Relatório Nitrato Mestrado

Vanessa dos Santos Guimarães
Validação dos Métodos de Determinação de Nitratos e Metais

em Águas Naturais e em Águas Residuais
Departamento de Química
Faculdade de Ciências da Universidade do Porto
Outubro / 2010
Vanessa dos Santos Guimarães
Validação dos Métodos de Determinação de Nitratos e Metais em Águas

Naturais e em Águas Residuais
Tese submetida à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto

para obtenção do grau de Mestre em Química
Departamento de Química
Faculdade de Ciências da Universidade do Porto
Outubro / 2010
Agradecimentos
Finalmente esta obra é uma realidade graças a muito trabalho, dedicação e

sacrifício, no entanto estes factores de nada serviriam sem o grande apoio de todos
os meus colegas de laboratório, especialmente do João, do Mário, da Mariana e da
Teresa. Pela paciência e ajuda o meu muito obrigado.
Gostaria de agradecer ao Sr. Eng. Hélder Durão a oportunidade que me deu
de poder estagiar no IDIT e o apoio prestado durante o período de estágio.
Ao Professor Dr. Manuel Azenha agradeço todo o apoio e orientação que me
deu durante o período de estágio, bem como as correcções e sugestões que propôs,
no sentido de melhorar este trabalho.
Quero deixar também uma nota de agradecimento à minha mãe e irmã por
estarem sempre presentes e pelo apoio incondicional que me deram também nesta
fase.
Agradeço especialmente ao Pedro pelas suas sugestões de melhoria,
infindável paciência e por ter estado sempre comigo.
Aos restantes familiares e especialmente ao meu avô por ser um lutador e por
me inspirar todos os dias, o meu muito obrigado.
Por último, agradeço à Eliane, ao Rui, à Cristiana, e a todos os meus amigos,
todo o apoio que me deram.
i
Resumo
A água é um bem essencial que deve ser usado de forma racional, sustentável
e cujo controlo de qualidade deve ser periódico e eficiente. Na legislação Portuguesa
são estipulados, relativamente a alguns elementos, valores paramétricos para águas
de consumo humano e para águas residuais. Contudo, para que este controlo seja
rigoroso, devem ser utilizados os métodos analíticos especificados na legislação, ou
métodos alternativos a estes, desde que comprovem, junto da autoridade competente,
que os resultados obtidos são no mínimo tão fiáveis como os que seriam obtidos pelos
métodos especificados.
O trabalho apresentado foi realizado em ambiente empresarial no Instituto de
Desenvolvimento e Inovação Tecnológica (IDIT), e, durante grande parte do período
de estágio, efectuou-se a validação de um método espectrofotométrico de
determinação de nitrato em águas de consumo humano e em águas residuais,
alternativo ao método especificado na legislação. Este é um método relativamente
recente, rápido e económico e pode ser dividido essencialmente em duas fases. A
primeira fase consiste na redução ácida de nitrato a nitrito na presença de ácido
clorídrico concentrado e a segunda fase caracteriza-se por um processo de
diazotização no qual se forma um composto corado cuja absorção é máxima a 540
nm.
Após a avaliação de diversos parâmetros concluiu-se que o método está apto
para a análise de águas de consumo e não foram identificadas quaisquer limitações.
Relativamente às águas residuais, apesar de identificadas algumas limitações
associadas à especificidade/selectividade e robustez do método, foram propostas
alternativas no sentido de ultrapassar estas limitações e validar o método com
sucesso.
Efectuou-se ainda a validação de métodos de espectroscopia de absorção
atómica para a análise de chumbo, níquel, zinco e cobre, em águas residuais. Neste
caso, pretendia-se garantir que o equipamento, que não estava a ser utilizado naquele
momento, se encontrava apto e que os seus resultados eram fiáveis.
A legislação Portuguesa refere-se a este como sendo o método de referência
para a análise e quantificação de metais em águas residuais (DL 236/98). Esta
apresenta ainda alguns requisitos que devem ser cumpridos para garantir a eficiência
do método. Neste caso, os métodos validados cumprem com todos os requisitos
impostos.
ii
Résumé
L'eau est un bien essentiel qui doit être utilisée de forme rationnelle, soutenable
et dont le contrôle de qualité doit être périodique et efficace. Dans la législation
Portugaise il est stipulé, à l'égard de quelques éléments, les valeurs paramétriques
pour des eaux de consommation humaine et pour des eaux résiduelles. Néanmoins,
pour que ce contrôle soit rigoureux, les méthodes analytiques spécifiées dans la
législation doivent être utilisées, ou des méthodes alternatives à ceux-ci, dès lors qu’ils
vérifient, près des autoritées compétentes, que les résultats obtenus sont au minimum
aussi viables que ceux qu’ils seraient obtenus par les méthodes spécifiées.
Le travail présenté a été réalisé dans l’environnement d'entreprise dans Instituto
de Desenvolvimento e Inovação Tecnológica (IDIT), et, pendant une grande partie du
stage, a été effectuée l'étude de la validation d'une méthode spectrophotométrique de
détermination de nitrate dans les eaux de consommation humaine et dans les eaux
résiduelles, alternatif à la méthode spécifiée dans la législation. Celui-ci est une
méthode relativement récente, rapide, économique et peut être divisé essentiellement
en deux phases. La première phase consiste en la réduction acide de nitrate à nitrite
en présence d'acide chlorhydrique concentré et la seconde phase se caractérise par
un processus de diazotation sur laquelle se forme un composé rougâtre dont
l'absorbance est maximal à 540 nm.
Après l'évaluation de divers paramètres on peut conclure que la méthode est
apte pour l'analyse d'eaux de consommation et aucunes limitations ont été identifiées.
Par rapport aux eaux résiduelles, malgré l’identification de quelques limitations
associées à la spécificité/sélectivité de la méthode et robustesse, des solutions ont été
proposées qui ont permises de les mettre de côté.
L'étude d'une méthode de spectroscopie d'absorption atomique a été effectuée
pour l'analyse du plomb, du nickel, du zinc et du cuivre, dans des eaux résiduelles.
Dans ce cas, le but était de vérifier si l'équipement, qui était hors usage, à ce moment,
était apte et si les résultats obtenus étaient fiables.
La législation Portugaise indique que cette méthode est la méthodologie
analytique de référence pour l'analyse et la quantification de métaux dans des eaux
résiduelles (DL 236/98). Celle-ci présente encore quelques conditions qui doivent être
accomplies pour garantir l'efficacité de la méthode. Dans ce cas, la méthode validée
accomplit avec tous les requis imposés.
Abstract
iii
Water is an essential asset that must be used rationally, sustainable and whose
quality control should be regular and efficient. In Portuguese legislation are set out, for
some elements, parametric values for water consumption and wastewater. However,
for this control be rigorous, should be used the analytical methods specified in the
legislation, or alternative methods to these, since prove, with the competent authority,
that the obtained results are at least as viable as those that would be obtained by the
specified methods.
The work presented was done in a business environment on Instituto de
Desenvolvimento e Inovação Tecnológica (IDIT), and, during largely of stage period,
was conducted the study for a validation of a spectrophotometric method for
determining nitrate in water consumption and wastewater, alternative to the method
specified in the legislation. This is a relatively new method, faster and cheaper and
could be divided essentially in two steps. The first step consist in acid reduction of
nitrate to nitrite in the presence of concentrated hydrochloric acid and the second step
is characterized by a diazotization process in which a colored compound is formed
whose absorbance is maximum at 540 nm.
After evaluating several parameters it was concluded that the method is suitable
for the analysis of water consumption and were not identified any limitations. Relatively
to the wastewater, although identified some limitations associated to
specificity/selectivity and robustness of method, were proposed solutions to solve this
limitations.
There has also been studying a method of atomic absorption spectroscopy for
the analysis of lead, nickel, zinc and copper in wastewater. In this case, was pretended
verify if the equipment, that was not being in use in that moment, was operational and
if your results were reliable.
Portuguese legislation refers to this as the reference analytical methodology for
the analysis and quantification of metals in wastewater (DL 236/98). This includes
some requirements that must be met to ensure the efficiency of the method. In this
case, the validated method meets all requirements.
iv
Índice
Agradecimentos............................................................................................................ i
Resumo ....................................................................................................................... ii
Résumé ...................................................................................................................... iii
Abstract ...................................................................................................................... iii
Índice de Tabelas ....................................................................................................... 3
1. Introdução ............................................................................................................ 9
1.1. Entidade de acolhimento ............................................................................... 9
1.2. Objectivo ....................................................................................................... 9
1.3. Estrutura da tese ........................................................................................... 9
2. A Água: aspectos gerais, elementos quantificados e métodos de análise ......... 11
2.1. Água para Consumo Humano: Controlo de Qualidade e Legislação Vigente
......................................................................................................................12
2.2. Águas Residuais: Processo de Tratamento, Controlo de Qualidade e
Legislação Aplicável .............................................................................................. 13
2.3. Elementos Quantificados em Águas de Consumo Humano e em Águas
Residuais .............................................................................................................. 14
2.3.1. Nitrato: Origem, contaminação, implicações na saúde humana e
métodos de determinação.................................................................................. 14
2.3.2. Metais: Origem, contaminação, implicações na saúde humana e método
de determinação. ............................................................................................... 28
3. Validação de Métodos........................................................................................ 41
3.1. Avaliação Indirecta ...................................................................................... 42
3.1.1. Especificidade/Selectividade ................................................................ 42
3.1.2. Quantificação ........................................................................................ 44
3.1.3. Precisão ................................................................................................ 50
3.1.4. Robustez ............................................................................................... 53
3.2. Avaliação Directa......................................................................................... 53
4. Controlo de Qualidade ....................................................................................... 57
4.1. Controlo de qualidade externo .................................................................... 57
4.2. Controlo de qualidade interno ..................................................................... 57
4.3. Cartas de controlo ....................................................................................... 57
4.3.1. Cartas de controlo de médias ou indivíduos ......................................... 58
4.3.2. Cartas de controlo de amplitudes ......................................................... 59
1
4.3.3. Cartas de controlo de somas cumulativas ............................................ 60
4.3.4. Detecção de pontos fora de controlo .................................................... 60
4.3.5. Acções correctivas ................................................................................ 63
5. Quantificação da incerteza de um método ......................................................... 65
5.1. Contribuição da precisão na determinação da incerteza do método ........... 65
5.2. Contribuição da exactidão na determinação da incerteza do método ......... 67
5.3. Combinação das fontes de incerteza e cálculo da incerteza expandida ..... 71
6. Método de determinação de nitrato ................................................................... 73
6.1. Parte Experimental ...................................................................................... 73
6.1.1. Material reagentes e equipamentos ...................................................... 73
6.1.2. Procedimento experimental .................................................................. 76
6.2. Resultados/ Discussão de Resultados ........................................................ 79
6.2.1. Avaliação indirecta da validação do método ......................................... 79
6.2.2. Avaliação Directa ................................................................................ 115
6.2.3. Determinação da incerteza do método ............................................... 119
6.2.4. Combinação das fontes de incerteza e cálculo da incerteza expandida
..............................................................................................................120
6.3. Controlo de qualidade ............................................................................... 121
7. Métodos de determinação de metais em águas residuais ............................... 129
7.1. Parte Experimental .................................................................................... 129
7.1.1. Material reagentes e equipamentos .................................................... 129
7.1.2. Procedimento experimental ................................................................ 131
7.2. Resultados/Discussão de Resultados ....................................................... 136
7.2.1. Avaliação indirecta da validação do método ....................................... 136
7.2.1.1. Quantificação ................................................................................... 136
7.2.2. Avaliação Directa ................................................................................ 148
8. Considerações Finais....................................................................................... 151
9. Referências Bibliográficas .................................................................................. 155
Anexo I.....................................................................................................................159
Anexo II....................................................................................................................167
Anexo III...................................................................................................................173
Anexo IV...................................................................................................................179
2
Índice de Tabelas
Tabela 2.1: Balanço hídrico global ........................................................................... 11
Tabela 2.2: Vantagens e desvantagens dos principais métodos de determinação de
nitrato. ...................................................................................................................... 20
Tabela 2.3: : Grupos cromóforos comuns nas regiões do ultravioleta e visível. ....... 25
Tabela 2.4: Características das diversas chamas. ................................................... 37
Tabela 6.1: Material utilizado no processo de validação do método. ....................... 73
Tabela 6.2: Reagentes utilizados no processo de validação do método. ................. 73
Tabela 6.3: Instrumentos e equipamentos utilizados no processo de validação do
método...................................................................................................................... 75
Tabela 6.4: Dados relativos à preparação da solução padrão de partida e das
soluções padrão intermédias 1 e 2. .......................................................................... 76
Tabela 6.5: Dados relativos à preparação das soluções padrão de calibração para
determinação de nitrito. ............................................................................................ 76
Tabela 6.6: Dados relativos à preparação da solução padrão de partida e da solução
padrão intermédia. .................................................................................................... 77
Tabela 6.7: Dados relativos à preparação das soluções padrão da curva de
calibração (CC) para determinação de nitrato. ......................................................... 77
Tabela 6.8: Resultados obtidos para a validação da gama de trabalho. .................. 79
Tabela 6.9: Dados utilizados na construção da curva de calibração. ....................... 81
Tabela 6.10: Dados para o cálculo dos parâmetros da curva de calibração. ........... 81
Tabela 6.11: Parâmetros obtidos da regressão linear. ............................................. 82
Tabela 6.12: Desvios padrão residuais da curva de calibração linear e da curva de
calibração não linear. ............................................................................................... 83
Tabela 6.13: Resultados relativos ao estudo do limite de quantificação do método. 87
Tabela 6.14: Dados relativos ao teste de Grubbs para a amostra 0303SIL01
(consumo)................................................................................................................. 88
Tabela 6.15: Resultados associados à avaliação da repetibilidade do método através
da amostra 2101IDT01 (água de consumo). ............................................................ 89
da amostra 0802MAC01 (água de consumo). .......................................................... 90
da amostra 2402EXP02 (água de consumo). ........................................................... 90
do padrão de 0,5000 mg N-NO3-/L. .......................................................................... 90
do padrão de 5,000 mg N-NO3-/L. ............................................................................ 91
da amostra 0501NEO03 (água residual). ................................................................. 91
da amostra 1201TAF01 (água residual). .................................................................. 91
da amostra 0902MAS01 (água residual). ................................................................. 92
3
da amostra 2602CIF01 (água residual). ................................................................... 92
da amostra 0303SIL01 (água residual). ................................................................... 92
da amostra 1603NEU01 (água residual). ................................................................. 93
Tabela 6.26: Resultados associados ao estudo da precisão intermédia do método
com uma solução padrão de 0,5000 mg N-NO3-/L. .................................................. 94
Tabela 6.27: Resultados associados ao estudo da precisão intermédia do método
com uma solução padrão de 5,000 mg N-NO3-/L. .................................................... 95
Tabela 6.28: Resultados associados à aplicação do teste F na comparação de
variâncias de precisão intermédia, resultantes do estudo de um padrão de 0,5000
mg N-NO3-/L e de um padrão de 5,000 mg N-NO3-/L. .............................................. 96
Tabela 6.29: Resultados associados à aplicação do teste F na comparação de
variâncias de precisão intermédia com variâncias de repetibilidade, resultantes do
estudo de um padrão de 0,5000 mg N-NO3-/L e de um padrão de 5,000 mg N-NO3-/L.
................................................................................................................................. 97
Tabela 6.30: Taxas de recuperação associadas à interferência de ferro (II) no
método, para 4 níveis de concentração do interferente. ........................................... 98
Tabela 6.31: Taxas de recuperação associadas à interferência de nitrito no método,
para 5 níveis de concentração do interferente. ....................................................... 100
Tabela 6.32: Taxas de recuperação associadas às interferências de sulfato, cloreto e
zinco no método. .................................................................................................... 100
Tabela 6.33: Taxas de recuperação associadas à interferência de ácido glutâmico e
glucose no método, para 4 níveis de concentração do interferente. ...................... 101
Tabela 6.34: Taxas de recuperação associadas à interferência de KHP no método,
Tabela 6.35: Taxas de recuperação associadas à interferência de glicina no método,
Tabela 6.36: Aplicação do método de adição padrão na amostra 0902MAS01. .... 104
Tabela 6.37: Aplicação do método de adição padrão na amostra 0203VEU04...... 104
Tabela 6.38: Aplicação do método de adição padrão na amostra 1802COR01. .... 106
Tabela 6.39: Aplicação do método de adição padrão na amostra 0303SIL01........ 107
Tabela 6.40: Aplicação do método de adição padrão na amostra 0503SON01. .... 108
Tabela 6.41: Parâmetros definidos para os factores utilizados no estudo da robustez
do método............................................................................................................... 109
Tabela 6.42: Modelo de Plackett-Burman............................................................... 110
Tabela 6.43: Resultados obtidos para cada experiência em absorvância. ............. 110
Tabela 6.44: Efeitos dos factores em estudo.......................................................... 111
Tabela 6.45: Valores de texp determinados para cada factor. ................................. 112
Tabela 6.46: Modelo de Plackett-Burman............................................................... 113
Tabela 6.47: Resultados obtidos para cada experiência em absorvância. ............. 113
Tabela 6.48: Efeitos dos factores em estudo.......................................................... 114
Tabela 6.49: Valores de texp determinados para cada factor. ................................. 114
4
Tabela 6.50: Erros relativos das amostras utilizadas no processo de comparação de
métodos. ................................................................................................................. 118
Tabela 6.51: Dados utilizados no cálculo da u(Rm) das amostras analisadas. ....... 120
Tabela 6.52: Avaliação da recuperação do método através do teste t-student. ..... 120
Tabela 6.53: Resultados associados à aplicação do teste de Kolmogorov-Smirnov.
............................................................................................................................... 121
Tabela 6.54: Resultados de triplicados de um conjunto de amostras de águas
residuais, obtidos em condições de repetibilidade. ................................................ 125
Tabela 7.1: Material utilizado no processo de validação do método. ..................... 129
Tabela 7.2: Reagentes utilizados no processo de validação do método. ............... 129
Tabela 7.3: Instrumentos e equipamentos utilizados no processo de validação do
método.................................................................................................................... 130
calibração (CC) para determinação de chumbo. .................................................... 131
calibração (CC) para determinação de níquel. ....................................................... 132
calibração (CC) para determinação de cobre. ........................................................ 132
calibração (CC) para determinação de zinco.......................................................... 133
Tabela 7.8: Parâmetros relativos aos elementos metálicos em estudo .................. 135
Tabela 7.9: Resultados obtidos para a validação da gama de trabalho (cobre). .... 136
Tabela 7.10: Dados utilizados na construção da curva de calibração de
determinação de cobre. .......................................................................................... 137
Tabela 7.11: Parâmetros da curva de calibração. .................................................. 138
Tabela 7.12: equações de regressão linear relativas aos métodos de determinação
de níquel, chumbo e zinco. ..................................................................................... 138
Tabela 7.13: Resultados associados à avaliação da linearidade das curvas de
calibração dos metais em estudo. .......................................................................... 139
Tabela 7.14: Limites de detecção (L.D.) e de quantificação (L.Q) dos metais em
estudo. .................................................................................................................... 143
da amostra 1305PRO01. ........................................................................................ 144
da amostra 2503CAT03.......................................................................................... 144
Tabela 7.17: Resultados obtidos na determinação da precisão intermédia a partir de
um conjunto de triplicados de diferentes amostras de águas residuais. ................. 145
5
Índice de Figuras
Figura 2.1: Ciclo do azoto. ........................................................................................ 15
Figura 2.2: Formação de nitrato. .............................................................................. 16
Figura 2.3: Consumo aparente de fertilizantes inorgânicos na agricultura. .............. 17
Figura 2.4: Balanço do azoto. ................................................................................... 18
Figura 2.5: Espectro electromagnético. .................................................................... 23
Figura 2.6: Níveis electrónicos e transições electrónicas das moléculas. ................ 25
Figura 2.7: Monocromador. ...................................................................................... 27
Figura 2.8: Lâmpada de cátodo oco. ........................................................................ 35
Figura 2.9: Espectrofotómetro de absorção atómica com atomização em chama. .. 36
Figura 2.10: Sistema de atomização em chama com nebulizador e queimador....... 38
Figura 4.1: Carta de controlo de médias ou indivíduos. ........................................... 59
Figura 4.2: Carta de controlo de amplitudes. ............................................................ 59
Figura 4.3: Carta de controlo de somas cumultativas. .............................................. 60
Figura 4.4: 1º teste para detectar pontos fora de controlo. ....................................... 61
Figura 4.6: 3º teste para detectar pontos fora de controlo ........................................ 61
Figura 4.10: 7º teste para detectar pontos fora de controlo. ..................................... 63
Figura 4.11: 8º teste para detectar pontos fora de controlo. ..................................... 63
Figura 4.12: Procedimento de acções correctivas. ................................................... 64
Figura 6.1: Curva de calibração de determinação de nitrato. ................................... 84
Figura 6.2: Análise de resíduos. ............................................................................... 84
Figura 6.3: Avaliação da sensibilidade do método. .................................................. 86
Figura 6.4: Representação gráfica do método de adição padrão para a amostra
0902MAS01. ........................................................................................................... 104
0203VEU04. ........................................................................................................... 105
1802COR01............................................................................................................ 106
0303SIL01. ............................................................................................................. 107
0503SON01. ........................................................................................................... 108
Figura 6.9: Representação gráfica das funções de distribuição. ............................ 123
Figura 6.10: Carta de controlo do estudo da variação dos declives das curvas de
calibração. .............................................................................................................. 123
Figura 6.11: Carta de controlo de amplitudes de um conjunto de triplicados de
amostras de águas residuais. ................................................................................. 127
Figura 7.1: Espectrofotómetro de absorção atómica. ............................................. 130
Figura 7.2: Processo de digestão ácida. ................................................................ 134
Figura 7.3: Curva de calibração de determinação de cobre. .................................. 139
6
Figura 7.4: Análise de resíduos. ............................................................................. 140
Figura 7.5: Avaliação da sensibilidade do método ao longo da gama de trabalho. 141
7
A água: aspectos gerais, elementos quantificados e métodos de análise
1. Introdução
1.1. Entidade de acolhimento

O presente trabalho foi realizado em ambiente empresarial no Laboratório de
Águas e Efluentes (LAE) do Instituto de Desenvolvimento e Inovação Tecnológica
(IDIT).
O LAE está integrado na Unidade de Tecnologias Ambientais do IDIT e
acumulou ao longo dos últimos 15 anos uma sólida experiência em termos de
caracterização e depuração de águas e águas residuais e conta já com uma série
apreciável de intervenções na indústria, câmaras municipais e gabinetes de projecto.
O LAE dedica-se essencialmente à análise de águas, caracterização de
efluentes de origem industrial, análises físico-químicas, controlo de qualidade,
serviços de apoio e acções de formação.
1.2. Objectivo
Este trabalho apresenta como objectivo o estudo e validação de métodos
espectroscópicos de determinação de nitratos e metais em águas naturais e em águas
residuais.
1.3. Estrutura da tese

A tese está estruturada em 8 capítulos. No primeiro capítulo são fornecidas
informações relativas à entidade onde se realizou este projecto, aos objectivos do
trabalho, e à estrutura da dissertação. No capítulo 2, 3, 4 e 5 é apresentada uma
síntese da revisão bibliográfica das matérias abordadas na tese e ainda todos os
conceitos necessários para o desenvolvimento deste trabalho. No capítulo 6 é
fornecida toda a informação relativa ao método de determinação de nitratos,
nomeadamente a parte experimental do trabalho, resultados obtidos na sequência do
processo de validação e respectiva discussão de resultados. No capítulo 7 é possível
encontrar toda a informação acerca dos processos de validação dos métodos de
determinação de metais. As conclusões e recomendações para trabalhos futuros
encontram-se no capítulo 8. Por último, no capítulo 9 listam-se as referências
bibliográficas citadas no texto.
9
2. A Água: aspectos gerais, elementos quantificados e métodos de análise

A água é um recurso natural de elevado valor económico, ambiental e social,
sendo essencial à sobrevivência do homem e dos ecossistemas da Terra. Na
Natureza é a única substância que coexiste nos três estados físicos da matéria, pelo
que ocorrem transferências contínuas de água de um estado para o outro (Heller &
Pádua, 2006).
Estima-se que o volume total de água existente na Terra é de cerca de 1460
milhões de quilómetros cúbicos, distribuídos de forma irregular por rios, oceanos,
aquíferos e lagos. A tabela 2.1 apresenta dados acerca da distribuição da água e
respectivos tempos de residência.
Tabela 2.1: Balanço hídrico global
Volume Volume
Fonte Tempo de residência
(106 km3) (%)
Mares e Oceanos 1370 94 4000 anos
Lagos e Reservatórios 0,13 <0,01 10 anos
Pântanos <0,01 <0,01 1-10 anos
Rios <0,01 <0,01 2 semanas
Humidade do solo 0,07 <0,01 2 semanas -1 ano
Água subterrânea 60 4 2 semanas - 10000 anos
Geleiras (glaciares) 30 2 10-10000 anos
Água atmosférica 0,01 <0,01 10 dias
Água biosférica <0,01 <0,01 1 semana
Fonte: Heller & Pádua (2006).
Cerca de 94% de toda a água encontra-se nos mares e oceanos com um

período de renovação de cerca de 4000 anos. Os oceanos abrigam mais de 97% dos
seres vivos existentes no nosso planeta, são essenciais na biosfera, influenciam o
clima e afectam a nossa saúde e bem-estar (Joyce et al., 2004). As águas
subterrâneas apesar de representarem quase a totalidade da água doce não
congelada, o seu processo de renovação pode demorar até milhares de anos (Heller
& Pádua, 2006).
A directiva 2000/60/CE de 23 de Outubro de 2000 descreve que a água não é
um produto comercial como outro qualquer, mas um património que deve ser
protegido, defendido e tratado como tal. No entanto, ao longo do tempo com o
crescimento da população e o desenvolvimento industrial e agrícola, o seu consumo
aumentou drasticamente (Mendes & Oliveira, 2004). A incessante busca de água com
11
qualidade adequada para diversos fins e a não reposição da mesma contribuiu

significativamente para o actual nível de poluição dos sistemas aquíferos. Por
conseguinte, aquele que era considerado um recurso renovável infinito está a tornar-
se cada vez mais escasso e limitado.
Perante a situação actual, o interesse pela exploração das águas subterrâneas
tem vindo a aumentar a nível mundial. Na França, 60% da água utilizada para
consumo humano é proveniente de águas subterrâneas. (Causapé et al., 2006). Para
além de serem menos susceptíveis de contaminação, relativamente às águas
superficiais, os custos associados à sua protecção são cerca de 10 a 20 vezes
inferiores aos necessários para limpar e regenerar um aquífero poluído. Deste modo,
a protecção das águas subterrâneas tem vindo a ser alvo de particular importância a
nível ambiental, socioeconómico e político. (G. Rasula & M. Rasula, 2000).
Em Portugal, o sector agrícola é aquele que maior pressão exerce sobre a
contaminação das águas superficiais e subterrâneas, o que se deve essencialmente
à utilização de fertilizantes. Estima-se que este sector utiliza um volume de água
compreendido entre 75% e 87% do volume total de água, utilizado em todos os
sectores (REA1, 2007).
2.1. Água para Consumo Humano: Controlo de Qualidade e Legislação

Vigente
Na legislação portuguesa define-se água para consumo humano como sendo
toda a água, no seu estado original ou depois de tratada, destinada a ser bebida, a
cozinhar, à preparação de alimentos, à higiene pessoal ou a outros fins domésticos,
independentemente da sua origem. Inclui ainda, toda a água utilizada na indústria
alimentar, transformação, conservação ou comercialização de produtos ou
substâncias destinados ao consumo humano, assim como, a água utilizada na
limpeza de superfícies, objectos e materiais que podem estar em contacto com os
alimentos. (DL 306/2007).
Actualmente, a sociedade procura assegurar primordialmente a qualidade da
água para consumo humano, dada a sua importância para a saúde e a necessidade
de salvaguardar e promover a sua utilização sustentável (DL 243/2001). Contudo,
existem no Mundo mais de 2,6 biliões de pessoas que carecem de saneamento, e
mais de um bilião contínua a utilizar água imprópria para consumo. Perante esta
1 Relatório do estado do ambiente.

12
situação, morrem cerca de 5 milhões de pessoas por ano, na sua maioria crianças
(Dowbor &Tagnin, 2005).
A fim de assegurar a potabilidade da água para consumo humano, definiram-
se critérios de qualidade que incluem a especificação de parâmetros analíticos, cujos
valores são determinados a partir de estudos rigorosos efectuados pela Organização
Mundial de Saúde. Estes estudos baseiam-se na quantidade máxima de substância
que pode ser absorvida diariamente pelo homem, sem que hajam riscos para a sua
saúde ao longo da vida. A partir desta dose diária, calcula-se a concentração máxima
admissível (CMA) tendo em conta o peso corporal médio, a percentagem de ingestão
total e a quantidade de água ingerida, em média, por dia (OMS).
O decreto de lei 306/2007 entrou em vigor a 1 de Janeiro de 2008 e visa
proteger a saúde humana dos efeitos nocivos resultantes da eventual contaminação
dessa água e assegurar a disponibilização tendencialmente universal de água
salubre, limpa e desejavelmente equilibrada na sua composição. Para tal, são
referidos parâmetros microbiológicos, químicos e indicadores, com os respectivos
valores paramétricos, que deverão ser objecto de controlo periódico e eficiente.
Segundo o DL 236/98 o controlo deve ser efectuado através de um conjunto de acções
de avaliação da qualidade da água, realizadas com carácter regular pela entidade
responsável pela gestão dos recursos hídricos em sistemas naturais ou pela entidade
gestora do sistema de abastecimento de água, do sistema de tratamento de águas
residuais ou da instalação industrial, com vista à manutenção permanente da sua
qualidade em conformidade com a norma ou padrão estabelecido legalmente.
2.2. Águas Residuais: Processo de Tratamento, Controlo de Qualidade e

Legislação Aplicável
As águas residuais são portadoras de substâncias indesejáveis e resultam de
diversas actividades ou ocorrências ligadas à vida do homem. Geralmente
classificam-se as águas residuais de acordo com a sua proveniência, podendo estas
ser de origem doméstica, industrial ou urbana (J. Marques & J. Sousa, 2008). A
legislação portuguesa define águas residuais domésticas como sendo as águas
residuais que provêm de instalações residenciais e serviços, e que resultam
essencialmente do metabolismo humano e de actividades domésticas. Relativamente
às águas residuais industriais refere-se a estas como sendo todas as águas residuais
provenientes de qualquer tipo de actividade e que não possam ser classificadas como
13
águas residuais domésticas ou como águas pluviais. Por último, contempla ainda as
águas residuais urbanas como sendo as águas residuais domésticas ou a mistura
destas com águas residuais industriais ou com águas pluviais (DL 236/1998).
Tanto as águas residuais domésticas como as águas residuais industriais
contêm elementos que, caso sejam depositados directamente nos cursos de água,
em lagos, no mar ou no solo, podem criar graves consequências para o meio
ambiente. Torna-se portanto imprescindível a depuração das águas residuais, que tem
como objectivo a eliminação ou redução de substâncias em suspensão e a eliminação
ou redução de carga orgânica, até limites aceitáveis, de acordo com as características
do meio receptor, de forma a evitar a poluição dos cursos de água e do solo (F. Pita,
2002). O tratamento deste tipo de águas é efectuado em estações de tratamento de
águas residuais (ETAR), onde paralelamente ocorrem acções de avaliação da
qualidade da água, efectuadas pela entidade gestora do sistema de tratamento de
águas residuais.
2.3. Elementos Quantificados em Águas de Consumo Humano e em Águas

Residuais
Ao longo deste trabalho foram analisados alguns elementos em águas de
consumo humano e em águas residuais. Este capítulo apresenta as principais
características destes elementos e dos métodos utilizados na sua determinação.
2.3.1. Nitrato: Origem, contaminação, implicações na saúde humana e

métodos de determinação.
O nitrato é um dos elementos em estudo e foi analisado quer em águas de
consumo humano, quer em águas residuais.
2.3.1.1. A sua Origem: Fonte Natural e Fonte Antropogénica

O azoto foi descoberto por Daniel Rutherford em 1772 (G. Schweitezer & L.
Pesterfield, 2010) e é um elemento químico essencial à subsistência de todos os
organismos vivos, uma vez que contribui para a formação dos aminoácidos e dos
ácidos nucleicos (DNA e RNA) (Torres&Gama, 2005; Schuller, 2004). A atmosfera
contém 78% de azoto molecular (N2) gasoso, no entanto, devido à baixa reactividade
que este possui, não é um elemento abundante na crosta terrestre (J. Lee, 2003; J.
House, 2008).
14
O ciclo do azoto caracteriza-se por trocas constantes de azoto entre a

atmosfera e o solo, os oceanos e os organismos vivos, cuja quantidade estima-se
entre 108 a 109 toneladas por ano (J. Lee, 2003). A figura 2.1 ilustra os principais
processos que ocorrem no ciclo do azoto.
Figura 2.1: Ciclo do azoto2.
As plantas leguminosas apresentam geralmente nódulos nas suas raízes e

possuem a capacidade única de efectuar a fixação biológica do azoto molecular
(Nieuwenhuis&Nieuwelink, 2003). Este processo consiste em converter azoto
molecular em amoníaco e ocorre por acção de bactérias do género Rhizobium, que
ao infectarem as raízes destas plantas, desencadeiam a formação de nódulos, onde
ocorre o armazenamento de azoto. A bactéria fornece azoto à planta que, por sua vez,
disponibiliza nutrientes para o metabolismo bacteriano (Nieuwenhuis&Nieuwelink,
2003; Sprent, 1987; Miessler&Tarr, 2003).
Determinadas plantas leguminosas são frequentemente consumidas pelos
animais. Após a sua colheita, as raízes destas plantas degradam-se nos solos e
libertam compostos orgânicos azotados. Por outro lado, a morte e decomposição dos
animais fazem com que o azoto consumido anteriormente retorne ao solo. Desta
2 Fonte: Chemistry of the environment, Elsevier Science & Technology Books, 2002
15
forma, o azoto presente no solo pode sofrer nitrificação, através da acção de bactérias
nitrificantes, dando origem ao nitrato (S. Krause et al., 2002).
O ião nitrato corresponde à forma mais oxidada e mais estável do azoto. A
elevada solubilidade dos seus sais faz com que este não permaneça em quantidade
apreciável na crosta terrestre, embora existam pequenos depósitos em algumas
regiões desertas (J. Lee, 2003).
A figura 2.2 ilustra os processos naturais e antropogénicos que contribuem para
a formação de nitrato.
Figura 2.2: Formação de nitrato3.
2.3.1.2. Contaminação de Água por Nitrato no Território Português

Actualmente a actividade agrícola é provavelmente a principal fonte
antropogénica de contaminação de nitrato em águas subterrâneas (M. Almasri & J.
Kaluarachchi, 2007). Deste modo, o azoto utilizado nos fertilizantes é o elemento
nutritivo que exerce maior pressão sobre o ambiente (REA, 2007).
Outros nutrientes utilizados em fertilizantes, como o potássio e o fósforo, pelo
facto dos seus iões possuírem carga positiva, têm tendência a formar ligações com as
partículas de carga negativa do solo, ficando ai retidos. Em contrapartida, o ião nitrato
apresenta carga negativa pelo que não fica retido no solo e é facilmente arrastado e
3 Fonte: adaptado de www.microagua.pt/nitratos.htm
16
transportado pela água (rega e precipitação), podendo contaminar os recursos

hídricos subterrâneos ou superficiais (J. Ibanez et al., 2007).
A figura 2.3 ilustra o consumo aparente de fertilizantes inorgânicos na
agricultura, desde o ano 2000 até ao ano 2006, em Portugal.
Figura 2.3: Consumo aparente de fertilizantes inorgânicos na agricultura 4.
Entre 2004 e 2006 ocorreu uma redução do consumo aparente de fertilizantes

azotados, fosfatados e potássicos na agricultura. De 2005 para 2006 verificou-se uma
redução de 16,2% do consumo total, sendo que o decréscimo mais significativo
ocorreu nos fertilizantes azotados (22,1%) (REA, 2007).
O balanço do azoto baseia-se na diferença entre a quantidade total de azoto
(fertilizantes inorgânicos, decomposição atmosférica, fixação biológica e fertilizantes
naturais) disponível para um sistema agrícola e a sua remoção pela agricultura. Este
cálculo fornece informação acerca da fracção que fica potencialmente disponível para
transporte pela água (REA, 2007).
A figura 2.4 representa o balanço do azoto à superfície do solo, em Portugal,
entre o ano 2000 e o ano 2006.
4 Fonte: Relatório do estado do ambiente (REA), 2007

17
Figura 2.4: Balanço do azoto5.
De acordo com a informação ilustrada anteriormente verifica-se que Portugal

passou de um balanço de 44,3 kg azoto/ha em 2000 para 17,0 kg azoto/ha em 2006,
o que é concordante com a informação relativa ao consumo aparente de fertilizantes.
Contudo, ocorrem casos pontuais de poluição gerada por fertilizantes azotados, em
determinadas zonas do país (REA, 2007).
O Decreto-Lei n.º 68/99, de 11 de Março, apresenta como objectivo a redução
da poluição das águas causada ou induzida por nitratos de origem agrícola e impedir
a propagação da referida poluição, com o fim de proteger a saúde humana, os
recursos vivos, os sistemas aquáticos e salvaguardar outras utilizações legítimas da
água (INAG; DL n.º68/69). Na Portaria n.º164/2010 de 16 de Março, são identificadas
zonas vulneráveis, ou seja, áreas que drenam para as águas poluídas ou susceptíveis
de serem poluídas por nitratos e onde se praticam actividades agrícolas que possam
contribuir para a poluição das mesmas. Em 2010 o governo alargou a protecção a
duas novas áreas, passando de uma área total de 3,336km2 (2007) para uma área
total de 3,711 km2 de terra cultivável.
2.3.1.3. Consumo de Nitrato: Implicações na Saúde Humana

A absorção de nitrato no corpo humano ocorre através da ingestão de vegetais,
carne ou água (World Health Organization - WHO). Cerca de 25% do nitrato ingerido
é recirculado na saliva, sendo que 20% deste é convertido em nitrito pela acção de
5 Fonte: Relatório do estado do ambiente, 2007

18
bactérias presentes na boca (WHO, Shao-Ting et al., 2007). O ião nitrito é

relativamente tóxico devido à sua interacção com a hemoglobina. A sua presença no
sangue provoca a oxidação do ferro (II) a ferro (III), formando a metemoglobina que
não é capaz de efectuar o transporte de oxigénio (metemoglobinemia). Este processo
de redução ocorre essencialmente em crianças, uma vez que o elevado pH do seu
estômago cria condições favoráveis ao desenvolvimento de microrganismos nitrato-
redutores (S.Krause et al., 2002).
O nitrito resultante do processo de redução pode ainda reagir com aminas
primárias presentes no corpo humano para formar compostos N-nitroso. Alguns
destes são considerados carcinogénicos para o Homem.
Têm sido realizados diversos estudos no sentido de relacionar o consumo de
nitrato com o cancro do estômago, má formação congénita e diabetes. Contudo, não
se conseguiu provar uma relação evidente entre o seu consumo e as doenças
referidas.
Na legislação Portuguesa o valor paramétrico para o nitrato corresponde a 50
mgL-1 NO3. Considera-se que, acima deste valor, o seu consumo pode ser nocivo para
a saúde humana.
2.3.1.4. Métodos de Determinação de Nitrato

Actualmente a concentração excessiva de nitrato no meio ambiente constitui
um grave problema para a saúde pública, tornando-se fundamental o uso de métodos
eficazes na sua determinação. Foram desenvolvidos inúmeros métodos para a sua
determinação em água, contudo, qualquer um destes está sujeito a interferências e
outras limitações, sendo necessário avaliar qual o método que melhor se adapta aos
objectivos pretendidos.
Os principais métodos utilizados na determinação de nitratos em água são
baseados nas técnicas de cromatografia iónica, redução em coluna de cádmio,
espectrofotometria e potenciometria com eléctrodo selectivo. A cromatografia de
permuta iónica permite a determinação de iões através de resinas de permuta iónica,
cujo mecanismo baseia-se no equilíbrio de permuta entre iões em solução e iões do
mesmo sinal à superfície da resina. Quando se pretende determinar aniões utilizam-
se resinas constituídas por aminas terciárias ou primárias (M. Gonçalves, 1996,
Skoog, 2008).
19
A redução em coluna de cádmio refere-se ao processo de redução do nitrato a

nitrito através da passagem da solução por uma coluna de cádmio. O nitrito formado
é detectado espectroscopicamente após processo de diazotização, no qual se forma
um corante rosa avermelhado (N. Raikos et al., 1988; American Public Health
Association, 2005).
A potenciometria com eléctrodo selectivo permite a determinação da
concentração de espécies químicas em amostras e baseia-se na comparação entre o
valor da diferença de potencial (d.d.p) desenvolvida entre um par de eléctrodos,
mergulhados na solução a analisar, e a d.d.p. que é desenvolvida entre o mesmo
conjunto de eléctrodos em soluções padrão da mesma espécie. O eléctrodo selectivo
a anião nitrato é um eléctrodo selectivo de membrana líquida, que contém um
composto orgânico que se liga selectivamente ao ião a que o eléctrodo é sensível (J.
A. Rodrigues et al., 2006).
A determinação espectrofotométrica baseia-se na reacção entre o nitrato e o
2,6-dimetilfenol para formar um composto corado com absorção máxima a 324 nm.
A tabela 2.2 apresenta as principais características, vantagens e desvantagens
das técnicas enunciadas.
Tabela 2.2: Vantagens e desvantagens dos principais métodos de determinação de nitrato.
Método Características Vantagens Interferentes/Desvantagens

- Matéria Orgânica.
- Substâncias com TR idênticos à
Cromatografia de - Gama de trabalho: - Baixo L.D. espécie que se pretende
permuta iónica de 0,42 a 14,0 mg/L. - Volume de determinar.
(EPA 300,0) amostra reduzido. - Ião acetato.
- Amostras com partículas
suspensas > 0,45 µm
- Gama de trabalho: - Cor/ turbidez.
Método de redução - Baixo L.D.
de 0,01 a 1,00 mg - Matéria suspensa.
em coluna de - Possibilidade de
NO3-N/L. - Óleos e gorduras.
cádmio (SWEWW reactivação do
- Absorção a 543 - Cloro residual.
4500 NO3- E) cádmio.
nm. - Pouco viável economicamente.
- Os iões de Cl- interferem quando a
- Rapidez e
sua concentração é 10 vezes
Simplicidade,
Método do superior à concentração de nitrato.
- Gama de trabalho: desde que o pH e
eléctrodo selectivo - Os iões bicarbonato interferem
de 1 a 1000 mg NO3- a força iónica da
(SMEWW 4500 quando a sua concentração é 5
/L solução se
NO3- D) vezes superior à concentração de
mantenham
nitrato.
constantes.
- NO2-, CN-, S2- ,Br-, I-, ClO3-, ClO4-.
20
Continuação da tabela 2.2:
Método Características Vantagens Interferentes/Desvantagens

Os iões NO2- interferem a
- Rapidez e
Determinação - Gama de trabalho: concentrações superiores a 0,5
Simplicidade.
espectrofotométrica de 1 a 110 mg NO3- mg/L, e os iões Cl- interferem a
- Baixo custo dos
directa /L. concentrações superiores a 50
reagentes.
mg/L.
Fonte: N. Raikos et al., 1988; American Public Health Association, 2005.
A escolha do método ideal deve ter em conta a gama de trabalho adequada,

bem como, as interferências, vantagens e desvantagens associadas a cada um dos
métodos.
Método de Redução em Meio Ácido

O método de determinação de nitrato que foi objecto de estudo neste trabalho
é um método relativamente recente, rápido, simples e económico (S. MIR, 2008). O
método divide-se em 3 fases: redução de nitrato em meio ácido, processo de
diazotização e detecção por espectroscopia de absorção molecular.
O processo de redução de nitrato a ácido nitroso é efectuado através da adição
de ácido clorídrico concentrado. O ácido nítrico formado é um oxidante muito forte,
pelo que supõe que será facilmente reduzido a ácido nitroso. O processo é traduzido
pelas duas equações químicas seguintes:
KNO3 (aq) + HCl (aq) → KCl (aq) + HNO3 (aq)

HNO3 (aq) + 2HCl (aq) → Cl2 (g) + HNO2 (aq) + H2O (l)
Equação 1 e 2: Formação de ácido nítrico e redução a ácido nitroso.
O ácido nitroso não é estável em solução, no entanto, aquando da sua

formação, desencadeia o processo de diazotização, a elevada temperatura, da
sulfanilamida adicionada no início do processo. A diazotização ocorre em meio ácido
e dá origem a um diazo composto. O processo descrito é traduzido pela seguinte
equação química:
21
+
NH2 N N
(aq) + NO2- (aq) + 2H+ (aq) (aq) + 2H2O (l)
SO2NH2 SO2NH2
sulfanilamida diazo composto
Equação 3: Diazotização da sulfanilamida.
A amina aromática diazotizada sofre facilmente ataque nucleófilo, após adição

do dicloridrato de N-(1-naftil)etilenodiamina (NEDA), dando origem a um corante azo
vermelho-violeta. A equação seguinte descreve este processo:
+ +
Cl NH2(CH2)2NH3Cl
-
+ + + -
N N Cl NH2(CH2)2NH3Cl
(aq) + (aq) N N (aq)
SO2NH2 NED
A
SO2NH2
corante azo
Equação 4: Ataque nucleófilo a uma amina aromática diazotizada.
O corante formado absorve radiação a 540 nm. A radiação emitida é detectada

por espectroscopia de absorção molecular.
22
Espectroscopia de Absorção Molecular do Visível e Ultravioleta
Absorção de Radiação
A espectroscopia de absorção molecular baseada na radiação ultravioleta e
visível é uma das ferramentas mais úteis e mais utilizadas, em análise quantitativa,
por todo o mundo (Skoog et al., 1998).
A radiação electromagnética consiste na propagação de ondas
electromagnéticas, sendo que apenas uma pequena parte é detectada pelo olho
humano, como luz. A radiação electromagnética é constituída por uma campo
magnético e um campo eléctrico, que se movimentam perpendicularmente um ao
outro, na direcção da propagação de energia (H. Gϋnzler & A. Williams, 2001).
Numa onda electromagnética o comprimento de onda (λ) e a frequência (υ)
estão relacionados com a energia de um fotão (E), através da constante de Plank
(h=6,62 x 10-34) e da velocidade de energia radiante no vácuo (c=3,0x108 m/s) (P.
Patnaik & J. Dean, 2004), segundo a equação E=hυ=h(c/λ).
Existem vários tipos de radiação presentes no espectro electromagnético,
classificados segundo a respectiva frequência de onda (H. Gϋnzler & A. Williams,
2001). A figura seguinte apresenta o espectro electromagnético.
Figura 2.5: Espectro electromagnético.
A absorção de radiação por moléculas orgânicas resulta das interacções entre

os fotões e os electrões que formam as ligações químicas. O comprimento de onda
23
no qual uma molécula orgânica absorve está relacionado com a intensidade das suas
ligações químicas (Skoog et al., 1998).
É possível dividir as moléculas orgânicas em quatro grupos, que representam
a maioria das transições electrónicas estudadas (M. Gonçalves, 1996). O primeiro
grupo é constituído pelas moléculas que apenas possuem átomos de carbono e
átomos de hidrogénio. Nos compostos que apresentam apenas ligações simples é
necessário fornecer uma elevada quantidade de energia, da zona do ultravioleta de
vácuo (< 200 nm), para quebrar uma ligação química e passar de uma orbital σ ligante
para uma orbital σ* anti-ligante (transição σ → σ*) (M. Gonçalves, 1996; F. Settle,
1997). Por outro lado existem os hidrocarbonetos insaturados, por exemplo o
propileno, que possui uma ligação Π. Como a força de ligação dos electrões Π ligantes
é menor, estes podem passar para níveis de energia superiores, orbitais Π* anti-
ligantes, sem que ocorra a ruptura completa da molécula. Devido às transições Π →
Π* os hidrocarbonetos com ligações duplas absorvem radiação na região do
ultravioleta - visível (200 a 700 nm).
Nas moléculas em que existem ligações duplas e simples alternadas ocorre
deslocalização electrónica. Quanto maior for o número de ligações duplas conjugadas,
mais estáveis serão as moléculas, maior será o efeito de deslocalização e menor será
a energia necessária fornecer para que as transições Π → Π* ocorram. Deste modo,
a banda de absorção desloca-se para a zona de maiores comprimentos de onda.
Compostos que possuam dez ou mais ligações duplas alternadas, possuem cor (M.
Gonçalves, 1996).
As moléculas orgânicas podem ainda conter grupos orgânicos insaturados que
absorvem nas regiões do ultravioleta e visível, designados por grupos cromóforos
(Skoog et al.,1998). Na tabela 2.3 são apresentados alguns dos grupos cromóforos
existentes.
Ocorrem ainda transições n → Π* quando as moléculas apresentam electrões
não ligantes. Estas transições ocorrem na região dos 200-700 nm (M. Gonçalves,
1996; F. Settle, 1997).
A figura 2.6 representa os níveis electrónicos existentes e as transições
electrónicas efectuadas.
24
Tabela 2.3: : Grupos cromóforos comuns nas regiões do ultravioleta e visível 6.
Grupo Estrutura Transições

Acetileno >C≡C< Π → Π*
Π → Π*
Amida – CONH2
n → Π*
Π → Π*
Carbonilo >C=O
n → Π*
Π → Π*
Carboxilato – COO-
n → Π*
Π → Π*
Ester – COOR
n → Π*
Olefina >C=C< Π → Π*
Π → Π*
Nitro – NO2
n → Π*
Π → Π*
Imina >C=N–
n → Π*
Figura 2.6: Níveis electrónicos e transições electrónicas das moléculas 7.
Lei de Lambert-Beer
A lei de Lambert-Beer é fundamental para todos os tipos de absorção de
radiação electromagnética e demonstra que, para uma dada substância a um
determinado comprimento de onda, a absorvância é directamente proporcional à
concentração da espécie que absorve radiação (R. Kellner et al., 2004; M. Gonçalves,
1996). A equação 2.1 traduz a lei enunciada:
6, 7 Fonte: Adaptado de F. Settle, 1997.
25
A  a b c (2.1)
A absorvância (A) é dada pelo logaritmo da razão entre a intensidade da

radiação incidente (I0) e a intensidade da radiação após absorção (I), e relaciona-se
com a concentração de determinada espécie através da absortividade (a) e do
percurso óptico (b). A absortividade é directamente proporcional à área de captura
associada a uma determinada partícula, e designa-se por absortividade molar (ε)
quando a concentração é expressa em moles por litro. O percurso óptico (b)
corresponde à espessura da substância (M. Gonçalves, 1996; F. Settle, 1997; P.
Patnaik, 2004).
Contudo, a relação linear existente entre a absorvância e a concentração deixa
de ser válida caso ocorram desvios à lei de Lambert-Beer. Estas alterações ocorrem,
por exemplo, quando a concentração do analito é elevada (c ≥ 0,10 molL-1) ao ponto
de fazer variar o índice de refracção, alterando o valor da absortividade (R. Kellner et
al., 2004; P. Patnaik, 2004; M. Gonçalves, 1996).
Um outro desvio à Lei de Beer é observado quando as medições são
efectuadas sem a utilização de radiação monocromática. A não utilização da mesma
origina uma perda de resolução que se reflecte negativamente na linearidade entre a
absorvância e a concentração (R. Kellner et al., 2004).
Por último, temos os desvios químicos que podem resultar da existência de
uma reacção química que provoca a variação da concentração da espécie absorvente
em solução. A alteração do pH e da força iónica do sistema pode contribuir para
alterações a nível reaccional, pelo que não deve ser efectuada (P. Patnaik, 2004 ; M.
Gonçalves, 1996).
Equipamento
O espectrofotómetro é o equipamento utilizado neste método. Actualmente é
constituído por cinco componentes principais: Fontes de radiação, monocromador,
porta células com as células, detector e amplificador (M. Gonçalves, 1996; Skoog et
al., 1998).
A fonte de energia utilizada para medições na região do visível do espectro é
uma lâmpada de filamento de tungsténio incandescente. Na região do ultravioleta esta
26
lâmpada é substituída por um tubo de descarga de hidrogénio ou deutério (R. Kellner

et al., 2004)
O monocromador é composto por um conjunto de fendas e lentes, juntamente
com um prisma ou rede de difracção que realizam a dispersão da radiação, conforme
ilustrado na figura 2.7:
Figura 2.7: Monocromador8.
Neste caso o monocromador é constituído por uma rede de difracção. A

radiação entra pela fenda de entrada e é colimada através de uma lente, incidindo na
rede de difracção. Após a dispersão da radiação ocorre a sua focagem para a fenda
de saída.
Girando-se a rede de difracção é possível incidir na fenda de saída diferentes
comprimentos de onda (Skoog et al.,1998).
Em espectroscopia utilizam-se normalmente células de vidro ou de quartzo, e
possuem um percurso óptico de 1 cm, embora possam também ser utilizadas células
de 0,1 cm e células de 10 cm.
No final do percurso da radiação, aparece o detector que converte a radiação
em sinal eléctrico e que deve ser sensível, rápido, produzir um sinal eléctrico que
possa ser facilmente amplificado e que apresente pequeno ruído de fundo.
Actualmente, utilizam-se como detectores a célula fotoeléctrica e o fototubo
(fotomultiplicador).
8 Fonte: http://www.chemicool.com/definition/wavelength_selectors.html
27
2.3.2. Metais: Origem, contaminação, implicações na saúde humana e

método de determinação.
Neste trabalho os metais em estudo foram o chumbo, o cobre, o zinco e o
níquel. As suas análises foram efectuadas apenas em águas residuais.
2.3.2.1. Chumbo: Aspectos Gerais

O chumbo, palavra proveniente do latim plumbum, é um metal utilizado desde
a antiguidade e foi um dos primeiros a ser manuseado pelo Homem. É conhecido
desde 3500 a.C., segundo descobertas arqueológicas efectuadas no Egipto (S. Watt,
2002).
O chumbo é um metal pesado (ρ=11,34 gcm-3), de cor branca-azulada, tóxico,
macio, altamente maleável e possui baixa condutividade eléctrica. Pertence ao 14º
grupo da tabela periódica com o número atómico 82, massa atómica de 207,19 uma
e pontos de fusão e ebulição a 327,5 ºC e 1740 ºC respectivamente. O chumbo de
origem natural consiste em 52% de 208Pb, 24% 206Pb, 23% 207Pb e 1% de 204Pb (J.
Lee, 2003 ; J.Casas & J. Sordo, 2006).
Apesar de corresponder ao 36º elemento mais abundante na crosta terrestre,
nos últimos 50 anos, tem vindo a ser extraído, acumulado, utilizado pelo Homem e
reemitido para o meio ambiente (E. Merian, 1991).
O chumbo é normalmente extraído dos seus minerais, principalmente do
sulfureto de chumbo (PbS), e é utilizado essencialmente na produção de gasolina,
tintas, placas, tubos, vidros cristal, vidros lapidados, soldas e algumas baterias e
acumuladores (J. Lee, 2003, Dietert, 2004).
A maior parte do chumbo que se encontra na atmosfera resulta do processo de
combustão da gasolina. Vários estudos indicam que o tráfego automóvel é
responsável por cerca de 90% do total de emissões de chumbo para a atmosfera (E.
Merian, 1991; R. Harrison & D.Laxen, 1984).
A contaminação da água residual por chumbo deve-se sobretudo à queda de
poeiras que contém chumbo e que atingem os sistemas de drenagem de águas
pluviais. Contudo, a sua dispersão não é homogénea, estudos realizados nos EUA
demonstram que a concentração de chumbo presente na água, quer precipitado ou
dissolvido, depende da densidade de tráfego automóvel, das emissões industriais e
dos factores climáticos, de um determinado local (E. Merian, 1991).
28
O chumbo é absorvido pelo corpo humano por via pulmonar, digestiva ou

cutânea. A via pulmonar é a que apresenta um maior risco, uma vez que, 35% a 50%
do chumbo inalado pode ser absorvido pelo sangue (Factor segurança, 2006).
Estão mais sujeitos ao risco de intoxicação os trabalhadores expostos aos seus
vapores, fumos ou poeiras. Sendo também determinante, a idade, a condição do
paciente, a quantidade absorvida e o tempo de exposição (Factor segurança, 2006;
F. Moreira & J. Moreira, 2004).
Os riscos associados à exposição ao chumbo consistem numa possível
intoxicação aguda ou intoxicação crónica. A intoxicação aguda é rara e apenas ocorre
sob doses elevadas, enquanto a intoxicação crónica (saturnismo), mais comum,
caracteriza-se por alterações ao nível do sistema nervoso, renal, cardiovascular e
hematológico (F. Moreira & J. Moreira, 2004; Dietert, 2004).
2.3.2.2. Cobre: Aspectos Gerais

O cobre foi provavelmente o primeiro metal a ser utilizado pelo homem. A sua
datação remonta ao ano 3500 aC., época em que os egípcios utilizavam o cobre para
fazer ferramentas, tigelas, pregos e canos. Investigações realizadas indicam que o
cobre era obtido através da redução do carvão, presente nas minas de cobre (G.
Schweitzer & L.Pesterfield, 2010).
O cobre é um metal pesado (ρ=8,93 gcm-3), corresponde ao 25º elemento mais
abundante na crosta terrestre, pertence ao 11º grupo da tabela periódica com o
número atómico 29 e uma massa atómica de 64 uma. O metal de cor avermelhado
apresenta um ponto de fusão de 1083 ºC e um ponto de ebulição de 2590 ºC. O cobre
é um dos melhores condutores de calor e de electricidade e consiste numa mistura
isotópica de 69.1% de 63Cu e 30.9% 65Cu (E. Merian, 1991; J. Lee, 2003).
Os compostos de Cu(I) e Cu(II) apresentam propriedades muito diferentes do
metal (Cu). Actualmente, praticamente não existe cobre na sua forma natural, estando
este presente nos seus minerais. Os mais comuns são a calcopirita (CuFeS2), a
calcocita (Cu2S), o óxido cuproso Cu2O (cuprita, vermelho rubi), o carbonato básico
de cobre CuCO3.Cu(OH)2 (malaquita, verde) e a burnita Cu5FeS4 (mistura de cores
iridescentes) (E. Merian, 1991).
Actualmente o cobre ainda é intensivamente utilizado em diversas funções.
Para além da elevada aplicação em sistemas eléctricos, é também muito utilizado em
canalizações, na construção de telhas, como agente precipitante de selénio, em
29
corantes, fungicidas, catalisadores, na produção de diversas ligas metálicas e

equipamento farmacêutico (J. Lee 2003; E. Merian, 1991).
A importância de determinado elemento no solo resulta sobretudo da sua
abundância na crosta terrestre e da sua mobilidade geoquímica. No entanto, o cobre
faz parte de inúmeros materiais utilizados pelo Homem, sendo estes depositados
normalmente no solo, tornando-se hoje difícil encontrar uma área, quer rural, quer
urbana, que não seja abrangida pela sua contaminação (A. Ribeiro, 1992). O metal é
especialmente retido em solos ricos em matéria orgânica, devido à formação de
complexos estáveis, através das reacções com os grupos COOH e OH fenólicos (C.
Costa, 2004).
O cobre é também um dos metais responsáveis pela poluição hídrica (A.
Ribeiro, 1992). As principais fontes de contaminação consistem no processo de
corrosão de instalações hidráulicas prediais, erosão de depósitos naturais e
preservantes de madeira. As principais consequências associadas à ingestão de água
contaminada com cobre resultam de problemas gastrointestinais (para exposição de
curta duração) e danos no fígado ou rins (L. Heller & V. Pádua, 2006).
É um metal essencial à sobrevivência dos organismos pois participa em
processos biológicos cruciais, como co-factor enzimático, e essencialmente, por
transportar electrões em reacções de oxidação/redução na fotossíntese. Contudo,
quando acumulado pelo organismo em concentrações elevadas, inibe processos
fisiológicos importantes, afectando o crescimento e a reprodução (R. Moraes et al.,
2001).
2.3.2.3. Zinco: Aspectos Gerais

Não há registo da época em que o Zinco foi descoberto, no entanto, consta-se
que este metal foi utilizado na China e na Índia, durante a época medieval (K. Lew,
2008). Durante centenas de anos utilizou-se o zinco através do bronze, uma liga
metálica constituída por zinco e cobre, embora não houvesse consciência da mistura
dos dois metais (AGA, 2006). Apenas em 1746, o cientista alemão Andreas Marggraf
identificou o zinco como sendo um elemento (E. Merian, 1991; K. Lew, 2008).
O zinco, do alemão zink, é um metal de transição de aspecto branco azulado
que corresponde ao 24º elemento mais abundante na crosta terrestre. É um metal
pesado (ρ=7,14 gcm-3), sólido à temperatura ambiente, pertence ao 12º grupo da
tabela periódica, com o número atómico 30 e massa atómica 65,4 uma. Possuí um
30
ponto de fusão de 420ºC e um ponto de ebulição de 907 ºC (J. Lee, 2003; K. Lew,
2008; E. Merian, 1991).
Quando se formou a terra, o zinco foi depositado na forma de sulfureto (ZnS).
A sua meteorização hidrotermal desencadeou a formação de importantes depósitos
de carbonatos e silicatos. A hemimorfita Zn4(OH)2(Si2O7).H2O apesar de menos
importante do ponto de vista económico, é um exemplo interessante de pirossilicato
(J. Lee, 2003).
O zinco é utilizado sobretudo no revestimento de objectos de ferro, a fim de
evitar a sua corrosão, na produção de ligas metálicas, destacando-se o bronze, na
fundição de peças metálicas, como eléctrodo negativo nas pilhas secas e como
pigmento branco em tintas (ZnO) (E. Merian, 1991; J.Lee, 2003; AGA, 2006).
Exerce um papel fundamental em diversas enzimas, sendo do ponto de vista
biológico, o segundo elemento de transição mais importante (J. Lee, 2003). Após o
ferro, é o zinco que está presente em maior quantidade no nosso organismo. Acredita-
se que regula a comunicação entre células do cérebro (T. Crook & B. Adderly, 1998).
Como elemento vital, considera-se que do ponto de vista da saúde pública, é lhe dado
pouca importância. A utilização de adubo artificial tem contribuído para que as plantas
não possuam micro-elementos essenciais, ficando assim desprovidas de zinco, o que
afecta consequentemente toda a cadeia alimentar (M. Uyldert, 1997).
As principais fontes de emissão de zinco são as siderúrgicas e fundições,
processos de combustão, tráfego de veículos, produção de borracha, o óleo do motor
e os gases de escape (J. Gutberlet, 1996).
Os resíduos de zinco são depositados em grandes quantidades na água. A sua
contaminação é especialmente nociva para os peixes, uma vez que, o seu sistema
respiratório manifesta lesões citológicas ao efeito tóxico deste metal. Geralmente, os
níveis elevados de zinco na água resultam da intensa urbanização e da poluição
industrial (J. Gutberlet, 1996).
A dose diária de zinco adequada para o homem é de 15 miligramas e para a
mulher é de 12 miligramas (T. Crook & B. Adderly, 1998). O excesso de zinco pode
afectar o sistema imunológico e a absorção de cobre, ferro e cálcio, pode também
contribuir para o aparecimento de anemia, aumento de leucócitos e a febre de zinco
provocada pela inalação de pó de óxido de zinco (J. Gutberlet, 1996; T. Crook & B.
Adderly, 1998).
31
2.3.2.4. Níquel: Aspectos Gerais

O Níquel corresponde ao vigésimo segundo elemento mais abundante na
crosta terrestre e é produzido em grandes quantidades (J. Lee, 2003). O seu nome
provém da época medieval, altura em que na região da Europa central, os
escavadores das minas ansiavam pela busca de cobre e prata. Por vezes, tal não
acontecia e inconscientemente adquiriam níquel. Ao se aperceberem do engano
durante a sua fundição, atribuíam a culpa aos deuses da montanha, os níqueis. As
piritas de níquel vermelho, muito idênticas ao cobre, eram designadas por
“Kupfernickel” (M. Uyldert, 1997).
É um metal pesado (ρ=8,91 gcm-3), branco prateado, extremamente brilhante,
maleável e dúctil. Corresponde na tabela periódica ao número atómico 28, massa
atómica 58,7 uma e apresenta um ponto de fusão e um ponto de ebulição de 1,455
ºC e de 2,920ºC respectivamente. O Ni (II) tem tendência a formar vários complexos,
que geralmente são quadrados ou octaédricos. Em estados de oxidação mais
elevados são instáveis (A. Stimola, 2007; J. Lee, 2003).
Os minerais de níquel de maior valor económico são os sulfuretos, que
normalmente estão misturados com sulfuretos de ferro ou cobre, e depósitos de
silicatos e óxidos/hidróxidos. O mineral mais importante é a pentlandita (Fe,Ni) 9S8,
com uma proporção de Fe:Ni de 1:1 (J. Lee, 2003).
O níquel é um elemento que faz parte de mais de 3000 ligas metálicas,
utilizadas em diversos fins, desde utensílios de cozinha e equipamento anti-corrosivo
até ao uso em joalharias. É também utilizado em galvanoplastia, na produção de
baterias de níquel/cádmio, em hastes de soldadura, tintas para pinturas e cerâmicas,
em moldes para recipientes de cerâmica e de vidro, próteses dentárias, componentes
informáticos, fitas magnéticas, e em catalisadores de níquel (E. Merian, 1991; S.
Williams, 2005; P. Udeh, 2004).
Este metal desempenha um papel crucial, uma vez que activa a urease, uma
enzima presente no homem, plantas e animais. É particularmente activa nas folhas e
contribui para a formação de amoníaco e dióxido de carbono, a partir de ureia (E.
Malavolta et al., 2000).
O níquel entra na atmosfera através de fontes naturais (actividade vulcânica),
combustão de combustíveis fósseis, processos industriais e incineração de resíduos
(E. Merian, 1991).
32
A contaminação da água subterrânea e da água superficial com níquel ocorre

através da desintegração de rochas e solos, precipitação, ciclos biológicos e
principalmente pela actividade industrial. Metade da quantidade de níquel que se
encontra em águas fluviais está na forma iónica, enquanto a outra parcela é
constituída por diversos complexos estáveis de níquel (E. Merian, 1991).
Para além do níquel apresentar baixa toxicidade relativamente a outros metais
(zinco, manganês e crómio), não se acumula nos tecidos humanos. Considera-se que
o níquel pode ser nocivo à saúde humana quando a sua dose diária ultrapassa os 250
miligramas. Se tal se suceder, mas apenas por curtos períodos de tempo, não há
indícios da ocorrência de problemas de saúde. Contudo, se a exposição a este metal
for de longa duração, há registo de alguns problemas de saúde, tais como: problemas
respiratórios, dermatites, dermatoses, alergias na pele e cancro (naso faringe) (P.
Udeh, 2004; P. Williams et al., 2000; P. Madoni, 1999).
2.3.2.5. Espectroscopia de Absorção Atómica

A espectroscopia de absorção atómica é um método analítico com elevada
selectividade e que se baseia na absorção de energia pelos átomos de determinado
elemento, que se pretende quantificar. É uma das técnicas mais utilizadas
mundialmente, em diversas aplicações (F. Settle, 1997; R. Kellner et al., 2004).
Relativamente à espectroscopia de emissão atómica, a espectroscopia de
absorção atómica é uma técnica recente, tendo sido descrita por Walsh em 1955 (R.
Kellner et al., 2004). Dez anos mais tarde construiu-se o primeiro aparelho e
actualmente determinam-se cerca de 60 a 70 elementos, havendo vários tipos de
aparelhos comerciais (M. Gonçalves, 1996).
A técnica baseia-se na absorção de radiação, de intensidade definida e
comprimento de onda específico, na zona do visível ou ultravioleta, pelos átomos
neutros de determinado elemento, dando origem a uma transição electrónica entre o
nível E e o nível E+hυ. A intensidade desta transição está relacionada com a
concentração dos átomos no estado fundamental, de acordo com a seguinte
expressão:
T=P/P0 (2.2)
33
Em que T é a transmitância, P é a energia da fonte luminosa que atravessou a

amostra e P0 é a energia da fonte luminosa antes de atravessar a amostra. Na
espectroscopia de absorção atómica a absorvância relaciona-se com a transmitância
através da seguinte expressão (F. Settle, 1997):
A = -log T = -log P/P0 = log P0/P = log 1/T=abc (2.3)
Assim, pode chegar-se à lei de Lambert Beer:
A= log 1/T=abc (2.4)
Em que o coeficiente a é conhecido como absortividade e tem um valor

característico para cada elemento e cada conjunto de parâmetros instrumentais, entre
os quais o comprimento de onda. Neste caso, o valor de c refere-se à concentração
dos átomos na chama. Este valor é proporcional à concentração da solução aspirada
através do valor do caudal de aspiração (M. Gonçalves, 1996).
Na espectroscopia de absorção atómica com atomização em chama, a chama
que contém os átomos absorventes actua como uma célula com determinada
espessura (b), que pode sofrer pequenas variações devido a flutuações na chama (M.
Gonçalves, 1996).
Equipamento
O equipamento utilizado em espectroscopia de absorção atómica possui os
mesmos componentes básicos que um espectrofotómetro que mede a absorção
molecular de soluções, sendo a fonte e a célula de absorção as principais diferenças
entre os dois. Os aparelhos de absorção atómica são constituídos pelos seguintes
sistemas: sistema de emissão, sistema de absorção, sistema de selecção e sistema
de detecção (M. Gonçalves, 1996).
O sistema de emissão consiste numa fonte de radiação, cuja radiação emitida,
é absorvida pelos átomos da amostra. As fontes de radiação utilizadas são: as
lâmpadas de cátodo oco, lâmpadas de descarga de vapor, lâmpadas para
multielementos e lâmpadas de descarga sem eléctrodos (E.D.L.). Neste trabalho,
utilizou-se uma lâmpada de cátodo oco para cada metal analisado.
34
A lâmpada de cátodo oco é revestida por vidro e é enchida com um gás inerte,
normalmente néon, árgon ou ocasionalmente hélio a uma pressão de 1 a 5 torr. É
constituída por um cátodo oco revestido pelo metal de interesse e um ânodo
constituído por um fio metálico. Aplica-se uma voltagem entre o ânodo e o cátodo de
cerca de 500 V com uma corrente que vai de 2 a 30 mA. O gás inerte é ionizado no
ânodo e os iões de carga positiva produzidos são acelerados em direcção ao cátodo,
fazendo com que este liberte átomos do metal. O vapor atómico do metal ao ser
excitado por colisões com os átomos do gás inerte emite a sua radiação característica
(F. Settle, 1997). A figura 2.8 apresenta uma lâmpada de cátodo oco.
Figura 2.8: Lâmpada de cátodo oco9.
O sistema de absorção engloba todos os sistemas e acessórios que estão

envolvidos na produção de vapor atómico. Nos equipamentos que possuem
atomizador de chama o sistema de absorção é constituído essencialmente pela
chama, queimador, pulverizador, capilares, tubos ou sistemas de injecção,
reguladores e manómetros para controlar a pressão dos gases e chaminé (M.
Gonçalves, 1996).
O sistema de selecção refere-se ao equipamento para selecção espectral que
inclui principalmente filtros, rede de difracção, monocromadores, fendas e lentes (M.
Gonçalves, 1996).
Por último, existe o sistema de detecção que é constituído por sistemas de
fotodetecção (fotodetectores não multiplicadores e fotomultiplicadores) e de medida.
9 Fonte: F. Settle, 1997.

35
Deste faz parte, todo o equipamento necessário para a alimentação do

fotomultiplicador, amplificação, entre outros (M. Gonçalves, 1996).
A figura 2.9 ilustra um modelo do equipamento de espectroscopia de absorção
atómica com atomização em chama, onde estão descritos os seus principais sistemas.
Figura 2.9: Espectrofotómetro de absorção atómica com atomização em chama10.
Sistema de atomização no método de chama

Na atomização em chama, a amostra é inicialmente convertida numa névoa
fina, constituída por pequenas gotas de solução. O processo é realizado num
nebulizador idêntico ao apresentado na figura 2.10.
No final do tubo capilar imerso na amostra, a amostra é aspirada numa câmara
de spray através de um fluxo de gases de combustão, a elevada pressão. O impacto
da amostra com a pérola de impacto de vidro (figura 2.10) produz um aerossol que
posteriormente se mistura com os gases de combustão na câmara de spray, antes de
passar ao queimador. No queimador, a energia térmica da chama origina um aerossol
seco com pequenas partículas sólidas, que são depois volatilizadas pela energia
térmica, produzindo um vapor constituído por espécies moleculares, espécies iónicas
e átomos livres (D. Harvey, 2000).
A energia térmica na atomização em chama é fornecida pela combustão de
uma mistura de combustível/oxidante. Na tabela 2.4 resumem-se as temperaturas das
várias chamas, mais vulgarmente utilizadas em absorção atómica.
10Fonte: Adaptado de “The Lind Group” (http://hiq.linde-

gas.com/international/web/lg/spg/like35lgspg.nsf/docbyalias/anal_abs)
36
Para os elementos que se vaporizam facilmente em chamas de temperatura

baixa, poucas são as vantagens das chamas de oxigénio/hidrogénio,
oxigénio/acetileno, oxigénio/cianogénio ou acetileno/óxido nitroso, sendo antes
vantajosa a chama ar/acetileno (M. Gonçalves, 1996).
O uso de oxigénio ou óxido nitroso, em vez de ar, aumenta a temperatura da
chama, o que é particularmente útil para elementos que formam compostos que não
se dissociam a temperaturas baixas. Contudo, a chama mais utilizada em absorção
atómica é a de ar/acetileno, uma vez que, para a maioria dos elementos tem uma
temperatura apropriada para a sua atomização (M. Gonçalves, 1996).
Tabela 2.4: Características das diversas chamas11.
Comburente Combustível Gama de temperatura ºC

Ar Gás natural 1700-1900
Ar Metano Cerca de 1900
Ar Propano Cerca de 1950
Ar Hidrogénio 2000-2050
Ar Acetileno 2100-2400
Óxido nitroso Acetileno 2650-2800
Oxigénio Hidrogénio 2550-2700
Oxigénio Acetileno 3060-3200
11 Fonte: M. Gonçalves, 1996
37
Figura 2.10: Sistema de atomização em chama com nebulizador e queimador.
A principal vantagem da atomização em chama é a reprodutibilidade com que

a amostra é introduzida no espectrofotómetro. Contudo, uma desvantagem
significativa dos atomizadores de chama é a baixa eficiência de atomização que se
pode verificar. Esta situação pode ocorrer por duas razões: Primeiro, a maioria dos
aerossóis produzidos durante a nebulização são constituídos por gotas que são
grandes de mais para serem transportadas para a chama e, consequentemente, 95%
da amostra nunca atinge a chama. Uma segunda razão que justifica a baixa eficiência
da atomização consiste no grande volume de gases de combustão que diluem
significativamente a amostra. O efeito destas duas contribuições reduz a sensibilidade
do método e a concentração do analito na chama pode ser de apenas 2,5 x 10-6 desta
em solução (D. Harvey, 2000).
38
Interferências
A absorção atómica é uma técnica muito específica e com muito poucas
interferências. Como são muito bem determinadas, existem métodos acessíveis que
podem corrigir a maioria dos problemas. De seguida são descritas as principais
interferências deste método:
Interferências químicas
De um ponto de vista teórico, uma interferência química resulta do efeito de
qualquer composto que evita, pelo menos parcialmente, a atomização dum dado
elemento. Pode-se considerar que existem essencialmente duas razões que
contribuem para a formação de interferências químicas:
1) A conversão da amostra em átomos não ser quantitativa, devido a dificuldades
em fundir e vaporizar o sal;
2) As moléculas não serem completamente dissociadas, ou os átomos livres
reagirem espontaneamente com outros átomos, ou radicais próximos, pelo que
não ficam disponíveis para a absorção, o que depende da estequiometria da
chama e da afinidade dos átomos para outros existentes na chama.
Muitas interferências químicas podem ser eliminadas aumentando a
temperatura da chama ou alterando a vizinhança química dos átomos. Estas
interferências podem ainda ser eliminadas quimicamente ou por adição da espécie
interferente às soluções padrão, ou formando uma ligação química do anião
interferente com um outro catião adicionado em excesso à amostra, ou ainda
protegendo o catião a determinar, por complexação (M. Gonçalves, 1996).
Interferências físicas de matriz

Algumas propriedades físicas da solução podem afectar o valor da absorvância
medida, em especial, a pressão de vapor e a tensão superficial que influenciam o
tamanho das gotas. A viscosidade também influencia a velocidade com que o aerossol
atinge a chama por aspiração. É, portanto, essencial que a viscosidade dos padrões
seja o mais próxima possível da viscosidade da amostra.
As interferências físicas podem ser eliminadas diluindo a amostra ou
transferindo a matriz da amostra para os padrões, o que nem sempre é possível.
Também se pode usar o método de adição padrão, que é um método muito mais
prático de resolver estes problemas (M. Gonçalves, 1996).
39
Interferências de ionização
As interferências de ionização são interferências químicas em que se dá a
ionização duma dada percentagem de átomos na chama. Por exemplo, uma chama
de oxigénio/gás natural possui energia suficiente para ionizar os metais alcalinos e
alcalino-terrosos. Consequentemente, há uma redução do número de átomos neutros
disponíveis que podem absorver radiação ao comprimento de onda seleccionado.
Uma forma de evitar esta interferência é através da diminuição da temperatura
da chama que poderá, no entanto, aumentar as interferências químicas. Pode também
adicionar-se ao elemento em estudo uma substância mais facilmente ionizável, o que
faz aumentar a pressão parcial dos electrões, deslocando o equilíbrio para a formação
de átomos neutros (M. Gonçalves, 1996).
Interferências de fundo
Existem duas razões fundamentais para a formação deste tipo de
interferências: a dispersão da luz por partículas sólidas na chama e a verdadeira
absorção por moléculas ou radicais provenientes principalmente da matriz da amostra.
Este tipo de interferência provoca um aumento do sinal e consequentemente da
absorvância.
A melhor forma de evitar as interferências de absorção molecular seria
aumentar a temperatura da chama, evitando assim a formação de moléculas
interferentes, contudo, este nem sempre é um método prático.
O melhor método de evitar este tipo de interferência é usar um
espectrofotómetro de duplo feixe, com duas lâmpadas, uma de cátodo oco e uma de
fonte contínua, como a de deutério. A radiação da lâmpada de cátodo oco e a da fonte
contínua passam alternadamente através da chama. Após a passagem pelo
monocromador, ambos os feixes incidem no mesmo detector determinando-se depois
a razão das duas intensidades (M. Gonçalves, 1996). Neste caso, como o analito
absorve muito pouco do espectro contínuo, a absorvância do contínuo é toda da
interferência e pode ser subtraída à absorvância total, obtida pela radiação emitida
pela lâmpada de cátodo oco.
40
Validação de métodos
3. Validação de Métodos
Actualmente, é relativamente fácil referir uma série de vantagens que
incentivam os laboratórios de ensaio e/ou calibração, que operam no ramo do controlo
de qualidade, a estarem acreditados. Para tal reconhecimento, os laboratórios têm de
evidenciar que actuam de acordo com a norma de referência, NP EN ISO/IEC
17025:2000, documento que serve de base ao sistema da qualidade.
A implementação de um sistema da qualidade consiste numa melhor
sistematização organizacional e um adequado desempenho técnico, cujo objectivo é
a obtenção de resultados com um nível de qualidade bem caracterizado.
As normas ISO para a acreditação constituem a base de uma rede de
reconhecimento de competências de dimensão mundial que é assegurada a nível
nacional pelo organismo nacional de acreditação. Estes documentos definem
genericamente os requisitos que uma determinada entidade deve cumprir para obter
o reconhecimento de competência do organismo avaliador. Para que um laboratório
cumpra estes objectivos, terá de realizar todo um conjunto de operações que
permitam recolher dados para o sistema da qualidade, entre as quais, a validação de
métodos.
Diariamente, por todo o Mundo, realizam-se milhões de análises químicas em
milhares de laboratórios. Existem inúmeras razões que justificam a sua necessidade,
por exemplo, o controlo de qualidade de uma vasta gama de matérias-primas, que
servem de base à produção. É, portanto, imprescindível demonstrar e assegurar a
fiabilidade dos resultados das análises efectuadas.
A validação de métodos permite demonstrar que um método de ensaio, nas
condições em que é praticado, possui as características necessárias para assegurar
a obtenção de resultados com a qualidade exigida. É, por isso, um requisito de
extrema importância adequar o processo de validação ao método que se pretende
validar, ter em conta como e quando deve ser realizado, e saber exactamente o que
é necessário para que este seja efectuado.
A norma ISO 8402:1994 define validação como sendo a confirmação, através
do fornecimento de evidências objectivas, de que os requisitos necessários para uma
aplicação ou uso específicos são cumpridos.
O método de validação divide-se essencialmente em dois processos:
41
1. Processo que estabelece os critérios de desempenho (parâmetros de

validação) e limitações do método. Identifica os factores que influenciam
esses critérios e de que forma.
2. Processo de verificação da eficiência do método, ou seja, se é capaz de
solucionar determinado problema analítico.
Quando se pretende avaliar um método interno de ensaio cabe à entidade
efectuar a sua descrição, caracterização e incluir todos os registos obtidos. Avaliando
o grau de exigibilidade requerido para o método interno, será necessário realizar
alguns estudos de validação antes de o colocar em rotina, durante a sua
implementação ou sempre que ocorra uma alteração relevante do mesmo (Guia
RELACRE nº13, 2000).
Os requisitos mínimos para a validação de métodos internos de ensaio
dependem do tipo de método em causa e consistem no estudo e conhecimento da
gama de trabalho/linearidade, limiares analíticos (detecção e quantificação),
sensibilidade, precisão e exactidão. O laboratório é responsável pela escolha dos
parâmetros de validação e deverá ter em conta o objectivo do método que pretende
validar (Guia RELACRE nº13, 2000).
O processo de validação envolve o estudo de parâmetros por avaliação directa
e por avaliação indirecta (Guia RELACRE nº13, 2000).
3.1. Avaliação Indirecta

A avaliação indirecta é efectuada por determinação e evidência dos seus
parâmetros característicos.
3.1.1. Especificidade/Selectividade
Apesar de bem definidos, os conceitos de especificidade e selectividade são
regularmente utilizados indistintamente ou com diferentes interpretações.
Uma amostra é geralmente constituída pelo analito que se pretende determinar,
pela matriz e por outros componentes que podem influenciar a medição, mas que não
se pretende determinar. A especificidade e a selectividade estão relacionadas com a
capacidade de detecção. Um método é considerado específico caso produza resposta
para apenas um analito. Por outro lado, o método é selectivo quando produz resposta
para vários analitos, mas é capaz de distinguir a resposta de um analito da de outros
(INMETRO, 2003; Eurachem, 1998).
42
No estudo da especificidade e selectividade de um método deve-se avaliar a

possível interferência de espécies geralmente presentes nas amostras em estudo. A
interferência em causa poderá ser aditiva, caso seja provocada por espécies ou
efeitos que são independentes da concentração do analito, proporcional, quando a
perturbação depende do nível de concentração do analito, ou múltipla caso resulte da
combinação dos 2 tipos de interferências anteriormente mencionados (M. Valcárcel &
M. Cases, 2000).
Durante o estudo da especificidade/selectividade do método devem-se realizar
ensaios de recuperação utilizando uma série de amostras, com a mesma matriz, em
que apenas se varia a concentração do analito em proporções bem conhecidas e ao
longo de toda a gama de trabalho. Deste modo, é possível adquirir informação acerca
do mecanismo de interferência (INMETRO, 2003).
Caso um método apresente limitações no que diz respeito à sua
especificidade/selectividade, pode-se considerar que este é aplicável quando na
prática e após a realização de ensaios de recuperação (cálculo da percentagem de
recuperação), se verificar que as taxas de recuperação estão compreendidas entre 80
e 120% (D. Harvey, 2000). Contudo, poderão ser aceites diferentes intervalos uma
vez que, cabe ao laboratório ter critérios de aceitação relativos às taxas de
recuperação conseguidas, baseados em dados e factos credíveis (Guia RELACRE
nº13, 2000).
Uma vez conhecidos os efeitos dos erros resultantes das interferências, pode-
se tentar superar estes problemas com a utilização do método de adição-padrão,
análise de múltiplos componentes ou por uma mudança no pré-tratamento, separação
ou detecção (INMETRO, 2003).
Método de adição padrão

O método de adição padrão pode ser convenientemente utilizado, caso não se
conheça a composição da amostra a analisar.
No método de adição padrão as leituras de absorvância são feitas em várias
soluções, todas elas contendo o mesmo volume de amostra e concentrações
diferentes de padrão adicionado. Quando se representa o valor da absorvância em
função da concentração de padrão adicionado, a recta obtida não passa pela origem,
pelo que a absorvância para a concentração nula de padrão adicionado corresponde
ao valor da amostra. A partir deste valor determina-se a concentração do elemento
43
em estudo a partir da abcissa na origem (M. Gonçalves, 1996) Quanto maior for o
número de soluções utilizadas, maior será a precisão deste método.
O método permite eliminar todo o tipo de interferências que fazem com que o
coeficiente de proporcionalidade entre a absorvância e a concentração seja diferente,
para os padrões simples e para a amostra, e que se torna constante pela adição de
quantidades idênticas de amostra aos padrões (M. Gonçalves, 1996).
No método de adição padrão a determinação da composição do desconhecido
baseia-se numa série de ensaios e não apenas num ponto experimental (CC) e
consequentemente o erro dessa estimativa é menor. A equação 3.1 apresenta a
fórmula de cálculo desta incerteza.
Sy
1 1 y2
Sx    
x
N (3.1)
b N n
b 2   (x i  x) 2
i1
Sendo:
xi – valores individuais de concentração;
yi – valores individuais de sinal instrumental;
x - média de valores de x (concentração dos padrões utilizados);
y - média dos valores de y (sinal instrumental);
Sy/x– desvio padrão residual;
b – declive da curva de calibração;
n – número de ensaios independentes (replicados) efectuados para a amostra;
N – número de padrões.
3.1.2. Quantificação
Em métodos quantitativos a interpretação de informações veiculadas pelos
estudos e ensaios realizados é efectuada através do cálculo de vários parâmetros,
tais como:
 A curva de calibração que é obtida segundo um processo através do qual se
relaciona a resposta dum sistema de medida com uma concentração ou uma
quantidade de substância conhecida. A sua construção é efectuada
inicialmente pela escolha de uma gama de trabalho que se deve adaptar aos
objectivos pretendidos, e que deve incluir, se possível no centro, a
concentração esperada da amostra.
44
Estando definida a gama de trabalho é necessário proceder à sua validação

recorrendo ao teste de homogeneidade de variâncias (teste F). Após este
processo, prepara-se uma série de soluções padrão e efectuam-se as
medições num equipamento analítico. Estabelece-se um gráfico de calibração
e determina-se a concentração do parâmetro nas amostras, por interpolação.
A calibração analítica deve ser efectuada aquando da análise, devendo existir
critérios para aceitação das curvas de calibração relativos à linearidade e à
estabilidade entre calibrações, definidos internamente. A linearidade da curva
de calibração pode ser avaliada através de um modelo estatístico, de acordo
com a norma ISO 8466-1.
Quando não se efectua a curva de calibração diária, para cada série de
amostras, cabe ao laboratório definir um processo para verificação da validade
da curva usada, face a critérios de aceitação de desvios.
Caso se utilize o método dos mínimos quadrados, o eixo vertical (yy) representa
sempre a resposta instrumental do equipamento e o eixo horizontal (xx)
representa sempre as concentrações dos padrões, uma vez que se assume
que os erros associados aos valores de x são desprezáveis em relação aos de
y. Por este método demonstra-se que os coeficientes a (ordenada na origem)
e b (declive) da recta de regressão de y em x, y=a + bx, são dados por:
 (x i  x)  (y i  y)
a  y bx (3.3)
b i1
N
(3.2)
 (x
i1
i  x) 2
Sendo:
xi – valores individuais de concentração;
x - média de valores de x (concentração dos padrões utilizados);
y - média dos valores de y (sinal instrumental).
Os coeficientes a e b dão uma estimativa da verdadeira função que é limitada

pela dispersão inevitável do método. A precisão da estimativa é quantificada
pelo desvio padrão residual (Sy/x) da recta de regressão (equação 3.4), que
45
exprime a dispersão dos valores do sinal instrumental em torno da curva de

calibração.
 y  (a  b  x i )
2
i
(3.4)
Sy  i1
x N2
Em que N é o número de padrões de calibração.

Os desvios padrão do declive b e da ordenada na origem a, são dados por:
Sb 
Sy
x x 2
i
N (3.5) Sa  S y  i1
(3.6)
 (x
N
 x) N   (x i  x)
2 x 2
i
i1 i1
A concentração do analito na amostra pode ser obtida a partir de um sinal

instrumental y0, através da equação 3.7:
y0  a
x (3.7)
b
A incerteza do valor interpolado de uma concentração x0 qualquer é a

combinação da incerteza da determinação do valor medido e a incerteza da
estimativa dos coeficientes de regressão. Da propagação dos erros segue-se
que para cada concentração x0, existe um intervalo de confiança do verdadeiro
valor de y0, cujos limites descrevem duas hipérboles que envolvem a recta de
calibração. A equação 3.8 apresenta a expressão que permite determinar o
desvio padrão para uma dada concentração.
Sy
1 1 (y 0  y) 2
Sx  x
   N (3.8)
b N n
b 2   (x i  x) 2
i1
Sendo:
n – número de ensaios independentes (replicados) efectuados para a amostra;
N – número de padrões.
46
 O limite de detecção (LD) que corresponde ao teor mínimo medido, a partir

do qual é possível detectar a presença do analito com uma certeza estatística
razoável. Este limiar analítico corresponde à mais pequena quantidade de
substância a analisar que pode ser detectada numa amostra, mas não
necessariamente quantificada como valor exacto (Eurachem, 1998; Guia
RELACRE nº13, 2000).
O limite de detecção é determinado por vários autores de formas diferentes,
muito embora todos admitam que o limite de detecção deve ser definido em
termos estatísticos como o menor valor que se pode distinguir do branco (M.
Gonçalves, 2000). Um dos métodos de o determinar consiste na medição de
uma série de brancos ou padrões vestígio (entre 10 e 20 ensaios), preparados
de forma independente e lidos ao longo de vários dias de trabalho. Deste modo,
o limite de detecção (L.D.) é obtido através da equação 3.9:
L.D.  X 0  K  σ o (3.9)
Em que X0 é a média aritmética do teor medido de uma série de brancos ou

padrões vestígio, nas condições acima referidas, e σ o representa o desvio
padrão associado a X0. Se a lei de probabilidade de X0 é suficientemente

conhecida e partindo do princípio que é gaussiana então toma-se o valor de
K≈3,3 para um grau de confiança de cerca de 99,7% (Guia RELACRE 13,
2000).
Caso se pretenda utilizar dados de uma curva de calibração linear, o limite de
detecção para um grau de confiança de 99,7% é dado pela equação 3.10:
3,3  S 
 y 
L.D.   x 
(3.10)
b
Em que Sy/x é o desvio padrão residual, e b é o declive da curva de calibração

(Guia RELACRE nº13, 2000).
 O limite de Quantificação (L.Q.) que corresponde à menor concentração

medida a partir da qual é possível a quantificação do analito, com uma dada
47
precisão e exactidão. O seu valor pode ser associado ao padrão de menor

concentração, excluindo o branco, cuja determinação ocorre através de uma
série de padrões internos com concentração próxima ou igual ao limiar de
quantificação, analisados em condições de precisão intermédia. Segundo as
recomendações da IUPAC, o coeficiente de variação para estes padrões não
deve exceder 10% (Guia RELACRE 13, 2000).
O L.Q. pode ser determinado tendo em conta a média aritmética do teor medido
de uma série de brancos, preparados de forma independente e lidos ao longo
de vários dias de trabalho. Deste modo o L.Q. é obtido segundo a equação
3.11:
L.Q.  X0  10σ 0 (3.11)
Em que X0 é a média de o teor medido de uma série de brancos e σ 0 representa
o desvio padrão associado a X0.

Poder-se-á utilizar para estimar o L.Q. um conjunto de padrões vestígio ou
brancos fortificados, independentes, testados em condições de precisão
intermédia, e sobre os quais serão feitos estudos de exactidão e precisão (erro
relativo e coeficiente de variação, respectivamente). Adoptar-se-á como
estimativa do L.Q., a concentração utilizada, desde que os parâmetros antes
citados revelem níveis aceitáveis (por exemplo: inferiores ou iguais a 10%)
(guia RELACRE 13, 2000).
Caso o método de determinação do limite de quantificação envolva a utilização
de uma curva de calibração, utiliza-se a equação 3.12 para a sua determinação:
10  S 
 y 
L.Q.   x  (3.12)
b
Em que Sy/x é o desvio padrão residual da curva de calibração e b é o declive

da mesma.
Os valores dos limiares analíticos devem ser actualizados sempre que ocorram
alterações de analista, reagentes, equipamento, ambiente, entre outros. Nos
casos em que se utilizam, no traçado de uma curva de calibração, escalas não
48
lineares, os limiares analíticos deverão ser avaliados de forma diferente e caso

a caso (Guia RELACRE nº13, 2000; Guia RELACRE nº3, 1996).
 A sensibilidade que é um parâmetro que avalia a variação da resposta em

função da concentração do analito. Pode ser expressa pelo quociente entre o
acréscimo do valor lido, L, e a variação da concentração, C, correspondente
àquele acréscimo. Depende da natureza do analito e da técnica de detecção
utilizada e avalia a capacidade de um método ou equipamento para distinguir
pequenas diferenças de concentrações de um analito (INMETRO, 2003; Guia
RELACRE nº13, 2000; Eurachem, 1998).
A sensibilidade do método pode ser avaliada através do estudo da sua
capacidade para discriminar pequenas diferenças de concentrações de um
analito. Assim, tendo em conta duas amostras distintas de concentrações c1 e
c2 e supondo que a diferença entre estas concentrações é mínima, o método
analítico apresenta sensibilidade caso esta diferença seja igual ou superior a 3
vezes a incerteza associada à quantificação destas concentrações (Sc1,c2).
c2  S c1  S c2 é possível obter Sc1,c2 através da equação 3.13:

2 2 2
Sendo, S c1,
S c1,c2  S c1  S c 2 (3.13)
No entanto, tendo em conta que c1 e c2 correspondem a concentrações muito

próximas, considera-se que a incerteza associada a c1 (Sc1) é
aproximadamente igual à incerteza associada a c2 (Sc2):
S c1  S c 2  S x
Deste modo:
Sc21,c 2  2  S x  Sc1,c2  2  S x
2
(3.14)
49
Tendo em conta que a sensibilidade corresponde ao menor intervalo de

concentrações que o método é capaz de distinguir, poderá ser determinada
pela equação 3.15:
S d  c2 - c1  3  S f g  Sd  c2 - c1  3  2  S x (3.15)
Em que Sd corresponde à sensibilidade do método, quando quantificada para

um grau de confiança de 99,7%, e o Sx corresponde ao desvio padrão com que
o método quantifica uma determinada concentração. O valor de Sx pode ser
determinado a partir da equação 3.8.
3.1.3. Precisão
A precisão é definida como sendo o grau de concordância entre os resultados
de medições independentes obtidos a partir de uma mesma amostra, amostras
idênticas ou padrões, em condições específicas. O estudo deve, sempre que possível,
ser efectuado com amostras para minimizar efeitos de matriz (S. Ellison et al., 2009;
Guia RELACRE nº13, 2000; INMETRO, 2003; Eurachem, 1998).
Se o método a ser validado aplica-se à análise de uma gama de concentrações
do analito e/ou diferentes tipos de amostra, a precisão deve ser estudada para um
conjunto de amostras representativo (S. Ellison et al., 2009).
As condições em que os replicados são efectuados determinam a natureza da
precisão estimada. Existem duas medidas extremas para avaliar esta dispersão,
designadas por repetibilidade e reprodutibilidade, entre estas, ocorre uma situação
intermédia designada por precisão intermédia ou variabilidade intralaboratorial (S.
Ellison et al., 2009; Guia RELACRE nº13, 2000). A dispersão associada a estes 3
componentes da precisão é determinada através dos respectivos desvios padrão.
Repetibilidade
A repetibilidade refere-se à precisão de um método de ensaio obtida a partir de
um conjunto de replicados, sobre uma mesma amostra, realizados no mesmo
laboratório, pelo mesmo analista, o mesmo equipamento, o mesmo tipo de reagentes
50
e em curtos intervalos de tempo (S. Ellison et al., 2009; Guia RELACRE nº13, 2000;
Eurachem, 1998).
O limite de repetibilidade (r) é calculado através do desvio-padrão dos
resultados dos ensaios realizados em condições de repetibilidade e permite ao
analista decidir se a diferença entre dois ensaios consecutivos, nestas condições, é
significativa. Na prática aceitam-se os resultados de duas determinações efectuadas
em condições de repetibilidade se |Xi-Xi-1| ≤ r. Caso não se aplique esta situação é
necessário realizar um análise crítica e, se necessário, efectuar a repetição de ensaios
segundo um plano assente em dados bibliográficos ou normas, nomeadamente a
norma ISO 5725-2 e ISO 5725-6 (INMETRO, 2003; Guia RELACRE nº13, 2000).
Para determinar a repetibilidade de um método num laboratório, realizam-se
uma série de medições (n≥10), sobre uma mesma amostra ou solução padrão, em
condições de repetibilidade. Caso seja necessário, repete-se este procedimento para
vários níveis de concentração, cobrindo todo o domínio de aplicação do método.
Para um nível de confiança de 95%, o limite de repetibilidade (r) é determinado
através da equação 3.16:
r  t  2  S ri  1,96  2  S ri  2,8 * S ri2 (3.16)
Em que a variância de repetibilidade ( Sri2 ) é dada por:
 (n 
p
wi  1)  S 2wi
S 
2 w 1 (3.17)
ri p
 (n
w 1
wi  1)
Sendo:
S 2wi – variância associada aos resultados considerados, para cada laboratório;
(nwi-1) – graus de liberdade da série de análises;
p – número de laboratórios participantes.
Deve também ser calculado o coeficiente de variação de repetibilidade (CV r),

para cada nível de concentrações, expresso em percentagem, segundo a expressão:
Sri
CVr   100 (3.18)
x 51
Sendo:
Sri – desvio padrão de repetibilidade;
x – média dos valores considerados.
Reprodutibilidade
Segundo a norma ISO 3534 a reprodutibilidade refere-se à precisão de um
método de ensaio obtida a partir de um conjunto de replicados, sobre uma mesma
amostra, realizados em laboratórios diferentes, por diferentes analistas, com
diferentes equipamentos e/ou em épocas diferentes.
O limite de reprodutibilidade (R) é o valor abaixo do qual se deve situar com
uma probabilidade específica (95%), a diferença absoluta entre dois ensaios, obtidos
nas condições referidas.
A reprodutibilidade de um método de análise é obtida a partir de ensaios
interlaboratoriais. Assim, é enviada uma série de amostras aos laboratórios
participantes, os quais realizam ensaios sobre a mesma amostra (S. Ellison et al.,
2009; Guia RELACRE nº13, 2000; Guia RELACRE nº3, 1996; Guia RELACRE nº7,
1996; Eurachem, 1998).
Precisão Intermédia
A precisão intermédia refere-se à precisão avaliada, sobre a mesma amostra,
amostras idênticas ou padrões, utilizando o mesmo método, no mesmo laboratório ou
laboratórios diferentes, mas definindo rigorosamente os factores de variação, tais
como:
– diferentes analistas;
– diferentes equipamentos;
– diferentes épocas;
Na secção 1 do capítulo 5 são apresentados os três métodos mais comuns para

determinar a precisão intermédia de um método.
52
3.1.4. Robustez
A robustez de um método diz respeito à sensibilidade que este apresenta
perante pequenas variações de factores que influenciam o desempenho do método.
Um método é robusto caso se manifeste praticamente insensível a pequenas
variações que possam ocorrer durante a sua execução (Guia RELACRE 13, 2000;
INMETRO, 2003).
A avaliação da robustez de um método pode ser efectuada através do
planeamento factorial Plackett-Burman, que permite ainda obter a influência de cada
uma das variações nos factores seleccionados. Este teste baseia-se na realização de
um determinado número de ensaios sobre uma amostra, efectuados segundo um
plano de controlo de factores. Para tal, deve-se ter em conta todos os factores
susceptíveis de influenciar o resultado final, ou seja, os factores que ao variarem
poderão afectar negativamente a execução do método (Y. Heyden et al., 2001).
3.2. Avaliação Directa

Este tipo de avaliação tem como principal objectivo determinar a exactidão dos
métodos de ensaio.
A Exactidão de um método refere-se ao grau de concordância entre o resultado
de um ensaio e o valor de referência aceite como verdadeiro. A exactidão, quando
aplicada a uma série de resultados de ensaio, implica uma combinação de
componentes de erros aleatórios e sistemáticos (tendência) (Eurachem, 1998; Guia
RELACRE 13, 2000).
Para se avaliar a exactidão de um método recorre-se normalmente ao uso de
materiais de referência certificados, ensaios interlaboratoriais e testes comparativos.
Materiais de referência certificados

Os materiais de referência certificados (MRC) constituem uma excelente
ferramenta no controlo externo da qualidade de uma análise química, pelo que,
sempre que possível, devem ser usados na validação de um método de ensaio (Guia
RELACRE 13, 2000).
Ensaios Interlaboratoriais
Os ensaios interlaboratoriais permitem, além de avaliar o desempenho de um
laboratório, estabelecer a eficácia e a comparabilidade de novos métodos de ensaio
53
ou de medição, monitorar métodos estabelecidos e determinar as características de

desempenho de um método (INMETRO, 2003).
Os ensaios laboratoriais consistem na determinação de um conjunto de
parâmetros físico-químicos, sobre uma mesma amostra, por um grupo de
Laboratórios. O desempenho de cada um dos laboratórios intervenientes é
determinado através do valor do Z-score, segundo a equação 3.19 (RELACRE, 2010):
(X lab  X v )
Z (3.19)
S
Sendo:
Xlab – valor obtido pelo laboratório;
Xv – valor aceite como verdadeiro, isto é, o estabelecido no ensaio interlaboratorial;
S – a incerteza de Xv.
A avaliação de um ensaio interlaboratorial pode ser efectuada segundo a

seguinte informação (RELACRE, 2010):
 -3 ≤ Z ≤ +3 o resultado é satisfatório.
 -3 > Z ou Z > +3 o resultado é insatisfatório.
Testes Comparativos
A comparação de métodos consiste na comparação dos resultados obtidos
através de um método interno com os resultados obtidos por um método de referência.
O objectivo é estudar o grau de proximidade dos resultados obtidos pelos dois
métodos de ensaio, ou seja, avaliar a exactidão do método interno relativamente ao
de referência (INMETRO, 2003).
Para se efectuar a comparação de métodos, realizam-se análises em replicado,
utilizando individualmente os dois métodos de ensaio sobre as mesmas amostras. A
comparação dos resultados obtidos pode ser efectuada estatisticamente recorrendo
ao teste t de comparação de médias, que se aplica quando se pretende comparar dois
métodos sobre a mesma amostra. Não é obrigatório o mesmo número de ensaios em
54
cada método, uma vez que, o estudo da proximidade dos resultados obtidos pelas
duas metodologias é feito em torno da média de valores (Guia RELACRE 13, 2000).
Este teste pressupõe a comparação entre dois valores de t, o t experimental
(texp), e o t tabelado (tcrit), tendo em conta que, estatisticamente, os resultados
provenientes dos dois métodos não apresentam desvios significativos se |texp| ≤ tcrit.
Pode-se ainda efectuar a comparação entre dois métodos através do cálculo
do erro relativo. Quando um resultado apresenta um erro relativo de 1% relativamente
ao valor de referência, o método analítico possui elevada exactidão. Os métodos que
apresentam erros relativos entre 1% e 5% têm exactidão moderada, e os que possuem
erros relativos superiores a 5% apresentam baixa exactidão (D. Harvey, 2000).
55
Controlo de qualidade
4. Controlo de Qualidade
Após o estudo aprofundado do método e aprovação do mesmo, o laboratório
deve exercer um controlo da sua execução, de forma a garantir que as condições de
validade do método se mantêm. O laboratório deve, portanto, possuir um sistema de
controlo de qualidade (CQ) dos resultados obtidos, o qual se baseia num conjunto de
técnicas e actividades de carácter operacional utilizadas com vista a responder às
exigências (Guia RELACRE 3, 1996; Eurachem, 1998).
4.1. Controlo de qualidade externo

O controlo de qualidade é externo caso as acções de CQ sejam efectuadas
pelo laboratório, mas cuja realização depende de uma intervenção exterior ao
laboratório, como por exemplo: a análise de MRC e ensaios interlaboratoriais (Guia
RELACRE 3, 1996; Eurachem, 1998).
4.2. Controlo de qualidade interno

O controlo de qualidade (CQ) é interno caso as acções de CQ cuja
implementação depende apenas da vontade e meios do laboratório, e não de um
factor externo. Por exemplo: a execução da análise de amostras em duplicado, a
utilização de amostras cegas, a eliminação do efeito de matriz através do método de
adição padrão e a utilização de materiais de referência internos (Guia RELACRE 3;
1996, Eurachem, 1998).
4.3. Cartas de controlo

Em 1931 Shewhart criou as cartas de controlo com o objectivo de permitir o
controlo de qualidade dos produtos através de uma representação gráfica (Guia
RELACRE 3, 1996).
Em Controlo Químico da Qualidade é frequente o recurso a cartas de controlo
para verificar se um determinado evento se encontra de acordo com determinadas
especificações. Várias situações de diagnóstico de falta de conformidade,
previamente estabelecidas através de testes e regras são evidenciadas através do
recurso à estatística (J. Pereira, 2006).
O acompanhamento de determinado processo no espaço-tempo permite definir
limites de aviso e de controlo, que representam os limites probabilísticos de acontecer
o processo em causa, podendo estes ser utilizados no diagnóstico dessa variável com
57
o intuito de verificar se o processo está a sofrer algum tipo de alteração (J. Pereira,
2006).
Existem 3 tipos básicos de cartas de controlo, as de Shewhart, Aceitação e
Previsão, entre as quais se destacam as cartas de Shewhart de médias ou indivíduos,
as cartas de amplitudes e as cartas de somas cumulativas (Guia RELACRE 3, 1996).
4.3.1. Cartas de controlo de médias ou indivíduos

As cartas de controlo (CC) de médias ou de indivíduos representam a variação
de determinado parâmetro ao longo do tempo. A figura 4.1 representa um exemplo de
uma carta de controlo de médias ou indivíduos.
Geralmente as CC partem do pressuposto que a ocorrência de erros é
aleatória, pelo que a distribuição de pontos em torno do valor médio (x m) segue uma
distribuição normal. Deste modo, a probabilidade de um ponto se situar a mais dois
desvios padrão (2S) do valor médio é inferior a 5%, e a mais de 3 desvios padrão (3S)
não excede 0,3%. Assim, para além de uma linha central que representa o valor médio
(xm) costumam representar-se (ISO 7873) uma série de linhas de referência (figura
4.1):
 as linhas de xm ± 2S, normalmente designadas por linhas de aviso;

 as linhas de xm ± 3S, normalmente designadas por linhas de controlo.
Para construir uma carta de controlo deste tipo é necessário recorrer a ensaios
prévios (no mínimo 10) para se estabelecer o valor médio e o respectivo desvio
padrão. Estes ensaios devem ser realizados num período de tempo idêntico àquele
em que depois se irão representar os dados.
Após a obtenção do valor médio e do desvio padrão, traça-se a carta e inicia-
se a representação dos pontos correspondentes às análises a controlar. Deve-se
efectuar pelo menos um controlo dos parâmetros por cada 20 análises efectuadas
(Guia RELACRE 3, 1996).
Uma vantagem adicional da utilização de cartas de controlo de médias advém
do teorema do limite central, pelo qual a distribuição de valores médios tende a seguir
a lei normal, mesmo que a população individual não a siga (Guia RELACRE 3, 1996).
58
Figura 4.1: Carta de controlo de médias ou indivíduos.
4.3.2. Cartas de controlo de amplitudes

As cartas de controlo de amplitudes assumem que estando o método sob
controlo estatístico, os desvios entre réplicas se mantêm dentro de limites pré-
determinados.
A construção de uma CC de amplitudes também pressupõe a realização de
estudos prévios para conhecer o valor médio Rm das diferenças entre duplicados, ou
da amplitude para maior número de réplicas. Normalmente, admite-se para a linha de
controlo o valor de 3,27Rm (Guia RELACRE 3, 1996).
A figura 4.2 representa uma carta de controlo de amplitudes:
Figura 4.2: Carta de controlo de amplitudes.
59
4.3.3. Cartas de controlo de somas cumulativas

As cartas de controlo de somas cumulativas são bastante recomendadas, pois
apresentam maior sensibilidade do que as cartas de controlo de médias ou indivíduos,
permitindo detectar desvios ou tendências antecipadamente. No entanto, a construção
deste tipo de cartas é bastante complexa, o que é visto como uma desvantagem
relativamente aos outros tipos de cartas.
Para a construção deste tipo de cartas é necessário definir um valor esperado
para o ensaio em causa e somar continuamente os desvios observados. Sempre que
o processo sai fora de controlo exercem-se acções correctivas e recomeçam-se as
cartas (Guia RELACRE 3, 1996). A figura 4.3 apresenta uma carta de controlo de
somas cumulativas:
Figura 4.3: Carta de controlo de somas cumulativas.
4.3.4. Detecção de pontos fora de controlo

A norma ISO 8258 refere-se a cartas de controlo de média ou indivíduos e
apresenta diversos testes de desvios que permitem detectar pontos fora de controlo.
As figuras de 4.4 a 4.11 apresentam os 8 testes existentes, onde os pontos fora de
controlo estão representados por um círculo negro.
60
Figura 4.4: 1º teste para detectar pontos fora de controlo.
No teste apresentado pela figura existe um ponto fora de ±3S. A probabilidade

de tal acontecer é de 0,3%.
Neste caso existem 2 pontos em 3 pontos consecutivos fora de ± 2S. A

probabilidade normal de tal acontecer foi ultrapassada.
Figura 4.6: 3º teste para detectar pontos fora de controlo
61
Este teste apresenta 4 pontos em 5 pontos consecutivos fora de ± 1S. A

probabilidade normal de acontecer foi ultrapassada.
Neste teste existem 15 pontos consecutivos dentro de ± 1S. O desvio padrão

actual é inferior ao teórico.
Neste teste existem 9 pontos consecutivos de um dos lados da média. Existe

um desvio sistemático relativamente ao valor estabelecido.
62
Este teste apresenta 8 pontos consecutivos fora de ± 1S. Existem duas

distribuições em vez de uma só.
Este teste apresenta 6 pontos consecutivos a subir ou descer. Existe uma

tendência não aleatória.
Neste teste existem 14 pontos consecutivos alternando a subir e a descer.

Existe uma série temporal que afecta os dados.
4.3.5. Acções correctivas

As cartas de controlo devem ser permanentemente actualizadas, a fim de se
detectar atempadamente possíveis anomalias.
Após detecção da existência de anomalias no processo analítico, é
fundamental definir o procedimento a seguir. Na presença de pontos fora de controlo
é comum efectuar o procedimento descrito na figura 4.12 (Guia RELACRE 3, 1996).
63
Cada laboratório deve optimizar o método de modo a atingir a qualidade que

pretende no resultado final (Guia RELACRE 3, 1996).
Parar análises
Fora de controlo Parar relatórios
Avisar responsáveis
Identificação da causa
Correcção da deficiência
Verificação da correcção
Identificação das
análises afectadas
Reanalisar amostras
Corrigir relatórios
Retorno ao trabalho
analítico normal
Figura 4.12: Procedimento de acções correctivas.
64
Quantificação da incerteza de um método
5. Quantificação da incerteza de um método

Segundo o guia IPAC para a quantificação de incertezas em ensaios químicos
(IPAC, 2007), a determinação da incerteza de um método pode ser efectuada com
base em dados de validação e consiste na utilização de parâmetros do desempenho
global do método, estimados em ambiente intralaboratorial.
As fontes de incerteza individuais que foram consideradas neste trabalho estão
associadas à precisão e à exactidão do método na sequência do estudo da precisão
e exactidão do método.
5.1. Contribuição da precisão na determinação da incerteza do método

O guia do IPAC refere-se à precisão como sendo uma componente maioritária
da incerteza global pelo que necessita de ser devidamente avaliada em todo o âmbito
de aplicação do método. A incerteza deve, portanto, ser avaliada da forma mais
realista possível e recomenda-se que seja em condições de precisão intermédia, uma
vez que, nestas condições tem-se em conta eventuais variações do desempenho do
método resultantes de alterações de parâmetros experimentais que normalmente são
mantidos constantes no mesmo dia de trabalho.
Existem diversas formas de determinar a precisão intermédia de um método,
de entre as quais de destacam três:
1) Desvio padrão de resultados replicados de uma amostra ou padrão de controlo,

obtidos em condições de precisão intermédia. Deste modo, deve-se variar,
entre análises, todos os parâmetros experimentais que afectam o desempenho
do método. Se os ensaios forem efectuados em dias diferentes assume-se que
varia aleatoriamente grande parte dos parâmetros experimentais que afectam
o desempenho do método.
Neste caso, a incerteza padrão associada à precisão do método é calculada a
partir do desvio padrão dos resultados replicados, Sprecisão:
 (y k  y)2
S precisão  k 1 (5.1)
n 1
65
Onde:
n – número de replicados;
yk – resultado do replicado de índice k (k=1 a n);
y – média aritmética de todos os resultados yk.
2) Amplitude média relativa ou absoluta de resultados replicados de diversas

amostras ou padrões. Neste caso a precisão é dada por:
t n
 (y
j1 k 1
jk  y j )2
S precisão  (5.2)
t(n  1)
Onde:
t – número de amostras ou padrões analisados n vezes em condições de precisão
intermédia;
yjk – resultado replicado k (k varia de 1 a n) da amostra ou padrão j (j varia de 1 a t);
y j – média aritmética dos resultados de n ensaios realizados sobre a amostra ou
padrão j.
3) Desvio padrão estimado a partir dos limites de controlo de uma carta de

controlo de valores individuais baseados em resultados replicados obtidos em
condições de precisão intermédia.
Consoante a amplitude da gama de aplicação do método, em termos de níveis

de concentração, a incerteza associada à precisão é combinada, com as outras fontes
de incerteza, como uma incerteza absoluta ou relativa.
Quando o método é aplicável numa gama alargada de concentrações deve
estimar-se a incerteza padrão relativa associada à precisão, u´precisão :
Sprecisão
u´precisão  (5.3)
y
66
5.2. Contribuição da exactidão na determinação da incerteza do método

Segundo o guia IPAC, a quantificação da incerteza associada à exactidão pode
ser efectuada de várias formas dependendo dos recursos disponíveis e do tipo de
método de ensaio. De seguida são apresentados 4 processos alternativos para a
quantificação da exactidão do método:
1) Quantificação da exactidão através da análise de materiais de referência

certificados (MRC).
Nestas condições, a recuperação média do método Rm é estimada a partir
da equação 5.4:
c obs
Rm  (5.4)
c MRC
Onde:
c obs – concentração média de uma série de análises do MRC;
c MRC – valor certificado do MRC.
A incerteza padrão, u( Rm ), associada a Rm , é calculada pela equação 5.5:
2
 s obs
2
  u(c MRC ) 

u( Rm )  Rm       (5.5)

 n  c obs
2
  MRC 
c
Onde:
sobs – desvio padrão da série de análises do MRC;
n – número de análises do MRC;
u(c MRC) – incerteza padrão associada ao teor certificado do MRC.
2) Quantificação da exactidão através da análise de amostras, sem analito

nativo, fortificadas no laboratório.
Quando a exactidão do método é avaliada através da análise de amostras
sem analito nativo às quais foi previamente adicionada uma quantidade
67
conhecida de analito (fortificação), a recuperação média, Rm , do método é

calculada pela equação 5.6:
c obs
Rm  (5.6)
c f ortif icada
Onde:
c obs – concentração média de uma série de análises de amostras fortificadas;
C fortificada – concentração da amostra fortificada.
Neste caso, a incerteza padrão u( Rm ), associada a Rm , é função da

incerteza associada à fortificação da amostra como apresentado na
equação 5.7:
2
 s obs
2
  u(c f ortif icada ) 

u( Rm )  Rm       (5.7)

 n  c obs
2
  f ortif icada 
c
Onde:
sobs – desvio padrão da série de análises de amostras fortificadas;
n – número de análises da amostra fortificada;
u(c fortificada) – incerteza padrão associada ao teor de amostras fortificadas.
3) Quantificação da exactidão através da análise de amostras, com analito

nativo, fortificadas no laboratório. Neste caso a recuperação média, Rm , do
método é calculada pela equação 5.8:
c obs  c nativ a
Rm  (5.8)
c f ortif icada
Onde:
c nativ a – concentração média do analito nativo.
68
Neste caso, a incerteza padrão u( Rm ), associada a Rm , é dada pela

equação 5.9:
 s obs
2

  s nativ
2
 2
 n
a
  u(c f ortif icada ) 
u( Rm )  Rm   
 (c obs  c nativ a ) 2   c f ortif icada 
(5.9)
 
 
Onde:
Snativa – desvio padrão de uma série de análises de amostras não fortificadas.
4) Quantificação da exactidão através da análise de amostras analisadas por
um método de referência.
Nestas condições, a recuperação média do método é dada pela equação
5.10:
c método
Rm  (5.10)
c método_pad rão
Onde:
c método – concentração média, da amostra analisada , estimada pelo método que
está sob avaliação;
c método_pad rão – concentração média, da amostra analisada , estimada pelo
método de referência.
Neste caso, u( Rm ) , é função da incerteza associada a c método_pad rão
estimada pelo método de referência e é dada por:
2
 S2   u( c método_pad rão ) 
u( Rm )  Rm   método   (5.11)
  c 
 n  c método
2
  método_pad rão 
69
Onde:
Smétodo – desvio padrão de resultados de n análises da amostra estudada
utilizando o método que está sob avaliação;
n – número de ensaios de recuperação efectuados pelo método em estudo;
u( c método_pad rão ) – incerteza padrão associada à c método_pad rão .
Avaliação da exactidão do método

Uma vez estimada a incerteza associada à exactidão do método é necessário
avaliar se os resultados são afectados por desvios sistemáticos relevantes que
necessitem de correcção. Para tal, pode-se efectuar um teste t-student ou utilizar
outras ferramentas consideradas válidas (IPAC, 2007).
Através do teste t-student é possível avaliar se a recuperação média do
método ( Rm ), tendo em conta u( Rm ) , é significativamente diferente de 1. Este teste
baseia-se no cálculo de um valor t, segundo a equação 5.12:
1  Rm
t (5.12)
u( Rm )
Caso os graus de liberdade associados à u( Rm ) sejam conhecidos, t é

comparado com um valor tcrit extraído de uma tabela t-student bilateral, para o número
de graus liberdade em causa, e um grau de confiança de 95%.
Contudo, se os graus de liberdade associados à u( Rm ) forem desconhecidos
mas expectavelmente elevados, o t é comparado com um valor de tcrit igual a 2
produzindo uma comparação com um grau de confiança aproximadamente igual a
95%.
Quando:
1  Rm
t ≤ tcrit , a recuperação do método, Rm , não é significativamente diferente de
u( Rm )
1, e habitualmente, não se procede à correcção dos resultados dos ensaios em termos

de exactidão.
70
1  Rm
t > tcrit , a recuperação do método, Rm , é significativamente diferente 1, e
u( Rm )
habitualmente, procede-se à correcção da exactidão dos resultados dos ensaios.
Se a Rm não é significativamente diferente de 1, considera-se que é igual a 1
e a incerteza padrão, u( Rm ) , é equivalente à incerteza padrão relativa u( Rm ) .
Se a Rm é significativamente diferente de 1 e os resultados dos ensaios são
corrigidos em termos de exactidão do método, considera-se a Rm estimada
experimentalmente para o cálculo de u( Rm ) :
u( Rm )
u( Rm )  (5.13)
Rm
5.3. Combinação das fontes de incerteza e cálculo da incerteza expandida

O cálculo da incerteza padrão combinada baseia-se na lei de propagação das
incertezas. As componentes de incerteza padrão relativa estimadas a partir dos dados
de validação, podem ser combinadas de duas formas, dependendo dos seguintes
casos:
1) Quando o método é aplicável numa gama larga de concentrações, as

componentes de incertezas devem ser contabilizadas como componentes
independentes de uma expressão multiplicativa. Assim, a incerteza padrão
combinada, u(y), de uma determinada grandeza y, é traduzida pela
expressão seguinte:
u( y )  y  (uprecisão ) 2  (u(Rm )) 2  y  (sprecisão ) 2  (u(Rm )) 2 (5.14)
2) Quando o método é aplicável numa gama restrita de concentrações, as

componentes de incertezas podem ser contabilizadas simplesmente como
componentes independentes de uma expressão aditiva. Deste modo, a
71
incerteza padrão combinada, u(y), de uma determinada grandeza y, é

calculada pela equação 5.15.
u( y )  (uprecisão
2
 (u(Rm )  y ) 2  (sprecisão
2
 (u(Rm )  y ) 2 (5.15)
Se as incertezas associadas à precisão e à exactidão são estimadas a partir de

um número elevado de ensaios experimentais, a incerteza expandida combinada pode
ser estimada, para um grau de confiança de 95%, multiplicando a incerteza combinada
por um factor de expansão igual a 2.
72
Método de determinação de nitrato
6. Método de determinação de nitrato
6.1. Parte Experimental

Neste capítulo são apresentados os reagentes, material, instrumentos e
equipamentos utilizados durante o processo de validação do método.
6.1.1. Material, reagentes e equipamentos

De seguida são apresentadas três tabelas que contém a informação relativa ao
material, reagentes, instrumentos e equipamentos utilizados, respectivamente.
Tabela 6.1: Material utilizado no processo de validação do método.
Material
– Luvas de Látex ou Nitrilo.
– Gobelés de 100 mL e de 500 mL.
– Espátula e microespátula.
– Vidros de relógio.
– Balões volumétricos (classe A) de 1L, 500 mL, 250 mL, 100 mL e 50 mL.
– Micropipeta (200µL-1000 µL).
– Pipetas Volumétricas (classe A) de 5mL, 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL e 50 mL.
– Pipetas graduadas (classe A) de 5 mL.
– Tubos de ensaio com capacidade para 20 mL.
– Suporte para tubos de ensaio.
– Funis de plástico.
– Papel de filtro com poros de 0,45 mm.
– Parafilme.
Tabela 6.2: Reagentes utilizados no processo de validação do método.
Reagentes
Nome Características
– Marca: Merck
– GP: min. 99%
Nitrato de sódio (NaNO3)
– p.a
– M=85,00 gmol-1
– Marca: Panreac Química S.A.
Sulfato de ferro (II) e amónio
[(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O] – GP: 99-101%
– M=392,14 gmol-1
73
Continuação da tabela 6.2.
– Marca: Acros
– GP: 97%
Nitrito de Potássio (KNO2)
– p.a
– M=85,10 gmol-1
– Marca: Riedel-de Haën
Dicloridrato de N-(1-naftil)etilenodiamina
(NEDA) (C12H16Cl2N2) – GP: min. 98%
– M=259,18 gmol-1
– Marca: HIMEDIA
Sulfanilamida (C6H8N2O2S) – GP: min. 99%
– M=172,21 gmol-1
Dicromato de Potássio (K2Cr2O7) – GP: min. 99,5 %
– M=294,19 gmol-1
– Marca: Merck
Sulfato de ferro (II) (FeSO4.7H2O) – GP: 99,5 %
– M=278,02 gmol-1
Nitrito de sódio (NaNO2) – GP: 98%
– M=69,00 gmol-1
– Marca: Merck
Nitrato de potássio (KNO3) – GP: min. 99%
– M=101,11 gmol-1
Sulfato de sódio anidro (Na2SO4) – GP: min. 99%
– M=142,04 gmol-1
Cloreto de Amónio (NH4Cl) – GP: min. 99,5%
– M=53,49 gmol-1
– Marca: Merck
Cloreto de sódio (NaCl) – GP: min. 99,5 %
– M=58,44 gmol-1
Cloreto de Zinco (ZnCl2)
– GP: min. 98%
74

Glicina (C2H5NO2) – GP: min. 99,7%
– M=75,07 gmol-1
Hidrogenoftalato de potássio (KHD) – Marca: Fisher Scientific

(KC8H5O4) – M=204,23 gmol-1
– Marca: Fluka
L-Ácido Glutâmico (C5H9NO4) – GP: min. 99%
– M=147,13 gmol-1
– Marca: M&B Laboratory Chemicals
D(+)-Glucose (C6H12O6)
– M=180,16 gmol-1
Ácido clorídrico concentrado (HCl), 37% – p.a

– M=36,46 gmol-1

Ácido sulfúrico concentrado (H2SO4) – p.a
– M=98,08 gmol-1
Água destilada
Tabela 6.3: Instrumentos e equipamentos utilizados no processo de validação do método.
Instrumentos e equipamentos
– Balança analítica, Sartorius analytic – B-120S.
– Espectrofotómetro UV-VIS, SHIMADZU, UV - 160.
– Espectrofotómetro, HACH, DR/2000.
75
6.1.2. Procedimento experimental
6.1.2.1. Lavagem do material

A lavagem do material utilizado foi efectuada manualmente através da
utilização de detergente próprio para o efeito. A sua remoção foi executada com água
da torneira, tendo sido ainda submetido a lavagens sucessivas com água destilada.
6.1.2.2. Tratamento prévio de amostras de água de consumo e de

água residual
Ao chegarem ao laboratório as amostras foram acidificadas com ácido sulfúrico
10% até pH 2,0 e refrigeradas a 4ºC.
Antes de as amostras serem utilizadas, foram filtradas, algumas mais do que
uma vez, até estarem completamente livres de partículas.
Sempre que necessário foram diluídas com água destilada.
6.1.2.3. Preparação de soluções
Soluções padrão de nitrito de sódio

Neste trabalho efectuou-se a preparação de várias soluções padrão. Como a
aplicação do método de determinação de nitrato exige a determinação prévia do nitrito
nas amostras, aplicou-se inicialmente um método para a sua determinação (SMEWW
4500-NO2–B; American Public Health Association, 2005). Para tal, prepararam-se
soluções padrão de calibração a partir de uma solução padrão de partida, preparada
a partir de nitrito de sódio, devidamente padronizada e conservada em ambiente
refrigerado com 2 mL de clorofórmio. As tabelas 6.4 e 6.5 descrevem a preparação
destas soluções:
Tabela 6.4: Dados relativos à preparação da solução padrão de partida e das soluções padrão
intermédias 1 e 2.
[soluções padrão]
Solução m NaNO2 (g) Vpipetado (mL) Vbalão (mL)
(mgN-NO2–/L)
Solução padrão inicial 1,2320 – 1000,0 248,00
Solução padrão i1 – 20,18 500,00 10,00
Solução padrão i2 – 5,000 500,00 0,1000
Tabela 6.5: Dados relativos à preparação das soluções padrão de calibração para determinação de
nitrito.
[solução padrão i2] Vpipetado Vbalão [soluções padrão CC]

Solução
(µgN-NO2–/L) (mL) (mL) (µgN-NO2–/L)
76
P1 2,50 5,00
P2 5,00 10,0
P3 6,00 12,0
P4 7,50 15,0
100,0 50,00
P5 10,00 20,00
P6 15,00 30,00
P7 20,00 40,00
P8 25,00 50,00
Soluções padrão de nitrato de potássio

As soluções padrão de calibração de nitrato foram obtidas a partir da solução
padrão de partida, preparada com nitrato de potássio e devidamente conservada em
ambiente refrigerado com 2mL de clorofórmio. A preparação destas soluções está
resumida nas tabelas 6.6 e 6.7:
Tabela 6.6: Dados relativos à preparação da solução padrão de partida e da solução padrão
intermédia.
[solução padrão]
Solução m (KNO3) /g Vpipetado /mL Vbalão/mL
(mg N-NO3–/L)
Solução padrão de partida 0,7218 – 1000,0 100,0
Solução padrão intermédia – 10,00 1000,0 10,00
Tabela 6.7: Dados relativos à preparação das soluções padrão da curva de calibração (CC) para
determinação de nitrato.
[solução intermédia] Vpipetado Vbalão [soluções padrão CC]

Solução
(mg N-NO3–/L) (mL) (mL) (mg N-NO3–/L)
P1 5,000 100,0 0,5000
P2 10,00 100,0 1,000
P3 20,00 100,0 2,000
10,00
P4 30,00 100,0 3,000
P5 40,00 100,0 4,000
P6 50,00 100,0 5,000
Reagentes de coloração
Neste trabalho prepararam-se duas soluções com reagentes de coloração: a
sulfanilamida e o dicloridrato de N-(1-naftil)etilenodiamina (NEDA).
77
Na preparação da solução de sulfanilamida adicionou-se 500,0 mg deste

reagente a cerca de 50 mL de água, adicionou-se 1,00 mL de ácido clorídrico
concentrado, transferiu-se a solução para um balão volumétrico de 100,0 mL e
completou-se o restante volume com água destilada. A solução foi conservada em
ambiente refrigerado.
Na preparação da solução de NEDA adicionou-se 1 g deste reagente a cerca
de 50 mL de água, adicionou-se 1,00 mL de ácido clorídrico concentrado, transferiu-
se a solução para um balão volumétrico de 100,0 mL e completou-se o restante
volume com água destilada. O armazenamento e conservação desta solução foi
efectuado em local escuro e refrigerado, sendo estável nestas condições durante um
mês.
Solução de ureia
A preparação da solução de ureia foi executada para o processo de remoção
de nitrito das amostras. Para tal, adicionou-se 2g de ureia a cerca de 50 mL de água,
transferiu-se a solução para um balão volumétrico de 100,0 mL e completou-se o
restante volume com água destilada.
6.1.2.4. Determinação e remoção de nitrito

Antes de se proceder à determinação de nitrato nas amostras, verificou-se a
existência de nitrito, visto a sua presença, poder interferir neste método.
Quando a concentração de nitrito foi superior a 200,00 µg N-NO2–/L, efectuou-
se a sua remoção adicionando, por cada mL de amostra, 0,10 mL de solução de ureia
e 0,20 mL de ácido clorídrico concentrado. Posteriormente, a solução obtida foi
incubada durante 10 minutos em banho-maria.
6.1.2.5. Determinação de nitrato

Após a preparação de todas as soluções necessárias, efectuou-se a
determinação de nitrato. Para tal, adicionou-se 1,00 mL de cada uma das soluções
padrão de calibração em tubos de ensaio (20 mL), 200,00 µL de sulfanilamida e 2,00
mL de ácido clorídrico concentrado. De seguida, as soluções foram incubadas durante
3 min em banho-maria. O nível da água do banho permaneceu cerca de 2 centímetros
acima do nível da solução no tubo de ensaio. Após o arrefecimento das soluções em
banho de água fria, adicionou-se 200,00 µL de NEDA e observou-se rapidamente a
formação de cor vermelho-violeta. O desenvolvimento da cor final das soluções foi
78
obtido ao fim de 30 minutos e as amostras foram analisadas por espectroscopia de

absorção molecular a um comprimento de onda de 540 nm. Com os dados obtidos
construiu-se a curva de calibração.
Repetiu-se o procedimento anterior para as amostras de águas de consumo e
de águas residuais, após o seu tratamento.
6.2. Resultados/ Discussão de Resultados

Neste capítulo serão apresentados os resultados relativos ao processo de
validação e a respectiva discussão.
6.2.1. Avaliação indirecta da validação do método
6.2.1.1. Quantificação
– Gama de trabalho
Neste trabalho a validação da gama de trabalho foi efectuada segundo a norma
ISO 8466-1 (ISO, 1990). Desta forma, analisaram-se em 10 réplicas independentes
as soluções padrão de concentração mais baixa e de concentração mais elevada da
curva de calibração, e calcularam-se as respectivas variâncias. Posteriormente, a
gama de trabalho compreendida entre 0,5000 mg N-NO3-mg/L e 5,000 mg N-NO3-
mg/L foi avaliada pelo teste de homogeneidade de variâncias.
Os resultados dos ensaios executados, bem como a respectiva análise
estatística, encontram-se na tabela 6.8.
Tabela 6.8: Resultados obtidos para a validação da gama de trabalho.
0,5000 5,000
Padrão
(mg N-NO3-/L) (mg N-NO3-/L)
rvânc
Abso
0,044 0,472
ias
0,052 0,481
79
0,047 0,477
0,044 0,474
0,048 0,473
0,049 0,482
0,052 0,474
0,051 0,481
0,053 0,479
0,050 0,483
Desvio padrão 3,23 x 10-3 4,12 x 10-3
Variância 1,04 x 10-5 1,69 x 10-5
* Fexp 1,63
Fcrit 3,18
* O valor de Fexp foi obtido através da equação:
2
S P5
Fexp  2
(6.1)
S P0.5
O valor de Fcrit apresentado foi consultado numa tabela de valores teóricos de

F, para um grau de confiança de 95% e para 9 graus de liberdade associados ao
numerador e 9 graus de liberdade associados ao denominador do quociente entre as
variâncias obtidas.
Como Fexp<Fcrit as diferenças de variâncias não são significativas e a gama
de trabalho está bem ajustada.
A validação da gama de trabalho garante a aplicabilidade do método dos
mínimos quadrados simples e deve ser realizada sempre que se justifique.
– Curva de calibração
A curva de calibração construída baseia-se no método dos mínimos quadrados,
pelo que no eixo das ordenadas representa-se a resposta instrumental e no eixo das
abcissas representa-se as concentrações dos padrões.
A tabela 6.9 apresenta as absorvâncias obtidas para cada padrão de
calibração, a respectiva média e desvio padrão. A utilização destes dados permitiu a
construção da curva de calibração.
80
Tabela 6.9: Dados utilizados na construção da curva de calibração.

Padrão P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7
Concentração (mg N-NO3-/L) 0 0,5000 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000
0,000 0,049 0,096 0,185 0,282 0,377 0,472
0,000 0,054 0,092 0,194 0,279 0,389 0,478
0,000 0,051 0,098 0,190 0,289 0,391 0,484
Absorvâncias
0,000 0,050 0,095 0,188 0,291 0,387 0,477

0,000 0,048 0,095 0,199 0,279 0,385 0,483
0,000 0,045 0,092 0,189 0,281 0,378 0,468
0,000 0,049 0,092 0,194 0,282 0,383 0,475
0,000 0,043 0,094 0,189 0,284 0,379 0,467
0,000 0,052 0,098 0,191 0,283 0,374 0,482
0,000 0,048 0,095 0,190 0,290 0,386 0,476
Média 0,000 0,049 0,095 0,191 0,284 0,383 0,476
Recorrendo ao método dos mínimos quadrados determinaram-se os

coeficientes a (ordenada na origem) e b (declive) da recta de regressão, através das
equações 3.2 e 3.3, bem como as incertezas associadas a estes parâmetros e o
desvio padrão residual através das equações 3.4, 3.5 e 3.6 (norma ISO 8466-1:1990).
A tabela 6.10 foi construída no sentido de facilitar o cálculo destes parâmetros da
curva de calibração.
Tabela 6.10: Dados para o cálculo dos parâmetros da curva de calibração.
Padrões P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 Média Soma

xi 0 0,5000 1,000 2,000 3,000 4,000 5,000 2,200 15,50
xi2 0 0,2500 1,000 4,000 9,000 16,00 25,00 7,890 55,25
xi - xméd -2,200 -1,700 -1,200 -0,2000 0,8000 1,800 2,800 -1,300x10-16 0,000
(xi - xméd )2 4,900 2,900 1,500 0,000 0,6000 3,200 7,800 3,000 20,90
yi 0,000 0,049 0,095 0,191 0,284 0,383 0,476 0,211 1,478
yi - yméd -0,211 -0,162 -0,116 -0,020 0,073 0,172 0,265 0 0
(yi - yméd)2 0,045 0,026 0,013 0,000 0,005 0,030 0,070 0,027 0,190
(xi - xméd) ,
0,468 0,278 0,141 0,004 0,057 0,307 0,738 0,285 1,99
(yi -yméd)
*yesp 0,000 0,048 0,096 0,191 0,286 0,381 0,476 0,211 1,48
(yi-yesp) 0,000 0,001 -0,001 0,000 -0,002 0,002 0,000 -4,29x10-5 -3,00x10-4
(yi-yesp)2 9,00x10-8 1,00x10-6 1,00x10-6 0,00 4,00x10-6 4,00x10-6 0,00 1,44x10-6 1,01x10-5
Os parâmetros da curva de calibração, determinados com base nos dados da

tabela 6.10, são apresentados na tabela 6.11.
81
Tabela 6.11: Parâmetros obtidos da regressão linear.
Parâmetro Valor
b 0,0952
Sb 0,0003
a 0,0003
Sa 0,0008
Sy/x 1,34x10-3
Assim, a equação de regressão linear é dada por:
y = 0,0952x + 0,0003
– Linearidade
A linearidade da curva de calibração foi avaliada através de um modelo
estatístico, de acordo com as normas ISO 8466-1 e 8466-2 (ISO, 2001). Para tal,
utilizou-se a função de calibração linear determinada anteriormente e utilizando os
mesmos dados, construiu-se uma curva de calibração não linear que corresponde a
um polinómio de segundo grau (ISO 8466-2).
Após construção de ambas as curvas de calibração e determinação das
respectivas equações, procedeu-se à determinação dos desvios padrão residuais da
curva de calibração linear (Sy/x) e da curva de calibração não linear (Sy2), sendo este
último obtido segundo a equação 6.2:
(6.2) Sy 
 (y i  y i )2
N3
Em que:
y i – é obtido através da equação da curva de calibração não linear que corresponde a
y i  a  b  x i  c  x i2 .
82
Os valores dos desvios padrão residuais, Sy/x e Sy2, encontram-se na tabela

6.12.
Tabela 6.12: Desvios padrão residuais da curva de calibração linear e da curva de calibração não
linear.
Parâmetro Curva de calibração linear Curva de calibração não linear

Desvio padrão residual Sy/x = 1,34 x 10-3 Sy2 = 1,48 x 10-3
Posteriormente, determinou-se a diferença das variâncias (S2) que é dada por:
ΔS2  (N  2)  S2y /x  (N  3)  S2y 2 (6.3)
S2= 1,85x10-7
E, por último, calculou-se o valor teste, Fexp, e comparou-se este valor com o
valor tabelado da distribuição F de Snedecor / Fischer.
ΔS 2
Fexp  2 (6.4)
Sy2
Fexp= 0,08 < Fcrit (0,95; 1,4 gl) = 7,71, logo a função de calibração não linear
não conduz a um ajuste significativamente melhor. A função de calibração é linear.
Reunidos os dados necessários procedeu-se à construção e interpretação do

gráfico da curva de calibração (figura 6.1).
83
Curva de Calibração
0.500
0.400
Absorvância
0.300
0.200
y = 0,0952x + 0,0003
0.100
R² = 1
0.000
0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000
Concentração (mgN-NO3-/L)
Figura 6.1: Curva de calibração de determinação de nitrato.
A curva de calibração construída apresenta um coeficiente de correlação

superior a 0,9995, o que corrobora a linearidade.
A análise de resíduos também corrobora a linearidade. O gráfico de resíduos é
apresentado na figura 6.2.
0.025 P5
0.020
0.015
0.010 P3
P1 P7
Resíduos
0.005
0.000
0 0.049 0.095 0.191 0.284 0.383 0.476
-0.005
-0.010 P4
-0.015 P2
-0.020
P6
-0.025
Padrões
Figura 6.2: Análise de resíduos.
Nos gráficos de resíduos os pontos devem distribuir-se de forma aleatória em

torno da recta que corresponde ao resíduo zero. Nestas condições supõe-se que os
erros são independentes, de média nula e de variância constante. Neste caso, os
84
resíduos comportam-se de forma aleatória, ou seja, não seguem nenhum tipo de

padrão, sendo a condição de independência satisfeita.
– Sensibilidade
A sensibilidade do método, como já foi referido, pode ser avaliada através do
estudo da sua capacidade para discriminar pequenas diferenças de concentrações de
um analito. Para tal, considerou-se um pequeno intervalo de concentrações entre c1
e c2 e partiu-se do princípio que os erros associados aos valores dessas
concentrações seguem uma distribuição gaussiana.
Para que o método apresente sensibilidade a diferença entre c2 e c1 terá que
cumprir com a seguinte condição:
c2 - c1  3  Sc1,c2  c2 - c1  3  2  S x (6.5)
Sabendo o valor de Sx e a respectiva concentração associada, é possível

determinar o intervalo mínimo de concentrações (c2-c1) que o método é capaz de
distinguir. Assim, supondo c1= 0,50 mg N-NO3-/L; Sc1 = Sx = 1,59 x 10-2 mg N-NO3-/L,
o valor de c2 é dado pela equação 6.6:
c2  c1 3  2  S x (6.6)
Como c2=0,57 mg N-NO3-/L, c2-c1= 0,57-0,50 = 0,07 mg N-NO3-/L, o que indica

que, neste nível de concentração, o método apenas é capaz de discriminar uma
variação de concentração de 0,07 mg N-NO3-/L, ou seja, o método apresenta uma
sensibilidade de 0,07 mg N-NO3-/L.
A representação gráfica de 3  2  S x = f (concentração) permite avaliar a

sensibilidade ao longo da gama de trabalho (figura 6.3).
85
Avaliação da sensibilidade do método
7.40E-02
7.20E-02
7.00E-02
6.80E-02
6.60E-02
6.40E-02
6.20E-02
0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000
Concentração (mg N-NO3-/L)
Figura 6.3: Avaliação da sensibilidade do método.
Através da representação gráfica da sensibilidade em função da concentração

é possível concluir que, até uma concentração de 2,000 mg N-NO3-/L há uma ligeira
diminuição dos valores de Sx e consequentemente um aumento da sensibilidade do
método, uma vez que o intervalo entre concentrações que o método é capaz de
discriminar é menor. A partir desta concentração há uma tendência inversa, ou seja,
à medida que a concentração aumenta a sensibilidade do método diminui
ligeiramente.
Ao longo da gama de trabalho a sensibilidade do método varia apenas entre
0,06 mg N-NO3-/L e 0,07 mg N-NO3-/L, pelo que se pode concluir que esta é
praticamente constante.
– Limiares analíticos
O limite de detecção do método (L.D.) foi obtido a partir de parâmetros da curva
de calibração e utilizou-se a equação 6.7 para a sua determinação.
3,3  S 
 y 
3,3x1,34x1 0 3
L.D.   x 
  0,05 mg N  NO 3 /L (6.7)
b 0,0952
O valor do limite de detecção é de 0,05 mg N-NO3-/L.
86
O limite de quantificação do método (L.Q.) em estudo foi obtido a partir da

análise dos resultados de um conjunto de padrões independentes, obtidos em
condições de precisão intermédia, e sobre os quais foram realizados estudos de
precisão e de exactidão. A tabela 6.13 apresenta os resultados obtidos para cada um
dos padrões em estudo.
Tabela 6.13: Resultados relativos ao estudo do limite de quantificação do método.
Concentrações (mg N-NO3-/L)

Ensaio
0,2500 0,5000
1 0,2200 0,5100
2 0,2200 0,5600
3 0,2400 0,5300
4 0,2600 0,5200
5 0,2400 0,5000
6 0,2700 0,4700
7 0,2900 0,5100
8 0,2500 0,4500
9 0,2100 0,5400
10 0,2700 0,5000
Média 0,2500 0,5100
Desvio padrão 2,71x10-2 3,37x10-2
CV (%) 11,0 6,6
Erro relativo (%) 0 1,0
A precisão dos resultados foi avaliada através do coeficiente de variação (CV)

e a exactidão através da quantificação do erro relativo. Geralmente adopta-se como
valor do Limite de quantificação a mais baixa concentração em estudo, desde que os
parâmetros citados revelem níveis aceitáveis, isto é, valores inferiores a 10% (IUPAC).
Neste caso, efectuaram-se 10 ensaios, em condições de precisão intermédia, numa
solução padrão de 0,2500 mgN-NO3-/L. Apesar do erro relativo em relação ao valor
médio ser nulo, o coeficiente de variação, que nos indica a dispersão dos resultados
em relação à média, foi superior a 10%. Deste modo, considerou-se que o coeficiente
de variação não cumpria com as recomendações da IUPAC e não se adoptou esta
concentração para o limite de quantificação do método.
Posteriormente, efectuou-se o mesmo procedimento para uma solução padrão
de 0,5000 mgN-NO3-/L, tendo-se obtido um coeficiente de variação de 7% e um erro
relativo de 1%, pelo que se adoptou este valor para o limite de quantificação do
método.
87
6.2.1.2. Precisão
Neste trabalho a precisão do método foi avaliada através de 2 componentes: a
repetibilidade e a precisão intermédia. Não foi possível avaliar este parâmetro através
da reprodutibilidade do método, uma vez que, não se reuniram as condições
necessárias para a execução deste método noutros laboratórios.
– Repetibilidade
O estudo da repetibilidade do método foi efectuado com 11 amostras: 6 de
águas residuais, 3 de água de consumo e 2 soluções padrão. Cada amostra foi
analisada em replicado (10 ensaios), tendo sido determinado o respectivo limite de
repetibilidade (r), o desvio padrão de repetibilidade e o coeficiente de variação (ISO
5725-6).
Antes de se executar o estudo de repetibilidade do método, utilizou-se o teste
de Grubbs para eliminação de valores aberrantes (ISO 5725-2). Na aplicação deste
teste ordenaram-se os resultados obtidos, calculou-se a média e o desvio padrão e
testaram-se os valores suspeitos, que correspondem à maior e à menor concentração,
através do cálculo do valor de G (equação 6.8).
valor suspeito  média

G (6.8)
desvio padrão
Caso o teste indique a existência de valores aberrantes retira-se esse valor e

repete-se o teste, caso contrário pode-se proceder ao estudo da repetibilidade do
método.
De seguida é apresentado um exemplo (tabela 6.14), para uma das amostras,
das tabelas que foram construídas e que apresentam todos os dados e parâmetros
calculados através da aplicação do teste de Grubbs.
Tabela 6.14: Dados relativos ao teste de Grubbs para a amostra 0303SIL01 (consumo).
Absorvância [NO3-] Concentrações Média Desvio padrão Gexp

88
(mg N-NO3-/L) ordenadas

0,086 0,90 0,87 -1,01
0,087 0,91 0,87
0,091 0,95 0,89
0,096 1,00 0,89
0,085 0,89 0,90
0,91 4,12x10-2
0,083 0,87 0,91
0,088 0,92 0,91
0,085 0,89 0,92
0,083 0,87 0,95 2,38
0,087 0,91 1,00 1,94
A utilização do teste de Grubbs na avaliação dos dados relativos à amostra

0303SIL01 permitiu a detecção de um valor aberrante. O valor de Gexp correspondente
ao valor maior (2,38) foi superior ao valor de G tabelado (2,18, 95%, n=10), pelo que
se recorreu à sua eliminação. De seguida, efectuou-se novamente este teste para o
valor maior, no qual se obteve um valor de Gexp (1,94) inferior ao valor de G tabelado
(2,18) e se considerou o valor válido.
Nas restantes amostras não se detectaram valores aberrantes e avançou-se
directamente para a avaliação da repetibilidade do método. Os resultados obtidos são
apresentados nas tabelas de 6.15 a 6.25.
Águas de Consumo
Tabela 6.15: Resultados associados à avaliação da repetibilidade do método através da amostra

2101IDT01 (água de consumo).
[Nitrato] *Srepetibilidade
Absorvância Média |Xi-Xi-1| R CVr (%)
0,049 0,51 0,01
0,050 0,52 0,02
0,048 0,50 0,02
0,050 0,52 0,05
0,045 0,47 0,01
0,51 2,34x10-2 0,07 5
0,044 0,46 0,05
0,049 0,51 0,01
0,050 0,52 0,00
0,050 0,52 0,00
0,050 0,52
*Desvio padrão de repetibilidade.
89

0802MAC01 (água de consumo).
[Nitrato] Srepetibilidade
Absorvância Média |Xi-Xi-1| r CVr (%)
0,142 1,49 0,08
0,150 1,57 0,12
0,139 1,46 0,12
0,150 1,57 0,01
0,149 1,56 0,02
1,56 4,90x10-2 0,14 3
0,151 1,58 0,00
0,151 1,58 0,04
0,155 1,63 0,05
0,150 1,57 0,00
0,150 1,57

2402EXP02 (água de consumo).
0,161 1,69 0,00
0,161 1,69 0,00
0,161 1,69 0,01
0,162 1,70 0,09
0,153 1,60 0,01
1,68 4,88x10-2 0,14 3
0,154 1,61 0,13
0,166 1,74 0,02
0,168 1,76 0,11
0,158 1,66 0,03
0,161 1,69
Soluções Padrão
Tabela 6.18: Resultados associados à avaliação da repetibilidade do método através do padrão de

0,5000 mg N-NO3-/L.
0,044 0,4590 0,0840
0,052 0,5431 0,0525
0,047 0,4905 0,0315
0,044 0,4590 0,0420
0,048 0,5011 0,0105
0,5116 3,395x10-2 0,0941 7
0,049 0,5116 0,0315
0,052 0,5431 0,0105
0,051 0,5326 0,0210
0,053 0,5536 0,0315
0,050 0,5221
90
Tabela 6.19: Resultados associados à avaliação da repetibilidade do método através do padrão de

5,000 mg N-NO3-/L.
0,472 4,955 0,095
0,481 5,049 0,042
0,477 5,007 0,032
0,474 4,976 0,011
0,473 4,965 0,095
5,014 4,322x10-2 0,1198 1
0,482 5,060 0,084
0,474 4,976 0,074
0,481 5,049 0,021
0,479 5,028 0,042
0,483 5,070
Águas Residuais

0501NEO03 (água residual).
0,236 2,48 0,04
0,232 2,43 0,10
0,241 2,53 0,02
0,239 2,51 0,03
0,242 2,54 0,03
2,50 4,20x10-2 0,12 2
0,239 2,51 0,06
0,233 2,44 0,12
0,244 2,56 0,11
0,234 2,46 0,04
0,238 2,50

1201TAF01 (água residual).
Absorvância Média |Xi-Xi-1| R CVr (%)
0,353 3,71 0,00
0,353 3,71 0,08
0,345 3,62 0,05
0,350 3,67 0,03
0,347 3,64 0,07
3,68 3,54x10-2 0,10 1
0,354 3,72 0,02
0,356 3,74 0,07
0,349 3,66 0,02
0,351 3,68 0,02
0,349 3,66
91

0902MAS01 (água residual).
0,100 1,05 0,10
0,091 0,95 0,04
0,095 0,99 0,04
0,091 0,95 0,02
0,093 0,97 0,03
0,99 3,74x10-2 0,10 4
0,090 0,94 0,08
0,098 1,03 0,00
0,098 1,03 0,00
0,098 1,03 0,02
0,096 1,01

2602CIF01 (água residual).
0,038 0,40 0,05
0,043 0,45 0,03
0,040 0,42 0,06
0,046 0,48 0,05
0,041 0,43 0,03
0,42 2,76x10-2 0,08 7
0,038 0,40 0,00
0,038 0,40 0,03
0,041 0,43 0,01
0,040 0,42 0,02
0,038 0,40

0303SIL01 (água residual).
0,086 0,90 0,01
0,087 0,91 0,04
0,091 0,95 0,06
0,085 0,89 0,02
0,083 0,87 0,90 2,65x10-2 0,05 0,07 3
0,088 0,92 0,03
0,085 0,89 0,02
0,083 0,87 0,04
0,087 0,91
92

1603NEU01 (água residual).
0,077 0,81 0,01
0,078 0,81 0,04
0,082 0,86 0,02
0,084 0,88 0,04
0,080 0,84 0,07
0,87 4,27x10-2 0,12 5
0,087 0,91 0,01
0,086 0,90 0,01
0,087 0,91 0,02
0,089 0,93 0,05
0,084 0,88
Um método apresenta repetitibilidade, com um grau de confiança de 95%, caso

a diferença absoluta entre dois resultados de ensaio consecutivos (Xi-Xi-1) seja inferior
ao limite de repetibilidade (r). Deste modo, todas as amostras em estudo cumprem
com este critério, o que permite afirmar que o método apresenta repetitibilidade.
A repetitibilidade de um método pode ainda ser avaliada através do coeficiente
de variação (CV) que mede o grau de dispersão dos resultados em torno de uma
concentração média. Quando o seu valor é superior a 10% considera-se que há uma
elevada dispersão e que o método apresenta pouca repetitibilidade. Neste caso, todas
as amostras apresentaram CV de repetitibilidade inferiores a 10% e a maioria das
amostras CV inferiores a 5%. Verifica-se que quer para as amostras de águas de
consumo quer para as amostras de águas residuais há um aumento do CV à medida
que a concentração de nitrato nas amostras se aproxima do valor do limite de
quantificação (0,5000 mg N-NO3-/L).
Ao se comparar amostras com uma mesma concentração de nitrato ou
concentrações próximas, mas com diferentes matrizes, é ainda possível retirar
algumas conclusões acerca da influência da matriz da amostra na repetibilidade do
método. Neste caso, comparou-se uma amostra de água de consumo (0802MAC01)
com uma amostra de água residual (0902MAS01), com concentrações próximas, e,
tendo em conta a proximidade dos respectivos coeficientes de variação, 3,2% e 3,8%,
é possível concluir que provavelmente a matriz da amostra não afecta de forma
relevante a repetibilidade do método.
– Precisão intermédia
93
A precisão intermédia de um método pode ser quantificada de diversas formas.

Neste caso, o método utilizado baseou-se na quantificação da precisão intermédia
através de replicados de um padrão, realizados em dias diferentes. Nestas condições,
efectuaram-se 31 ensaios numa solução padrão de 0,5000 mg N-NO3-/L e numa
solução padrão de 5,000 mg N-NO3-/L. Os resultados obtidos são apresentados nas
tabelas 6.26 e 6.27.
Note-se que nestas condições não se realizaram os mesmos ensaios em
amostras, devido ao facto de estas se degradarem em curtos períodos de tempo.
Tabela 6.26: Resultados associados ao estudo da precisão intermédia do método com uma solução
padrão de 0,5000 mg N-NO3-/L.
[Nitrato]
Data Absorvância Média (yk-yméd)2 G
(mg N-NO3-/L)
11-12-2009 0,047 0,4987 0,4880 1,157x10-4
14-12-2009 0,048 0,4953 5,356x10-5
15-12-2009 0,042 0,4308 3,270x10-3 -1,72
17-12-2009 0,045 0,4672 4,333x10-4
18-12-2009 0,041 0,4287 3,511x10-3
21-12-2009 0,044 0,4772 1,170x10-4
22-12-2009 0,046 0,4830 2,487x10-5
23-12-2009 0,047 0,5064 3,385x10-4
29-12-2009 0,049 0,5011 1,712x10-4
15-01-2010 0,052 0,5425 2,972x10-3
18-01-2010 0,052 0,5390 2,606x10-3
19-01-2010 0,045 0,4528 1,235x10-3
21-01-2010 0,047 0,4573 9,418x10-4
27-01-2010 0,042 0,4462 1,742x10-3
29-01-2010 0,045 0,4737 2,032x10-4
01-02-2010 0,043 0,4415 2,158x10-3
05-02-2010 0,040 0,4622 6,663x10-4
10-02-2010 0,046 0,4832 2,248x10-5
12-02-2010 0,045 0,4730 2,236x10-4
15-02-2010 0,046 0,4769 1,227x10-4
22-02-2010 0,050 0,5170 8,444x10-4
25-02-2010 0,048 0,4989 1,202x10-4
03-03-2010 0,049 0,5345 2,165x10-3
08-03-2010 0,048 0,5032 2,307x10-4
11-03-2010 0,050 0,5194 9,861x10-4
16-03-2010 0,047 0,4916 1,303x10-5
19-03-2010 0,052 0,5484 3,654x10-3 1,82
24-03-2010 0,045 0,4697 3,351x10-4
Continuação da tabela 6,26,
94
[Nitrato]
Data Absorvância Média (yk-yméd)2 G
(mg N-NO3-/L)
29-03-2010 0,051 0,5441 0,4880 3,151x10-3
30-03-2010 0,047 0,4975 8,997x10-5
31-03-2010 0,044 0,4662 4,720x10-4
Soma 3,299x10-2
*Si(T) 3,316x10-2
CV (%) 7
*Desvio padrão de precisão intermédia em mg N-NO3-/L.
Tabela 6.27: Resultados associados ao estudo da precisão intermédia do método com uma solução
padrão de 5,000 mg N-NO3-/L.
[Nitrato]
Data Absorvâncias Média (yk-yméd)2 G
(mg N-NO3-/L)
11-12-2009 0,471 5,000 4,982 3,096x10-4
14-12-2009 0,474 4,956 6,849x10-4
15-12-2009 0,475 4,904 6,126x10-3 -2,11
17-12-2009 0,472 4,920 3,904x10-3
18-12-2009 0,476 4,955 7,256x10-4
21-12-2009 0,465 4,951 9,657x10-4
22-12-2009 0,472 4,958 5,963x10-4
23-12-2009 0,468 4,976 4,367x10-5
29-12-2009 0,479 5,037 2,995x10-3
15-01-2010 0,480 5,010 7,803x10-4
18-01-2010 0,480 4,993 1,107x10-4
19-01-2010 0,490 4,939 1,891x10-3
21-01-2010 0,511 4,962 4,023x10-4
27-01-2010 0,470 4,985 7,559x10-6
29-01-2010 0,475 5,000 3,182x10-4
01-02-2010 0,472 4,962 4,051x10-4
05-02-2010 0,429 4,923 3,484x10-3
10-02-2010 0,477 5,001 3,555x10-4
12-02-2010 0,469 4,960 5,019x10-4
15-02-2010 0,472 4,952 9,310x10-4
22-02-2010 0,488 5,037 3,021x10-3
25-02-2010 0,467 4,966 2,659x10-4
03-03-2010 0,460 5,036 2,911x10-3
08-03-2010 0,478 5,029 2,236x10-3
11-03-2010 0,478 5,001 3,555x10-4
16-03-2010 0,477 5,018 1,275x10-3
19-03-2010 0,477 5,022 1,593x10-3
24-03-2010 0,477 4,988 3,971x10-5
29-03-2010 0,474 5,039 3,264x10-3 1,54
95
Continuação da tabela 6,27,

[Nitrato]
Data Absorvâncias Média (yk-yméd)2 G
(mg N-NO3-/L)
30-03-2010 0,472 5,004 4,982 4,909x10-4
31-03-2010 0,469 4,964 3,457x10-4
Soma 4,133x10-2
*Si(T) 3,712x10-2
CV (%) 1
*Desvio padrão de precisão intermédia em mg N-NO3-/L.
Do mesmo modo que no estudo da repetibilidade do método, antes de se

proceder a análise dos resultados, averiguou-se a possível existência de valores
aberrantes. De acordo com os resultados obtidos através da aplicação do teste de
Grubbs não foram detectados valores aberrantes, uma vez que todos os valores de G
são inferiores ao valor de Gcrit= 2,76 (tabelado).
Realizou-se o estudo da precisão intermédia para o padrão de concentração
mais baixa (0,5000 mg N-NO3-/L) e para o padrão de concentração mais elevada
(5,000 mg N-NO3-/L) da gama de trabalho validada, tendo-se obtido variâncias de
precisão intermédia estatisticamente idênticas, segundo a aplicação do teste F, cujos
resultados encontram-se na tabela 6.28.
Tabela 6.28: Resultados associados à aplicação do teste F na comparação de variâncias de precisão

intermédia, resultantes do estudo de um padrão de 0,5000 mg N-NO3-/L e de um padrão de 5,000 mg
N-NO3-/L.
[Nitrato] * S i2 (T) Fexp (95%; 30, 30 gl) Fcrit

(mg N-NO3-/L) (mg N-NO3-/L)2
0,5000 1,100x10-3
1,25 1,84
5,000 1,378x10-3
*Variância de precisão intermédia.
Perante os resultados obtidos assume-se que, nas condições acima referidas,

não existem diferenças significativas de precisão intermédia ao longo da gama de
trabalho.
Existem alguns factores susceptíveis de sofrerem variações, ao logo do tempo.
A fim de se avaliar a influência destes factores nos resultados experimentais,
efectuou-se a comparação dos resultados obtidos em condições de repetibilidade com
os resultados obtidos em condições de precisão intermédia, na sequência do estudo
de soluções padrão de 0,5000 e 5,000 mg N-NO3-/L, em ambas as condições
96
referidas. Deste modo, utilizaram-se os dados das tabelas 6.18, 6.19, 6.26 e 6.27 para
determinar as variâncias de repetibilidade e de precisão intermédia, e aplicou-se o
teste F. Os resultados associados a este estudo são apresentados na tabela 6.29.
Tabela 6.29: Resultados associados à aplicação do teste F na comparação de variâncias de precisão

intermédia com variâncias de repetibilidade, resultantes do estudo de um padrão de 0,5000 mg N-NO3-
/L e de um padrão de 5,000 mg N-NO3-/L.
2
[Nitrato] * *Srepetibili dade * S i2 (T) Fexp (95%; 9, 30 gl) Fcrit
(mg N-NO3-/L) (mg N-NO3-/L)2 (mg N-NO3-/L)2
0,5000 1,153x10-3 1,100x10-3 1,05
2,21
5,000 1,868x10-3 1,378x10-3 1,36
*Variância de precisão intermédia.
**Variância de repetibilidade
Segundo os resultados obtidos é possível concluir que, em ambos os casos,

não há uma influência significativa do factor tempo nos resultados experimentais, visto
que os valores de Fexp obtidos são inferiores ao valor de Fcrit, o que indica que as
variâncias de repetibilidade e as variâncias de precisão intermédia são
estatisticamente idênticas.
Se se considerar que o desvio padrão de precisão intermédia é de 3,712x10-2
mg N-NO3-/L demonstra-se ainda que o método cumpre com os requisitos impostos
na legislação (DL 306/2007; DL 336/98) que definem que, quer para a análise de
águas consumo quer para a análise de águas residuais, o desvio padrão de precisão
intermédia não poderá ser superior a 10% do valor paramétrico, ou seja, (0,1*11,30
mg N-NO3-/L) 1,10 mgN-NO3-/L.
6.2.1.3. Especificidade/Selectividade
A fim de se avaliar a especificidade e a selectividade do método procurou-se
identificar espécies, habitualmente presentes nas amostras de águas de consumo e
de águas residuais analisadas no laboratório do IDIT, que poderiam actuar como
interferentes deste método. Os possíveis interferentes escolhidos foram: o ferro (II), o
nitrito, o sulfato, o cloreto, o zinco, o hidrogenoftalato de potássio, uma mistura de
ácido glutâmico e glucose, e glicina. As concentrações de cada interferente foram
escolhidas com base em estudos prévios, tendo em conta os valores normalmente
obtidos e os valores máximos obtidos.
97
A medição pode sofrer alterações porque os reagentes, a matriz da amostra ou

outros componentes, podem alterar a sensibilidade do método. Por esta razão,
resolveu-se efectuar um conjunto de testes que permitiram avaliar o efeito de
possíveis interferentes.
Os testes consistiram na adição de uma quantidade conhecida de nitrato, a
várias soluções com diferentes concentrações do interferente em causa. Portanto,
supondo que a concentração de nitrato na amostra antes da adição é nula, e sabendo
a concentração da solução após a adição, efectuaram-se ensaios de recuperação com
o objectivo de avaliar se o efeito do interferente é ou não significativo, ou se apenas o
é a partir de determinada concentração. Geralmente, aceitam-se taxas de
recuperação entre 80% e 120% (D. Harvey, 2000), sendo estas determinadas pela
equação 6.9:
 
[NO 3 ] após adição  [NO 3 ] antes adição
Recuperaçã o(%)  
(6.9)
[NO 3 ] adicionada
As adições efectuadas correspondem a concentrações ao longo da gama de

trabalho, de modo a avaliar o efeito do interferente à medida que a concentração de
nitrato aumenta.
Inicialmente estudou-se a interferência de ferro (II), tendo-se preparado 4
soluções de diferentes concentrações e adicionado, a cada uma, diferentes
quantidades de nitrato. A tabela 6.30 apresenta as percentagens de recuperação
associadas ao estudo da interferência de ferro (II) no método, para 4 níveis de
concentração de interferente (10,00 mg/L, 20,00 mg/L, 100,0 mg/L e 1,000 g/L).
Tabela 6.30: Taxas de recuperação associadas à interferência de ferro (II) no método, para 4 níveis
de concentração do interferente.
[Ferro (II)] (mg/L)

[Nitrato]adicionada (mg N-NO3-/L)
10,00 20,00 100,0 1000
0,5000 104 102 140 29
1,000 98 80 134 27
3,000 97 102 120 91
5,000 98 107 114 152
98
Através dos resultados obtidos é possível concluir que o ferro (II) pode causar
interferências na determinação de nitrato.
Para concentrações de ferro (II) de 10,00 e 20,00 mg/L não se verificam
interferências significativas, uma vez que as taxas de recuperação obtidas estão
dentro do intervalo de aceitação (80%-120%).
Quando a concentração de ferro (II) é de 100,0 mg/L verifica-se um aumento das
taxas de recuperação de nitrato, sendo este mais significativo para concentrações de
nitrato mais baixas, de 0,5000 mg N-NO3-/L e de 1,000 mg N-NO3-/L. Neste caso, as
taxas de recuperação obtidas chegam a ultrapassar os valores do intervalo de
aceitação, o que indica que a interferência de ferro (II) é significativa.
Para uma concentração de 1,000 g/L de ferro (II), obtêm-se taxas de
recuperação muito baixas, de 29% e de 27% que correspondem a adições de nitrato
de 0,5000 mg N-NO3-/L e de 1,000 mg N-NO3-/L, respectivamente. Para uma adição
de 3.000 mg N-NO3-/L não se verifica um efeito significativo do interferente (91%),
contudo, com a adição de 5,000 mg N-NO3-/L observa-se um aumento significativo da
taxa de recuperação de nitrato (152%). Esta situação indica que, para esta
concentração de ferro (II), ocorre um efeito significativo deste interferente, pelo que
não se detecta um aumento do sinal constante com o aumento das concentrações de
nitrato adicionadas.
Uma vez que se comprovou que, em determinadas condições, a presença de
ferro (II) pode causar grande interferência no método, deve-se, sempre que possível,
determinar a sua concentração na amostra e, sempre que for necessário, devem ser
tomadas medidas no sentido de eliminar a interferência ou o interferente.
Posteriormente, são apresentados na tabela 6.31 os resultados relativos à

interferência causada pelo nitrito. Esta interferência foi estudada para 5 níveis de
concentração (100,0 µg N-NO2-/L, 200,0 µg N-NO2-/L, 1,000 mg N-NO2-/L, 2,000 mg
N-NO2-/L e 10,00 mg N-NO2-/L).
99
Tabela 6.31: Taxas de recuperação associadas à interferência de nitrito no método, para 5 níveis de
concentração do interferente.
[Nitrito] (mg N-NO2-/L)

[Nitrato]adicionada (mg N-NO3-/L)
0,1000 0,2000 1,000 2,000 10,00
0,5000 117 126 155 174 372
1,000 109 123 121 128 228
3,000 97 104 95 94 133
5,000 98 100 92 93 111
O nitrito é logicamente um dos interferentes deste método. Contudo, este teste

foi executado no sentido de avaliar a sua interferência à medida que a sua
concentração aumenta e à medida que a concentração de nitrato adicionada aumenta.
Esta experiência foi também executada com o objectivo de identificar possíveis
concentrações de nitrito em que a sua interferência deixa de ser significativa, e
possibilita a eliminação da etapa de remoção prévia de nitrito da amostra.
Na tabela 6.31 observa-se que para todos os níveis de concentração de nitrito
ocorre uma redução das taxas de recuperação de nitrato, à medida que a
concentração de nitrato adicionada aumenta. No entanto, a redução que ocorre é mais
significativa para concentrações de interferente mais elevadas, de 1,000 mg N-NO2-
/L, 2,000 mg N-NO2-/L e 10,00 mg N-NO2-/L.
Para concentrações de interferente de pelo menos 0,1000 mg N-NO2-/L e
inferiores pode assumir que o efeito do interferente não é significativo, já que, as taxas
de recuperação obtidas estão dentro do intervalo de aceitação (80%-120%).
Os resultados da tabela 6.32 referem-se às taxas de recuperação de nitrato,

associadas às interferências de sulfato, cloreto e zinco no método. Para estes 3
interferentes testou-se apenas um nível de concentração (1,000 g/L).
Tabela 6.32: Taxas de recuperação associadas às interferências de sulfato, cloreto e zinco no

método.
[Nitrato]adicionada [Sulfato] [Cloreto] [Zinco]

(mg N-NO3-/L) 1,000 g/L 1,000 g/L 1,000 g/L
0,5000 107 98 98
3,000 91 100 97
5,000 95 98 97
100
Nos estudos da influência de sulfato, cloreto ou zinco no método de ensaio,

começou-se com uma concentração de 1,000 g/L, tendo em conta que, geralmente,
estas amostras nunca atingem concentrações superiores a esta.
Para este nível de concentração dos interferentes não se obtiveram taxas de
recuperação fora do intervalo de aceitação (80%-120%), pelo que se pode considerar
que estes não são interferentes significativos do método.
Posteriormente, efectuou-se o estudo da interferência de matéria orgânica na
determinação de nitrato utilizando, para o efeito, soluções de uma mistura de ácido
glutâmico e glucose, soluções de hidrogenoftalato de potássio (KHP) e soluções de
glicina.
Os resultados das tabelas 6.33, 6.34 e 6.35, apresentam as taxas de
recuperação, associadas aos interferentes mencionados.
Tabela 6.33: Taxas de recuperação associadas à interferência de ácido glutâmico e glucose no

método, para 4 níveis de concentração do interferente.
Concentração de ácido glutâmico e glucose (g/L)

[Nitrato]adicionada
(mg N-NO3-/L) 0,0500 + 0,0500 0,0700+ 0,0700 0,3500 + 0,3500 3,500 + 3,500
(CBO≈70) (CBO≈100) (CBO≈500) (CBO≈5000)
0,5000 115 109 109 193
1,000 105 100 108 132
3,000 100 93 101 92
5,000 101 94 99 92
Relativamente à interferência de ácido glutâmico e glucose é possível concluir

que para os três primeiros níveis de concentração desta mistura há uma ligeira
redução das taxas de recuperação, com o aumento da concentração de nitrato
adicionada. Contudo, todas as taxas de recuperação de nitrato encontram-se dentro
do intervalo de aceitação, compreendido entre 80% e 120%, o que indica que apesar
da existência de interferências é possível a aplicação do método.
Quando a amostra contém 3,500 g/L de cada um dos componentes ocorre uma
redução significativa das taxas de recuperação, à medida que a concentração de
nitrato adicionado aumenta. Neste caso, verifica-se que para concentrações de nitrato
de 0,5000 mg N-NO3-/L e de 1,000 mg N-NO3-/L ocorrem interferências significativas,
uma vez que, as taxas de recuperação obtidas (193% e 132%) ultrapassam
largamente os limites estabelecidos.
A carência bioquímica de oxigénio (CBO) corresponde à quantidade de
oxigénio consumido na degradação de matéria orgânica por processos biológicos.
101
Esta é uma análise que se executa frequentemente no laboratório em amostras de

águas residuais, pelo que poderá ser útil tentar compreender a relação entre o seu
valor e a interferência ocorrida. Neste caso, verifica-se que apenas ocorrem
interferências significativas quando o valor da CBO é de 5000 e a concentração de
nitrato presente é de 0,5000 mg N-NO3-/L e de 1,000 mg N-NO3-/L.
Tabela 6.34: Taxas de recuperação associadas à interferência de KHP no método, para 4 níveis de
[Nitrato]adicionada Concentração de KHP (g/L)

(mg N-NO3-/L) 0,0900 0,8500 8,500 17,00
(CQO=100) (CQO=1000) (CQO=10000) (CQO:20000)
0,5000 105 115 105 128
1,000 108 104 104 108
3,000 102 101 104 96
5,000 103 103 102 96
Segundo as taxas de recuperação determinadas para diversas concentrações

de KHP, ao longo da gama de concentrações de nitrato adicionadas, é possível
concluir que a influência do interferente apenas é significativa quando a concentração
de nitrato é de 0,5000 mg N-NO3-/L e a concentração do interferente na matriz é de
17,00 g/L (%R=128). A esta concentração de KHP obteve-se uma carência química
de oxigénio (CQO) de 20000 mg O2/L. A CQO mede a quantidade de matéria orgânica
susceptível de ser oxidada por meios químicos. Um valor de CQO de 20000 é muito
raro na maioria das amostras de águas residuais, contudo, quando tal acontece, a
concentração de nitrato geralmente presente na amostra permite efectuar diluições e
reduzir o efeito do interferente.
Para os restantes níveis de concentração de KHP, a diferentes concentrações
de nitrato adicionadas, não se verificaram interferências significativas, uma vez que
as taxas de recuperação obtidas estão dentro do intervalo de aceitação.
Tabela 6.35: Taxas de recuperação associadas à interferência de glicina no método, para 4 níveis de
[Nitrato]adicionada Concentração de glicina (mgN/L)

(mg N-NO3-/L) 6,000 13,00 65,00 653,0
0,5000 105 98 113 94
1,000 97 95 99 86
3,000 96 93 92 83
5,000 99 94 91 88
102
No que diz respeito à interferência de glicina no método, não existem taxas de

recuperação com valores fora do intervalo entre 80% e 120%, pelo que se pode
considerar que, nesta gama de concentrações, a interferência causada pela glicina
não é significativa. No entanto, à medida que a concentração de glicina aumenta, há
uma tendência para a redução das taxas de recuperação em 10%.
Após o estudo de possíveis interferentes e do efeito das suas interferências,
procurou-se encontrar algumas técnicas capazes de eliminar, ou minimizar, os efeitos
dos constituintes não desejados. Geralmente utilizam-se técnicas que permitem a
separação física do constituinte desejado daqueles que interferem, ou a conversão
química do constituinte indesejável numa espécie que não interfira.
As técnicas de comparação são muitas vezes usadas, embora inerentemente
menos satisfatórias que o uso de uma separação física ou duma reacção química. Se
a composição da amostra a analisar não se conhece, pode ser convenientemente
empregada a técnica de adição padrão.
– Método de adição padrão

Neste trabalho, aplicou-se o método de adição padrão para a determinação de
nitrato num conjunto de amostras de águas residuais e de águas de consumo. O
objectivo era encontrar um método capaz de corrigir os efeitos de matriz de amostras
complexas, e de corrigir os efeitos que afectam a sensibilidade do método. Assim,
contabilizando as diferenças entre ambos os métodos de quantificação, através da
comparação das concentrações obtidas, utilizando o teste t de comparação de médias
(D. Harvey, 2000), é possível identificar problemas no desempenho do método.
Antes da análise, efectuaram-se diluições nas amostras, de forma a reduzir o
máximo de interferências possível. Estas foram ainda submetidas, sempre que
necessário, à remoção prévia de nitrito.
De seguida, são apresentados os resultados obtidos para 5 águas residuais
nas quais se verificaram diferenças significativas de desempenho entre o método de
adição padrão e o método da curva de calibração. Os resultados das restantes
amostras são apresentados no anexo I.
103
Tabela 6.36: Aplicação do método de adição padrão na amostra 0902MAS01.
[Nitrato]
Amostra Método Equação da recta Sx texp *tcrit
(mg N-NO3-/L)
Adição padrão y=0,0870x+0,0507 0,58 2,8x10-2
0902MAS01 6,26 2,31
Curva de calibração y=0,0954x-0,0001 0,50 1,7x10-2
*Valor de t-student para um grau de confiança de 95%, 4 e 5 (n-2) graus de liberdade.
0.500
Absorvância
0.300
0.100 y = 0,0870x + 0,0507

R² = 0,9996
-1.000 0.000 1.000 2.000 3.000 4.000
-0.100
Figura 6.4: Representação gráfica do método de adição padrão para a amostra 0902MAS01.
Tabela 6.37: Aplicação do método de adição padrão na amostra 0203VEU04.

[Nitrato]
(mg N-NO3-/L)
0203VEU04 16,79 2,31
Curva de calibração y=0,0913x+0,0002 0,66 7,7x10-3
104
Figura 6.5: Representação gráfica do método de adição padrão para a amostra 0203VEU04.
As amostras 0902MAS01 e 0203VEU04 eram incolores, apresentavam pouca

quantidade de sólidos suspensos totais (SST<10,00 mg/L), foram filtradas e diluídas
20 vezes e 10 vezes respectivamente.
Através do teste t, de comparação de médias, conclui-se que as concentrações
obtidas por ambos os métodos são estatisticamente diferentes (t exp>tcrit), para ambas
as amostras. Estes resultados apontam para a eventual presença de pelo menos um
interferente. Contudo, os resultados dos ensaios de recuperação, efectuados em
ambas as amostras, foram de 94% e 91% respectivamente, o que indica que com
base no critério de aceitação de taxas de recuperação normalmente utilizado (80%-
120%), estes resultados seriam aceites.
Apesar de não se saber a composição destas amostras, teve-se acesso aos
resultados das análises de CQO e CBO. Tendo em conta o efeito da diluição, obteve-
se, para a amostra 0902MAS01, um valor de CQO <2 mg O2/L e um valor de CBO
<0,4 mg O2/L. Para a amostra 0203VEU01 obteve-se um valor de CQO <4 mg O2/L e
um valor de CBO <0,9 mg O2/L. Os resultados obtidos para ambas amostras indicam
que, à partida, não houve interferência de matéria orgânica no método.
Nestas amostras não foi possível identificar os interferentes em causa, no
entanto, tudo indica que através do método de adição padrão esta interferência é
eliminada.
105
Tabela 6.38: Aplicação do método de adição padrão na amostra 1802COR01.

[Nitrato]
(mg N-NO3-/L)
1802COR08 11,97 2,31
Curva de calibração y=0,0969x-0,0001 0,23 6,9x10-2
0.200
Absorvância
0.150
0.100
0.050 y = 0,0407x + 0,0227

R² = 0,9998
0.000
-1.000 0.000 1.000 2.000 3.000 4.000
-0.050
Figura 6.6: Representação gráfica do método de adição padrão para a amostra 1802COR01.
A amostra 1802COR01 foi recolhida após tratamento físico-químico,

apresentava cor amarela, elevada quantidade de espuma, cheiro intenso e poucos
sólidos suspensos. A amostra foi filtrada e diluída 40 vezes antes de se aplicar o
método de adição padrão. Após a reacção de redução a amostra era incolor, pelo que
não houve qualquer interferência no desenvolvimento de cor da amostra.
Segundo os resultados obtidos é possível concluir que ocorrem interferências
significativas na utilização do método da curva de calibração, uma vez que, o
coeficiente angular obtido pelo método de adição padrão corresponde a metade do
obtido pelo outro método de quantificação.
Os resultados obtidos através de outras análises realizadas no laboratório não
permitiram retirar grandes conclusões. Contudo, sabe que a amostra após diluição
apresentava um valor de CQO de 625 mg O2/L e que é constituída por óleos e
gorduras.
Apesar de toda a incerteza relativa a esta amostra, supõe-se que o método de
adição padrão tenha sido capaz de eliminar este tipo de interferências.
106
Tabela 6.39: Aplicação do método de adição padrão na amostra 0303SIL01.

[Nitrato]
(mg N-NO3-/L)
0303SIL01 16,95 2,31
Figura 6.7: Representação gráfica do método de adição padrão para a amostra 0303SIL01.
A amostra 0303SIL01 não apresentava cor e possuía poucos sólidos

suspensos. Antes de ser analisada foi filtrada e diluída 10 vezes.
Neste caso, as concentrações obtidas por ambos os métodos são
estatisticamente diferentes e a concentração obtida pelo método da curva de
calibração é superior.
Efectuou-se um ensaio de recuperação com o objectivo de se saber se o valor
obtido se encontrava dentro do intervalo de aceitação de taxas de recuperação,
compreendido entre 80% e 120%. O resultado obtido foi de 118% o que indica que
está dentro do intervalo de aceitação e o resultado obtido pelo método de
quantificação da curva de calibração ainda seria aceite.
Apesar de não se saber a composição da amostra e o tipo de interferências
presentes, admite-se, tendo em conta o comportamento constante ao longo da
representação gráfica, que o método de adição padrão consegue eliminar este tipo de
interferências.
107
Tabela 6.40: Aplicação do método de adição padrão na amostra 0503SON01.

[Nitrato]
(mg N-NO3-/L)
0503SON01 5,83 2,36
Figura 6.8: Representação gráfica do método de adição padrão para a amostra 0503SON01.
A amostra 0503SON01 era uma amostra composta recolhida de um efluente à

entrada do tratamento físico-químico. A sua cor era castanho-escuro e possuía 2,20
g/L de sólidos suspensos.
A concentração obtida através do método da curva de calibração é superior à
concentração obtida através do método de adição padrão. A amostra apresentava um
valor de CQO de 1650 mg O2/L e 23 mg/L de azoto amoniacal, o que indica a presença
de uma quantidade apreciável de matéria orgânica e de amoníaco, que são
compostos que podem ser facilmente oxidados pelo ácido nítrico e contribuir para o
aumento da concentração de nitrito formado e consequentemente para o aumento da
concentração de nitrato determinada.
Neste caso, também se supõe que o método de adição padrão tenha sido
capaz de eliminar este tipo de interferências.
108
Utilizando o método de adição padrão, foram ainda efectuadas determinações

de nitrato a mais 7 amostras de águas residuais, para as quais não se obtiveram
diferenças significativas entre as concentrações obtidas a partir dos 2 métodos de
quantificação. Foram ainda analisadas 5 amostras de água de consumo, não se tendo
obtido concentrações de nitrato estatisticamente diferentes.
Através da análise dos resultados obtidos é possível concluir que em
determinadas condições a determinação de nitrato deverá ser efectuada recorrendo
ao método de adição padrão. É, portanto, crucial, definir as condições em que este
método deve ser executado. Uma forma simples e rápida de identificar consiste na
realização de pelo menos um ensaio de recuperação. Se o seu resultado não estiver
incluído no intervalo de aceitação compreendido entre 80% e 100%, deve-se efectuar
a determinação de nitrato através do método de adição padrão.
Por outro lado, através de algumas características de determinadas amostras
pode-se-á ter ideia da complexidade da matriz da amostra e por conseguinte da
presença de mais ou menos interferentes. Estas características estão normalmente
associadas à cor, cheiro, quantidade de partículas dissolvidas e à presença de
espuma. Na presença de uma amostra de cor, que apresente cheiro intenso, elevada
quantidade de partículas e formação de espuma, deve-se ter especial atenção, uma
vez que esta é uma amostra que à partida possui vários interferentes e que
provavelmente necessita de ser analisada através do método de adição padrão.
6.2.1.4. Robustez
A avaliação da robustez do método foi efectuada através do planeamento
factorial de Plackett-Burman, para uma amostra de água residual e para uma amostra
de água de consumo. A selecção dos 5 factores foi executada através da análise
pormenorizada das prescrições do método e da experiência pessoal e histórica. Para
cada factor em estudo definiu-se o valor nominal e as respectivas variações, tal como
descrito na tabela 6.41. No modelo de Plackett-Burman o símbolo “mais” (+)
representa o valor nominal mais a variação definida e o símbolo “menos” (-) representa
o valor nominal menos a variação definida.
Tabela 6.41: Parâmetros definidos para os factores utilizados no estudo da robustez do método.
Factor Valor nominal Variação

109
Tempo de incubação (A) 3 min ± 20 s

Volume de sulfanilamida (B) 200 μL ± 10 μL
Volume de NEDA (C) 200 μL ± 10 μL
Volume de HCl (D) 2,00 mL ± 0,20 mL
Tempo de desenvolvimento de cor (E) 30 min ± 1 min
De seguida estabeleceram-se as condições de realização da série de ensaios

e procedeu-se à sua execução.
Segundo o modelo de Plackett-Burman, para um conjunto de 5 factores
realizaram-se 8 experiências em triplicado. As tabelas 6.42 e 6.43 apresentam o
modelo construído e os resultados em cada uma das 8 experiências.
Amostra de água residual 1003TAF02
Tabela 6.42: Modelo de Plackett-Burman.

Factores
Experiências Resposta
A B C D E
1 + + + - + 0,324
2 - + + + - 0,274
3 - - + + + 0,287
4 + - - + + 0,261
5 - + - - + 0,330
6 + - + - - 0,335
7 + + - + - 0,248
8 - - - - - 0,312
Tabela 6.43: Resultados obtidos para cada experiência em absorvância.
Experiência Ensaios Média Desvio padrão Variância CV(%)

0,327
1 0,322 0,324 5,00x10-3 2,50x10-5 1
0,324
0,270
2 0,279 0,274 4,51x10-3 2,03x10-5 2
0,274
0,292
3 0,288 0,287 5,57x10-3 3,10x10-5 2
0,281

0,263
4 0,261 4,33x10-6 1
0,260
110
2,08x10-3
0,259
0,325
5 0,329 0,330 5,03x10-3 2,53x10-5 2
0,335
0,333
6 0,338 0,335 2,52x10-3 6,33x10-6 1
0,335
0,244
7 0,251 0,248 3,61x10-3 1,30x10-5 2
0,249
0,309
8 0,310 0,312 3,79x10-3 1,43x10-5 1
0,316
O efeito de cada factor no resultado experimental é dado pela equação 6.10:
EX 
 Y( )   Y( ) (6.10)
N/2 N/2
Em que x corresponde ao factor em estudo, ∑Y(+) corresponde ao somatório

das respostas médias das experiências em que ocorreu uma variação positiva do valor
nominal (+) e ∑Y(-) corresponde ao somatório das respostas médias das experiências
em que ocorreu uma variação negativa do valor nominal.
Os efeitos podem ainda ser normalizados relativamente à média dos resultados
experimentais [EX (%)], o que permite ao analista considerar o peso da influência de
cada um dos factores (equação 6.11).
EX
E X (%)   100 (6.11)
Y
Em que Y corresponde à resposta média, resultante das 8 experiências

executadas ( Y = 0,296).
Efectuaram-se os cálculos dos efeitos de cada factor e os resultados são
apresentados na tabela 6.44.
Tabela 6.44: Efeitos dos factores em estudo.
Factores EX EX(%)
-3
A 8.75x10 3.0
B 4.75x10-3 1.6
C 1.73x10-2 5.8
111
D 5.78x10-2 19.5
E 8.25x10-3 2.8
Através dos resultados obtidos é possível concluir que os factores que

exerceram maior efeito nos resultados obtidos foram o C (volume de NEDA) com 5,8%
e o D (volume de HCl) com 19,5%.
Realizou-se ainda um teste estatístico, o teste t, com o objectivo de se saber
se os efeitos dos factores são estatisticamente significativos e a partir de que valor o
são. Neste teste o valor de texp é dado por:
EX
t (6.12)
(SE)e
Em que (SE)e representa a variabilidade experimental e é determinado a partir

da equação 6.13:
4S 2
(SE)e  (6.13)
N
Sendo S2 (1.50x10-5) a média das variâncias dos resultados obtidos, para cada
uma das experiências efectuadas, apresentadas na tabela 6.39.
Os valores de t calculados para cada factor são apresentados na tabela 6.45.
Tabela 6.45: Valores de texp determinados para cada factor.
Factores EX (SE)e texp tcrit

A 8,75x10-3 3,18
B 4,75x10-3 1,73
C 1,73x10-2 2,75x10-3 6,27 2,12
D 5,78x10-2 21,00
E 8,25x10-3 3,00
Os resultados apresentados indicam que para uma amostra de água residual o

método não demonstrou ser robusto para a maioria dos factores em estudo. Os
valores de texp obtidos para 4 factores, susceptíveis de afectarem os resultados
112
experimentais, foram superiores ao valor de tcrit (2,12; 95%; 16gl), o que indica que os
seus efeitos são estatisticamente significativos. Contudo, há que reconhecer a
posteriori que houve um certo exagero na escolha da variação do volume de HCl (10%
do valor nominal), o que justifica o valor elevado de texp que se obteve. O método
apenas se revelou robusto para pequenas variações efectuadas no volume de
sulfanilamida (factor B).
Em geral, os resultados obtidos para uma amostra de água residual
demonstram que o método apresenta baixa robustez. No entanto, os resultados
satisfatórios dos ensaios de precisão e também de exactidão comprovam que os
factores em estudo podem, se cuidadosamente controlados, não afectar o resultado
final.
Amostra de água de consumo 0303SIL01
Tabela 6.46: Modelo de Plackett-Burman.

Factores
Experiências Resposta
A B C D E
1 + + + - + 0,188
2 - + + + - 0,167
3 - - + + + 0,171
4 + - - + + 0,164
5 - + - - + 0,183
6 + - + - - 0,195
7 + + - + - 0,154
8 - - - - - 0,185
Tabela 6.47: Resultados obtidos para cada experiência em absorvância.

0,188
1 0,189 0,188 5,77x10-4 3,33x10-7 0,3
0,188
0,168
2 0,164 0,167 2,31x10-3 5,33x10-6 1,4
0,168
0,168
3 0,168 0,171 5,20x10-3 2,70x10-5 3,0
0,177
Continuação dos resultados da tabela 6.47.

4 0,159 0,164 4,6
113
0,161 7,57x10-3 5,73x10-5

0,173
0,183
5 0,183 0,183 5,77x10-4 3,33x10-7 0,3
0,184
0,194
6 0,196 0,195 1,15x10-3 1,33x10-6 0,6
0,194
0,153
7 0,153 0,154 2,31x10-3 5,33x10-6 1,5
0,157
0,192
8 0,181 0,185 5,86x10-3 3,43x10-5 3,2
0,183
Para a amostra de água de consumo, os resultados dos cálculos dos efeitos

normalizados de cada factor são apresentados na tabela 6.48.
Tabela 6.48: Efeitos dos factores em estudo.
Factores EX EX(%)
A 1,25x10-3 0,7
B 5,75x10-3 3,3
C 8,75x10-3 5,0
D 2,38x10-2 13,5
E 1,25x10-3 0,7
Os resultados obtidos indicam que os factores que exercem maior efeito, tal
como se verificou para a amostra de água residual, são o factor C com 5% (volume
de NEDA) e o factor D (volume de HCl) com 13,5%. No entanto, nesta amostra o efeito
deste 2 factores é menos significativo do que na amostra de água residual.
Relativamente ao factor A (tempo de incubação) há também uma redução do
seu efeito na amostra de água de consumo. Contudo, com o factor B ocorreu o aposto,
ou seja, o seu efeito é mais significativo na amostra de água de consumo e este foi o
único em que ocorreu esta situação.
Na tabela 6.49 são apresentados os resultados do teste estatístico efectuado,
no sentido de avaliar se os efeitos dos factores são estatisticamente significativos.
Tabela 6.49: Valores de texp determinados para cada factor.
Factores EX (SE)e texp tcrit

A 1,25x10-3 0,44
2,87x10-3 2,12
B 5,75x10-3 2,00
114
C 8,75x10-3 3,05
D 2,38x10-2 8,29
E 1,25x10-3 0,44
Através dos valores de texp obtidos é possível concluir que para a amostra de
água de consumo verifica-se que existem 2 factores, o B e o C, cujos efeitos são
estatisticamente significativos.
Contrariamente aos resultados obtidos para a amostra de água residual, os
factores A e E não apresentaram efeitos significativos do ponto de vista estatístico,
pelo que se pode concluir que há uma menor tendência para que o desempenho do
método seja afectado por pequenas variações dos factores em estudo.
Analogamente às amostras de águas residuais, demonstrou-se através da
avaliação da precisão e da exactidão do método, que é possível controlar os factores
em estudo de modo a não afectar o resultado final.
6.2.2. Avaliação Directa

Este tipo de avaliação tem como principal objectivo determinar a exactidão do
método de ensaio. Neste processo de validação a avaliação da exactidão do método
foi efectuada através de ensaios interlaboratoriais e de testes comparativos.
Ensaios interlaboratoriais
Realizaram-se dois ensaios interlaboratoriais em diferentes períodos, um com
uma água de consumo e outro com uma água residual.
A amostra de água de consumo era incolor e possuía poucos sólidos
suspensos. Inicialmente filtrou-se a amostra e determinou-se a concentração de nitrito
presente. Como a concentração de nitrito foi de 8,09 µgN-NO2-/L não se efectuou a
sua remoção e procedeu-se de imediato à execução do método de determinação de
nitrato.
A amostra foi analisada sem diluição e diluída 5 vezes, tendo-se obtido os
seguintes resultados:
– [NO3-] (sem diluição) = 2,17 mg N-NO3-/L (A=0,206) = 9,55 mg NO3-/L.

– [NO3-] (diluída 5 vezes) = 0,48*5 = 2,41 mg N-NO3-/L (A=0,046) = 10,60 mg NO3-/L12.
12 Nota: 1 mg N-NO3-/L ≈ 4.4 mg NO3-/L.

115
Neste caso, considerou-se a concentração obtida após diluição.

O valor de referência, aceite como verdadeiro, corresponde a 10,1 mg NO3-/L
e o desvio padrão associado é de 0,4 mg/L. Assim, o factor de desempenho do
laboratório (Z) corresponde ao valor obtido pela equação 3.19.
(X lab  X v ) 10,60  10,1

Z   1,3
S 0,4
Como o valor de Z encontra-se no intervalo entre -3 e 3, considera-se que o

desempenho do método é satisfatório.
Uma vez que se efectuou o cálculo da incerteza do valor obtido, o valor
verdadeiro (Xv) deve estar dentro do intervalo de incerteza de Xlab. Quando tal não
acontece, este intervalo pode estar subestimado. Nestes casos, é geralmente
empregue o conceito de erro normalizado (En) para efectuar a avaliação do
desempenho:
(X lab  X v ) 10,60  10,1

En    0,81 (6.14)
2
Ulab  Uref
2
0,14 2  0,6 2
Em que:
Xlab – corresponde ao valor obtido pelo método interno.
Uref – incerteza associada ao valor verdadeiro.
Ulab – incerteza associada ao valor obtido (determinada na secção 2.4 capítulo 6).
Como |En| ≤ 1, então Ulab está bem estimada.
A amostra de água residual analisada era ligeiramente amarelada e possuía

alguns sólidos suspensos (SST=135 mg/L). Antes da sua análise, filtrou-se a amostra
e determinou-se a concentração de nitrito presente. Como a concentração obtida foi
inferior a 5,00 µgN-NO2/L não se efectuou a sua eliminação e procedeu-se à
determinação de nitrato.
A amostra foi diluída 5, 10 e 20 vezes, tendo-se obtido os seguintes resultados:
116
– [NO3-] (sem diluição) = < 0,50 mg N-NO3-/L.

– [NO3-] (diluída 5 vezes) = < 0,50 mg N-NO3-/L.
As concentrações obtidas foram unânimes e, portanto, este foi o resultado

utilizado no cálculo do factor de desempenho do laboratório.
O valor de referência, aceite como verdadeiro, é de 1,51 mg N-NO3-/L e o desvio
padrão associado é de 0,51 mg/L. Assim, o factor de desempenho do laboratório (Z)
é dado pela equação 3.19:
(Xlab  Xv) 0,50  1,51

Z   2,0
S 0,51

Efectuou-se também o cálculo do erro normalizado (En), da mesma forma que
no ensaio interlaboratorial anterior:
(X lab  X v ) 0,50  1,51

En    1
2
Ulab  Uref
2
0,14 2  0,9 2
Como |En| ≤ 1, então Ulab está bem estimada.
Testes comparativos
O principal objectivo dos testes comparativos é avaliar a exactidão do método
interno relativamente ao de referência. Neste caso, o método de referência é a
cromatografia de permuta iónica e os ensaios foram executados num laboratório
alemão acreditado (GBA).
Antes de serem enviadas, as 5 amostras foram diluídas, filtradas e preservadas
com ácido sulfúrico a pH<2. Devido à possível degradação das amostras e alteração
da concentração de nitrato, as amostras voltaram a ser analisadas, em triplicado, no
dia em que chegaram ao laboratório alemão.
117
Neste caso avaliou-se a exactidão do método de ensaio através do cálculo do

erro relativo (Er), expresso em percentagem (equação 6.15), para cada amostra
analisada.
(X lab  X v )
Er(%)   100 (6.15)
Xv
Em que:
Xlab- corresponde ao resultado obtido pelo método em estudo.
Xv – corresponde ao valor de referência, obtido a partir do método de referência.
Os erros relativos de cada uma das amostras analisadas encontram-se na

tabela 6.50.
Tabela 6.50: Erros relativos das amostras utilizadas no processo de comparação de métodos.
Amostras Xlab (mg N-NO3-/L) Xv (mg N-NO3-/L) Er (%) Erro absoluto

0303SIL01 1,84 1,90 3 0,06
0903IMO02 2,89 2,70 7 0,19
0503MAS01 1,92 2,00 4 0,08
1003TAF02 2,82 2,70 4 0,12
3003FER01 0,77 0,75 2 0,02
Os métodos analíticos podem ser divididos em 3 grupos de acordo com a

magnitude dos seus erros relativos. Quando um resultado (Xlab) apresenta um erro
relativo de 1% relativamente ao valor de referência (Xv), o método analítico possui
elevada exactidão. Os métodos que apresentem erros relativos entre 1% e 5% têm
exactidão moderada, e os que possuem erros relativos superiores a 5% apresentam
baixa exactidão (D. Harvey, 2000).
Neste caso, tendo em conta as 5 amostras em estudo, 20% das amostras
analisadas possuem um erro relativo superior a 5% e 80% das amostras analisadas
possuem um erro relativo entre 1% e 5%, pelo que se pode admitir que o método
possui exactidão moderada.
118
6.2.3. Determinação da incerteza do método
6.2.3.1. Incerteza associada à precisão do método

Neste processo, a incerteza associada à precisão do método (u´precisão) foi
determinada através dos desvios padrão de precisão intermédia, determinados
anteriormente. Como a incerteza relativa associada à precisão varia ao longo da gama
de trabalho, efectuou-se a sua determinação para o padrão de menor concentração
(0,5000 mg N-NO3-/L) e para o padrão de maior concentração (5,000 mg N-NO3-/L) da
gama de trabalho.
Para uma concentração de 0,5000 mg N-NO3-/L, Si(T)=3,322x10-2 mg N-NO3-
/L, a incerteza relativa associada à precisão do método é dada pela equação 5.3.
Si 3,32x10 2
uprecisão    6,64x10 2
y 0,5000
Para uma concentração de 5,000 mg N-NO3-/L, Si (T) = 3,712 x10-2 mg N-NO3-

/L, a incerteza relativa associada à precisão do método é dada pela equação 5.3.
Si 3,71x10 2
uprecisão    7,42x10 3
y 5,000
Através desta metodologia apenas é possível estimar a precisão do método

num nível de concentração e considerando um tipo de matriz. Por este motivo, com o
objectivo de determinar a incerteza total máxima, optou-se por utilizar a incerteza
relativa associada à precisão intermédia do padrão de menor concentração (0,5000
mg N-NO3-/L), que corresponde a 6,64x10-2.
6.2.3.2. Incerteza associada à exactidão do método
No método em causa, a avaliação da exactidão foi efectuada a partir de
informação relativa a amostras analisadas por um método de referência (ponto 4 da
secção 3 do capítulo 5). Os valores considerados no cálculo final resultam da média
dos valores obtidos para as 5 amostras analisadas nestas condições.
119
A tabela 6.51 apresenta os valores de Rm , u( c método_pad rão ) , c método_pad rão , Smétodo,
c método e de u( Rm ) de cada uma das 5 amostras analisadas nestas condições, obtidos
segundo as equações 5.10 e 5.11.
Tabela 6.51: Dados utilizados no cálculo da u(Rm) das amostras analisadas.
Amostras Rm c método Smétodo c método_pad rão u(cmétodo_padrão) u(Rm)

0303SIL01 0,97 1,84 0,02 1,90 0,02
0903IMO02 1,07 2,89 0,03 2,70 0,02
0503MAS01 0,96 1,92 0,02 2,00 0,04 0,02
1003TAF02 1,04 2,82 0,02 2,70 0,02
3003FER01 1,03 0,77 0,02 0,75 0,06
De seguida, avaliou-se se a recuperação do método era significativamente

diferente de 1, através do teste t-student (equação 5.12). Os resultados do teste, das
incertezas padrão relativas e o valor médio considerado no cálculo final, são
Tabela 6.52: Avaliação da recuperação do método através do teste t-student.
Amostras texp tcrit (95%; 3gl) u( Rm ) u ( Rm )

0303SIL01 1,55 0,02
0903IMO02 4,15 0,02
0503MAS01 1,94 4,30 0,02 0,03
1003TAF02 2,85 0,02
3003FER01 0,37 0,06
6.2.4. Combinação das fontes de incerteza e cálculo da incerteza expandida

A incerteza padrão relativa, resultante da combinação das fontes de incerteza
associadas à precisão e à exactidão do método, é determinada a partir da equação
5.14.
u(y)
 (uprecisão )2  (u( Rm ))2  (6,64x10 2 )2  (0,03) 2  0,07
y
120
Com um grau de confiança de 95%, a incerteza expandida combinada é de:

0,07x2=0,14. Deste modo, considera-se que a incerteza do método é de 14%.
6.3. Controlo de qualidade

O controlo de qualidade do método foi efectuado através de cartas de controlo.
Com o objectivo de se estudar a estabilidade do método ao longo do tempo,
construíram-se várias curvas de calibração e analisou-se a distribuição dos seus
declives, durante um período de 3 meses, através de uma carta de controlo de médias
ou indivíduos.
Antes de se proceder à construção da carta de controlo, avaliou-se se a
dispersão dos resultados obtidos seguia uma distribuição normal. Para o efeito,
utilizou-se o teste de Kolmogorov-Smirnov (KS) que se baseia na comparação da
curva de frequência cumulativa dos dados (Fn(x) =número de observações (Xi≤x)/n),
com a função de distribuição normal teórica em hipótese (F0(x)). Quando as duas
curvas se sobrepõem, a estatística do teste é calculada através da máxima diferença
entre ambas (D=max|F0(x)-Fn(x)|). Se os dados experimentais se afastam
significativamente do que é esperado, segundo a distribuição em hipótese, então as
curvas obtidas devem encontrar-se igualmente afastadas, caso contrário, se o ajuste
ao modelo hipotético é admissível, as curvas têm um delineamento próximo (D.
Harvey, 2000).
Neste caso, as hipóteses propostas são as seguintes:
H0: As funções de distribuição, Fn(x) e F0(x), são estatisticamente idênticas e as curvas

têm um delineamento próximo.
H1: As funções de distribuição, Fn(x) e F0(x), são estatisticamente diferentes.
A tabela 6.53 apresenta os resultados obtidos, os valores da variável Z, os
valores da frequência cumulativa e da função de distribuição normal e os valores da
diferença entre ambas.
Tabela 6.53: Resultados associados à aplicação do teste de Kolmogorov-Smirnov.
Curva de calibração Declives Z Zordenados Fn(x) F0(x) Diferença (D)

1 0,0942 -0,378 -3,289 0,032 0,0005 0,032
2 0,0955 0,162 -1,584 0,065 0,0571 0,007
3 0,0968 0,703 -0,545 0,097 0,2912 0,194
4 0,0959 0,329 -0,420 0,161 0,3372 0,176
121
5 0,0961 0,412 -0,420 0,161 0,3372 0,176

6 0,0941 -0,420 -0,378 0,226 0,3520 0,126
7 0,0952 0,038 -0,378 0,226 0,3520 0,126
8 0,0942 -0,378 -0,337 0,290 0,3669 0,077
9 0,0948 -0,129 -0,337 0,290 0,3669 0,077
10 0,0958 0,287 -0,254 0,355 0,4013 0,046
11 0,0961 0,412 -0,254 0,355 0,4013 0,046
12 0,0992 1,701 -0,129 0,387 0,4483 0,061
13 0,1030 3,281 -0,087 0,419 0,4641 0,045
14 0,0943 -0,337 -0,046 0,548 0,4801 0,068
15 0,0950 -0,046 -0,046 0,548 0,4801 0,068
16 0,0949 -0,087 -0,046 0,548 0,4801 0,068
17 0,0872 -3,289 -0,046 0,548 0,4801 0,068
18 0,0954 0,121 0,038 0,613 0,5160 0,097
19 0,0945 -0,254 0,038 0,613 0,5160 0,097
20 0,0952 0,038 0,121 0,645 0,5478 0,097
21 0,0969 0,744 0,162 0,710 0,5636 0,146
22 0,0938 -0,545 0,162 0,710 0,5636 0,146
23 0,0913 -1,584 0,204 0,742 0,5793 0,163
24 0,0950 -0,046 0,287 0,774 0,6141 0,160
25 0,0955 0,162 0,329 0,806 0,6293 0,177
26 0,0950 -0,046 0,412 0,871 0,6591 0,212
27 0,0950 -0,046 0,412 0,871 0,6591 0,212
28 0,0956 0,204 0,703 0,903 0,7580 0,145
29 0,0941 -0,420 0,744 0,935 0,7704 0,165
30 0,0943 -0,337 1,701 0,968 0,9554 0,012
31 0,0945 -0,254 3,281 1,000 0,9995 0,000
Média 0,0951
Desvio padrão 2,40x10-3
Neste caso, o valor máximo da diferença corresponde a 0,212 e o valor crítico

tabelado para um grau de confiança de 95% é de 0,238, pelo que se aceita a hipótese
nula e conclui-se que as curvas têm um delineamento próximo.
A figura 6.9 apresenta a representação gráfica das duas funções de
distribuição:
122
1.000
0.800
0.600
F(x)
F0(x)
0.400
Fn(x)
0.200
0.000
-4.000 -3.000 -2.000 -1.000 0.000 1.000 2.000 3.000 4.000
Figura 6.9: Representação gráfica das funções de distribuição.
A figura 6.10 apresenta a carta de controlo que representa a variação dos

declives das curvas de calibração, ao longo do tempo. Os valores das linhas de aviso
e das linhas de controlo foram determinados através da média e do desvio padrão dos
primeiros 9 declives obtidos, não representados na carta de controlo.
Estudo da variação dos declives das curvas de calibração
0.1040
0.1020
0.1000
0.0980 +3σ
+2σ
0.0960
0.0940
+2σ
0.0920 +3σ
0.0900
0.0880
0.0860
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75
Tempo (dias)
Figura 6.10: Carta de controlo do estudo da variação dos declives das curvas de calibração.
123
A carta de controlo representada não apresenta comportamento idêntico a

qualquer um dos 8 testes de desvios recomendados pela norma ISO 8258. Contudo,
existem 4 pontos fora de controlo uma vez que ultrapassam as linhas de controlo
(linhas vermelhas). Os primeiros dois pontos fora de controlo indicam o inicio de uma
possível tendência para valores superiores à média. Quando tal se sucedeu,
procedeu-se a uma nova preparação dos reagentes de coloração e resolveu-se o
problema. Como se verificou anteriormente os dois factores que exercem maior
influência na variação dos resultados experimentais são o volume de NEDA (reagente
de coloração) e o volume de ácido clorídrico. Verificou-se ainda que, com o aumento
do volume de NEDA havia também um aumento do sinal instrumental. Neste caso,
tendo em conta que todos os outros factores se mantiveram constantes, o aumento
dos valores dos declives deveu-se provavelmente à influência do reagente NEDA e
possivelmente a concentração da solução preparada era superior à concentração
indicada.
O terceiro ponto fora de controlo, contrariamente aos dois primeiros, situa-se
abaixo da linha de controlo inferior. Neste caso, suspeita-se que a degradação do
reagente NEDA tenha sido a causa. Este reagente apresenta elevada sensibilidade à
luz e deve ser armazenado num frasco escuro em local escuro e fresco. Como foi
acidentalmente deixado fora deste local durante 3 dias sofreu uma rápida degradação
e provavelmente afectou o desempenho normal do método. Após nova preparação
deste reagente efectuou-se a construção da curva de calibração e verificou-se a
correcção do valor do declive.
Durante os 75 dias de análise, verificou-se ainda um quarto ponto fora de
controlo, seguido de um ponto que já indicava uma possível tendência para a
diminuição do valor do declive. Neste caso, supõe-se que o problema foi o mesmo
que no caso anterior, pois todos os outros factores susceptíveis de influenciar o
desempenho do método estavam devidamente controlados e o reagente NEDA
apresentava naquele momento uma cor escura que se foi intensificando ao longo dos
20 dias após a sua última preparação. Como já se previa, o problema foi resolvido
após preparação de novo reagente. A partir desse momento, como não havia nada
estabelecido relativamente ao prazo de utilização deste reagente, a sua preparação
foi efectuada de 15 em 15 dias, tendo-se tido, durante esse período de tempo, o
cuidado de manter o frasco devidamente armazenado sempre que não era utilizado.
124
Através da análise desta carta de controlo é possível concluir que se todos os

factores que influenciam o desempenho do método forem devidamente controlados,
não será necessário preparar uma curva de calibração diária, sendo apenas
necessário o controlo dos valores com a análise diária de um ou dois padrões de
controlo.
No decorrer deste trabalho obtiveram-se resultados que permitiram a

construção de uma carta de controlo de amplitudes (figura 6.11). Os resultados
apresentados na tabela 6.54 resultam das análises em triplicado de um conjunto de
amostras de águas residuais, executadas em condições de repetibilidade.
Tabela 6.54: Resultados de triplicados de um conjunto de amostras de águas residuais, obtidos em

condições de repetibilidade.
[NO3-]
Amostra Replicados Amplitude
(mgN-NO3-/L)
0,214 2,27
2212CON01 0,218 2,31 0,07
0,221 2,35
0,147 1,52
2212MAF01 0,154 1,59 0,07
0,150 1,55
0,049 0,51
1112IDI01 0,049 0,51 0,04
0,045 0,47
0,088 0,92
1112LAC01 0,092 0,96 0,05
0,087 0,91
0,234 2,46
0501NEO03 0,234 2,46 0,18
0,251 2,64
0,045 0,47
0501SON01 0,047 0,49 0,02
0,047 0,49
0,159 1,66
0601ANT01 0,168 1,76 0,09
0,167 1,75
0,352 3,67
1201TAF01 0,352 3,67 0,07
0,345 3,60
125

[NO3-]
(mgN-NO3-/L)
0,070 0,73
2201SOI01 0,068 0,71 0,08
0,076 0,79
0,159 1,69
2501STA01 0,155 1,64 0,11
0,149 1,58
0,148 1,69
0802MAC01 0,151 1,73 0,08
0,155 1,77
0,051 0,54
0902MAS01 0,047 0,49 0,04
0,049 0,51
0,045 0,47
1802COR01 0,049 0,52 0,04
0,049 0,52
0,056 0,61
2202GCO01 0,052 0,57 0,07
0,058 0,63
0,041 0,43
1902NEU01 0,042 0,44 0,06
0,047 0,49
0,046 0,48
1901RON01 0,046 0,48 0,05
0,051 0,53
0,048 0,50
0303SIL01 0,056 0,59 0,09
0,057 0,60
0,060 0,63
0203VEU04 0,061 0,64 0,04
0,064 0,67
0,063 0,66
0503SON01 0,058 0,61 0,05
0,061 0,64
0,050 0,52
1103GES02 0,047 0,49 0,08
0,042 0,44
0,064 0,67
1603NEU01 0,064 0,67 0,02
0,066 0,69
0,080 0,84
3003GCO01 0,072 0,75 0,08
0,073 0,77
126

[NO3-]
(mgN-NO3-/L)
0,181 1,90
0503MAS01 0,184 1,93 0,04
0,180 1,89
0,266 2,80
1003TAF01 0,269 2,83 0,03
0,268 2,82
0,068 0,71
3003FER01 0,065 0,68 0,03
0,066 0,69
Rm 3.27 Rm
0,08 0,25
0.30
0.25
0.20
Amplitude
0.15
0.10
0.05
0.00
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Ensaios
Figura 6.11: Carta de controlo de amplitudes de um conjunto de triplicados de amostras de águas

residuais.
Na construção da carta de controlo de amplitudes determinou-se para cada

triplicado a respectiva amplitude, que corresponde à diferença entre a maior e a menor
concentração, e o valor de Rm que é utilizado no cálculo da linha de controlo e que
corresponde à média das amplitudes dos primeiros 9 triplicados, sendo que estes não
foram representados na carta de controlo.
Através da análise da carta de controlo de amplitudes é possível avaliar a
estabilidade da repetibilidade de diferentes amostras de águas residuais. Na carta
127
apresentada verifica-se que todas as amplitudes representadas encontram-se abaixo

da linha de controlo e não há uma elevada dispersão entre as amplitudes
representadas, o que indica que a repetibilidade do método não sofre grandes
variações quando se analisam diferentes amostras de águas residuais.
Já havia sido demonstrado que o método apresenta repetibilidade e que a
estabilidade dos seus resultados é pouco afectada pela matriz da amostra em estudo.
A informação obtida pela presente carta de controlo corrobora as referidas ilações.
128
Métodos de determinação de metais em águas residuais
7. Métodos de determinação de metais em águas residuais
7.1. Parte Experimental

Neste capítulo são apresentados os reagentes, material, instrumentos e
equipamentos utilizados durante o processo de validação do método.
7.1.1. Material, reagentes e equipamentos

De seguida são apresentadas três tabelas que contêm a informação relativa ao
material, reagentes, instrumentos e equipamentos utilizados.
Tabela 7.1: Material utilizado no processo de validação do método.
Material
– Luvas de Látex ou Nitrilo.
– Gobelés de 150 mL e 250 mL.
– Espátula e microespátula.
– Vidros de relógio.
– Balões volumétricos (classe A) de 250 mL, 100 mL, 50 mL e 25 mL.
– Micropipeta (200µL-1000 µL).
– Pipetas Volumétricas (classe A) de 5mL, 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL e 50 mL.
– Pipeta graduada com êmbolo de 5 mL.
– Funis de plástico.
– Papel de filtro com poros de 0,45 mm.
– Parafilme.
– Frascos de plástico de 50 mL.
Tabela 7.2: Reagentes utilizados no processo de validação do método.
Reagentes

Solução padrão de chumbo (comercial)
[Pb(NO3)2] em HNO3 0,5N – Concentração: 1,000±0,002 g Pb/L
– M=331,2 gmol-1
–Marca: Panreac Química S.A.
Solução padrão de níquel (comercial)
– Concentração: 1,000±0,002 g Ni/L
[Ni(NO3)2.6H2O] em HNO3 0,5N
– M=290,80 gmol-1
129
Solução padrão de cobre (comercial)
– Concentração: 1,000±0,002 g Cu/L
[Cu(NO3)2.3H2O] em HNO3 0,5N
– M=187,57 gmol-1

Solução padrão de zinco (comercial)
[Zn(NO3)2.6H2O] em HNO3 0,5N – Concentração: 1,000±0,002 g Zn/L
– M=297,47 gmol-1
Ácido Nítrico, 65%
– M=63,01 gmol-1
Água desionizada
Tabela 7.3: Instrumentos e equipamentos utilizados no processo de validação do método.
Instrumentos e equipamentos
– Balança analítica, Sartorius analytic – B-120S.

– Espectrofotómetro de absorção atómica, atomização com chama (ar-acetileno), Perkin
Elmer, AAnalyst 300, com correcção de fundo por lâmpada de deutério (figura 7.1).
– Lâmpadas de cátodo oco, específicas para cada metal, da marca Phillips.
Figura 7.1: Espectrofotómetro de absorção atómica.
130
7.1.2. Procedimento experimental
7.1.2.1. Lavagem do material

A lavagem do material utilizado em toda a actividade experimental foi efectuada
com uma solução de ácido nítrico (15%), de forma a evitar possíveis contaminações.
7.1.2.2. Tratamento prévio de amostras de águas residuais

Ao chegarem ao laboratório as amostras foram acidificadas com ácido sulfúrico
10% até pH 2,0 e refrigeradas a 4ºC.
7.1.2.3. Preparação de soluções

Neste trabalho efectuou-se a determinação de 4 metais: chumbo, níquel, cobre
e zinco. De seguida é apresentada a preparação de todas as soluções padrão.
Soluções padrão de nitrato de chumbo:
Todas as soluções padrão de chumbo foram obtidas a partir de uma solução
padrão comercial de nitrato de chumbo com uma concentração de 1,000 g Pb/L. A
partir desta preparou-se uma solução padrão intermédia de 100,0 mg Pb/L, que foi
utilizada na preparação das soluções padrão da curva de calibração. A tabela 7.4
resume a preparação destas soluções.
determinação de chumbo.
[solução padrão intermédia] Vpipetado Vbalão [soluções padrão CC]

Solução
(mg Pb/L) (µL) (mL) (mg Pb/L)
P1 200,00 100,0 0,2000
P2 500,00 100,0 0,5000
P3 800,00 100,0 0,8000
100,0
P4 600,00 50,00 1,200
P5 800,00 50,00 1,600
P6 1000,0 50,00 2,000
Soluções padrão de nitrato de níquel:

Todas as soluções padrão de níquel foram obtidas a partir de uma solução
padrão comercial de nitrato de níquel com uma concentração de 1,000 g Ni/L. A partir
desta preparou-se uma solução padrão intermédia de 100,0 mg Ni/L, que foi utilizada
131
na preparação das soluções padrão da curva de calibração. A tabela 7.5 resume a

preparação destas soluções.
determinação de níquel.
Solução
(mg Ni/L) (µL) (mL) (mg Ni/L)
P1 200,00 100,0 0,2000
P2 500,00 100,0 0,5000
P3 800,00 100,0 0,8000
100,0
P4 600,00 50,00 1,200
P5 800,00 50,00 1,600
P6 1000,0 50,00 2,000
Soluções padrão de nitrato de cobre:

Todas as soluções padrão de cobre foram obtidas a partir de uma solução
padrão comercial de nitrato de cobre com uma concentração de 1,000 g Cu/L. A partir
desta preparou-se uma solução padrão intermédia de 100,0 mg Cu/L, que foi utilizada
na preparação das soluções padrão da curva de calibração. A tabela 7.6 resume a
determinação de cobre.

Solução
(mg Cu/L) (µL) (mL) (mg Cu/L)
P1 250,00 250,00 0,1000
P2 300,00 100,0 0,3000
P3 500,00 100,0 0,5000
P4 100,0 800,00 100,0 0,8000
P5 600,00 50,00 1,200
P6 800,00 50,00 1,600
P7 1000,0 50,00 2,000
Soluções padrão de nitrato de zinco:

As soluções padrão de zinco foram obtidas a partir de uma solução padrão
comercial de nitrato de zinco com uma concentração de 1,000 g Zn/L. A partir desta
preparou-se uma solução padrão intermédia de 100,0 mg Zn/L, que foi utilizada na
132
preparação das soluções padrão da curva de calibração. A tabela 7.7 resume a

determinação de zinco.
Solução
(mg Zn/L) (µL) (mL) (mg Zn/L)
P1 250,00 250,00 0,1000
P2 300,00 100,0 0,3000
P3 100,0 500,00 100,0 0,5000
P4 700,00 100,0 0,7000
P5 900,00 100,0 0,9000
7.1.2.4. Processo de digestão ácida

Antes de se proceder à análise espectrofotométrica efectuou-se a digestão das
soluções padrão e de todas amostras, de forma a obter todo o metal na sua forma
livre.
O processo de digestão utilizado baseou-se no procedimento do método
SMEWW 3030E (American Public Health Association, 2005) e é descrito pelos
seguintes pontos:
1- Agitou-se convenientemente a amostra ou padrão, de forma a homogeneizar

as soluções;
2- Transferiu-se 50,00 mL de amostra ou padrão para um gobelé de 150 mL.
3- Adicionou-se 5,00 mL de ácido nítrico concentrado com uma pipeta graduada
com êmbolo;
4- Tapou-se o gobelé com um vidro de relógio e colocou-se na placa de
aquecimento. Evaporou-se a amostra até se obter um volume de cerca de 2
mL, garantindo que a amostra não entra em ebulição e que não ocorre secagem
da mesma (figura 7.2);
5- Repetiu-se o ponto 3 e o ponto 4 as vezes necessárias, até se dar por concluída
a digestão. Considerou-se a digestão completa quando a amostra se
apresentava incolor ou praticamente incolor, ou quando não se verificou
qualquer alteração no aspecto da amostra após refluxo prolongado;
6- Retirou-se o gobelé da placa de aquecimento e deixou-se arrefecer;
133
7- Após arrefecimento, lavou-se com água desionizada as paredes do matraz e

filtrou-se a amostra para remover partículas insolúveis que poderiam entupir o
nebulizador;
8- Por fim, ajustou-se o volume do filtrado a 50,00 mL com água desionizada.
Figura 7.2: Processo de digestão ácida.
7.1.2.5. Preparação do espectrofotómetro de absorção atómica

A determinação de metais em águas residuais por espectroscopia de absorção
atómica com chama foi efectuada segundo o seguinte procedimento, que teve como
base o manual “Hardware Guide, HGA 800, Perkin Elmer.
1- Ligou-se o computador e o espectrofotómetro;

2- Efectuou-se a instalação manual da lâmpada;
3- Ligou-se a lâmpada através do software e introduziu-se os dados relativos
ao elemento metálico, intensidade da corrente da lâmpada, largura da
fenda, e comprimento de onda característico do elemento em estudo (tabela
7.8);
4- Ajustou-se a lâmpada manualmente de forma a obter a energia máxima
possível;
5- Aguardou-se pelo menos 30 minutos para que a lâmpada aquecesse, de
forma a garantir que a sua energia permanecia estável durante a análise.
134
6- Estabeleceram-se as condições relativas à equação da recta, unidades e

número de replicados (“Equation, units & replicates”) e os dados referentes
à curva de calibração;
7- Ligou-se a ventilação e verificou-se a pressão do acetileno;
8- Ligou-se o ar, o acetileno e a chama, e ajustou-se o caudal do ar e do
acetileno de forma a conseguir a melhor composição da chama;
9- Aspirou-se água desionizada com o objectivo de remover possíveis
impurezas presentes no nebulizador e queimador;
10- Fez-se “auto-zero” ao equipamento utilizando o branco das amostras
digerido;
11- Na primeira vez que se utilizou o aparelho e sempre que se detectou alguma
anormalidade, aspirou-se um padrão e observou-se qual a melhor
absorvância. Durante este processo efectuou-se, quando necessário, o
ajuste do caudal do ar e do acetileno e o ajuste do nebulizador;
12- Procedeu-se à análise.
Tabela 7.8: Parâmetros relativos aos elementos metálicos em estudo
Metal *λ (nm) **i lâmpada (mA) Largura da fenda

Cobre 324,7 5 0,70
Chumbo 217,0 10 0,70
Níquel 232,0 15 0,20
Zinco 213,9 10 0,70
. *comprimento de onda.
** intensidade de corrente
7.1.2.6. Análise das amostras

A análise dos padrões de calibração e das amostras foi realizada segundo o
seguinte procedimento:
1- Aspirou-se o branco das amostras digerido. Nesta etapa o software do
aparelho gravou o sinal desta solução para que pudesse efectuar a devida
correcção ao longo da análise;
2- Analisaram-se as amostras, procedendo-se sempre à limpeza do tubo
capilar entre aspirações, com papel absorvente.
135
7.2. Resultados/Discussão de Resultados

Neste capítulo são apresentados os resultados relativos ao processo de
validação do método de espectroscopia de absorção atómica para determinação de
cobre. Os resultados dos restantes metais (chumbo, níquel e zinco) são apresentados
nos anexos II, III e IV.
A discussão dos resultados foi efectuada em conjunto e é apresentada neste
capítulo.
7.2.1. Avaliação indirecta da validação do método
7.2.1.1. Quantificação
Neste trabalho a avaliação da gama de trabalho foi efectuada através do teste
de homogeneidade de variâncias.
A norma ISO 8466-1 estabelece que para se avaliar a da gama de trabalho do
método deve-se analisar em 10 réplicas independentes o primeiro e último padrão da
curva de calibração e calcular as respectivas variâncias.
Os resultados relativos aos ensaios realizados e as respectivas variâncias são
Tabela 7.9: Resultados obtidos para a validação da gama de trabalho (cobre).
Padrão 0,1000 2,000

0,015 0,176
0,012 0,177
0,012 0,178
Absorvâncias
0,011 0,177
0,010 0,177
0,012 0,176
0,009 0,176
0,011 0,178
0,011 0,176
0,012 0,174
Variância 2,50x10-6 1,39x10-6
* Fexp 1,80
Fcrit 3,18
136
* O valor de Fexp foi obtido através da equação 7.1:
2
SP0.1
Fexp  2
(7.1)
SP2
O valor de Fcrit apresentado foi consultado numa tabela de valores teóricos de

F de Fischer, para um grau de confiança de 95% e para 9 graus de liberdade
associados ao numerador e 9 graus de liberdade associados ao denominador do
quociente entre as variâncias obtidas.
Como Fexp<Fcrit as diferenças de variâncias não são significativas e considera-
se que a gama de trabalho, compreendida entre 0,1000 e 2,000 mg Cu/L, está bem
ajustada.
As gamas de trabalho dos métodos de determinação de zinco, níquel e chumbo
foram validadas pelo mesmo teste, e correspondem aos respectivos intervalos:
0,1000–0,9000 mg Zn/L, 0,2000–2,000 mg Ni/L e 0,2000–2,000 mg Pb/L.
A validação da gama de trabalho garante a aplicabilidade do método dos
mínimos quadrados simples e deve ser realizada sempre que se justifique.
A curva de calibração construída baseia-se no método dos mínimos quadrados.
A tabela 7.10 apresenta as absorvâncias obtidas para cada padrão de calibração, a
respectiva média e desvio padrão. A utilização destes dados permitiu a construção da
curva de calibração.
Tabela 7.10: Dados utilizados na construção da curva de calibração de determinação de cobre.
Padrão P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8
Concentração (mg Cu/L) 0 0,1000 0,3000 0,5000 0,8000 1,200 1,600 2,000
0,000 0,009 0,028 0,045 0,071 0,104 0,136 0,171
0,000 0,011 0,027 0,044 0,069 0,101 0,133 0,168
Absorvâncias 0,000 0,008 0,027 0,045 0,071 0,105 0,139 0,177
0,000 0,011 0,029 0,047 0,072 0,106 0,141 0,178
0,000 0,010 0,026 0,045 0,070 0,104 0,137 0,175
Média 0,000 0,010 0,027 0,045 0,071 0,104 0,137 0,174
Recorrendo ao método dos mínimos quadrados determinaram-se os

coeficientes a (ordenada na origem) e b (declive) da recta de regressão, bem como
137
as respectivas incertezas e o desvio padrão residual. Para tal utilizaram-se as

equações 3.2, 3.3, 3.4, 3.5 e 3.6. (norma ISO 8466-1:1990):
Os parâmetros da curva de calibração encontram-se na tabela 7.11.
Tabela 7.11: Parâmetros da curva de calibração.
Parâmetro Valor
b 0,0860
Sb 0,0006
a 0,0011
Sa 0,0006
Sy/x 1,09x10-3
Assim, a equação de regressão linear corresponde a:
y = 0,0860x + 0,0011
Realizou-se o mesmo estudo para os restantes metais e as equações de

regressão linear são apresentadas na tabela 7.12.
Tabela 7.12: equações de regressão linear relativas aos métodos de determinação de níquel, chumbo
e zinco.
Metal Equação de regressão linear Coeficiente de correlação (R)

Cobre y= 0,0860x + 0,0011 0,9998
Chumbo y=0,0364+0,0007 0,9993
Níquel y=0,0702x+0,0010 0,9996
Zinco y=0,422x+0,0015 0,9999
– Linearidade
A linearidade das curvas de calibração destes métodos, tal como o método
anterior, foi avaliada através de um modelo estatístico, de acordo com as normas ISO
8466-1 e 8466-2 (ISO, 2001). Para tal, utilizou-se a função de calibração linear
determinada anteriormente e utilizando os mesmos dados, construiu-se uma curva de
calibração não linear que corresponde a um polinómio de segundo grau (ISO 8466-
2).
138
Os valores dos desvios padrão residuais (Sy/x e Sy2), da diferença das variâncias
(S2), do Fexp e do Fcrit, são apresentados na tabela 7.13.
Tabela 7.13: Resultados associados à avaliação da linearidade das curvas de calibração dos metais
em estudo.
Metal Sy/x Sy2 S2 Fexp Fcrit

Cobre 1,09x10-3 1,18x10-3 1,27x10-7 0,09 6,61 (95%; 1,6 gl)
Chumbo 1,07x10-3 9,07x10-4 2,44x10-6 2,96 7,71 (95%; 1,5 gl)
Níquel 1,54x10-3 1,33x10-3 4,81x10-6 2,73 7,71 (95%; 1,5 gl)
Zinco 1,94x10-3 1,11x10-3 1,14x10-5 9,29 10,13 (95%; 1,4 gl)
As diferenças de variâncias foram determinadas a partir da equação 6.3, e os

valores de Fexp foram determinados através da equação 6.4.
Após a determinação de todos os parâmetros necessários comparou-se o valor
de Fexp com o valor tabelado da distribuição F de Snedecor/ Fischer (Fcrit). Os
resultados apresentados na tabela 7.13 indicam que, para todos os métodos, os
valores de Fexp são inferiores aos valores de Fcrit, pelo que se conclui que, as funções
de calibração não linear não conduzem a um ajuste dos pontos significativamente
melhor, e, portanto, as funções de calibração são lineares.
Reunidos os dados necessários procedeu-se à construção e interpretação do

gráfico da curva de calibração:
0.180
0.160
0.140
0.120
Absorvância
0.100
0.080
0.060 y = 0,0860x + 0,0011
0.040 R² = 0,9997
0.020
0.000
0.000 0.400 0.800 1.200 1.600 2.000
Concentração (mg Cu2+/L)
Figura 7.3: Curva de calibração de determinação de cobre.

139
A curva de calibração construída apresenta um coeficiente de correlação

superior a 0.9995, o que corrobora a linearidade.
Efectuou-se ainda a análise de resíduos. A figura 7.4 apresenta o gráfico de
resíduos.
0.0015
P5 P8
0.001 P4
0.0005
P2 P3
Resíduos
0
0.0 0.1 0.3 0.5 0.8 1.2 1.6 2.0
-0.0005
P6
-0.001
-0.0015 P1
-0.002 P7
Padrões
Figura 7.4: Análise de resíduos.
Nos gráficos de resíduos os pontos devem distribuir-se de forma aleatória em

torno da recta que corresponde ao resíduo zero. Nestas condições supõe-se que os
erros são independentes, de média nula e de variância constante. Neste caso, os
resíduos não se comportam de forma aleatória (4 resíduos positivos consecutivos),
contudo, como se trata de um conjunto de resíduos muito pequenos, e tendo em conta
os critérios anteriores (coeficiente de correlação e teste de linearidade), não se atribui
um significado relevante à análise dos resíduos.
No que diz respeito aos restantes metais em estudo (chumbo, níquel e zinco)
verifica-se a mesma situação.
– Sensibilidade
Para avaliar a sensibilidade do método utilizou-se o mesmo método que foi
apresentado no processo de validação anterior. De acordo com seus princípios, para
que um método apresente sensibilidade é necessário que a diferença mínima entre
concentrações seja igual ou superior a 3  2  S x (equação 3.15). Deste modo,
pretende-se determinar o intervalo de concentrações a partir do qual o método
apresenta sensibilidade.
140
Assim, supondo um intervalo de concentrações entre c1 e c2, e tendo

conhecimento que c1 = 0,80 mg Cu/L; Sc1 = Sx =1,34x10-2 mg Cu/L, o valor de c2 é
dado pela equação 6.6:
c2  c1  3  2  S x
Como c2=0.86 mg Cu/L, c2-c1 = 0,86-0,80 = 0,06 mg Cu/L, o que indica que,
neste nível de concentração, o método apenas consegue discriminar um intervalo de
concentrações de 0,06 mg Cu/L, ou seja, o método apresenta uma sensibilidade de
0,06 mg Cu/L.
Do mesmo modo e para uma mesma concentração c1 (0,80 mg/L), determinou-
se a sensibilidade dos restantes métodos, que corresponde a: 0.10 mg Ni/L, 0.13 mg
Pb/L e 0.02 mg Zn/L.
A representação gráfica 3  2  S x =f (concentração) permite avaliar a

sensibilidade ao longo da gama de trabalho (figura 7.5).
6.80E-02
6.60E-02
6.40E-02
6.20E-02
6.00E-02
5.80E-02
5.60E-02
0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00
Concentração (mg Cu2+/L)
Figura 7.5: Avaliação da sensibilidade do método ao longo da gama de trabalho.
Através da representação gráfica é possível concluir que, até uma

concentração de 0,80 mg Cu/L ocorre uma ligeira diminuição dos valores de Sx e
consequentemente um aumento da sensibilidade do método. Esta situação verifica-
141
se pelo facto do erro associado a uma determinada concentração ser menor quando
esta se encontra no centro da curva de calibração.
A partir de 0,80 mg Cu/L há uma tendência inversa, ou seja, à medida que a
concentração aumenta a sensibilidade do método diminui ligeiramente. Nos níveis de
concentrações da gama de trabalho verifica-se que a sensibilidade do método varia
entre 0,06 mg Cu/L e 0,07 mg Cu/L.
Relativamente aos restantes métodos em estudo, verifica-se o mesmo
comportamento da sensibilidade ao longo da gama de trabalho, sendo que esta
também varia, embora de forma diferente, para diferentes níveis de concentrações da
respectiva gama de trabalho. Deste modo, os intervalos de sensibilidade para cada
um dos metais são os seguintes: 0,13 mg Pb/L–0,15 mg Pb/L, 0,10 mg Ni/L–0,12 mg
Ni/L e 0,021-0,024 mg Zn/L.
Neste processo de validação os valores do limite de detecção e do limite de
quantificação do método foram obtidos a partir de parâmetros da curva de calibração.
Para a determinação do limite de detecção do método (L.D.) utilizou-se a
equação 3.10 :
3,3  S 
 y 
x  3,3x1,09x1 0 3
L.D.    0,04 mg Cu2 /L
b 0,0860
O valor do limite de detecção é de 0,04 mg Cu/L.
O limite de quantificação do método (L.Q.) foi determinado a partir da equação

3.12. Neste caso não se utilizou o mesmo método que no processo de validação
anterior, uma vez que não se reuniu a informação necessária para que esse fosse
aplicável.
10  S 
 y 
10x1,09x10 3
L.Q.   x 
  0,13 mg Cu/L
b 0,0860
O valor do limite de quantificação é de 0,13 mg Cu/L.

142
Os limites de detecção e de quantificação dos métodos de determinação de

chumbo, níquel e zinco foram obtidos de igual modo. A tabela 7.14 resume os valores
obtidos para cada um dos metais em estudo.
Tabela 7.14: Limites de detecção (L.D.) e de quantificação (L.Q) dos metais em estudo.
Limite de detecção (L.D.) Limite de quantificação (L.Q.)
Metal
(mg *M/L) (mg *M/L)
Cobre 0,04 0,13
Chumbo 0,10 0,29
Níquel 0,07 0,22
Zinco 0,02 0,05
*M – metal (cobre, chumbo, níquel e zinco).
7.2.1.2. Precisão
Neste trabalho a precisão do método foi avaliada através de 2 parâmetros: a
repetibilidade e a precisão intermédia. Não foi possível avaliar a precisão através da
reprodutibilidade do método, uma vez que não se reuniram as condições necessárias
para a execução deste método em outros laboratórios.
– Repetibilidade
O estudo da repetibilidade do método foi efectuado com 2 amostras de águas
residuais. Cada amostra foi analisada em replicado (10 ensaios), tendo sido
determinado o respectivo limite de repetibilidade (r), o desvio padrão de repetibilidade
e o coeficiente de variação (ISO 5725-6).
Antes de se executar o estudo de repetibilidade do método, utilizou-se o teste
de Grubbs para eliminação de valores aberrantes (ISO 5725-2). Neste caso, não se
detectou a presença de valores aberrantes.
As tabelas 7.15 e 7.16 apresentam os resultados relativos ao estudo de
repetibilidade do método:
143

1305PRO01.
[Cu]
Absorvância Média Desvio padrão |Xi-Xi-1| r CVr (%)
(mg Cu/L)
0,035 0,39 0,03
0,037 0,42 0,04
0,034 0,38 0,04
0,037 0,42 0,03
0,040 0,45 0,06
0,41 2,14x10-2 0,06 5
0,035 0,39 0,00
0,035 0,39 0,04
0,038 0,43 0,02
0,036 0,41 0,02
0,038 0,43

2503CAT03.
[Cu]
(mg Cu/L)
0,073 0,84 0,02
0,075 0,86 0,00
0,075 0,86 0,01
0,074 0,85 0,00
0,074 0,85 0,00
0,85 1,07x10-2 0,03 1
0,074 0,85 0,02
0,076 0,87 0,02
0,074 0,85 0,01
0,073 0,84 0,01
0,074 0,85
Um método apresenta repetitibilidade, com um grau de confiança de 95%, caso

o módulo da diferença absoluta entre dois resultados de ensaio (|Xi-Xi-1|), seja inferior
ao limite de repetibilidade (r). Neste caso, ambas as amostras em estudo cumprem
com este critério, o que permite afirmar que o método tem repetibilidade.
O coeficiente de variação (CV) de repetibilidade mede o grau de dispersão dos
resultados em torno de uma concentração média. Quando o seu valor é superior a
10%, considera-se que ocorre uma forte dispersão, e avalia-se como negativa a
eficácia do parâmetro em estudo. Neste caso, ambas as amostras apresentaram CV
de repetibilidade inferiores a 10%, o que se considera aceitável.
No que diz respeito aos outros metais em estudo, verifica-se que todos os
métodos apresentam repetibilidade, uma vez que todos cumprem com o critério acima
144
referido. Relativamente aos coeficientes de variação obtidos pode-se considerar que

praticamente todos apresentam valores aceitáveis, ou seja inferiores a 10%, excepto
no caso de uma amostra em que se analisou chumbo. Neste caso o CV foi de 12%,
no entanto, poder-se-á considerar este valor razoável se se tiver em conta que o nível
de concentração em estudo (≈0,23 mg Pb/lL) é ligeiramente inferior à concentração
do limite de quantificação (0,29 mg Pb/L).
A precisão intermédia de um método pode ser quantificada de diversas formas.
Neste caso, optou-se por efectuar a sua determinação através da utilização de um
conjunto de triplicados de diversas t amostras. Para tal, utilizou-se um conjunto de
amostras de águas residuais e entre ensaios variou-se o tempo (dias diferentes). Os
resultados obtidos são apresentados na tabela 7.17.
Tabela 7.17: Resultados obtidos na determinação da precisão intermédia a partir de um conjunto de

triplicados de diferentes amostras de águas residuais.
Amostra Replicados Média (yjk-yj,méd)2 ∑(yjk-yj,méd)2

0,43 8,65x10-5
2804REL01 0,45 0,44 1,64x10-4 2,63x10-4
0,44 1,23x10-5
0,43 9,88x10-4
2304CIF01 0,47 0,46 1,29x10-4 1,52x10-3
0,48 4,03x10-4
0,40 5,87x10-4
3003REI01 0,46 0,43 1,37x10-3 2,12x10-3
0,41 1,62x10-4
0,37 5,48x10-5
1105CIF01 0,38 0,36 2,53x10-4 8,51x10-4
0,34 5,43x10-4
0,27 2,61x10-4
3004AMO05 0,24 0,25 2,61x10-4 6,68x10-3
0,33 6,15x10-3
0,93 7,34x10-5
1905CAT01 0,96 0,94 5,21x10-4 7,99x10-4
0,92 2,04x10-4
0,30 3,21x10-5
1905CAT03 0,29 0,31 1,76x10-4 5,67x10-4
0,33 3,59x10-4
145
Continuação da tabela 7.17

0,44 2,91x10-5
0506AQL01 0,47 0,44 9,92x10-4 2,38x10-3
0,40 1,36x10-3
0,17 4,08x10-4
1705FIR01 0,20 0,19 1,02x10-5 7,07x10-4
0,21 2,89x10-4
∑∑(yjk-yj,méd)2 1,58x10-2
Si(T) 2,97x10-2 mg Cu/L
A avaliação da precisão intermédia do método de determinação de cobre foi

efectuada através do desvio padrão de precisão intermédia. O decreto de lei 236/98
define como valor limite de emissão (VLE) na descarga de águas residuais, uma
concentração de 1,0 mg Cu/L. Este impõe ainda que o desvio padrão de precisão
intermédia, do respectivo método de quantificação, deve ser inferior a 10% do valor
paramétrico (VLE), ou seja, inferior a 0,10 mg Cu/L. Neste caso o desvio padrão obtido
(Si(T)=2,97x10-2 mg Cu/L) é consideravelmente inferior a 0,10 mg Cu/L, pelo que se
considera que o método é preciso e que está apto para a análise deste metal.
Os resultados dos desvios de precisão intermédia dos restantes métodos de
determinação de metais, bem como os respectivos valores limite de emissão (VLE)
na descarga de águas residuais, são apresentados na tabela 7.18.
Tabela 7.18: Resultados associados à avaliação da precisão intermédia dos métodos de

determinação de metais.
Si(T) VLE (DL 236/98) 10% VLE

Metal
(mg M*/L) (mg *M/L) (mg *M/L)
Cobre 0,03 1,0 0,10
Chumbo 0,03 1,0 0,10
Níquel 0,04 2,0 0,20
Zinco 0,03 5,0 0,50
*M – metal (cobre, chumbo, níquel e zinco).
Os resultados obtidos na tabela 7.18 demonstram que os restantes métodos

em estudo também cumprem com o requisito imposto pelo DL 236/98. Verifica-se,
portanto, que todos os desvios padrão de precisão intermédia são inferiores a 10% do
146
respectivo valor limite de emissão (VLE). Deste modo, considera-se que em termos
de precisão os métodos em estudo estão aptos para a análise dos respectivos metais.
7.2.1.3. Especificidade/Selectividade
O estudo da especificidade/selectividade do método foi efectuado através de
ensaios de recuperação que permitem avaliar as interferências presentes. Neste
sentido, utilizaram-se 9 amostras de águas residuais de diferentes concentrações, às
quais se adicionaram concentrações bem conhecidas do analito.
As taxas de recuperação foram determinadas com base na equação 6.9 e os
resultados encontram-se na tabela 7.19.
Tabela 7.19: Resultados associados aos ensaios de recuperação (cobre).

[amostra] [incremento] [amostra + incremento] Recuperação
Amostra
(mg Cu/L) (mg Cu/L) (mg Cu/L) (%)
2604REL01 0,43 0,43 0,87 103
2503CAT03 0,83 0,42 1,27 104
2204CAT01 0,40 0,10 0,52 115
3004AMO05 0,26 0,12 0,38 100
1705FIR01 0,19 0,10 0,28 97
1905CAT01 0,80 0,47 1,26 98
1905CAT03 0,29 0,15 0,46 114
0406AQH01 0,37 0,16 0,56 115
0506AQL01 0,44 0,19 0,66 116
Um método analítico pode ser considerado aplicável, mesmo que não revele
especificidade e selectividade, quando na prática, e após a realização de ensaios de
recuperação, se verificar que as taxas de recuperação estão compreendidas entre
80% e 120% (D. Harvey, 2000). Neste caso, todas as amostras analisadas
apresentam taxas de recuperação que se encontram dentro do intervalo de aceitação.
Supondo que os resultados obtidos são representativos do universo de amostral pode-
se considerar que à partida o método é aplicável.
Relativamente aos outros métodos de determinação de metais também se
verificou que todas as amostras analisadas apresentavam taxas de recuperação entre
80 e 120%. Assim, pela mesma razão que foi referida no método de determinação de
cobre, considera-se que à partida os restantes métodos em estudo são aplicáveis.
147
7.2.2. Avaliação Directa

Este tipo de avaliação tem como principal objectivo determinar a exactidão do
método de ensaio. Neste processo de validação a avaliação da exactidão do método
foi efectuada através de ensaios interlaboratoriais e de testes comparativos.
Ensaios interlaboratoriais
Durante o processo de validação dos métodos realizou-se um ensaio
interlaboratorial, no qual foi possível avaliar o desempenho do método de
determinação de cobre e do método de determinação de níquel em águas residuais.
A amostra de água residual analisada era ligeiramente amarelada e possuía
alguns sólidos suspensos (SST=135 mg/L). Antes de se proceder à análise digeriu-se
e filtrou-se a amostra.
As amostras foram analisadas sem diluição e obtiveram-se os seguintes
resultados:
– [Cu] = 0,86 mg Cu/L.

– [Ni] = 1,09 mg Ni/L.
No caso do cobre o valor de referência corresponde a 0,79 mg Cu/L e o desvio

padrão associado é de 0,04 mg Cu/L. Assim, o factor de desempenho do laboratório
(Z) corresponde ao valor obtido pela equação 3.19:
(X lab  X v ) 0,86  0,79

Z   1,8
S 0,04

Relativamente ao níquel o valor de referência corresponde a 0,96 mg Ni/L e o
desvio padrão associado é de 0,05 mg Ni/L. Deste modo, o factor de desempenho do
laboratório (Z) é dado pela equação 3.19:
(X lab  X v ) 1,09  0,96

Z   2,6
S 0,05
148

Testes comparativos
O principal objectivo dos testes comparativos é avaliar a exactidão do método
interno relativamente ao de referência. Neste caso, o método de referência é a
espectroscopia de absorção atómica (EAA) e os ensaios foram realizados num
laboratório alemão acreditado (GBA).
A maioria das amostras em estudo foram previamente digeridas e filtradas
antes de serem enviadas para o laboratório alemão.
Neste caso a exactidão do método de ensaio foi avaliada através do cálculo
dos erros relativos (Er) e absolutos, para cada amostra analisada. Os erros relativos
foram determinados com base na equação 6.15 e os resultados obtidos encontram-
se na tabela 7.20. O erro absoluto corresponde à diferença entre o valor obtido e o
valor aceite como verdadeiro. Os seus valores encontram-se na tabela 7.20.
Tabela 7.20: Erros relativos e absolutos associados aos resultados utilizados no processo de
comparação de métodos de determinação de cobre.
Amostras *Xlab (mg Cu/L) **Xv (mg Cu/L) Erro relativo (%) Erro absoluto
0605AMO01 <0,13 <0,10 - -
0804CAT01 <0,13 <0,10 - -
1305SUC01 <0,13 <0,10 - -
1805NEO01 <0,13 <0,10 - -
1805FAU01 <0,13 <0,10 - -
1805GAM01 <0,13 <0,10 - -
0705CAT01 0,16 0,11 5 0,05
2204CAT02 0,82 0,76 8 0,04
2705REI01 <0,13 <0,10 - -
1905CAT01 0,93 1,60 42 0,67
1905CAT03 0,30 0,28 6 0,02
3003REI01 0,40 0,37 9 0,03
1604GAM01 <0,13 <0,10 - -
2503CAT03 0,85 0,75 13 0,10
2304CIF01 0,43 0,47 8 0,04
2204CAT04 0,43 0,39 10 0,04
*Xlab- corresponde ao resultado obtido pelo método em estudo.

**Xv – corresponde ao valor de referência, obtido a partir do método de referência.
149
Supondo que as amostras em estudo são representativas do universo amostral,

é possível concluir que 50% das amostras apresentam erros relativos inferiores a 5%,
cerca de 44% apresentam erros relativos inferiores a 15% e aproximadamente 6%
apresentam erros relativos superiores a 15%.
O erro relativo não tem um valor recomendado na legislação. Contudo,
considera-se geralmente 15% como um valor aceitável. Neste caso, apenas 1 amostra
em 16 apresentou um erro relativo superior a 15%. O elevado erro relativo que se
obteve neste caso, permite concluir que poderá ter ocorrido um erro grosseiro por
parte de um dos métodos analíticos. Contudo, tendo em conta que esta amostra
representa apenas 6% do total de amostras comparadas, admite-se que o seu
resultado é pouco significativo.
A exactidão recomendada pela legislação refere-se ao erro absoluto e volta a
impor o limite de 10% do valor paramétrico. No DL 236/98 é definido como valor limite
de emissão de descargas de águas residuais uma concentração de 1,0 mg Cu/L.
Desta forma, 10% do valor paramétrico corresponde a 0,10 mg Cu/L. Nestas
circunstâncias apenas 1 das amostras em estudo não cumpriu com este requisito,
pelo que se pode considerar pouco significativo.
Nos restantes métodos em estudo os erros absolutos também não devem
ultrapassar o limite de 10% do valor paramétrico (VLE). Tendo em conta os valores
do limite de emissão apresentados na tabela 7.20 pode-se concluir que para estes 3
métodos todos os valores dos erros absolutos calculados são inferiores ao limite
imposto pelo DL 236/98.
150
Considerações Finais
8. Considerações Finais
A importância do trabalho efectuado reside na utilidade de se ter métodos de
análise válidos, que produzam resultados fiáveis e se possível que sejam métodos
rápidos e económicos. O estudo do método de determinação de nitrato tornou-se um
desafio deste trabalho, uma vez que este era um método relativamente recente e logo
à partida apresentava vantagens óbvias, relativamente a outros métodos de
determinação de nitratos, quer do ponto de vista económico, quer da sua simplicidade.
Contudo, estas vantagens não fazem sentido caso não se prove a viabilidade do
método e, portanto, um dos objectivos deste trabalho era efectuar o seu processo de
validação.
Considerando os princípios em que se baseava este trabalho foram tidos em
conta alguns documentos normativos, nomeadamente as normas ISO 8466-1, ISO
8466-2, ISO 5325-1, ISO 5325-2, ISO 5325-3, ISO 5325-6, ISO 8258 e ISO 3534-1. A
informação presente nestes documentos foi primordial no desenvolvimento deste
trabalho.
O processo de validação do método de determinação de nitrato foi iniciado com
a validação da gama de trabalho, tendo em conta que esta se deveria adaptar às
necessidades do método. Foram ainda avaliados outros parâmetros de validação tais
como: a sensibilidade, a curva de calibração e respectiva linearidade, os limiares
analíticos, a especificidade/selectividade do método, a precisão através do estudo da
repetibilidade e da precisão intermédia do método, a robustez e, por último, a
exactidão do método que foi avaliada a partir dos resultados dos ensaios
interlaboratoriais e através de comparações de resultados em que se utilizou, para o
efeito, um método de referência (cromatografia iónica).
Uma vez que os interferentes deste método eram praticamente desconhecidos,
efectuou-se o estudo de interferentes comuns nas amostras de águas residuais e
procurou-se avaliar, através de ensaios de recuperação, se estes causavam
interferências neste método. Após a conclusão do estudo da especificidade e
selectividade do método retiraram-se algumas ilações. Elementos como o sulfato, o
cloreto e o zinco, e ainda um aminoácido que foi a glicina, não apresentaram
interferências significativas no método. Contudo, houveram outros interferentes que
em determinadas condições demonstraram afectar significativamente os resultados
do método de ensaio, sendo esses: o ferro (II), o hidrogenoftalato de potássio (KHP),
o nitrito e uma mistura de ácido glutâmico e glucose.
151
Provavelmente alguns dos interferentes em causa não foram descobertos,

devido essencialmente à complexidade da matriz das amostras em estudo, contudo,
procurou-se encontrar métodos capazes de corrigir os efeitos de matriz de amostras
complexas e os efeitos que alteram a sensibilidade do método. Neste sentido, para
além de se efectuar o máximo de diluições possíveis nas amostras, utilizou-se o
método de adição padrão. Este método foi utilizado na análise de 17 amostras, das
quais apenas 5 revelaram a presença de interferências significativas, na sequência da
comparação efectuada entre os dois métodos de quantificação. Perante os resultados
obtidos admite-se que à partida o método de adição padrão é eficaz na correcção dos
efeitos de matriz deste tipo de amostras, devendo portanto ser utilizado sempre que
se comprove a sua necessidade, através de ensaios de recuperação.
No que diz respeito à avaliação da robustez do método é possível concluir que,
tanto para a água de consumo como para a água residual, os factores que ao serem
variados exercem maior influência no resultado final são o volume de ácido clorídrico
e volume de dicloridrato de N-(1-naftil)etilenodiamina (NEDA). No entanto, admite-se
que a variação do volume de ácido clorídrico utilizada (considerada expectável de
laboratório para laboratório) foi exagerada o que, de certa forma, justifica a tão elevada
influência deste factor. No caso da amostra de água residual, verificou-se ainda a
influência significativa de outros factores. Contudo, deve-se ter em conta que através
do estudo de outros parâmetros, tais como a incerteza total do método e a avaliação
de cartas de controlo, foi possível demonstrar que estes factores podem ser facilmente
controlados, de forma a garantir um bom desempenho do método.
Após a avaliação do desempenho global do método de determinação de nitrato
conclui-se que, de um modo geral, os resultados apresentados ao longo do processo
de validação foram satisfatórios e cumprem com os requisitos impostos pelos decretos
de lei 306/2007 e 236/98, que pretendem que se prove que o método em estudo
apresenta resultados pelo menos tão fiáveis como os que seriam obtidos pelos
métodos especificados legalmente. Os parâmetros que os anteriores decretos
mencionam para provar tal aspecto são a precisão, a exactidão e o limite de detecção,
sendo que os métodos devem ser capazes de atingir no mínimo 10% do valor
paramétrico.
No futuro seria interessante realizar mais estudos com vista à identificação de
possíveis interferentes do método com o intuito de conhecer melhor o tipo de amostras
que estão a ser analisadas e de melhorar o desempenho do método.
152
Durante o presente trabalho efectuou-se ainda a validação de 4 métodos de

espectroscopia de absorção atómica. Pretendia-se verificar se estes estariam aptos
para a análise de chumbo, níquel, zinco e cobre. Durante estes processos validaram-
se alguns parâmetros, tais como: a gama de trabalho, a linearidade da curva de
calibração, os limiares analíticos, a especificidade/selectividade do método, a precisão
através do estudo da reprodutibilidade e da precisão intermédia, e a exactidão que foi
avaliada com base nos resultados obtidos pelos ensaios interlaboratoriais, e a partir
da comparação dos resultados obtidos quer por estes métodos, quer por um método
de referência, que neste caso foi também um método de espectroscopia de absorção
atómica.
No final do processo de validação destes métodos verificou-se que os
resultados foram em geral satisfatórios para todos os parâmetros avaliados, pelo que
se considera que os métodos em estudo foram validados com sucesso.
Analogamente ao método que se validou inicialmente, também foram
cumpridos todos os requisitos impostos pelo decreto de lei 236/98, que pretende que
se prove que o método em estudo apresenta resultados pelo menos tão fiáveis como
os que seriam obtidos pelo método especificado legalmente.
153
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159
Anexo I
A1. Resultados associados à comparação de concentrações, quantificadas a

partir do método de adição padrão e do método da curva de calibração.
Águas residuais
Tabela A1.1: Aplicação do método de adição padrão na amostra 0902SON05.
[Nitrato]
(mg N-NO3-/L)
0902SON05 0,00 2,57
0.500
0.400
Absorvância
0.300
0.200
y = 0,0949x + 0,0747
0.100
R² = 0,9993
0.000
-2.000 -1.000 0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000
-0.100
Figura A1.1: Representação gráfica do método de adição padrão para a amostra 0902SON05.
Tabela A1.2: Aplicação do método de adição padrão na amostra 1902NEU01.

[Nitrato]
(mg N-NO3-/L)
1902NEU01 1,05 2,31
161
Anexo I
Figura A1.2: Representação gráfica do método de adição padrão para a amostra 1902NEU01.
Tabela A1.3: Aplicação do método de adição padrão na amostra 1902RON01.

[Nitrato]
(mg N-NO3-/L)
1902RON01 1,10 2,36
Figura A1.3: Representação gráfica do método de adição padrão para a amostra 1902RON01.
162
Anexo I
Tabela A1.4: Aplicação do método de adição padrão na amostra 0503MAS01.

[Nitrato]
(mg N-NO3-/L)
0503MAS01 0,85 2,36
Figura A1.4: Representação gráfica do método de adição padrão para a amostra 0503MAS01.
Tabela A1.5: Aplicação do método de adição padrão na amostra 1003TAF02.

[Nitrato]
(mg N-NO3-/L)
1003TAF02 0,63 2,31
163
Anexo I
Figura A1.5: Representação gráfica do método de adição padrão para a amostra 1003TAF02.
Tabela A1.6: Aplicação do método de adição padrão na amostra 1603NEU01.

[Nitrato]
(mg N-NO3-/L)
1603NEU01 0,86 2,31
0.300
0.250
Absorvância
0.200
0.150
0.100
y = 0,0942x + 0,068
0.050 R² = 0,9985
0.000
-1.000 -0.500 0.000 0.500 1.000 1.500 2.000
-0.050
-0.100
Figura A1.6: Representação gráfica do método de adição padrão para a amostra 1603NEU01.
164
Anexo I
Águas de consumo
Tabela A1.7: Aplicação do método de adição padrão na amostra 0802MAC01 (consumo).

[Nitrato]
(mg N-NO3-/L)
0802MAC01 Adição padrão y=0,0910x+0,0423 0,46 3,58x10-2
0,66 2,31
(consumo) Curva de calibração y=0,0954x-0,0001 0,47 1,72x10-2

0.500
0.400
0.300
Absorvância
0.200
0.100 y = 0,0910x + 0,0423

R² = 0,9991
0.000
-1.000 0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000
-0.100
Concentração (mgL-1)
Figura A1.7: Representação gráfica do método de adição padrão para a amostra 0802MAC01.
Tabela A1.8: Aplicação do método de adição padrão na amostra 2202GCO01 (consumo).

[Nitrato]
(mg N-NO3-/L)
2202GCO01 Adição padrão y=0,1054x+0,0555 0,53 1,87x10-2
2,07 2,31
(consumo) Curva de calibração y=0,0938x+0,0012 0,56 2,77x10-2
165
Anexo I
Figura A1.8: Representação gráfica do método de adição padrão para a amostra 2202GCO01.
Tabela A1.9: Aplicação do método de adição padrão na amostra 0303SIL01 (consumo).

[Nitrato]
(mg N-NO3-/L)
0303SIL01 Adição padrão y=0,917x+0,0456 0,50 5,37x10-2
1,13 2,31
Figura A1.9: Representação gráfica do método de adição padrão para a amostra 0303SIL01.
166
Anexo I
Tabela A1.10: Aplicação do método de adição padrão na amostra 0903IMO01 (consumo).

[Nitrato]
(mg N-NO3-/L)
0903IMO01 Adição padrão y=0,1001x+0,0648 0,65 9,90x10-3
1,28 2,36
Figura A1.10: Representação gráfica do método de adição padrão para a amostra 0903IMO01.
Tabela A1.11: Aplicação do método de adição padrão na amostra 3003GCO01 (consumo).

[Nitrato]
(mg N-NO3-/L)
3003GCO01 Adição padrão y=0,0938x+0,0796 0,85 2,84x10-2
0.00 2,31
(consumo) Curva de calibração y=0,0945x-0,00006 0,85 1,70x10-2
167
Anexo I
Figura A1.11: Representação gráfica do método de adição padrão para a amostra 3003GCO01.
168
Anexo II
A2.1 Avaliação indirecta da validação do método de determinação de chumbo.
A2.1.1 Quantificação (chumbo)
Tabela A2.1: Resultados obtidos para a validação da gama de trabalho (chumbo):
Padrão 0,2000 2,000

0,010 0,075
0,010 0,077
0,012 0,075
Absorvâncias
0,011 0,073
0,009 0,072
0,010 0,076
0,011 0,072
0,011 0,074
0,009 0,075
0,011 0,075
Variância 9,33x10-7 2,71x10-6
Fexp 2,90
Fcrit 3,18
Tabela A2.2: Dados utilizados na construção da curva de calibração de determinação de chumbo.
Concentração (mg Pb/L) 0 0,2000 0,5000 0,8000 1,200 1,600 2,000
0,000 0,011 0,022 0,032 0,046 0,059 0,073
0,000 0,011 0,020 0,031 0,044 0,058 0,071
Absorvâncias 0,000 0,009 0,021 0,031 0,047 0,061 0,075
0,000 0,010 0,021 0,032 0,047 0,062 0,077
0,000 0,009 0,020 0,031 0,047 0,058 0,073
Média 0,000 0,010 0,021 0,031 0,046 0,060 0,074
169
Anexo II
Tabela A2.3: Parâmetros obtidos da regressão linear (chumbo).
Parâmetro Valor
b 0,0364
Sb 5,93x10-4
a 0,0018
Sa 0,0007
Sy/x 1,07x10-3
Tabela A2.4: Dados relativos à avaliação da linearidade da curva de calibração de determinação de

chumbo.
Curva de calibração Desvio padrão residual S2 Fexp Fcrit (0,95; 1,4 gl)
linear 1,07x10-3
2,44x10-6 2,96 7,71
não linear 9,07x10-4
0.080
0.060
Absorvância
0.040
0.020
y = 0,0364x + 0,0018
R² = 0,9987
0.000
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 2.000
Concentração (mg Pb/L)
Figura A2.1: Curva de calibração de determinação de chumbo.
170
Anexo II
0.0025
0.0020
0.0015
P2 P3
0.0010
Resíduos
P5
0.0005 P4
0.0000
0.000 0.200 0.500 0.800 1.200 1.600 2.000
-0.0005
-0.0010 P6
P7
-0.0015
-0.0020
P1
-0.0025
Padrões
Figura A2.2: Análise de resíduos (chumbo).
1.55E-01
1.50E-01
1.45E-01
1.40E-01
1.35E-01
1.30E-01
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 2.000
Concentração (mg Pb/L)
Figura A2.3: Avaliação da sensibilidade do método ao longo da gama de trabalho.
171
Anexo II
Tabela A2.5: Limiares analíticos do método de determinação de chumbo.
Metal Limite de detecção (L.D.) Limite de quantificação (L.Q.)
Chumbo 0,10 mg Pb/L 0,29 mg Pb/L
A2.1.2 Precisão
– Repetibilidade
Tabela A2.6: Resultados associados à avaliação da repetibilidade do método através da amostra

0405BRO01 (chumbo).
Absorvância [Pb] (mg Pb/L) Média Desvio padrão |Xi-Xi-1| r CVr (%)
0,037 0,82 0,02
0,036 0,80 0,02
0,037 0,82 0,04
0,039 0,87 0,02
0,040 0,89 0,04
0,83 3,27x10-2 0,09 4
0,038 0,84 0,07
0,035 0,78 0,02
0,036 0,80 0,02
0,037 0,82 0,00
0,037 0,82

1606CAT01.
Absorvância [Pb] (mg Pb/L) Média Desvio padrão |Xi-Xi-1| r CVr (%)
0,011 0,25 0,05
0,009 0,20 0,03
0,010 0,23 0,00
0,010 0,23 0,03
0,011 0,25 0,03
0,24 2,84X10-2 0,08 12
0,012 0,28 0,05
0,010 0,23 0,03
0,009 0,20 0,03
0,010 0,23 0,05
0,012 0,28
172
Anexo II
Tabela A2.8: Resultados obtidos na determinação da precisão intermédia a partir de um conjunto de


0,82 6,71x10-4
1305PRO01 0,82 0,84 5,29x10-4 3,59x10-3
0,89 2,39x10-3
0,40 8,80x10-4
0305CTC07 0,44 0,43 5,68x10-5 1,43x10-3
0,45 4,90x10-4
0,84 9,38x10-4
2204CAT04 0,80 0,81 1,98x10-4 1,41x10-3
0,79 2,75x10-4
0,37 1,07x10-3
1105CIF01 0,31 0,34 6,32x10-4 1,76x10-3
0,33 5,68x10-5
0,40 9,67x10-5
0406AQH01 0,36 0,39 7,49x10-4 1,15x10-3
0,41 3,07x10-4
1,01 2,88x10-3
1604ECO02 1,08 1,068 6,94x10-5 5,01x10-3
1,11 2,06x10-3
0,85 6,08x10-5
0405BRO01 0,86 0,84 4,24x10-4 1,29x10-3
0,81 8,07x10-4
0,93 1,35x10-4
0506AQL01 0,99 0,94 1,79x10-3 2,86x10-3
0,91 9,38x10-4
0,38 5,65x10-4
1604ECO01 0,37 0,36 1,41x10-4 1,98x10-3
0,32 1,27x10-3
0,40 1,52x10-5
0804SON09 0,42 0,41 2,50x10-4 4,07x10-4
0,39 1,42x10-4
1,026 2,09x10-3
1604ECO02 1,086 1,07 2,05x10-4 3,27x10-3
1,103 9,82x10-4
∑∑(yjk-yj,méd)2 2,42x10-2
Si(T) 3,31x10-2 mg Pb/L
173
Anexo II
A2.1.3 Especificidade/Selectividade
Tabela A2.9: Resultados associados aos ensaios de recuperação (chumbo).
[amostra] [incremento] [amostra + incremento] Recuperação

Amostra
(mg Pb/L) (mg Pb/L) (mg Pb/L) (%)
0,40 0,50 0,91 103
0804SON08
0,40 0,90 1,28 97
3004AMO05 0,34 0,25 0,58 95
1805FAU01 0,35 0,10 0,45 100
1305PRO01 0,81 0,40 1,14 83
2204CAT02 0,44 0,19 0,61 89
1905CAT04 0,09 0,16 0,24 97
1604ECO02 0,80 0,50 1,20 80
1905CAT03 0,35 0,18 0,52 95
A2.2 Avaliação directa do método de determinação de chumbo
Tabela A2.10: Erros relativos e absolutos associados aos resultados utilizados no processo
de comparação de métodos de determinação de chumbo.
Amostras *Xlab (mg Pb/L) **Xv (mg Pb/L) Erro relativo (%) Erro absoluto
0405BRO01 0,81 0,77 5 0,04
0605PSA01 <0,29 <0,20 - -
0605AMO01 0,50 0,54 8 0,04
1305PRO01 0,94 1,00 6 0,06
1805NEO01 <0,29 <0,20 0 0
0705CAT01 <0,29 <0,20 0 0
2405IDE01 <0,29 <0,20 0 0
0305CTC07 0,45 0,44 2 0,01
2503CAT03 0,75 0,65 15 0,10
2204CAT04 0,84 0,80 5 0,04

174
Anexo III
A3.1 Avaliação indirecta do método de determinação de níquel
A3.1.1 Quantificação
Tabela A3.1: Resultados obtidos para a validação da gama de trabalho (níquel):
Padrão 0,2000 2,000

0,014 0,135
0,017 0,134
0,016 0,135
Absorvâncias
0,015 0,137
0,015 0,141
0,017 0,138
0,016 0,141
0,019 0,140
0,016 0,141
0,019 0,139
Variância 2,71x10-6 7,43x10-6
Fexp 2,74
Fcrit 3,18
Tabela A3.2: Dados utilizados na construção da curva de calibração de determinação de níquel.
Concentração (mg Ni/L) 0 0,2000 0,5000 0,8000 1,200 1,600 2,000
0,000 0,016 0,037 0,060 0,086 0,116 0,143
0,000 0,017 0,039 0,061 0,088 0,115 0,142
0,000 0,015 0,038 0,059 0,084 0,114 0,139
Absorvâncias
0,000 0,016 0,039 0,061 0,087 0,119 0,146
0,000 0,016 0,038 0,061 0,086 0,114 0,141
0,000 0,015 0,036 0,058 0,080 0,110 0,135
Média 0,000 0,016 0,038 0,060 0,085 0,115 0,141
175
Anexo III
Tabela A3.3: Parâmetros obtidos da regressão linear (níquel).

Parâmetro Valor
b 0,0702
Sb 8,55x10-4
a 0,0019
Sa 0,0010
Sy/x 1,54x10-3

níquel.
linear 1,54x10-3
4,81x10-6 2,73 7,71
0.150
0.135
0.120
Absorvância
0.105
0.090
0.075
0.060
0.045
0.030 y = 0,0702x + 0,0019
R² = 0,9993
0.015
0.000
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 2.000
Concentração (mg Ni/L)
Figura A3.1: Curva de calibração de determinação de níquel.
176
Anexo III
0.0025
P4
0.0020
0.0015 P3
0.0010
P7
0.0005 P2
Resíduos
0.0000
0.000 0.200 0.500 0.800 1.200 1.600 2.000
-0.0005
-0.0010
-0.0015 P6
P8
-0.0020
P1
-0.0025
Padrões
Figura A3.2: Análise de resíduos (níquel).

1.20E-01
1.15E-01
1.10E-01
1.05E-01
1.00E-01
9.50E-02
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000 1.200 1.400 1.600 1.800 2.000
Concentração (mg Ni/L)
Tabela A3.5: Limiares analíticos do método de determinação de níquel.
Metal Limite de detecção (L.D.) Limite de quantificação (L.Q)
Níquel 0,07 mg Ni/L 0,22 mg Ni/L
177
Anexo III
A3.1.2 Precisão
– Repetibilidade

0705GES01 (níquel).
Absorvância [Ni] (mg Ni/L) Média Desvio padrão |Xi-Xi-1| r CVr (%)
0,018 0,23 0,02
0,017 0,21 0,03
0,019 0,24 0,00
0,019 0,24 0,02
0,020 0,26 0,00
0,25 1,84x10-2 0,05 8
0,020 0,26 0,02
0,019 0,24 0,02
0,020 0,26 0,02
0,021 0,27 0,03
0,019 0,24

1305PRO01 (níquel).
Absorvância [Ni] (mg Ni/L) Média Desvio padrão |Xi-Xi-1| r CVr (%)
0,049 0,84 0,01
0,050 0,85 0,02
0,051 0,87 0,02
0,050 0,85 0,02
0,051 0,87 0,00
0,87 1,55x10-2 0,04 2
0,051 0,87 0,00
0,051 0,87 0,00
0,051 0,87 0,02
0,052 0,89 0,04
0,050 0,85
178
Anexo III


0,56 1,47x10-5
2804REL01 0,58 0,55 8,55x10-4 1,96x10-3
0,52 1,09x10-3
0,47 3,05x10-3
1604GAM01 0,40 0,44 1,57x10-4 5,09x10-3
0,45 1,88x10-3
0,81 1,71x10-3
3003FER01 0,88 0,85 8,74x10-4 2,73x10-3
0,86 1,41x10-4
0,39 3,40x10-4
2304CIF01 0,41 0,41 8,60x10-6 8,05x10-4
0,43 4,57x10-4
0,28 8,47x10-4
2405IDE01 0,30 0,31 1,32x10-4 2,63x10-3
0,35 1,65x10-3
1,08 1,42x10-3
1105CIF01 1,14 1,11 8,60x10-4 2,35x10-3
1,12 6,94x10-5
0,59 1,62x10-3
2705REI01 0,52 0,55 1,14x10-3 2,80x10-3
0,55 4,18x10-5
0,86 6,57x10-4
1305PRO01 0,87 0,88 1,70x10-4 2,32x10-3
0,92 1,50x10-3
1,17 1,39x10-3
0405BRO01 1,12 1,14 2,79x10-4 2,10x10-3
1,11 4,27x10-4
∑∑(yjk-yj,méd)2 2,28x10-2
Si(T) 3,56x10-2 mg Ni/L
179
Anexo III
Tabela A3.9: Resultados associados aos ensaios de recuperação (níquel).

[amostra] [incremento] [amostra+incremento]
Amostra Recuperação (%)
(mg Ni/L) (mg Ni/L) (mg Ni/L)
0605AMO01 0,11 0,25 0,37 104
1105CIF01 1,27 0,50 1,71 88
1805GAM01 0,33 0,30 0,63 101
2705REI01 0,76 0,25 1,03 108
0406AQH01 1,43 0,50 1,84 82
2405IDE01 0,25 0,15 0,41 104
1604GAM01 0,51 0,08 0,60 104
2304CIF01 0,43 0,09 0,51 97
2405GES01 0,54 0,13 0,66 94
0605PSA01 0,35 0,12 0,48 105
A3.2 Avaliação directa do método de determinação de níquel
Tabela A3.10: Erros relativos e absolutos associados aos resultados utilizados no processo de
comparação de métodos de determinação de níquel.
Amostras *Xlab (mg Ni/L) **Xv (mg Ni/L) Erro relativo (%) Erro absoluto
0405BRO01 1,17 1,15 2 0,02
1305PRO01 0,87 0,89 3 0,02
1805NEO01 <0,22 <0,20 - -
1805FAU01 <0,22 <0,20 - -
1805GAM01 1,42 1,25 13 0,17
2705REI01 0,59 0,53 12 0,06
3003REI01 0,52 0,47 11 0,05
2304CIF01 <0,22 <0,20 - -

180
Anexo IV
A4.1 Avaliação indirecta (zinco)
A4.1.1 Quantificação
Tabela A4.1: Resultados obtidos para a validação da gama de trabalho (zinco):
Padrão 0,1000 0,9000

0,046 0,368
0,041 0,363
0,048 0,372
Absorvâncias
0,047 0,378
0,046 0,371
0,049 0,372
0,054 0,381
0,051 0,372
0,047 0,375
0,053 0,377
Variância 1,44x10-5 2,68x10-5
Fexp 1,86
Fcrit 3,18
Tabela A4.2: Dados utilizados na construção da curva de calibração de determinação de zinco.
Padrão P1 P2 P3 P4 P5 P6
Concentração (mg Zn/L) 0 0,1000 0,3000 0,5000 0,7000 0,9000
0,000 0,044 0,127 0,213 0,295 0,375
0,000 0,044 0,130 0,216 0,301 0,383
Absorvâncias 0,000 0,048 0,128 0,219 0,300 0,380
0,000 0,042 0,129 0,211 0,294 0,375
0,000 0,041 0,128 0,217 0,302 0,380
Média 0,000 0,044 0,128 0,215 0,298 0,379
181
Anexo IV
Tabela A4.3: Parâmetros obtidos da regressão linear (zinco).
Parâmetro Valor
b 0,422
Sb 2,49x10-3
a 0,0015
Sa 0,0013
Sy/x 1,94x10-3

zinco.
linear 1,94x10-3
1,14x10-5 9,29 10,13
0.400
0.360
0.320
0.280
Absorvância
0.240
0.200
0.160
0.120
0.080 y = 0,4219x + 0,0015
R² = 0,9999
0.040
0.000
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000
Concentração (mg Zn/L)
Figura A4.1: Curva de calibração de determinação de zinco.
182
Anexo IV
0.0030 P4
0.0020
P5
0.0010
P2
Resíduos
P3
0.0000
0.0000 0.1000 0.3000 0.5000 0.7000 0.9000
-0.0010
-0.0020 P1
-0.0030 P6
Padrões
Figura A4.2: Análise de resíduos (zinco).
2.50E-02
2.40E-02
2.30E-02
2.20E-02
2.10E-02
2.00E-02
0.000 0.200 0.400 0.600 0.800 1.000
Concentração (mg Zn/L)
Tabela A4.5: Limiares analíticos do método de determinação de zinco.
Metal Limite de detecção (L.D.) Limite de quantificação (L.Q)
Zinco 0,02 mg Zn/L 0,05 mg Zn/L
183
Anexo IV
A4.1.2 Precisão
– Repetibilidade

2503CAT03 (zinco).
[Zn]
(mg Zn/L)
0,374 0,84 0,00
0,374 0,84 0,02
0,383 0,86 0,03
0,369 0,83 0,01
0,376 0,84 0,00
0,85 1,53x10-2 0,04 2
0,376 0,84 0,01
0,379 0,85 0,02
0,386 0,87 0,00
0,389 0,87 0,00
0,387 0,87

1905CAT01 (zinco).
[Zn]
(mg Zn/L)
0,182 0,42 0,04
0,197 0,46 0,04
0,181 0,42 0,03
0,191 0,45 0,03
0,205 0,48 0,44 2,09x10-2 0,03 0,06 5
0,191 0,45 0,00
0,191 0,45 0,03
0,179 0,42 0,04
0,196 0,46
184
Anexo IV


0,44 2,61x10-4
3003REI01 0,45 0,46 2,47x10-5 7,33x10-4
0,48 4,47x10-4
0,36 5,34x10-4
1604GAM01 0,33 0,34 5,18x10-5 8,38x10-4
0,32 2,53x10-4
0,85 6,94x10-5
2503CAT03 0,81 0,84 8,05x10-4 1,28x10-3
0,86 4,01x10-4
0,21 8,46x10-5
2304CIF01 0,21 0,20 1,69x10-4 7,47x10-4
0,18 4,93x10-4
0,47 1,12x10-3
0705GES01 0,41 0,44 8,31x10-4 1,97x10-3
0,44 2,15x10-5
0,36 3,48x10-4
0,34
0804CAT01 0,30 1,05x10-3 1,59x10-3
0,35 1,90x10-4
0,14 3,48x10-5
1105CIF01 0,12 0,13 5,63x10-5 9,36x10-5
0,13 2,56x10-6
0,50 2,15x10-3
1705FIR01 0,59 0,54 2,06x10-3 4,21x10-3
0,54 1,07x10-6
0,20 1,72x10-3
0705CAT01 0,28 0,24 1,76x10-3 3,49x10-3
0,24 2,50x10-7
0,77 2,49x10-4
0506AQL01 0,77 0,78 1,41x10-4 1,15x10-3
0,81 7,64x10-4
0,65 1,35x10-3
0406AQH01 0,71 0,69 3,93x10-4 2,03x10-3
0,70 2,87x10-4
∑∑(yjk-yj,méd)2 1,81x10-2
Si(T) 2,87x10-2 mg Zn/L
185
Anexo IV
Tabela A4.9: Resultados associados aos ensaios de recuperação (níquel).

[amostra] [incremento] [amostra+incremento] Recuperação
Amostra
(mg Zn/L) (mg Zn/L) (mg Zn/L) (%)
0605AQL01 0,77 0,35 1,10 93
0406AQH01 0,71 0,32 1,01 95
3004AMO05 0,37 0,16 0,54 106
1905CAT03 0,63 0,29 0,91 97
1905CAT01 0,51 0,22 0,73 97
2705REI01 0,27 0,10 0,36 89
0705GES01 0,47 0,19 0,65 97
2405GES01 0,31 0,12 0,42 96
2204CAT02 0,23 0,35 0,61 109
1805GAM01 0,25 0,10 0,36 111
1905CAT04 0,26 0,10 0,37 107
Tabela A4.10: Erros relativos e absolutos associados aos resultados utilizados no processo de
comparação de métodos de determinação de níquel.
Amostras *Xlab (mg Zn/L) **Xv (mg Zn/L) Erro relativo (%) Erro absoluto
0804CAT01 0,21 0,20 6 0,01
1805GAM01 2,30 2,40 4 0,10
0705CAT01 0,20 0,13 50 0,07
2204CAT02 1,50 1,40 7 0,10
1905CAT01 0,45 0,47 4 0,02
1905CAT03 0,29 0,32 10 0,03
1905CAT04 0,22 0,25 10 0,03
3003REI01 2,25 2,30 2 0,05
2503CAT03 0,85 0,91 7 0,06
2304CIF01 0,21 0,19 11 0,02
2204CAT04 4,60 4,30 7 0,30
2204CAT03 0,15 0,12 21 0,03

186

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Vanessa dos Santos Guimarães

Validação dos Métodos de Determinação de Nitratos e Metais

Validação dos Métodos de Determinação de Nitratos e Metais em Águas

Tese submetida à Faculdade de Ciências da Universidade do Porto

Finalmente esta obra é uma realidade graças a muito trabalho, dedicação e

1.1. Entidade de acolhimento

1.3. Estrutura da tese

2. A Água: aspectos gerais, elementos quantificados e métodos de análise

Tabela 2.1: Balanço hídrico global

Cerca de 94% de toda a água encontra-se nos mares e oceanos com um

qualidade adequada para diversos fins e a não reposição da mesma contribuiu

2.1. Água para Consumo Humano: Controlo de Qualidade e Legislação

1 Relatório do estado do ambiente.

2.2. Águas Residuais: Processo de Tratamento, Controlo de Qualidade e

2.3. Elementos Quantificados em Águas de Consumo Humano e em Águas

2.3.1. Nitrato: Origem, contaminação, implicações na saúde humana e

2.3.1.1. A sua Origem: Fonte Natural e Fonte Antropogénica

O ciclo do azoto caracteriza-se por trocas constantes de azoto entre a

Figura 2.1: Ciclo do azoto2.

As plantas leguminosas apresentam geralmente nódulos nas suas raízes e

Figura 2.2: Formação de nitrato3.

2.3.1.2. Contaminação de Água por Nitrato no Território Português

3 Fonte: adaptado de www.microagua.pt/nitratos.htm

transportado pela água (rega e precipitação), podendo contaminar os recursos

Figura 2.3: Consumo aparente de fertilizantes inorgânicos na agricultura 4.

Entre 2004 e 2006 ocorreu uma redução do consumo aparente de fertilizantes

4 Fonte: Relatório do estado do ambiente (REA), 2007

Figura 2.4: Balanço do azoto5.

De acordo com a informação ilustrada anteriormente verifica-se que Portugal

2.3.1.3. Consumo de Nitrato: Implicações na Saúde Humana

5 Fonte: Relatório do estado do ambiente, 2007

bactérias presentes na boca (WHO, Shao-Ting et al., 2007). O ião nitrito é

2.3.1.4. Métodos de Determinação de Nitrato

A redução em coluna de cádmio refere-se ao processo de redução do nitrato a

Tabela 2.2: Vantagens e desvantagens dos principais métodos de determinação de nitrato.

Método Características Vantagens Interferentes/Desvantagens

Continuação da tabela 2.2:

Método Características Vantagens Interferentes/Desvantagens

A escolha do método ideal deve ter em conta a gama de trabalho adequada,

Método de Redução em Meio Ácido

KNO3 (aq) + HCl (aq) → KCl (aq) + HNO3 (aq)

Equação 1 e 2: Formação de ácido nítrico e redução a ácido nitroso.

O ácido nitroso não é estável em solução, no entanto, aquando da sua

(aq) + NO2- (aq) + 2H+ (aq) (aq) + 2H2O (l)

sulfanilamida diazo composto

Equação 3: Diazotização da sulfanilamida.

A amina aromática diazotizada sofre facilmente ataque nucleófilo, após adição

(aq) + (aq) N N (aq)

Equação 4: Ataque nucleófilo a uma amina aromática diazotizada.

O corante formado absorve radiação a 540 nm. A radiação emitida é detectada

Espectroscopia de Absorção Molecular do Visível e Ultravioleta

Figura 2.5: Espectro electromagnético.

A absorção de radiação por moléculas orgânicas resulta das interacções entre

Tabela 2.3: : Grupos cromóforos comuns nas regiões do ultravioleta e visível 6.

Grupo Estrutura Transições

Figura 2.6: Níveis electrónicos e transições electrónicas das moléculas 7.

6, 7 Fonte: Adaptado de F. Settle, 1997.

A absorvância (A) é dada pelo logaritmo da razão entre a intensidade da

lâmpada é substituída por um tubo de descarga de hidrogénio ou deutério (R. Kellner

Figura 2.7: Monocromador8.

Neste caso o monocromador é constituído por uma rede de difracção. A

2.3.2. Metais: Origem, contaminação, implicações na saúde humana e

2.3.2.1. Chumbo: Aspectos Gerais

O chumbo é absorvido pelo corpo humano por via pulmonar, digestiva ou