim sendo, o tratamento por hemodilise e a urmia
tm influncia sobre os moncitos, ocorrendo uma sucessiva activao do complemento. Estas
clulas so activadas para a produo de elevados nveis destas citocinas, em que quanto
mais elevados os nveis, mais baixa a activao das clulas T [Girndt et al, 2001; Girndt et
al, 1998; Herbelin et al, 1990].
Um dos sinais que actua directamente na induo da IL-2 transmitido atravs das molculas
da famlia B7. Estas molculas constituem um dos mais importantes sinais co-estimulatrios
das APCs para as clulas T, atravs da interaco com o CD28, localizado na superfcie destes
linfcitos [Greenfield et al, 1998]. Alguns estudos direccionados avaliao da expresso
deste tipo de molculas, nomeadamente da B7-1 (CD80) e da B7-2 (CD86), sugerem que a
reduo da activao de clulas T no devido s prprias clulas mas sim s APCs [Girndt et
al, 2001], encontrando-se valores reduzidos da expresso da B7-2 [Girndt et al, 2001; Girndt
et al, 1999], levando posteriormente a uma reduo na relao entre o segundo sinal (B7-2) e
o primeiro sinal (HLA classe II) [Girndt et al, 1999].
Como referido anteriormente, existem dois tipos de clulas auxiliares: Th1, que secreta a
citocina IFN-, (inibe a diferenciao das clulas Th2) e a Th2, que produz interleucinas IL-4 e
IL-10 (inibe a secreo de IFN- e a imunidade celular) [Libetta et al, 2001]. Os valores de IL-
4 e IL-10 encontram-se elevados em doentes com falha renal crnica [Alvarez-Lara et al,
2004], sendo que estes valores elevados de IL-10 tambm ocorrem em doentes com
nefropatia diabtica e ESRD. O aumento da produo de IL-10 pode representar uma resposta
auto-regulatria para aumentar a produo de citocinas pr-inflamatrias pelos moncitos
[Kamel et al, 2009]. Em doentes em hemodilise, o aumento da sntese e secreo desta
citocina devido ao contacto com a membrana do dialisado [Brunet et al, 1998].
Em doentes em dilise, a reduo da IL-2 tem como consequncia uma reduo da activao
das clulas Th1 e Th2, pois esta citocina encontra-se envolvida na expanso de ambas as
linhas celulares. Contudo, estudos revelam que em casos de falha renal crnica, h uma
induo para a tendncia da diferenciao de clulas Th1 [Sester et al, 2000],
consequentemente levando ao aumento da razo Th1/Th2 [Ando et al, 2005; Sester et al,
2000; Nitta et al, 2002; Daichou et al, 1999]. Dois dos grandes promotores da diferenciao
das Th1 so a IL-12 (secretada por APCs) e o IFN-. A IL-12 encontra-se sobre-expressa nos
moncitos de doentes hemodialisados, enquanto que relativamente ao valores de IFN-
existem opinies diferentes. Estudos mais antigos relatam nveis de IFN- baixos [Sester et al,
2000], mas outros autores demonstraram que doentes com falha renal crnica e nefropatia
diabtica, apresentam nveis elevados desta citocina [Kamel et al, 2009; Alvarez-Lara et al,
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2004; Fodor et al, 2002]. Ao contrrio do IFN-, a IL-12 no afecta o desenvolvimento das
Th2. Assim, a alta frequncia de clulas Th1 em doentes hemodialisados pode ser explicada
pelos altos nveis de IL-12, que facilita e aumenta a diferenciao das Th1 sem afectar o
desenvolvimento das Th2. Tal indicativo que a funo auxiliar da activao das clulas B
(Th2) encontra-se mais comprometida que a funo efectora T (Th1) pela reduo de
activao de clulas T [Sester et al, 2000] (figura 1.4).
Figura 1.4: Alteraes da funo imunolgica em doentes com falha renal crnica [Adaptado de Girndt
et al, 2001]
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Na diabetes tipo 2, sem doena renal, a resistncia insulina leva a um aumento da secreo
de insulina, mas em doentes com ESRD tal no acontece, devido acidose metablica,
deficincia da 1,25 dihidroxivitamina D e hipertiroidismo secundrio [Mak, 1992]. Em doentes
que tenham ESRD e estejam em tratamento por hemodilise, ocorre uma alterao da
farmacocintica da medicao da diabetes, levando a um aumento dos nveis de glucose e um
aumento do risco de episdios hipoglicmicos [Shrishrimal et al, 2009]. Os doentes diabticos,
quando comparados com indivduos saudveis, apresentam uma excessiva produo de
citocinas Th1 acompanhado por uma deficincia de Th2 [Rapoport et al, 1998]. Este
fenmeno est envolvido na patognese da diabetes mellitus tipo 1 [Rabinovitch, 1994]. As
clulas Th1 auxiliares e as suas citocinas so mais prevalentes em relao com s clulas de
Th2, resultando numa cascata de processos imunolgicos nos ilhus pancreticos, levando
posteriormente destruio das clulas [Dietzmann et al, 2002].
Na tabela seguinte encontram-se alguns dos principais estudos feitos nesta rea e as suas
principais concluses.
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Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
Tabela 1.2: Principais estudos das clulas envolvidas na imunidade de doentes com ESRD, DN e falha crnica renal que faam tratamento de dilise.
Clulas em Citocinas/molculas
Referncia Doena N doentes Idade mdia Principais resultados
estudo em estudo
Zamauskaite 25 HD 52,1 Clulas Th1 IL-2, IFN-, TNF-, Diminuio da percentagem relativa de clulas CD3+ que
ESRD
et al, 1999 20 DP 57,9 Clulas Th2 IL-4 e IL-10 expressam IL-2, IFN-, TNF-, IL-4 e IL-10
Falha 14 Antes e
Kaul et al, renal depois algumas Baixa percentagem relativa de clulas T antes de HD; aumento
5914,2 Clulas T CD28, IL-6, IL-10
2000 crnica e semanas de HD, da percentagem relativa de clulas T aps 6 semanas de HD
ESRD onde 7 tm ND
Sester et al, Clulas Th1 Diminuio d expresso de IL-2, IFN-; aumento da expresso
ESRD 20 HD 56,512,8 IL-2, IFN- e IL-12
2000 Clulas Th2 de IL-12 e Th1
20 HD onde 5
63,311
Falha tm ND Diminuio da percentagem relativa de B7-2 em HD; valores
Girndt et al, CD14, HLA-DR, B7-1
renal 10 FRC sem Moncitos normais de expresso de B7-1 e HLA-DR em HD; B7-1 expresso
2001 (CD80), B7-2 (CD86)
crnica dilise, onde 3 71,110,3 s em moncitos activados
tm ND
Dietzmann
ESRD/ND 2 30 HD 7012 Clulas T CD69, CD3 Diminuio da expresso CD69 em linfcitos T
et al, 2002
Diminuio da percentagem relativa de clulas T em HD
Meier et al, 18 HD CD3, CD69, CD95, (comparando com grupo de ESRD e controlos); expresso
ESRD 516 Clulas T
2002 8 ESRD anexina V elevada de CD69 em HD (em comparao com os outros
grupos); aumento da apoptose das clulas T
20 HD 55,52,3 A HD potencia a sntese de TNF pelos moncitos mas aps HD
Falha Celulas T
Ando et al, TNF, IL-1, IFN, IL- no se altera; aps HD tambm no se altera nem o IFN, IL-4
renal auxiliares
2005 20 DP 53,811 4, CD14, CD4 e IL-1; aumento de Th1/Th2 e Th1 em HD; diminuio da
crnica Moncitos
sntese de IL-1 e TNF em PD e valores normais em HD
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Clulas em Citocinas/molculas
Referncia Doena N doentes Idade mdia Principais resultados
estudo em estudo
25 HD no
Bradran et
ESRD diabticos 47,17 Clulas B - Diminuio da percentagem relativa de clulas B
al, 2006
11 HD diabticos
CD4, CD8, CD3,
Diminuio da percentagem relativa de clulas B em doentes
CD45, CD14, CD19,
Litjens et Clulas T com DRC estdio 5, em relao ao grupo controlo;
DRC 38 DRC 5415 CD45RO, CCR7,
al, 2006 Clulas B predominncia da produo de citocinas tipo 1 em doentes em
CXCR3, CCR5, CCR4,
HD; aumento da expresso de CD25 em clulas CD4+
CD25 e CD27
Percentagem relativa de clulas T CD4+ e CD4/CD8 reduzida no
Yoon et al, 21 HD (antes e CD4, CD8, CD45RA,
ESRD 493,4 Clulas T grupo de ESRD; Diminuio da percentagem relativa de clulas
2006 depois HD) CCR7
T CD8+ aps a HD
15 HD 515 Diminuio da expresso de CD69 em clulas TCD4 em HD
Meier et al, 15 DP 527 CD3, CD4, CD69, (comparando com os outros grupos); diminuio da expresso
ESRD Clulas T
2007 CD95, IL-2 de IL-2 em clulas CD69+CD4+ na presena de ox-LDL e de Bcl-
15 DRC 504
2; aumento de Bax
Clulas T
CD3, CD4, CD8, Diminuio da percentagem relativa de linfcitos T e linfcitos
Clulas B
Costa et al, 50 HD em que 16 CD57, HLA-DR, CD28, T CD4+; aumento da expresso de IL-2, TNF, IFN, IL-6, sIL2R
ESRD - Moncitos
2008 tm ND sIL2R, IL-2, IL-4, IL-6, nas subpopulaes das clulas T, e na percentagem relativa de
Neutrfilos
IL-10, TNF e IFN clulas T CD28-, CD57+, HLA-DR+, CD28-HLA-DR+ e CD57+HLA-DR+
Eosinfilos
40 HD 2713 CD3, CD4, CD19, Percentagem relativa de CD19, CD3-CD16+CD56+, CD4, CD3 e
Hendrikx et
ESRD Clulas T CD4+ CD8, CD45, CD14, CD4+CD25bright+ mais baixa em doentes ESRD, em comparao
al, 2009 26 PD 199
CD25, CD16CD56 com os controlos
17
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
Citocinas/molculas
Referncia Doena N doentes Idade mdia Clulas em estudo Principais resultados
em estudo
17 Diabticos
sem alteraes 47,98,9
nos rins
22 ND (diabticos
tipo 2 com Aumento da sntese de IFN- e IL-10 em DN e ESRD, e sICAM-
Kamel et DN tipo 2 e 55,99,3 sICAM-1, IFN-, IL-10
alteraes nos Clulas CD4+ 1 e sE-selectin em diabticos, DN e ESRD; aps HD a sntese
al, 2009 ESRD e sE-selectin
rins) de sICAM-1, IFN- e IL-10 aumentam
19 ESRD
(diabticos tipo 2
52,88,8
com ESRD em
HD)
Clulas T
CD3, CD19, Diminuio da percentagem relativa de clulas B e CD8+
Clulas B
Vrabie et Falha renal 15 HD (antes e CD16/CD56, CD45, aps HD; aumento da percentagem relativa de clulas T
31-50 Clulas NK
al, 2009 crnica aps HD) CD4, CD8, CD25, HLA- CD4+ e NK e linfcitos T com receptor para a IL-2 aps HD;
Moncitos
DR no houve alterao na razo CD4/CD8 aps HD
Granulcitos
Diminuio da percentagem relativa de clulas T CD4+ em
Borges et 47 HD (12 antes CD3, CD4, Annexina V doentes HD, comparando com os controlos; aumento da
ESRD 65,5816,99 Clulas T CD4+
al, 2011 HD e depois HD) e 7-AAD percentagem relativa de clulas T apoptticas CD4+,
comparando antes e depois da HD
Abreviaturas: ESRD: Doena renal em fase terminal; ND: Nefropatia diabtica; HD: Hemodilise; DP: Dilise peritonial; IFN-: Interfero gama; TNF-: Factor de necrose
tumoral alfa; DRC: Doena renal crnica; FRC: Falha renal crnica
18
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
Atravs de uma anlise feita aos estudos realizados nesta rea verificou-se que existe uma
escassa informao acerca do comportamento da expresso de marcadores de activao em
clulas T e suas sub-populaes (CD4 e CD8), aps uma nica sesso de hemodilise, bem
como estudos focados no perfil citocnico inflamatrio em amostras de sangue, colhidas antes
e aps a hemodilise. Assim sendo, este estudo tem como principais objectivos:
19
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
Captulo 2
Materiais e Mtodos
1- Seleco da amostra
A amostra do estudo foi seleccionada de entre doentes que fazem hemodilise no centro de
dilise Nephrocare - Covilh, sendo que as caractersticas comuns foram: ter diabetes
mellitus tipo II, o tipo de acesso vascular ser por fstula arteriovenosa e no terem efectuado
nenhum transplante. Os critrios de excluso basearam-se em factores que podem afectar o
Sistema Imunolgico: serem fumadores e tomarem medicamentos anti-asmticos e
antibiticos. Assim sendo, a nossa amostra consistiu num grupo de 17 doentes (7 Homens e 10
Mulheres) com uma mdia de idades de 72.410,2, sendo que 88.2% so insulino-dependentes,
Todos os doentes realizam hemodilise h mais de um ano. As caractersticas laboratoriais
referentes s anlises feitas mais prximas do dia de colheita esto resumidas na tabela 2.1.
Todos os participantes foram informados dos objectivos do estudo e assinaram um
consentimento informado, submetido e aprovado pela comisso de tica da Fresenius Medical
Care.
20
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
O sangue foi incubado com os anticorpos durante 15 minutos, em gelo e no escuro. Para cada
amostra prepararam-se quatro tubos diferentes: o controlo negativo (tubo 0), que em vez do
anticorpo continha 50 L de staining buffer (PBS 1x contendo 0,2% de albumina srica bovina
(BSA) e 0,1% de azida de sdio (NaN3)); e trs tubos (tubo 1 a 3) com combinaes diferentes
de marcadores de activao como descrito na tabela 2.3.
21
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
Tabela 2.3: Combinao dos anticorpos e quantidade usada para a anlise da populao de linfcitos por
citometria de fluxo
Tubo CD3 (L) CD4 (L) CD8 (L) CD25 (L) CD69 (L) CD71 (L)
1 17 17 8 17 - -
2 17 17 8 - 17 -
3 17 17 8 - - 17
Aps incubao, procedeu-se lise das clulas com 1mL de soluo BD FACS Lysing (1x
concentrado), durante 15 minutos no escuro. Para a separao dos leuccitos totais do sangue
dos restantes constituintes celulares, centrifugou-se as amostras a 1200rpm durante 4
minutos. Aps desprezar o sobrenadante, procedeu-se lavagem (1 a 2 vezes) do pellet, para
retirar o maior nmero de eritrcitos lisados, com 500 L de Binding buffer (PBS: 1,37 M
NaCl, 27 mM KCl, 100 mM Na2HPO4, 20 mM KH2PO4 - pH7,4), seguido de nova centrifugao a
1200rpm durante 4 minutos. Uma vez isolados os leuccitos foram ressuspendidos em 400 L
de PBS e colocados no escuro e no gelo, at aquisio.
A anlise dos resultados foi feita com recurso ao software CELLquest, onde o sistema foi
definido para a avaliao de 15000 clulas, numa regio delimitada regio com as
caractersticas morfolgicas dos linfcitos (figura 2.1).
Linfcitos
Aps a definio desta regio e atravs da amostra do controlo negativo (sem anticorpo),
definiu-se uma regio para as clulas T, presentes na regio dos linfcitos, com a construo
de um grfico Dot blot complexidade (SSC) versus CD3, como exemplificado na figura 2.2.
22
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
Clulas CD3+
Figura 2.3: Histogramas representativos da seleco da regio positiva, em amostras dos controlos
negativos.
23
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
b)
a)
c) CD25-PE
Figura 2.4: Grficos representativos da metodologia usada para a determinao da percentagem relativa
de clulas T (a), T CD4 (b), T CD8 (b) e expresso de CD25 (c), CD69 (c) e CD71 (c) nas subpopulaes de
clulas T. Nota: No histograma c) s est representado uma das 3 regies resultantes de cruzamento.
Aps obteno do pellet este foi ressuspenso em 500 L de annexin binding buffer (0,1 M
Hepes/NaOH, 1,4 M NaCl, 25 mM CaCl2 - pH7,4) e posteriormente centrifugado a 1200rpm
durante 4 minutos. Aps desprezo do sobrenadante adicionou-se 100 L de annexin binding
buffer com 5 L de anexina V (FITC, Ref. #556420, BD Pharmingen). Aps 15 minutos de
incubao no escuro adicionou-se mais 300 L de annexin binding buffer. Para uma melhor
diferenciao da apoptose em fase inicial adicionou-se 5 L de iodeto de propdio (stock com
concentrao de 50 g/mL), pois intercala-se com a dupla hlice da cadeia de DNA, minutos
antes da anlise por citometria de fluxo.
4- Anlise de citocinas
Para a avaliao das citocinas utilizou-se o kit Cytometric Bead Array (CBA) Human
Inflammatory Cytokines (BD Pharmingen, 551811). As amostras de sangue foram colhidas
antes e aps a hemodilise, para tubos sem anticoagulante, tendo sido, posteriormente
isolado o soro por centrifugao, a 4000rpm durante 10 minutos, a uma temperatura de 20C.
24
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
O kit BD CBA Human Inflammatory Cytokines foi usado para medir quantitativamente os
nveis de protena das citocinas inflamatrias IL-8, IL-1, Il-6, IL-10, TNF- e IL-12p70, numa
nica amostra de soro. Este kit consiste num mtodo de captura de analito solvel ou de um
conjunto de analitos com esferas de tamanho e fluorescncia conhecidos, fazendo com que
seja possvel detectar os analitos usando a citometria de fluxo. Para tal, temos de proceder
primeiro preparao dos padres para a formao da curva de calibrao. Preparou-se um
tubo com as esferas padro e assay diluent do kit, num volume total de 2mL, para um tubo
denominado top Standard. A partir deste tubo procedeu-se a 8 diluies como
exemplificado na figura 2.5. Preparou-se tambm um tubo para controlo negativo que
continha s assay diluent.
De seguida preparou-se uma soluo com 10L de cada capture beads num volume total de
440 L, correspondente ao nmero de tubos a analisar (padres, controlo negativo e
amostras). Centrifugou-se a mistura das beads a 200g durante 5min, descartando o
sobrenadante com uma pipeta, e ressuspendendo, de seguida, o pellet em serum
enhancement buffer, num volume igual ao retirado de sobrenadante. Esta mistura das
capture beads, aps ser agitada em vortex, foi incubada durante 30 minutos temperatura
ambiente e no escuro.
Aps a incubao da mistura das capture beads adicionou-se 50 L a todos os tubos das
amostras, adicionando aos tubos de controlo, resumidos na tabela 2.4, 50 L de human
inflammatory cytokine standard dilutions.
25
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
Aps incubao adicionou-se 1mL de wash buffer a cada tubo a analisar e centrifugou-se a
200g durante 5 minutos. Retirou-se o sobrenadante, cuidadosamente, deixando
aproximadamente 100 L, tendo-se adicionado de seguida 50 L de human inflammatory
cytokine PE detection reagent a todos os tubos, ressuspendendo o pellet devagarinho. Aps
uma incubao de 1hora e meia, s escuras, adicionou-se aos tubos 1mL de wash buffer,
centrifugando-se de seguida a 200g durante 5 minutos. Descartou-se o sobrenadante, com
cuidado, e ressuspendeu-se o pellet em 300 L de wash buffer. As amostras permaneceram
no escuro at sua anlise por citometria de fluxo.
A anlise dos resultados foi efectuada atravs do software CELLquest e a realizao dos
clculos, num ficheiro Excell disponibilizado pela Becton Dickinson (BD).
5- Anlise estatstica
Para a comparao da percentagem relativa de clulas CD3, CD4, CD8, dos marcadores de
activao CD25, CD69 e CD71, nas subpopulaes de clulas T e das citocinas IL-8, IL-1, Il-6,
IL-10, TNF- e IL-12p70, antes e aps a hemodilise utilizou-se o Wilcoxon Signed-Rank test,
usando o software SPSS (verso 19), tendo sido considerados significativos valores com p
<0,05. Este teste permite detectar diferenas significativas entre os valores centrais de duas
situaes, quando se consideram os mesmos sujeitos. Representa a alternativa no
paramtrica ao teste t-student para amostras emparelhadas, quando no se encontram
reunidas as condies de aplicao de um teste paramtrico.
26
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
Captulo 3
Resultados
Tabela 3.1: Valores de mdia, desvio padro, mediana, mnimos e mximos das percentagens relativas
das clulas T, suas sub-populaes (CD4 e CD8) e razo CD4/CD8, antes e aps hemodilise
Pr dilise Ps dilise
p
MDP Med (min-mx) MDP Med (min-mx)
40 *
20
*
0
Clulas T CD4/CD8 CD3CD4 CD3CD8
Grfico 3.1: Percentagens relativas das clulas T, suas sub-populaes (CD4 e CD8) e razo CD4/CD8,
antes e aps hemodilise, em 17 doentes diabticos hemodialisados (* p <0,05)
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Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
Por citometria de fluxo foi tambm analisado o efeito da HD na expresso de trs marcadores
de activao, CD25, CD69 e CD71, nos linfcitos T globalmente e nas duas principais sub-
populaes, T CD4 e T CD8. Verificaram-se diferenas significativas na percentagem relativa
de clulas T CD25 (31,614,9 vs 36,212,7, p <0,05), nas clulas T CD8 CD25 (6,94,5 vs
9,16, p <0,05), em que se verifica um aumento de 15% e 32%, respectivamente, aps sesso
de hemodilise, e em clulas T CD69 (10,67,1 vs 7,84,2, p <0,05), onde se verifica uma
diminuio da percentagem relativa de 26%, aps sesso de hemodilise. Para os restantes
marcadores de activao expressos nas clulas T, T CD4 e T CD8 no se verificaram diferenas
significativas (Tabela 3.2 e Grfico 3.2).
Tabela 3.2: Valores de mdia, desvio padro, mediana, mnimos e mximos das percentagens relativas
da expresso de CD25, CD69 e CD71 em clulas T e suas sub-populaes (CD4 e CD8), antes e aps
hemodilise
Pr dilise Ps dilise
p
MDP Med (min-mx) MDP Med (min-mx)
CD3+ 31,614,9 33,7 (4,3-58,2) 36,212,7 34,3 (11,5-64,1) 0,013
CD25 CD4+ 45,117,1 47,2 (6,4-69,9) 47,913,5 45,6 (15,3-71,3) 0,176
CD8+ 6,94,4 6,7 (1-15,4) 9,16 6,9 (1,1-25,4) 0,002
Grfico 3.2: Percentagens relativas da expresso dos marcadores CD25, CD69 e CD71 em clulas T e suas
sub-populaes (CD4 e CD8), antes e aps hemodilise, em 17 doentes diabticos hemodialisados (* p
<0,05)
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Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
Posteriormente, foi feita uma anlise semelhante aos marcadores de activao expressos nas
sub-populaes de clulas analisadas para os valores de intensidade de fluorescncia, tendo-
se verificado as seguintes diferenas significativas, aps sesso de hemodilise: diminuio de
11% da percentagem relativa de clulas T CD4 que expressavam CD25 (56,420 vs 50,417,2,
p <0,05), de 39% nas clulas T CD71 (34,321,1 vs 219,7, p <0,05), de 32% de clulas T CD4
CD71 (3016 vs 20,410,6, p <0,05), e 42% de clulas T CD8 CD71 (39,430,9 vs 2312,6, p
<0,05). Para as outras clulas que expressaram os marcadores de activao CD25, CD69 e
CD71 no se encontraram diferenas significativas (Tabela 3.3 e Grfico 3.3).
Tabela 3.3: Valores da mdia, desvio padro, mediana, mnimos e mximos da Mean Fluorescence
Intensity (MFI) das clulas T e suas sub-populaes (CD4 e CD8) que expressam os marcadores CD25,
CD69 e CD71, antes e aps hemodilise
Pr dilise Ps dilise
p
MDP Med (min-mx) MDP Med (min-mx)
70
MFI
60 * Pr dilise
Ps dilise
50 *
40 * *
30
20
10
0
Grfico 3.3: Valores da Mean Fluorescence Intensity (MFI) das clulas T e suas sub-populaes (CD4 e
CD8) que expressam os marcadores de activao CD25, CD69 e CD71, antes e aps hemodilise, em 17
doentes diabticos hemodialisados (* p <0,05)
29
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
Para a anlise da apoptose celular em linfcitos, tambm se usou a citometria de fluxo, mas
estes resultados foram inconclusivos, sendo necessria a realizao de mais estudos
posteriormente.
2 Anlise de citocinas
Para a anlise da concentrao serolgica de citocinas inflamatrias, usou-se o Cytometric
Bead Array, que tem por base a citometria de fluxo e obtiveram-se diferenas significativas
em trs das citocinas estudadas: na IL-10 (2,10,7 pg/mL vs 2,50,7 pg/mL, p <0,05), e na IL-
6 (8,95,6 pg/mL vs 11,67,8 pg/mL, p <0,05), onde se verificou um aumento da
concentrao de 5% e 19%, respectivamente, aps a sesso de hemodilise, e na IL-8 (17,46
pg/mL vs 11,13,7 pg/mL, p <0,05), com uma diminuio da concentrao de 22%, aps
hemodilise. Nas outras citocinas avaliadas, para alm de no se ter verificado diferenas
significativas, verificou-se que em algumas amostras, o clculo da concentrao das citocinas
se encontrava abaixo do limite de deteco, tendo em conta a curva de calibrao realizada
no incio do procedimento (Tabela 3.4 e Grfico 3.4).
Tabela 3.4: Valores de mdia, desvio padro, mediana, mnimos e mximos da concentrao das
citocinas IL-8, IL-1, Il-6, IL-10, TNF- e IL-12p70, antes e aps hemodilise (n=15)
Pr dilise Ps dilise
Med (min- p
MDP Med (min-mx) MDP
mx)
IL12p70 5,50,4 1,8 (1,7-2,8) 5,50,5 2 (1,6-2,7) -
20 Concentrao de citocinas
15 IL12p70
(pg/mL)
TNFa
10
IL10
5 IL6
IL1b
0
IL8
Pr dilise Ps dilise
Grfico 3.4: Valores de concentrao das citocinas inflamatrias IL-8, IL-1, Il-6, IL-10, TNF- e IL-
12p70, antes e aps a sesso de hemodilise, expressos em pg/mL
30
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
Captulo 4
Discusso
A dilise leva a algumas alteraes no Sistema Imunolgico, como por exemplo na activao
do complemento, na funo dos macrfagos [Vrabie et al, 2009], na activao de clulas T
[Meier et al, 2002] e na libertao de vrias citocinas pr-inflamatrias [Zamouskaite et al,
1999]. No presente estudo propusemo-nos a analisar mais profundamente alguns aspectos
associados activao de linfcitos T, incluindo a sntese de citocinas inflamatrias. Inmeros
estudos incidiram sobre a comparao entre voluntrios saudveis e hemodialisados nestes
parmetros mas, poucos existem com foco nas alteraes que ocorrem aps uma sesso de
hemodilise.
Associada terapia renal, alguns autores [Fernandez-Fresnedo et al, 2000; Kurz et al, 1986]
reportaram uma linfopnia nas clulas T, no entanto, no nosso estudo, ao analisarmos os
valores de percentagem relativa de clulas T aps uma sesso de hemodilise, no se
verificam diferenas significativas, verificando-se assim que a HD no provoca alteraes na
percentagem destas clulas. Contudo, na anlise das subpopulaes destas clulas
verificaram-se alteraes. Relativamente percentagem relativa de clulas T CD4 verificou-
se um aumento de 10%, aps sesso de hemodilise, da percentagem de clulas positivas CD4,
no sendo estes resultados concordantes com outros autores, como Yoon e seus colegas, em
que no verificaram alteraes nesta percentagem celular. No entanto o estudo destes
investigadores continha uma populao de 21 doentes em hemodilise, enquanto no nosso
estudo analismos 17 amostras. Contudo, este aumento de percentagem de clulas T CD4
pode ser devido prpria durao do procedimento de HD (durao mdia de 4h), em que se
promove um estado contnuo de activao nas clulas T, como sugerido por Borges e colegas.
Quanto percentagem relativa de clulas T CD8, verificmos uma diminuio da percentagem
relativa de 17%, aps sesso de hemodilise, estando os nossos resultados de acordo com
estudos prvios, [Yoon et al, 2006]. Uma das possveis explicaes est relacionada com as
possveis consequncias do contacto do sangue com a membrana do dialisador, e se este
contacto pode levar apoptose celular destas clulas. No entanto, esta diminuio da
percentagem relativa de clulas T CD8 necessita da realizao de mais estudos para uma
melhor compreenso do porqu da diminuio destas clulas, aps a sesso de HD. Os nossos
estudos foram tambm concordantes com outros autores em relao ao valor da razo
CD4/CD8, verificando-se uma diminuio deste valor aps sesso de HD.
31
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
Alm dos valores de percentagem de clulas positivas, foram tambm comparados, antes e
aps HD, os valores de MFI (Mean Fluorescence Intensity). Este parmetro avalia a
intensidade de fluorescncia das clulas, que proporcional densidade celular das
molculas analisadas, e verificou-se uma reduo de 11% na percentagem relativa da
expresso de CD25 em clulas T e uma diminuio na expresso de CD71 em clulas T, T CD4
e T CD8 de 39%, 32% e 42%, respectivamente, aps sesso de HD. Assim, apesar de no
ocorrer diferenas na percentagem de clulas T que expressem estes dois marcadores,
verifica-se uma diminuio do nmero destes marcadores por clula com a sesso de HD. O
marcador de activao CD71 o receptor da transferrina e liga o complexo Fe(APO)
transferrina por endocitose, entregando o ferro, um importante co-factor de enzimas
necessrias ao crescimento celular e metabolismo. Consistentes com esta anlise esto os
resultados das ltimas anlises feitas antes da colheita de sangue dos doentes, onde se
verifica que aproximadamente 82% dos doentes apresentam valores de transferrina abaixo dos
valores de referncia (200-360 mg/mL). Apesar do valor de MFI, depois da sesso de HD, no
32
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
33
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
por estes investigadores so: o facto de que esta protena tem um peso molecular baixo,
sendo por isso fcil a sua difuso atravs da membrana de dilise; ou devido a uma
diminuio da estabilidade ou alterao na sua absoro pela membrana, durante a sesso de
hemodilise.
34
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
Captulo 5
Concluso
Atravs da realizao deste estudo concluiu-se que durante uma sesso de hemodilise
ocorrem algumas alteraes no Sistema Imunolgico, nomeadamente na expresso de alguns
marcadores de activao em clulas T e suas sub-populaes (CD4 e CD8). Verificou-se assim
que a hemodilise interferiu na expresso do marcador CD25 em clulas T e T CD8, e na
expresso de CD69 em clulas T. Verificou-se tambm que aps uma sesso de hemodilise a
densidade das molculas de CD71 diminuiu por clula, em clulas T, bem como as molculas
de CD25 em clulas T CD4. Alm disso tambm se verifica que a sesso de hemodilise altera
a secreo de algumas citocinas, ocorrendo o aumento de IL-10 e IL-6 e uma diminuio da
concentrao de IL-8, aps uma sesso de hemodilise, sugerindo que possivelmente estas
alteraes se devam ao contacto com a membrana do dialisador. Apesar disso, o facto de se
verificar um aumento de IL-10, durante a sesso de hemodilise, este tem um efeito anti-
inflamatrio, pode ser indicativo de que este tipo de tratamento melhora alguns sinais
caractersticos deste tipo de doentes. Um dos outros objectivos seria a anlise da apoptose
celular em linfcitos, aps a sesso de hemodilise, mas os resultados foram inconclusivos,
no tendo por isso sido possvel atingir este objectivo.
35
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
Captulo 6
Perspectivas futuras
Apesar dos poucos estudos publicados nesta rea, resultados contraditrios tm vindo a ser
reportados, no que respeita aos efeitos da hemodilise no Sistema Imunolgico dos doentes
com nefropatia diabtica. Deste modo, mais estudos necessitam de ser feitos para uma
melhor compreenso dos mecanismos induzidos pela hemodilise que originam alteraes na
imunologia celular. Uma vez que verificmos no nosso estudo uma aco da hemodilise no
fentipo das clulas T citotxicas, CD8+, diferente relativamente s clulas T auxiliares,
CD4+, mais estudos necessitam de ser realizados de modo a analisar tambm a funo
citotxica destas clulas. tambm importante realizar estudos sobre o efeito da hemodilise
na proliferao celular das clulas T e suas sub-populaes, para melhor avaliarmos as
consequncias da HD na capacidade de resposta a antignios. Uma vez que os nossos
resultados referentes apoptose celular foram inconclusivos, futuras experincias tero
tambm de focar este aspecto nas sub-populaes de linfcitos T. Para verificao da
consistncia dos nossos resultados ser necessrio tambm aumentar o nmero de amostras,
bem como efectuar o estudo num maior nmero sesses de dilise.
36
Marcadores de Activao e Perfil de Citocinas Inflamatrias em Doentes com Nefropatia Diabtica em Hemodilise
Captulo 7
Bibliografia
Abbas A, Lichtman A and Pillai S, Cellular and molecular immunology, 6th Edition, Sauders
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