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2017v11n4p32

CONTRIBUIÇÕES DA BIOLOGIA MOLECULAR PARA A PROTEÇÃO ANIMAL

E A INVESTIGAÇÃO DOS CRIMES CONTRA A FAUNA1
MOLECULAR BIOLOGY CONTRIBUTIONS FOR ANIMAL PROTECTION AND
THE INVESTIGATION OF CRIMES AGAINST WILDLIFE

RODRIGO GRAZINOLI GARRIDO

Doutor em Ciências;
Instituto de Pesquisa e Perícias em Genética Forense/PCERJ;
Professor Adjunto do PPGD-UCP e da FND-UFRJ
grazinoli.forense@gmail.com

EDUARDO LEAL RODRIGUES

Mestra em Ciências; Promega Corporation
rodrigues.dna@gmail.com

RESUMO ABSTRACT

Atividades antrópicas mal coordenadas ou Poorly coordinated or criminal human activi-

criminosas têm gerado extinção de espécies animais.
Atualmente, ferramentas moleculares podem contri-
buir sobretudo em duas vertentes da proteção animal:
no combate à biopirataria; e no manejo reprodutivo de
espécies. A partir de revisão da literatura, buscou-se
oferecer uma visão geral sobre as principais ferramen-
tas moleculares utilizadas na proteção à fauna e des-
crever exemplos destas tecnologias na identificação de
espécies para a tipificação de crimes contra a fauna,
além do fomento ao manejo reprodutivo de espécies
em risco de extinção
Palavras-chave: Crime ambiental. Perícia ambiental.
Taxonomia molecular.
ties have led to the extinction of species. Currently,
molecular tools can contribute mainly in two aspects
of preservation: in the fight against biopiracy; and
reproductive management of species. From literatu-
re review, we sought to provide an overview of the
main molecular tools used in the protection of fauna
and describe examples of these technologies in species
identification for typifying the crimes against wildlife,
in addition to promoting the reproductive management
species at risk of extinction.
Keywords: Environmental crime. Environmental sur-
vey. Molecular taxonomy.

____________________
1 Parte desse artigo foi apresentada no 22nd International Sustainable Development Research Society Conference, School of Science and
Technology, Universidade Nova de Lisboa, Lisboa, Portugal, 13 – 15 July 2016.

32
Revista Semioses, V 11, n.04, 2017
CONTRIBUIÇÕES DA BIOLOGIA MOLECULAR PARA A PROTEÇÃO ANIMAL E A INVESTIGAÇÃO DOS CRIMES CONTRA A FAUNA1
1. INTRODUÇÃO
Entre as atividades que colocam em risco es-
pécies animais, o tráfico de animais ou biopirataria
tem papel fundamental. Esta atividade criminosa mo-
vimenta entre 10-20 bilhões de dólares no mundo e 1
bilhão só no Brasil (RENCTAS, 2001). No entanto, a
legislação brasileira sobre crimes ambientais demanda
para correta tipificação e qualificação dos crimes con-
tra a fauna, a identificação da vítima animal ao nível
de espécies (BRASIL, 1998). Assim, quando há apre-
ensão de carne, peles, ovos e outros materiais bioló-
gicos, pode não ser possível a classificação a partir de
características externas, demandando a aplicação de
tecnologias moleculares (HEBERT et al., 2004; CAR-
VALHO, 2013).
Para tanto, várias ferramentas moleculares po-
dem contribuir. Um exemplo importante seria a utili-
zação de sequenciamento de marcadores moleculares,
como alvos do genoma mitocondrial (gene COI e cyt
b) (BOORE et al., 1999). Há também relato do uso do
gene cyt b para identificar espécies de aves areendidas
em tentativa de tráfico internacional (CARVALHO,
2013).
Por outro lado, a biologia molecular pode con-
tribuir com a preservação de em populações animais
reduzidas, já em risco de extinção. Nesse caso, a prote-
ção deve ser garantida através do manejo reprodutivo
e mensuração da representatividade genética da popu-
lação ameaçada (DESALLE; AMATO, 2004; ALLEN-
DORF et al 2010). Para essas práticas, marcadores do
tipo microssatélites têm sido amplamente empregados
(FRANKHAM et al., 2002).
Dessa forma, a partir de pesquisa explorató-
ria qualitativa, desenvolvida a partir de documentação
indireta de fontes primárias, legislação, e secundárias
como livros, artigos e sites, buscou-se oferecer uma vi-
são geral sobre as principais ferramentas moleculares
utilizadas na proteção à fauna e descrever exemplos
desta aplicação na identificação de espécies para tipifi-
cação e qualificação de crimes ambientais, bem como
no manejo reprodutivo de espécies em risco de extin-
ção.
2. BIODIVERSIDADE BRASILEIRA
O território brasileiro possui uma área de apro-
ximadamente 8,5 milhões de Km2, apresentando uma
dimensão continental e inúmeros ecossistemas. Dentro
dos biomas brasileiros – Floresta Amazônica, Cerrado
e Pantanal, Caatinga, Floresta Atlântica e Campos Su-
33
linos e Zona Costeira e Marinha – há uma magnífica
diversidade de espécies que classifica o Brasil como
um país de Mega Biodiversidade, juntamente com ou-
tros 17 países (WILSON; PETER, 1988). De acordo
com o Sistema de Informação Sobre a Biodiversidade
Brasileira (SiBBr), o Brasil possui cerca 170-210 mil
espécies descritas e estima-se que o país possa abrigar
cerca de 1,8 milhões de espécies.
No entanto, atividades antrópicas mal coorde-
nadas ou criminosas, tais como, queimadas, desmata-
mentos, poluição, caça e pesca ilegal e introdução de
espécies têm resultado na extinção e na ameaça de
extinção de muitas espécies animais. Em 2014, o Ins-
tituto de Chico Mendes de Preservação da Biodiversi-
dade (ICM-BIO) liberou a Lista das Espécies da Fauna
Brasileira Ameaçadas de Extinção (Portarias MMA nº
444/2014 e nº 445/2014, alterada pela Portaria MMA
nº 98/2015), o documento apresentava 1173 espécies
ameaçadas de extinção.
Atualmente, há inúmeros esforços de pesqui-
sadores e agência governamentais para a preservação
de espécies. Um exemplo é o Biota-FAPESP, que visa
aprimorar o conhecimento acerca da biodiversidade e
distribuição dos organismos no Estado de São Paulo
(FAPESP, 2016). Outro objetivo desses programas é
desenvolver formas de exploração sustentável de orga-
nismos com potencial econômico e a criação de área de
preservação ambiental.
Atualmente, no que diz respeito à conservação
de espécies, o campo da genética atua em duas verten-
tes principais: 1- combate à biopirataria; 2- manejo na
reprodução de espécies.
3. COMBATE À BIOPITARIA
O termo biopirataria foi introduzido no cená-
rio científico em 1993, como forma de denunciar abu-
sos econômicos por parte de corporações e instituições
científicas. Atualmente, o termo biopirataria é descrito
como a exploração, manipulação, exportação ou co-
mercialização internacional de recursos biológicos que
contrariam as normas da Convenção sobre Diversidade
Biológica (ONU, 1992).
No tocante ao tráfico ilegal de animais, o mon-
tante associado às negociações no mundo gravita em
torno de 10-20 bilhões de dólares, 1 bilhão no Brasil
aproximadamente, sendo considerada a terceira ati-
vidade criminosa mais rentável (ficando atrás apenas
do tráfico de drogas e tráfico de armas) (RENCTAS,
2001). Como forma de combater a prática de tal ati-
vidade, foi criada a Lei 9605/98 que visa tipificar as
CONTRIBUIÇÕES DA BIOLOGIA MOLECULAR PARA A PROTEÇÃO ANIMAL E A INVESTIGAÇÃO DOS CRIMES CONTRA A FAUNA1
ações criminosas contra o meio ambiente e em seu
artigo 29, define crimes contra a fauna como: “Ma-
tar, perseguir, caçar, apanhar, utilizar, vender, expor à
venda, exportar, adquirir, guardar, espécimes de fau-
na silvestre bem como produtos e objetos dela oriun-
dos.” E como qualificadora da pena, o § 4º discrimina
que “A pena é aumentada da metade se o crime é pra-
ticado [...] contra espécie rara ou considerada amea-
çada de extinção”
Assim, a identificação ao nível de espécies
se faz necessária como forma de identificar possíveis
agravantes. No entanto, alguns cenários não permi-
tem uma identificação taxonômica por meio de carac-
teres morfológicos, como nas apreensões de carne e
peles (HEBERT et al., 2004). Além disso, a identifi-
cação taxonômica requer um nível de conhecimento
elevado em relação à família da espécie, isto é, há
necessidade da presença de especialista.
Tendo em vista tais dificuldades, a identifi-
cação por meio de ferramentas de biologia molecular
tem auxiliado na identificação de espécies (HEBERT
et al., 2003; HAJIBABAEI et al., 2007; IVANOVA et
al., 2007; MEICKLEJOHN et al., 2013). A identifica-
ção molecular utiliza-se do sequenciamento de mar-
cadores moleculares, isto é, regiões-alvo do genoma
mitocondrial, tais como, o gene COI, que codifica a
subunidade I da enzima Citocromo Oxidase e o gene
cytb, que codifica a enzima citocromo B (BOORE et
al., 1999).
O gene cytb é amplamente utilizado para
identificação de espécies de vertebrados, enquanto
que o gene COI é usado em um contexto mais am-
plo. Contudo, há inúmeras discussões em relação a
região mais indicada para a análise (WILL; RUBI-
NOFF, 2004; MORITZ; CICERO, 2004; MEYER;
PAULAY, 2005; MEIER et al., 2006). (arara-vermelha-grande), Aratinga aurea (periquito-rei),
4. USO DE MARCADORES MOLECULARES
PARA IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES
Marcadores moleculares para identificação de
espécies consistem de alvos cujas sequências de nu-
cleotídeos sejam conservadas e apresentem variação
intraespecífica reduzida (WELLS et al., 2001; NEL-
SON et al., 2007; ROE; SPERLING, 2007; WELLS;
STEVEN, 2008). Contudo, a utilização de um único
marcador molecular é passível de questionamento,
haja vista que um marcador apenas pode não ser sufi-
ciente para discriminar a diversidade molecular pre-
sente entre táxons (WILL; RUBINOFF, 2004).
Conforme mencionado acima, o gene cytb e
o gene COI são ferramentas para identificação de espécies.
O cytb codifica a enzima citocromo B, pertencente à famí-
lia de genes da cadeia respiratória mitocondrial e compõe
um grupo de 11 proteínas denominados de complexo III.
Na mitocôndria, o complexo III atua na fosforilação oxi-
dativa para a produção ATP celular. Enquanto o gene COI
codifica a subunidade I a citocromo oxidase, esta consiste
de um catalisador terminal da cadeia respiratória mitocon-
drial, assim como o gene cytb (BOORE et al., 1999).
Uma vez que tais genes façam parte de uma ca-
deia com alto grau de complexidade, qualquer alteração
na estrutura das proteínas tende a ser um fator deletério
para o organismo. Dessa forma, a pressão seletiva consiste
em uma vantagem para que os mesmos possam ser usa-
dos como marcadores táxon-específico, pois são mantidos
conservados (WOLSTENHOLME, 1992; ROKAS et al.,
2003).
Em 2013, o Perito Criminal Federal Carlos Benig-
no Vieira de Carvalho publicou um relato de caso, em que
por meio da análise do gene citocromo b foi possível iden-
tificar espécies de aves, cujos ovos e indivíduos imaturos
haviam sido apreendidos. Inicialmente foi feita a incuba-
ção dos ovos no Jardim Zoológico de Brasília, mas infe-
lizmente, grande parte dos ovos e dos indivíduos imaturos
não se tornaram viáveis, sendo necessária a identificação
por meio de ferramentas de bióloga molecular (CARVA-
LHO, 2013).
Por meio da comparação das sequências obtidas
a partir das amostras apreendidas e de sequências previa-
mente depositadas no GenBank foi possível a identificação
dos 17 espécimes sequenciados, contudo, 11 foram identi-
ficados ao nível de espécie e 6 até o nível de gênero, sendo
enquadradas em duas famílias distintas, Psittacidae e Stri-
gidae. As espécies Alipiopsitta xanthops (anteriormente
Amazona xanthops) (papagaio-galego), Ara chloropterus
Amazona spp, Megascops choliba (corujinha-do-mato).
Paul Hebert et al., (2003) propuseram um sistema
de identificação de espécies por meio do sequenciamento
de uma região de 648pb do gene COI, que, de acordo com
o autor, apresentava divergência nucleotídica suficiente
para distinguir unidades taxonômicas. Tal metodologia
de análise foi nomeada como DNA Barcoding. Contudo,
a literatura científica já apresentava tal aplicação do DNA
mitocondrial, sendo denominado de DNA-Based id.
A análise do DNA Barcoding em animais está
voltada, principalmente, para os genes mitocondriais, de-
vido à abundância dessa organela nas células, sendo uma
vantagem para a obtenção de material genética exíguos
ou degradados. Tal abordagem pressupõe que indivídu-
os possuam sequências de nucleotídeos com alto grau de
34
CONTRIBUIÇÕES DA BIOLOGIA MOLECULAR PARA A PROTEÇÃO ANIMAL E A INVESTIGAÇÃO DOS CRIMES CONTRA A FAUNA1
similaridade, em relação às sequências homólogas de
indivíduos de espécies diferentes. Hebert e colabora-
dores (2003) propuseram um limiar de identificação,
comumente conhecido como Barcoding Gap. O Bar-
coding Gap seria definido quando a sequência de um
indivíduo que obtivesse uma variação de 3% ou mais.
No entanto, a literatura reporta que há uma ampla so-
breposição entre valores de variação intra e interespe-
cífica para diferentes táxons. Assim, é preciso estudo e
validação para aplicação em famílias distintas em con-
junção com a análise taxonômica (MEIER; PAULAY,
2005; MEIER et al., 2006; WIEMERS; FIEDLER,
2007; MEIER et al., 2008; SRIVATHSAN; MEIER,
2012).
Por outro lado, apesar da aplicação do DNA
para fins de identificação consistir em uma das etapas
para a proteção do Patrimônio Genético, é preciso sa-
lientar que as espécies ameaçadas de extinção são po-
pulações com um número de indivíduos relativamente
baixo e, portanto, apresentam diversidade genética re-
duzida.
Tanto o número reduzido de indivíduos quan-
to a baixa diversidade genética colocam as populações
em risco, isto porque, quaisquer eventos estocásticos,
ambientais ou demográficos, como desastres naturais,
variação dos recursos, taxas de mortalidade e natalida-
de, podem levar a um declínio da população ou mesmo
a extinção completa (DESALLE; AMATO, 2004; AL-
LENDORF et al., 2010). Além de tais fatores, há a es-
tocatiscidade genética, ou seja, a diversidade genética
reduzida favorece a ocorrência de cruzamentos endo-
gâmicos, fazendo com haja aumento na taxa de morta-
lidade devido à depressão endogâmica (FRANKHAM
et al., 2002; ALLENDORF et al., 2010).
A genética por meio da genotipagem de mar-
cadores moleculares polimórficos e manejo de cruza-
mentos visa reduzir o risco de extinção de espécies.
Trata-se de um esforço de longo prazo, cujo resultado
é o aumento populacional e da diversidade genética,
consequentemente, de seu potencial evolutivo (AL-
LENDORF et al., 2010).
A diversidade genética é um aspecto muito im-
portante para qualquer população. É preciso mencionar
que as mudanças ambientais são processos contínuos e
a diversidade genética está associada à capacidade de
uma espécie ou população se adaptar a essas mudan-
ças. A perda da diversidade genética resulta na redução
em taxas de reprodução e sobrevivência, ou seja, reduz
o valor adaptativo da espécie.
A utilização de marcadores do tipo microssa-
télites (ou STRs, do inglês Short Tandem Repeats) tem
35
sido amplamente empregada para tal finalidade, uma
vez que possuam alto grau de polimorfismos e, conse-
quentemente, permitem avaliar o grau de diversidade
genética e desenvolver estratégias de manejo da popu-
lação (FRANKHAM et al., 2002).
Os microssatélites, também nomeados como
STRs, são marcadores moleculares dispersos por todo
o genoma e com elevada diversidade alélica (BUTLER
et al., 2005). Estes marcadores genéticos consistem de
repetições curtas consecutivas, isto é, possuem uma
unidade de nucleotídeo repetida de forma consecutiva,
podendo ser do tipo Di-, Tri-, Tetra- e/ou Pentanucleo-
tídeos.
Estes polimorfismos são gerados e mantidos
por meio de erros atribuídos ao momento da replica-
ção do locus. O termo aplicado à falha no processo é
“Slippage” (ou escorregão) da polimerase, podendo
ocorrer dois tipos, “Backward Slippage” e “forward
Slippage”, o que resulta em eventos de contração do
locus (perda de repetições) ou na expansão do locus
(ganho de repetições), respectivamente (ELLEGREN,
2000, 2004).
Comumente, a genotipagem de certas popu-
lações naturais é realizada a partir de metodologias
não-invasivas, como por exemplo, penas e fezes. Des-
sa forma, é preciso ser cuidadoso com a genotipagem
dos microssatélites, uma vez a extração de DNA de
tais amostram tendem a gerar baixas concentrações de
material genético. O DNA em concentração reduzida
pode gerar artefatos de técnicas, como desequilíbrio
alélico em perfis genéticos heterozigotos, com maior
presença de um alelo em relação ao outro (DEMERS et
al., 1995). Além disso, pode ocorrer o denominado de
Alelo “Drop-out”, o que gera erroneamente um perfil
genético homozigoto, devido à baixa concentração do
material e não-amplificação de um dos alelos (ALON-
SO et al., 2001).
Uma forma de verificar se ocorreram erros na
genotipagem e testar hipóteses relacionadas à popula-
ção, consiste em analisar se a mesma está em Equi-
líbrio de Hardy-Weinberg. A aplicação do Equilíbrio
de Hardy-Weinberg permite também detectar falhas
associadas aos resultados, como genotipagem errônea
nos marcadores genéticos. Sem a análise do Equilíbrio
de Hardy-Weinberg, tais erros associados com a ge-
notipagem poderiam afetar de maneira significativa
as análises subsequentes (SINGLE et al., 2002). Além
disso, o excesso de indivíduos homozigotos pode indi-
car um outro artefato de técnica denominado de “Ale-
los Nulos” (GOMES et al., 1999). O alelo nulo con-
siste da não-amplificação de um alelo devido à uma
CONTRIBUIÇÕES DA BIOLOGIA MOLECULAR PARA A PROTEÇÃO ANIMAL E A INVESTIGAÇÃO DOS CRIMES CONTRA A FAUNA1
mutação na extremidade 3’ do sítio de hibridação do
oligonucleotídeo iniciador, gerando um perfil homo-
zigoto errôneo, da mesma forma que ocorre com o
Alelo “drop-out”. Sendo assim, a análise do Equilí-
brio de Hardy-Weinberg permite agregar qualidade e
segurança as pesquisas científicas (HOSKING et al.,
2004).
Outro parâmetro a ser mensurado é o Tama-
nho Populacional Efetivo (Ne) de uma população
ameaçada. Essa medida é definida em termos de re-
presentatividade genética, isto é, o número de indiví-
duos equivalente ao de uma população-padrão com
capacidade de manter a diversidade genética, ou seja,
todos os indivíduos que se reproduzem e deixam des-
cendentes e, por conseguinte, transmitem seus genes
(KLIMAN et al., 2008).
De forma geral, a diversidade genética é fun-
damental para a manutenção do potencial evolutivo
de uma espécie, portanto, populações reduzidas ten-
dem a ter mais cruzamentos endogâmicos o que po-
deria ocasionar o aumento da carga genética, isto é,
aumento da frequência de alelos deletérios na popula-
ção (FRANKHAM, 2005).
Da mesma forma que em cruzamentos ao
acaso, os endocruzamentos podem gerar indivíduos
heterozigotos e homozigotos. No entanto, pode haver
a geração de homozigotos por descendência, isto é,
indivíduos cujo genótipo apresenta alelos oriundos de
um ancestral comum (RODRIGUES et al., 2013). Es-
tes indivíduos podem ser considerados Alozigotos ou
Autozigotos. Os Alozigotos possuem genótipos em
que os alelos não são idênticos por descendência, mas
sim por estado e os Autozigotos possuem genótipos
que contém dois alelos idênticos por descendência.
Alguns alelos deletérios são mantidos na população
ao longo das gerações, mas estes não diminuem o
valor adaptativo do indivíduo, devido a relação de
dominância/recessividade com outros alelos do mes-
mo lócus. No entanto, indivíduos homozigotos para
alelos recessivos/deletérios possuem valor adaptativo
reduzido ou até mesmo nulo. Dessa forma, o cruza-
mento endogâmico tende a elevar a geração de indi-
víduos homozigotos para alelos recessivos/deletérios
(NARASINHAM et al., 2016).
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A aplicação de marcadores moleculares tem se mos-
trado uma alternativa viável em inúmeros campos da
ciência. Na taxonomia, o uso da biologia molecular
permite identificar organismos ao nível de espécie o
que se torna importante no combate a crimes ambien-
tais e na preservação de espécies.
Ferramentas moleculares são importantes, sobretu-
do, na identificação de animais em casos complexos,
como por exemplo, nas apreensões de peles, carnes,
ovos. Contudo, tal metodologia requer validação com
o aumento de amostragem dos táxons de forma a iden-
tificar o intervalo de variação interespecífica. A tecno-
logia molecular também contribui com a garantia da
sustentabilidade quando aplicada diretamente no ma-
nejo conservativo de espécies ameaçadas. O uso de
marcadores polimórficos, tais como os STRs, ganha
importância especialmente em populações pequenas.
Nessas populações, são aumentadas as chances de
alelos deletérios estarem em homozigose, reduzindo
o valor adaptativo da população e contribuindo para
a extinção.
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