BIOTECNOLOGIAS DA REPRODUÇÃO ANIMAL

PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS

Paulo Bayard D. GONÇALVES1, M.H. BARRETA, L.C. SIQUEIRA, A.Q.

ANTONIAZZI

INTRODUÇÃO
A produção in vitro de embriões (PIV) é uma biotécnica de reprodução
assistida e uma ferramenta para pesquisa de eventos relacionados à
maturação e fecundação de oócitos, capacitação espermática e
desenvolvimento embrionário na fase de pré-implantação. Além disso, a PIV é
um instrumento de suporte para outras biotécnicas como clonagem,
transgênese e transferência nuclear. Sua aplicação em escala comercial se
tornou viável após o advento da aspiração folicular in vivo e pelo
aprimoramento das condições de cultivo in vitro.
Passam-se 25 anos após o nascimento do primeiro bezerro produzido in
vitro e os índices de blastocistos obtidos ainda estão aquém do desejado,
variando entre 20-50% (média de 35%). Além da baixa eficiência da técnica, os
embriões que conseguem se desenvolver in vitro apresentam qualidade inferior
àqueles produzidos in vivo. Diversos parâmetros são utilizados para avaliar a
qualidade dos embriões PIV como morfologia, criotolerância, transcrição
(mRNA), eclosão in vitro e prenhez após a transferência. Entretanto, nenhuma
dessas técnicas permite uma seleção eficiente que assegure bons índices de
prenhez. O aumento da eficiência da PIV está condicionado ao
desenvolvimento de trabalhos que visem aperfeiçoar e simplificar as condições
de cultivo durante as várias etapas do processo, principalmente no que se
refere à maturação citoplasmática e molecular de oócitos obtida in vitro.

Maturação nuclear, citoplasmática e molecular do oócito

In vivo, a maturação nuclear do oócito inicia após o pico pré-ovulatório de
LH durante o estro e in vitro, a retirada do oócito do ambiente folicular reinicia a
meiose. Em bovinos, a maturação nuclear do oócito requer de 18-24h e
compreende a progressão do estádio diplóteno da primeira prófase meiótica
até metáfase II. A capacitação do oócito, avaliada pelo desenvolvimento
embrionário, tem sido positivamente associada com o tamanho do folículo
antral do qual foi recuperado (LONERGAN et al., 1994), com o estádio de
desenvolvimento folicular (MACHATKOVA et al., 2004) e com o local de
maturação (in vivo vs. in vitro; RIZOS et al., 2002). O TCM199 é o meio mais
difundido entre os laboratórios de PIV. Seus principais suplementos são o soro
fetal bovino, FSH, LH, piruvato, penicilina e estreptomicina. A maturação in vitro
varia de 18-24h em 5% de CO2 em ar e umidade saturada.

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Laboratório de Biotecnologia e Reprodução Animal, Universidade Federal de Santa Maria,
Santa Maria, RS, Brazil. e-mail: bayard@biorep.ufsm.br

Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 11, suplemento 1, p.135-138, abril, 2008

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In vivo, os folículos pré-
ovulatórios atingem um diâmetro de
12-20mm, e ovulam um oócito com
núcleo e citoplasma maturados
adequadamente. Entretanto, os
oócitos coletados para PIV são em
sua maioria oriundos de pequenos
folículos antrais e apesar de
competentes para o reinício da
meiose, apresentam baixa capa-
citação para o desenvolvimento
embrionário, por apresentarem uma
maturação citoplasmática e mole-
cular insuficiente. As condições de
cultivo in vitro têm sido constan-
temente manipuladas para melhorar
a capacitação do oócito após sua
retirada do ambiente folicular.
Fatores de crescimento, gonado-
trofinas e esteróides têm sido
adicionados aos mais diversos
meios de maturação. Porém,
apenas modestos incrementos na
capacidade de desenvolvimento
embrionário puderam ser obser-
vados e a produção de blastocistos
raramente atingiu 50%
(THOMPSON, 2000). Métodos
celulares e bioquímicos têm sido
usados para inibir o reinício da
meiose dos oócitos após sua
retirada do ambiente folicular,
visando melhorar o desenvol-
vimento citoplasmático e molecular
na ausência de maturação nuclear
(SIRARD, 2001). Esses estudos
demonstram que é possível manter
o reinício da meiose bloqueado por
24-48h sem afetar drasticamente o
desenvolvimento embrionário ou
fetal. Porém, nenhuma dessas
metodologias tem melhorado a
capacidade de desenvolvimento
embrionário. Recentemente, nosso
grupo demonstrou que a angio-
tensina II é capaz de reverter o
efeito inibitório das células da teca
sobre a maturação nuclear de
oócitos bovinos (GIOMETTI et al.,
2005). Além disso, o cultivo de
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CCOs em um sistema de maturação
com células foliculares, angioten-
sina II e IGF-I aumentou as taxas de
clivagem, blastocisto e eclosão in
vitro (STEFANELLO et al., 2006).
Fecundação in vitro
In vivo, o espermatozóide
percorre um longo trajeto para
chegar ao infundíbulo e fecundar o
oócito. Durante esse percurso,
glicosaminoglicanas presentes no
trato genital feminino induzem sua
capacitação. Para fertilização in
vitro, a capacitação espermática é,
geralmente, promovida pela hepa-
rina. Antes do processo de
capacitação, os espermatozóides
viáveis contidos em uma palheta de
sêmen precisam ser separados do
plasma seminal, crioprotetores,
extensores e células mortas. Para
bovinos, os métodos de separação
espermática mais utilizados são o
gradiente de percoll e o swim-up. O
co-cultivo de espermatozóides e
oócitos é realizado por um período
de 18-22h, a 39˚C e 5% de CO2 em
ar e umidade saturada. O sistema
de fertilização in vitro tenta
mimetizar as condições in vivo.
Porém, resultados variados são
obtidos com espermatozóides
oriundos de touros ou partidas
diferentes.
Desenvolvimento embrionário in
vitro
O momento crítico para o
desenvolvimento embrionário come-
ça após a fecundação, quando a
segunda meiose é reiniciada para
formar o pró-núcleo feminino, e
termina com a ativação do genoma
embrionário 8-16 células (BREVINI
GANDOLFI & GANDOLFI, 2001). O
desenvolvimento nesse período é
dependente de mRNA e proteínas
acumuladas durante a maturação
citoplasmática (BLONDIN &
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SIRARD, 1995). A transcrição nicas que dependam da PIV. Para

deficiente antes da ativação do isso se faz necessário o
genoma embrionário não permite o desenvolvimento de um sistema de
desenvolvimento em várias espé- maturação in vitro adequado que
cies. Isso foi um dos obstáculos da permita uma maior capacitação dos
PIV nas décadas de 60 e 70, fato oócitos e conseqüentemente uma
que contribuiu para melhoria dos maior taxa de desenvolvimento
sistemas de cultivo. embrionário.
Diversos fatores de cresci-
mento têm sido adicionados aos
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
meios de cultivo in vitro para
melhorar os índices de desenvol-
vimento embrionário (LONERGAN BLONDIN, P.; SIRARD,M.A. Oocyte
et al., 1996; MATSUI et al., 1997). and follicular morphology as
Porém, apenas em meios definidos determining characteristics for
esses fatores incrementam as taxas developmental competence in
de blastocisto. O cultivo in vivo no bovine oocytes. Molecular
oviduto de ovelhas (LONERGAN et Reproduction and Development,
al., 2003) e vacas, de embriões v.41, n.1, p.54-62, 1995.
bovinos fertilizados in vitro, parece
fornecer um ambiente adequado BREVINI GANDOLFI, T.A.L.;
para o desenvolvimento embrio- GANDOLFI, F. The maternal legacy
nário. A produção de blastocistos to the embryo: cytoplasmic
em sistemas de cultivo in vivo não é components and their effects on
superior a observada in vitro, mas a early development.
qualidade dos blastocistos cultiva- Theriogenology, v.55, n.6, p.1255-
dos in vivo é superior (RIZOS et al., 1276, 2001.
2002). GIOMETTI, I.C. et al. Angiotensin II
O cultivo embrionário in vitro reverses the inhibitory action
varia de 7-9 dias a 39ºC, atmosfera produced by theca cells on bovine
controlada (5% de O2, 5% de CO2 e oocyte nuclear maturation.
90% de N2) e umidade saturada. A Theriogenology, v.63, n.4, p.1014-
taxa de blastocisto geralmente é 1025, 2005.
avaliada no 7º dia após a
fecundação sendo que, os blasto- LONERGAN, P. et al. Role of
cistos podem permanecer na estufa epidermal growth factor in bovine
até o 9º dia para avaliar a taxa de oocyte maturation and
eclosão in vitro. preimplantation embryo
development in vitro. Biology of
CONSIDERAÇÕES FINAIS Reproduction, v.54, n.6, p.1420-
A otimização da técnica de PIV 1429, 1996.
visando à produção de embriões de LONERGAN, P. et al. Effect of
boa qualidade e em número cada follicle size on bovine oocyte quality
vez mais expressivo resultará na and developmental competence
diminuição do custo por embrião following maturation, fertilization,
produzido e possibilitará uma maior and culture in vitro. Molecular
difusão da técnica entre os Reproduction and Development,
produtores. Ainda, tais melhorias v.37, n.1, p.48-53, 1994.
seriam de grande valia para o
aprimoramento de outras biotéc- LONERGAN, P. et al. Temporal
Divergence in the Pattern of

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Messenger RNA Expression in

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