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Enzimas Microbianas de Uso Terapêutico PDF
Enzimas Microbianas de Uso Terapêutico PDF
e diagnóstico clínico
Karine Rigon Zimmer1
Gustavo Luís Borré2
Danielle da Silva Trentin2
Clovis Woicickoski Júnior2
Amanda Piccoli Frasson2
Alexandre de Arruda Graeff2
Patrícia Gomes2
Alexandre José Macedo3
Resumo
Abstract
1
Pós-Graduando do Programa de Pós-Graduação em Biologia celular e molecular - Centro de Biotecnologia - Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
2
Pós-Graduando do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas - Faculdade de Farmácia - Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
³ Professor da Faculdade de Farmácia, Laboratório de Tecnologia Bioquímica e do Centro de Biotecnologia, Grupo de Biofilmes & Diversidade
Microbiana - Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre - RS, Brasil. E-mail: alexandre.macedo@ufrgs.br
Recebido em 29/05/09 e aceito em 17/08/09.
Zimmer, K. R., Borré, G. L., Trentin, D. S., Júnior, C. W., Frasson, A. P., Graeff, A. A., Gomes, P., Macedo, A.J.
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registro escrito de seus atos, há referências ao ções estomacais sobre a carne, porém o isola-
uso de processos enzimáticos. Um dos mais mento de uma enzima só foi realizado em 1833
antigos alimentos processados pelo homem, pelos franceses Anselme Payen e Jean-François
o queijo, produzido na época das primeiras Persoz que precipitaram a diastase, enzima
civilizações – a partir de leite de cabra – foi a atualmente conhecida como amilase (SILVER-
forma rudimentar encontrada para mantê-lo em MAN, 2002). Em 1836, Theodor Schwann, ob-
condições de consumo por longos períodos de servou a primeira enzima descoberta a partir
tempo, e adicionalmente, facilitar seu transporte de um tecido animal, a pepsina, responsável
por longas distâncias. O processo produtivo pela digestão protéica (SILVERMAN, 2002).
envolve a transformação dos açúcares presen- No século XIX, Pasteur descreveu a
tes no leite em ácido lático. Seu consumo está conversão do açúcar em álcool por leveduras,
descrito na Odisséia de Homero, revelando que demonstrando desta forma, que os agentes res-
os Gregos já tinham difundido em sua cultura ponsáveis pela fermentação eram organismos
a produção deste alimento. vivos. Pasteur postulou que estes fermentos
A produção e o consumo de cerveja na eram inseparáveis da estrutura celular do leve-
Babilônia data de 6000 a.C. (JAY, 2000) e os do, declarando que "a fermentação alcoólica é
egípcios fabricavam pão dois milênios antes um ato correlacionado à vida e à organização
de Cristo nascer (CARBALLO, 2002), ambos das células do fermento e não à sua morte ou
produzidos com auxílio da levedura Saccharo- putrefação" (BUCHNER, 1907). Somente em
myces cerevisiae. A cerveja tornou-se rapida- 1878, passou-se a fazer distinção entre os or-
mente um produto de importância social, de ganismos inteiros e as moléculas capazes de
onde deriva o motivo para inclusão de uma realizar a catálise, passando a serem chamadas
série de leis no código de Hamurabi sobre a pelo termo cunhado por Wilhelm Kühne,
fabricação, comercialização e consumo da cer- enzimas, do grego, “no fungo” (PRICE, 1999),
veja. Já o pão, outro importante alimento, nos e a ação destas moléculas, chamada de fermen-
primórdios da humanidade era fermentado tação.
ao ar, naturalmente, sem a adição de nenhum No fim do século XIX, Eduardo Büchner,
tipo de produto. Este processo baseia-se no fato provou que as enzimas permanecem ativas
de que existem esporos microbianos suspensos mesmo fora das células que as produzem,
na atmosfera, os quais, ao atingirem a massa demonstrando que estas não necessitam de
contendo os açúcares do trigo, crescem fermen- células vivas para a sua atividade. Esta desco-
tando a mistura, permitindo a fabricação do berta valeu-lhe o prêmio Nobel de Química de
pão. Já na Idade Média passou-se a guardar 1907 (BUCHNER, 1907). Todavia, depois de
parte da massa fermentada para utilizar-se nas transcorrido um quarto do século XX, não se
produções seguintes, visto que a “massa ve- tinha conhecimento da natureza das enzimas,
lha” contém grande quantidade de microrga- até que em 1926 James Sumner purificou e
nismos fermentadores viáveis, reduzindo-se, cristalizou a urease, sabidamente uma enzima
desta forma, o tempo de fermentação do pão. (PRICE, 1999; NORTHROP, 1946). Tal fato
Inicialmente, esta produção era puramente contribuiu com a elucidação deste mistério que
empírica. A escolha do tipo de microrganismo caiu por terra com os trabalhos de Northrop e
mais adequado para cada processo era reali- Stanley no início da década de trinta do século
zada por tentativa e erro, e o conhecimento era passado com as enzimas pepsina, tripsina e
passado através das gerações. Por muito tem- quimiotripsina, provando inequivocamente que
po não se soube que estas leveduras eram orga- as enzimas são proteínas (NORTHROP, 1946).
nismos vivos. A certeza deste fato veio apenas Em 1955, Sanger desenvolveu o primei-
no século XIX com Louis Pasteur (JAY, 2000). ro método para determinar a estrutura primária
No século XVIII, Spallanzani, um cientista de proteínas, sendo a insulina a primeira a ser
italiano, já conhecia a ação digestiva de secre- sequenciada (SANGER, 1958). Quase dez anos
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depois, foi determinada pela primeira vez a De acordo com a finalidade, as enzimas
estrutura tridimensional de uma proteína, a podem ser administradas por via tópica, oral,
lisozima, através de técnicas de cristalografia intravaginal e parenteral, apresentando-se, no
de raios-X (PRICE, 1999). último caso, geralmente na forma de prepara-
ções liofilizadas contendo sais tamponantes
3 Enzimas de uso terapêutico biocompatíveis. Atualmente existe no merca-
do uma ampla variedade de medicamentos à
O uso terapêutico de enzimas remonta base de enzimas para aplicação como anti-
ao final do século XIX, quando preparações inflamatórios, antissépticos, auxiliares diges-
brutas de enzimas pancreáticas de origem suína tivos, na reposição de enzimas hemostáticas,
já eram empregadas como auxiliares diges- na inibição da coagulação, na reposição de
tivos (CRUZ et al., 2008). Para as enzimas enzimas metabólicas, no tratamento da fibrose
utilizadas em aplicações digestivas e tópicas, cística bem como na terapia contra o câncer
a pureza, a fonte e a dose não são considera- (tabela 1). Dentre as principais enzimas tera-
das cruciais (AEHLE, 2007). Entretanto, o uso pêuticas de origem microbiana, destaca-se a
endovenoso de enzimas microbianas requer L-asparaginase utilizada para o tratamento
uma purificação de alta seletividade acoplada de leucemia linfocítica aguda. Esta enzima é
à preservação da atividade enzimática, evi- capaz de esgotar os estoques de asparagina
tando a desnaturação protéica e a proteólise. plasmática, causando a morte de células blás-
Diversos requisitos devem ser considerados ticas que não possuem a enzima asparagina
para o uso de enzimas com fins terapêuticos, sintetase (NARTA et al., 2007). Células sadias
dentre eles a baixa resposta imunológica, alta não são afetadas, uma vez que não necessitam
atividade e estabilidade em pH fisiológico, de aporte exógeno de asparagina. A enzima
baixa taxa de eliminação e independência de é obtida principalmente através dos microrga-
cofatores exógenos. Além disso, quando se nismos Escherichia coli e Erwinia carotovora,
utilizam microrganismos como fonte destas havendo formulações no mercado da enzima
moléculas, deve-se buscar cepas não pato- nativa de ambos os organismos e da L-aspara-
gênicas objetivando evitar a presença de to- ginase de E. coli conjugada ao polietilenoglicol
xinas (NETO, 2001; AEHLE, 2007). (PEG) (NARTA et al., 2007). As formulações
Na prática, poucas enzimas possuem as lipossomais ainda estão em estudo e apresen-
propriedades necessárias para este fim, cuja tam, assim como a PEG-asparaginase, menor
instabilidade dos biocatalizadores, suscetibi- toxicidade, aumento do tempo de circulação
lidade ao ataque de proteases, dificuldade de na corrente sanguínea e consequente aumento
acesso ao órgão-alvo e antigenicidade repre- da atividade terapêutica (NETO, 2001).
sentam algumas das limitações da terapia A enzima estreptoquinase, produzida por
enzimática. Entretanto, estas dificuldades Streptococcus ß-hemolítico, especialmente S.
podem ser contornadas por diferentes estraté- pyogenes e S. equisimilis, pertence à primeira
gias de formulação, como a conjugação quí- classe de agentes fibrinolíticos a ser utilizada
mica com polímeros utilizada para diminuir a na clínica, sendo capaz de ativar o plasmino-
resposta imune, um dos efeitos mais comuns gênio, substância precursora da plasmina, que
das enzimas microbianas. Além disso, a incor- por sua vez dissolve os coágulos sanguíne-
poração de enzimas a lipossomos (vesículas os (RANG et al., 2004). É utilizada para eli-
microscópicas compostas de uma ou mais minação de trombos venosos e embolias pul-
membranas lipídicas envolvendo um compar- monares agudas e quando administrada na
timento aquoso) confere diminuição da toxi- forma endovenosa, reduz a taxa de mortalida-
cidade, direcionando o acesso ao órgão-alvo de no infarto do miocárdio. Uma das princi-
e reduzem a resposta imunológica (CRUZ pais limitações desta terapia é a resposta anti-
et al., 2008). gênica, variando desde reações menores, como
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Tabela 1 – Exemplos de enzimas terapêuticas (adaptado de AEHLE, 2007 e CRUZ et al., 2008)
Número
Enzima Fonte Nome comercial Uso terapêutico
E.C.
Urato oxidase 1.7.3.3 Aspergillus flavus Uricozyme Gota
Peroxinorm
Superóxido dismutase 1.15.1.1 Fígado bovino e eritrócitos Inflamação
Oxinorm
Lipase 3.1.1.3 Rhizopus arrhizus Auxiliar digestivo
Desoxirribonuclease 3.1.21.1 Células CHO recombinante Pulmozyme Fibrose cística
Desoxirribonuclease
3.1.21.1 Streptococcus haemolyticus Varidase Úlceras gástricas
(streptodornase)
Antiviral e alguns
Ribonuclease 3.1.26.4 Rana pipiens Onconase
cânceres
B-amilase 3.2.1.1 Aspergillus oryzae Auxiliar digestivo
Celulase 3.2.1.4 Trichoderma viride Auxiliar digestivo
Lisozima 3.2.1.17 Clara de ovos Murazyme Colpistar Antibiótico
Células humanas ou
Galactosidade 3.2.1.22 Fabrazyme Replagal Doença de Fabry
CHO recombinantes
Kluyveromyces fragilis,
Lactase 3.2.1.23 Surelac Lactaid Intolerância a lactose
Aspergillus oryzae, A. niger
Glicocerebrosidase 3.2.1.45 Células CHO recombinantes Cerezyme Doença de Gaucher
Estreptoquinase 3.4.21.73 Streptococcus ß hemolitico Streptase Kabikinase Coágulo sanguíneo
Bronquite crônica
Esfericase 3.4.21 Bacillus sphaericus
Pneumonia aguda
Papaína 3.4.22.2 Carica papaya Panafil Digestão Verminose
Colagenase 3.4.24.3 Clostridium histolyticum Santyl Kollagenase Úlceras de pele
Serrapeptase 3.4.24.40 Serratia E15 Danzen Inflamação
Escherichia coli, Leucemia linfocítica
L-asparaginase 3.5.1.1 Elspar Erwinase
Erwinia carotovora aguda
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mesmo substâncias tóxicas como pesticidas, (GACESA; HUBBLE, 1990; KOPETZKI et al.,
herbicidas e metais pesados. Antígenos virais, 1994; AEHLE, 2007). As enzimas podem ser
anticorpos, proteínas, medicamentos, vitami- empregadas para uso diagnóstico de uma for-
nas e hormônios estão entre outros compostos ma geral de três diferentes maneiras:
que podem ser analisados por métodos que a) Ensaios enzimáticos. Inúmeros en-
utilizam enzimas. saios, baseados em diferentes enzimas, estão
As enzimas para uso diagnóstico são em atualmente disponíveis utilizando uma ampla
muitos casos obtidas de microrganismos. A variedade de métodos de detecção. Em muitos
principal razão para se utilizar microrganismos casos, as reações enzimáticas são monitoradas
na produção de enzimas que poderiam ser pela medida espectrofotométrica da oxidação/
isoladas de plantas e animais, é a facilidade no redução de coenzimas ou utilizando reações
melhoramento e a eficiência na produção (KO- colorimétricas de ponto final (AEHLE, 2007).
PETZKI et al., 1994; AEHLE, 2007). Enzimas Um dos métodos comercialmente disponíveis
em diagnóstico são normalmente necessárias para a quantificação de glicose emprega a
em quantidades relativamente pequenas (me- enzima glicose oxidase a qual é obtida a partir
nos de 10 kg/ano no mundo), diferentemente de diferentes fontes fúngicas, principalmente
das enzimas industriais que são usualmente pro- do gênero Penicillium e Aspergillus como, por
duzidas em grandes quantidades. exemplo A. niger (WONG et al., 2008). Além
Do ponto de vista industrial, técnicas mo- disso, enzimas microbianas como colesterol
leculares, em especial a tecnologia de DNA esterase (obtida de espécies de Nocardia,
recombinante, têm sido amplamente emprega- Saccharomyces cerevisiae e Saccharopolys-
das na produção destas enzimas. Recentes pora erythraea) e urease (obtida de espécies
avanços nesta área têm permitido a clonagem de Lactobacillus e Streptococcus) têm sido
de numerosos genes de interesse e a manipu- amplamente utilizadas em ensaios enzimáticos
lação de diferentes células (em especial as (WONG et al., 2008) e em biosensores para
bacterianas e fúngicas), permitindo maior pro- determinação de metabólitos importantes em
dução da enzima desejada. Há registros indi- áreas médicas e ambientais. Biosensores enzi-
cando aumentos de até mil vezes na produção máticos são importantes exemplos da utiliza-
de enzimas de uso diagnóstico comparadas ção de enzimas microbianas em testes diag-
com os níveis obtidos do organismo produtor nósticos. Estes têm movimentado milhares de
natural (KOPETZKI et al., 1994). Assim, dólares em todo mundo. Enzimas em bio-
enzimas recombinantes com alto nível de ex- sensores são muito atrativas, devido à varie-
pressão, obtidas a partir de técnicas moleculares, dade de produtos de reação quantificáveis os
reduzem a necessidade de passos de purifica- quais incluem prótons, elétrons, luz e calor
ção, tornando muitas vezes o processo mais (NEWMAN; TURNER, 2005; WONG et al.,
eficiente. Enzimas como glicose-6-fosfato 2008). Na tabela 2, encontram-se alguns exem-
desidrogenase (Leuconostoc dextranicus), plos de enzimas utilizadas nesse tipo de ensaio
creatinase (Pseudomonas putida), galactose com um dos possíveis produtores da enzima
desidrogenase (P. fluorescens) e Taq polimerase em questão.
(Thermus aquaticus) têm sido produzidas com b) Imunoensaios enzimáticos. Dentro des-
sucesso utilizando estas técnicas (KOPETZKI te grupo encontram-se enzimas utilizadas em
et al., 1994). técnicas imunológicas, nas quais elas apresen-
A utilização de enzimas nestes ensaios tam-se acopladas a anticorpos ou antígenos.
apresenta inúmeras vantagens comparada aos A notável especificidade torna o ensaio espe-
métodos químicos convencionais, já que estes cífico, a alta afinidade dos anticorpos pelos
são de difícil realização devido à baixa sensibi- antígenos e o poder amplificador da catálise
lidade, seletividade, custo, tempo de realiza- enzimática tornam o ensaio extremamente sen-
ção e quantidade de amostra que necessitam sível. Nesses métodos, enzimas originárias de
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organismos como E. coli, Vibrio harveyi, Elec- RUGELES, 2006). Estas enzimas estão presen-
trophorous electicus e A. niger são ligadas de tes em bactérias, fungos, protozoários, plan-
forma covalente a um determinado anticorpo tas superiores e vertebrados. As RNases são
e a reação catalisada pela enzima, quando da classificadas em três grandes famílias: super
adição de substrato específico, é utilizada para família A, família T1 e família T2. As RNases
quantificar o sistema (ROITT et al., 1999) têm como substratos diferentes sequências do
(tabela 2). RNA. Por exemplo, a RNase A cliva a extre-
c) Quantificação direta de enzimas micro- midade 3’ de resíduos terminados em C e U,
bianas. Realizada em fluidos corporais repre- dando origem a um produto 3’-fosforilado. A
senta outra ferramenta importante na detecção RNase Phy I apresenta como substratos resí-
de infecções microbianas. Visto que estas en- duos G, A e U e como produtos mononucleo-
zimas são produzidas unicamente por certos tídeos com C 5’ terminal. A RNase U2 cliva
microrganismos, sua detecção em fluidos cor- ligações 3’-fosfodiéster adjacentes às purinas,
porais é um forte indício de infecção. Enzimas originando purinas 3’-fosfato ou ainda oligonu-
potencialmente úteis para este propósito inclu- cleotídeos com esse grupo terminal (RITTIÉ;
em ß-lactamases, glicosidases, neuramidases, PERBAL, 2008).
galactosidases entre outras (YOLKEN, 1981). A produção de ribonucleases por diver-
Tabela 2 – Exemplos de enzimas de origem microbiana
sos microrganismos tem sido amplamente estu-
utilizadas em ensaios diagnósticos dada. A tabela 3 ilustra os principais microrga-
Enzima Microrganismo nismos produtores de RNases as quais já fo-
Ensaios enzimáticos
ram isoladas e caracterizadas.
O cultivo destes microrganismos é geral-
Glicose oxidase Aspergillus niger, Penicillium sp.
mente realizado em meio líquido, e a fermen-
Leuconostoc mesenteroides,
Glicose-6-fosfato desidrogenase tação ocorre sob diferentes condições tais como
L. dextranicus
fermentação submersa com agitação (XIONG
Lactobacillus fermentum,
Urease
Streptococcus sp.
et al., 2005) e com células imobilizadas (MA-
NOLOV et al., 1993). As RNases obtidas a
Creatinase Pseudomonas putida
partir de microrganismos têm sido utilizadas
Galactose desidrogenase Pseudomonas fluorescens
amplamente em técnicas de biologia molecular
Piruvato oxidase Lactobacillus plantarum e na indústria farmacêutica (XIONG et al.,
Saccharomyces cerevisiae, 2004). Muitas RNases são altamente citotóxi-
Colesterol oxidase Saccharopolyspora erythraea, cas e, em alguns casos são seletivas às células
Nocardia sp.
malignas. Como fatores determinantes dessa
Imunoensaios enzimáticos citotoxicidade, podemos citar a atividade catalí-
Acetilcolinesterase Electrophorous electicus tica, a habilidade de escapar de inibidores natu-
Fosfatase alcalina Escherichia coli rais, a estabilidade e a eficiência de internali-
ß-galactosidase Escherichia coli zação. Esse somatório de fatores indica que as
Glicose oxidase Aspergillus niger
RNases podem ser utilizadas como fármacos
alternativos no tratamento de tumores (MAKA-
Glicose-6-fosfato desidrogenase Leuconostoc mesenteroides
ROV; ILINSKAYA, 2003).
Outra aplicação bastante investigada é
5 Ribonucleases
o uso destas enzimas na terapia antiviral. Seu
emprego pode ser justificado pela capacidade
As ribonucleases ou RNases são as proteí- de penetração na célula e degradação do RNA
nas responsáveis pela atividade degradativa de viral (RNA ribossomal, no caso dos vírus de
RNA, participando de diversos processos fisio- RNA e RNA mensageiro após a transcrição,
lógicos, como a transcrição e processamento em vírus de DNA), somado ao fato de promo-
do RNA, morte celular, defesa do hospedeiro ver quimiotaxia às células do sistema imune
e controle do crescimento tumoral (ÚSUGA; (ÚSUGA; RUGELES, 2006).
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Microrganismos produtores
Agaricus bisporus Ganoderma lucidum Pleurotus tuber-regium
Agrocybe cylindracea Hypsizigus marmoreus Rhizopus niveus
Aspergillus clavatus Irpex lacteus Rhizopus oryzae
Aspergillus niger Lentinus edodes Rhizopus stolonifer
Aspergillus oryzae Penicillium brevicompacturn Russulus virescens
Aspergillus pallidus Penicillium citrinum Termitomyces globulus
Calvatia caelata Pleurotus eryngii Thelephora ganbajun
Clitocybe maxima Pleurotus ostreatus Volvariella volvacela
Dictyophora indusiata Pleurotus pulmonarius
Flammulina velutipes Pleurotus sajorcaju
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Tabela 4 – Dados comerciais do grupo comercial no qual as colagenases se inserem (adaptado de BRASIL, 2009)
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Zimmer, K. R., Borré, G. L., Trentin, D. S., Júnior, C. W., Frasson, A. P., Graeff, A. A., Gomes, P., Macedo, A.J.
Tabela 5 – Medicamentos baseados em inibidores enzimáticos mais vendidos em 2007 (adaptado de WTN 2009)
Posição Bilhões
no Produto / Empresa / Fármaco Doença de Crescimento
ranking dólares
Liptor (Pfizer / Astellas Pharma) Colesterol
1 $13,7 1%
(atorvastatina) elevado
Plavix (Bristol-Myers Squibb / Sanofi-Aventis)
2 Trombose $8,1 28%
(clopidogrel)
Remicade (Johnson & Johnson, Schering-Plough, Mitsubishi Tanabe) Artrite
5 $5,3 18%
(infliximab) reumatóide
Divan (Novartis)
8 Hipertensão $5,0 19%
(valsartan)
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