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Parte III:
CULTURA DE CÉLULAS
1.CULTURA DE CÉLULAS
a)Objectivo
b)Tipo de Culturas Celulares
9
_0
c)Passagem das Células
SC
Q
2.COLECÇÃO DE CÉLULAS
A
IC
a)ECACC
LÍN
C
b)ATCC
IA
O
c)NIH
LG
RO
3.MEIOS DE CULTURA
VI
4.Como escolher um meio

C
A
5.Constituintes básicos do meio de cultura

M
II
6.DESCONGELAÇÃO: COMO INICIAR UMA CULTURA
7.TRIPSINIZAÇÃO
8.CONTAGEM DE CÉLULAS
Quirina Santos-Costa
URIA-CPM, FFUL
9
_0
SC
Q
A
IC
LÍN
C
IA
O
LG
RO
VI
C
A
M
II
URIA-CPM, FFUL
CULTURA DE CÉLULAS
Objectivo:
Isolamento viral a partir de material biológico adequado
9
_0
Propagação in vitro de vírus já isolados
SC
Q
A
Condições:
IC
LÍN
Esterilidade
C
IA
Frascos de cultura em plástico ou vidro tratados
O
Meios de cultura* LG
RO
Estufa de CO2
VI
Microscópio invertido
C
A
M
Hote de fluxo laminar vertical

II
*Meios de cultura: satisfação das exigências nutricionais das

células
URIA-CPM, FFUL
TIPOS DE CULTURAS CELULARES
Modo de propagação:
1. Suspensão
9
_0
2. Monocamada
SC
Q
A
Natureza das células:
IC
LÍN
1. Primárias
C
2. Secundárias
IA
O
3. Contínuas
LG
RO
Morfologia das células:

VI
C
1. Epiteliais
A
M
2. Fibroblásticas
II
3. Outras (células sanguíneas, nervosas, musculares)

9
_0
Suspensão: as células crescem sem estarem
SC
1.
Q
aderentes entre si ou ao suporte sólido (paredes
A
interiores do frasco de cultura ou outro recipiente onde
IC
LÍN
estejam a ser cultivadas)
C
IA
O
2. LG
Monocamada: crescem aderindo ao suporte sólido e
RO
entre si. Estas células necessitam, para serem
VI
transferidas para outro suporte sólido, de serem

C
A
dissociadas entre si e do suporte sólido onde se

M
fixaram (métodos enzimáticos e/físicos).

II
URIA-CPM, FFUL
Natureza das células

Células primárias:
9
resultam directamente de um órgão ou tecido animal;
_0
SC
têm uma vida limitada.
Q
A
IC
LÍN
Células secundárias:
C
IA
Derivam de subculturas das células primárias;
O
LG
Podem atingir as 50 passagens ou subculturas.
RO
VI
C
Células contínuas:
A
M
Derivam de tecidos cancerosos ou de células primárias

II
e secundárias que sofreram transformação;

Têm a capacidade de se multiplicarem ilimitadamente,
sem inibição de contacto e com grande rapidez.

URIA-CPM, FFUL
1. Suspensão
9
_0
2. Monocamada
SC
Q
A
Natureza das células:
IC
LÍN
1. Primárias
C
2. Secundárias
IA
O
3. Contínuas
LG
RO
Morfologia das células:

VI
C
1. Epiteliais
A
M
2. Fibroblásticas
II
3. Outras (células sanguíneas, nervosas, musculares)
URIA-CPM, FFUL
COLECÇÃO DE CÉLULAS
Será possível introduzir, propagar, consolidar e disseminar erros durante a

manipulação numa linha celular?
Sim, repare-se que, muitos contaminantes são invisíveis ao olho nu (micoplasma ou
9
vírus que não induzem efeito citopático), ou seja existem contaminações inaparentes!
_0
SC
Sistematizam as técnicas de cultura
Q
Crioconservação em Azoto Líquido
A
Técnicos permanentes e especializados
IC
LÍN
Controlo de Qualidade para contaminações microbianas, nomeadamente o
Micoplasma
C
Garantem a identidade e a pureza da linha celular
IA
O
Recomendações
LG
RO
características a linha celular
como manter a linha celular
VI
como lidar com dificuldades

C
A
qual o meio de cultura apropriado

M
qual o material necessário

II
quais as condições de incubação, etc.

formulários de encomenda
quem pode depositar
como pode depositar
etc.
URIA-CPM, FFUL
AS “MEGASTORES”
European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC),
HLS Centre for Applied Microbiology and Research,
Porton Down, Salisbury SP4 OJG, UK.
Telephone (44) 980610391; fax (44) 980 611315.
“Description of holdings: 1200 cell lines and hybridomas, 250 HLA-defined cell lines,
9
_0
and approximately 7000 human genetic and chromosome abnormality cell lines (2000
SC
stored as untransformed lymphocytes).”
Q
American Type Culture Collection (A TCC),
A
IC
12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA.
LÍN
Telephone (301) 991 2600; fax (301) 231 5826.
C
“The A TCC has a large and comprehensive stock of material built up over
IA
a considerable period of time. A certain number of deposits carry 'certified
O
cell line' status and extensive testing programmes have been carried out
LG
on this material. The whole of the collection comprises over 3200 cell lines
RO
and hybridomas from approximately 75 different species.”
VI
National Institute of Health (NIH)

C
About us….
A
M
“The NIH AIDS Reagent Program evolved from a small bank of HIV research materials into a
II
unique worldwide resource of state-of-the art reagents for HIV and other pathogens.
Many of these reagents are not commercially available.
The first Catalog, published in 1988, listed 62 reagents from 20 contributors. Reagents are
shipped to scientists all over the world.
The value of the NIH AIDS Reagent Program is evident from the diversity of registered users;
as of June 2003, scientists from the US and 65 foreign countries registered to receive reagents.
During the past year over 14,000 reagents were provided.
US scientists obtaining AIDS reagents from the program work primarily in academ-ic settings.”
URIA-CPM, FFUL
COLECÇÃO DE CÉLULAS DE CULTURA CELULAR
EPITELIAL: 293T
9
_0
SC
Q
A
IC
LÍN
C
IA
O
LG
RO
VI
C
A
M
II
URIA-CPM, FFUL
EPITELIAL/FIBROBLÁSTICA: GHOST (derivadas

das Hos=osteosarcoma humano)
9
_0
SC
Q
A
IC
LÍN
C
IA
O
LG
RO
VI
C
A
M
II
URIA-CPM, FFUL
FIBROBLÁSTICA:Vero; Fibroblastos de Salmão, MRC-5
9
_0
SC
Q
A
IC
LÍN
C
IA
O
LG
RO
VI
C
A
M
II
URIA-CPM, FFUL
LINFOCÍTICA:Linfócitos humanos mortos…
9
_0
SC
Q
A
IC
LÍN
C
IA
O
LG
RO
VI
C
A
M
II
URIA-CPM, FFUL
SUSPENSÃO: J774
9
_0
SC
Q
A
IC
LÍN
C
IA
O
LG
RO
VI
C
A
LINFOBLASTÓIDE PROMONOCÍTICA: U937

M
II
URIA-CPM, FFUL
MEIOS DE CULTURA
De um modo geral as células requerem um ambiente estéril,
9
_0
componentes nutricionais, pH e temperatura estáveis.
SC
Hoje em dia já existem várias formulações de meios de cultura
Q
disponíveis, de acordo com o tipo de cultura com que se está a trabalhar.
A
IC
LÍN
Exemplos:
C
• BME (basal medium Eagle´s)
IA
O
• EMEM (minimum essencial medium with Earl´s salts)
LG
• DMEM (Dulbecco´s modified Eagle´s medium, meio sintético
RO
VI
complexo)
C
• RPMI 1640 (criado pelo Roswell Park Memorial Institute, meio

A
M
sintético complexo)
II
• CMRL (basal médium designed for serum-free formulations)

• D-22 (basal medium for insect cell culture)
URIA-CPM, FFUL
COMO ESCOLHER UM MEIO?
a. Tipo de células
i. Aderentes (Vero)
ii. Suspensão (Ly Humanos)
9
_0
iii. Tipo de densidade celular
SC
(baixa, para clonagens: 293T, meio com HEPES)
Q
(elevada: bio-reactores com densidades na ordem do s108células/mL)
A
IC
LÍN
b. Sistemas estáticos
C
São os sistemas clássicos de cultura em frasco deitado ou na vertical, em
IA
laboratório de baixa ou média produtividade.
O
LG
c. Sistemas dinâmicos ou perfusão contínua (sistema aberto)
RO
O meio terá que ter à partida todos os nutrientes necessários para a duração
VI
da cultura, nomeadamente em termos de fontes de energia, mas tendo em

C
A
conta que a degradação destes aumenta os níveis de toxicidade. Portanto

M
podem ser introduzidos controladamente no meio.

II
URIA-CPM, FFUL
CONSTITUINTES BÁSICOS DO MEIO?
a. Água
b. Sais inorgânicos (oligoelementos)

• Na+, K+, Mg++, Ca++, Cl-, HCO3-
• Mantêm o potencial de membrana
9
São co-factores nas reacções ezimáticas intracelulares
_0
•
Factores de adesão (tripsinização)
SC
•
Q
c. sistemas tampão
A
O meio de cultura necessita de sistemas tampão para compensar a evolução do CO2, libertado pelas células e da
IC
produção de ácido láctico, resultante do metabolismo da glucose.
LÍN
Explos (não tóxicos, com pKa=6,1):
C
• Bicarbonato
IA
• Fosfato
O
A conjugação da concentração de bicarbonato e a tensão de CO2 promove a osmolaridade e pH correctos.
LG
RO
d. hidratos de carbono
• Glucose
VI
• Maltose
C
• Sacarose
A
• Frutose
M
• Galactose
II
A glucose é o hidrato de carbono mais usado como fonte de energia do meio.
e. Indicadores de pH
• Vermelho de fenol (2mg/L)
Qualquer que seja o meio requer a presença de um indicador de pH, que nos chamará mais facilmente à atenção
para as alterações que possam ocorrer devidas ao metabolismo das células.
URIA-CPM, FFUL
CONSTITUINTES BÁSICOS DO MEIO?
f. vitaminas
• Ácido para-amino benzóico
• Biotina
• Ácido fólico
• Ácido nicotínico
• Riboflavina
9
_0
• Tiamina
SC
• Inositol
• Vit. B12
Q
• Vit. E i. SUPLEMENTOS
A
• Vit. A i. Hormonas
IC
São intervenientes em numerosos processos metabólicos. ii. Soro
LÍN
iii. Proteínas e
péptidos para meios sem
C
g. Aminoácidos essenciais
Arginina soro (alfa-globulina,
IA
•
Cisteína fibronectina, albumina e
O
•
Prolina transferrina)
LG
•
iv. Antibióticos e
• L-Glutamina, etc.
RO
Antifúngicos
• Gentamicina (50ug/
VI
mL)
h. lípidos (ácidos gordos)
C
• Penicilina (100UI)/
• Colesterol
A
mL / Estreptomicina (50ug/
• Ácido linolénico e linoleico
M
mL)
• Ácido palmítico, etc.
II
• Anfotericina B
É um dos componentes fornecido pelo soro.
(fungisona)
Mantêm a esterilidade do meio, mas numa escala
industrial estão ausentes.
Não podem ser citotóxicos
Têm que ser de largo espectro, e induzir o mínimo de
resistências
Atenção à relação custo/benefício.
URIA-CPM, FFUL
MEIOS COM SORO, PORQUÊ?
Em 1950 o primeiro meio com soro teve um sucesso imenso, porque este aditivo fornecia elementos
essenciais, mas desconhecidos, ao meio, e de uma forma empírica:
• Factores de Crescimento (estimulam e aceleram o crescimento e diferenciação celular;
previnem os processos de Apoptose)
9
_0
o EGF, IL-6, PDGF, Insulina
SC
• Albumina
Q
o liga-se aos iões tóxicos, funcionando como agente desintoxicante;
o é um “carrier” de Vit. lipossolúveis e esteróides
A
IC
o é um factores de protecção contra os choques físicos das pipetagens, etc.
LÍN
• Factores de Adesão celular
C
o Fibronectina
IA
o Laminina
O
o Fetuína
LG
• Transportador do ião Fe+++. O complexo Transf/Fe+++ é fundamental nos receptores
RO
celulares.
o Transferrina
VI
• Antiproteases (previne a degradação proteolítica das células e do próprio meio)

C
o Alfa1-antitripsina (tripsinização)
A
M
Alfa2-macroglobulina
II
TIPOS DE SORO
FCS (soro bovino fetal)
NCS (soro de recém-nascido de vitela), com altos teores de biotina.
Várias espécies animais e de animais de diferentes idades.
Os soros de animais adultos não são tão eficientes, porque não são tão ricos.
São obtidos no matadouro, por punção cardíaca asséptica, ou por animais “dadores”.
URIA-CPM, FFUL
MEIOS SEM SORO
Sempre que possível seria desejável que não se usasse soro nos
9
meios de cultura:
_0
SC
 É um componente empírico e com elementos não
Q
quantificados (albumina);
A
 Não pode ser usado no fabrico de produtos bio-
IC
farmacêuticos;
LÍN
 Não pode ser usado em técnicas que requerem um meio
C
sintético de composição bem definida e conhecida,
IA
O
nomadamente em estudos de factores de crescimento,
LG
citocinas, moléculas de adesão, etc.;
RO
 Pode transportar vírus ou factores de inibição.
VI
C
O meio sem soro:

A
M
É reprodutível;
II
Não tem factores desconhecidos.
URIA-CPM, FFUL
TÉCNICA DE DESCONGELAÇÃO:
COMO INICIAR UMA CULTURA
Processo rápido
Libertar do DMSO que é tóxico.
Lançar as células em cultura
(Controlo de qualidade do processo de CONGELAÇÃO: Descongelar uma ampola
9
criopreservada com 24h, para que se veja se a congelação foi eficiente e se as células têm
_0
boa viabilidade).
SC
Q
I. A partir de Frascos de Cultura, transportados à T. A.
A
IC
LÍN
O frasco de Cultura vem com o volume completo até ao máximo, de modo
a evitar entradas de ar o contaminações. Assim que chega ao laboratório,
C
IA
as células devem ser passadas de imediato, para evitar o prolongamento
O
do sofrimento de ausência de temperatura ideal e % de CO2.
LG
RO
1. Transferir a suspensão ou fazer uma desagregação por
VI
enzimática (tripsinização), química (EDTA) ou mecânica

C
(cell-scrapper) para tubo(s) estéril de 50mL

A
M
2. Centrifugar a 1500 rpm durante 5 minutos a 4ºC

II
3. Rejeitar o sobrenadante por decantação.

4. Ressuspender as células na quantidade de volume de
Meio de Cultura adequado.
5. Transferir para frasco de cultura de cultura adequado
6. Examinar ao MO invertido
Incubar em estufa 37ºC, 5%CO2.
URIA-CPM, FFUL
TÉCNICA DE DESCONGELAÇÃO:
COMO INICIAR UMA CULTURA
II. A partir de Criotubos, transportados em Gelo Seco (-20-30ºC)
9
Material:
_0
SC
Material técnico protector (luvas, bata, protector dos sapatos, óculos ou viseira)
Q
A
Câmara de fluxo estabilizada
IC
Estufa CO2
LÍN
Banho a 37ºC
C
Frasco de cultura T25 identificado com: Nome do técnico; data;
IA
nº de passagem tipo de cultura
O
LG
Marcador
Falcon50mL
RO
Pipetas graduadas
VI
Pipetador automático
C
A
Suporte com gelo

M
1 Criotubo com células J774 Suspensão

II
40mL Meio RPMI 1640 N, pré-aquecido

1 Criotubo com células aderentes
40mL Meio DMEM N, pré-aquecido
Centríuga JOUAN
Álcool 70º
URIA-CPM, FFUL
PASSAGEM DE CÉLULAS
9
_0
Passagem das células ou subcultura:
SC
Q
A
IC
Consiste na dissociação, por acção
LÍN
C
enzimática (tripsina) ou física (raspadores),
IA
O
de uma cultura celular e utilização das
LG
RO
células daí resultantes para estabelecer uma

VI
C
nova cultura.
A
M
II
URIA-CPM, FFUL
TRIPSINIZAÇÃO
Objectivo:
Libertar as células do suporte sólido (parede do frasco de
cultura) e dissociar as células entre si.
9
_0
SC
Material:
Q
A
frascos de cultura
IC
LÍN
Tripsina-EDTA
C
IA
PBS sem Ca2+ nem Mg2+
O
LG
Meio Dulbecco’s DMEM completo:
RO
•1mM L-Glutamina
VI
C
•1mM piruvato de sódio

A
M
•1mM A.A. não essenciais

II
•10% (v/v) soro bovino fetal

•2,5 µg/ml fungizona
•50 µg/ml gentamicina
URIA-CPM, FFUL
TRIPSINIZAÇÃO
Técnica adaptada à aula prática de Virologia:
9
_0
SC
Q
A
IC
LÍN
C
IA
O
LG
RO
VI
C
A
M
II
URIA-CPM, FFUL
CONTAGEM DE CÉLULAS
EM
HEMATÍMETRO DE NEUBAUER
1m
9
_0
Altura= 0,1 mm
SC
1m
Q
1 2 Área= 1mm*1mm=1mm2
A
Volume= 0,1mm3
IC
LÍN
C
IA
N (1+2+3+4) 0,1 µL
O
LG 4
RO
X 1000 µL
VI
C
A
M
3 4
Diluição com Azul de Tripan
II
1/10 (90 µL + 10 µL)
N/4 * 105 células / ml

URIA-CPM, FFUL
BIBLIOGRAFIA
http://www.aidsreagent.org/
9
_0
http://www.atcc.org/
SC
Q
A
http://www.cdc.gov/
IC
LÍN
http://www.ecacc.org.uk/
C
IA
O
http://www.invitrogen.com/
LG
RO
VI
http://www.nuncbrand.com/
C
A
M
http://www.sigmaaldrich.com/
II
URIA-CPM, FFUL

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Parte III:

b)Tipo de Culturas Celulares

4.Como escolher um meio

5.Constituintes básicos do meio de cultura

6.DESCONGELAÇÃO: COMO INICIAR UMA CULTURA

Hote de fluxo laminar vertical

*Meios de cultura: satisfação das exigências nutricionais das

Morfologia das células:

3. Outras (células sanguíneas, nervosas, musculares)

transferidas para outro suporte sólido, de serem

dissociadas entre si e do suporte sólido onde se

fixaram (métodos enzimáticos e/físicos).

Natureza das células

Derivam de tecidos cancerosos ou de células primárias

e secundárias que sofreram transformação;

sem inibição de contacto e com grande rapidez.

Morfologia das células:

3. Outras (células sanguíneas, nervosas, musculares)

Será possível introduzir, propagar, consolidar e disseminar erros durante a

como lidar com dificuldades

qual o meio de cultura apropriado

qual o material necessário

quais as condições de incubação, etc.

National Institute of Health (NIH)

EPITELIAL/FIBROBLÁSTICA: GHOST (derivadas

FIBROBLÁSTICA:Vero; Fibroblastos de Salmão, MRC-5

LINFOCÍTICA:Linfócitos humanos mortos…

LINFOBLASTÓIDE PROMONOCÍTICA: U937

De um modo geral as células requerem um ambiente estéril,

• RPMI 1640 (criado pelo Roswell Park Memorial Institute, meio

• CMRL (basal médium designed for serum-free formulations)

da cultura, nomeadamente em termos de fontes de energia, mas tendo em

conta que a degradação destes aumenta os níveis de toxicidade. Portanto

podem ser introduzidos controladamente no meio.

b. Sais inorgânicos (oligoelementos)

A glucose é o hidrato de carbono mais usado como fonte de energia do meio.

• Antiproteases (previne a degradação proteolítica das células e do próprio meio)

O meio sem soro:

Não tem factores desconhecidos.

enzimática (tripsinização), química (EDTA) ou mecânica

(cell-scrapper) para tubo(s) estéril de 50mL

2. Centrifugar a 1500 rpm durante 5 minutos a 4ºC

3. Rejeitar o sobrenadante por decantação.

II. A partir de Criotubos, transportados em Gelo Seco (-20-30ºC)

Suporte com gelo

1 Criotubo com células J774 Suspensão

40mL Meio RPMI 1640 N, pré-aquecido

células daí resultantes para estabelecer uma

•1mM piruvato de sódio

•1mM A.A. não essenciais

•10% (v/v) soro bovino fetal

Técnica adaptada à aula prática de Virologia:

1/10 (90 µL + 10 µL)

N/4 * 105 células / ml

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