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Revista de Ciências Médicas Chinesas Tradicionais

Volume 2, Edição 3 , julho de 2015 , páginas 150-158
acesso livre

Bases biológicas da “depressão com estagnação do qi do fígado e

síndrome de deficiência do baço”: um estudo de perfil de expressão
gênica digital
Junling Li a, Lifu Bi um, Kai Xia um, Kuo Gao um, Jianxin Chen um, Shuzhen Guo um, Tian Wang um, Xueling Ma b, Weiming Wang
c, Huihui Zhao um, Yubo Li d, Wei Wang um
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https://doi.org/10.1016/j.jtcms.2016.02.006 Obtenha direitos e conteúdo

Sob uma Creative Commons licença

Abstrato

Objetivo
Investigar as bases biológicas da “depressão com estagnação do qi do fígado e síndrome de deficiência do
baço ”.

Métodos
Um método de perfil de expressão gênica digital foi conduzido para explorar mudanças globais no
transcriptoma de mRNA em um modelo de rato com depressão com estagnação do qi do fígado e
síndrome de deficiência do baço. A reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (q-PCR)
foi realizada para verificar os cinco genes mais interessantes com base na análise da Enciclopédia de
Genes e Genoma de Kyoto (KEGG). Sini San , que dispersa o qi estagnado do fígado e fortalece o baço, foi
administrado aos ratos modelo para observar se poderia reverter essas mudanças genéticas no fígado.

Resultados
Quarenta e seis genes diferencialmente expressos foram identificados. Três dos cinco genes de maior
interesse - Hnf4α , Hnf4γ e Cyp1a1 - com base na análise KEGG, foram confirmados por PCR em tempo
real. Sini San reduziu as alterações da expressão gênica de Hnf4α , Hnf4γ e Cyp1a1 no modelo de rato.

Conclusões
Hnf4α , Hnf4γ e Cyp1a1 estão envolvidos em “depressão com estagnação do qi do fígado e síndrome de
deficiência do baço”. Esses achados indicam que ratos deprimidos com estagnação do qi do fígado e
síndrome de deficiência do baço apresentam risco de doenças hepáticas. Além disso, nossos resultados
irão informar a exploração da etiologia da depressão e ajudar no desenvolvimento de estratégias
terapêuticas eficazes.

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Palavras-chave
Depressão; Estagnação do qi do fígado e síndrome de deficiência do baço; Gene expresso
diferencialmente; Fígado; Base biológica

Introdução
A depressão é um transtorno psiquiátrico complexo , caracterizado por anedonia e sentimentos de
tristeza. 1 De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), espera-se que a depressão seja a
segunda causa de incapacidade após doença cardíaca até 2020. 2 Embora a depressão tenha sido
intensamente estudada, sua etiologia e estratégias terapêuticas eficazes ainda são ilusórias. Na China, a
Medicina Tradicional Chinesa (MTC) tem sido amplamente utilizada no tratamento da depressão e
muitas vezes proporciona bom efeito terapêutico . De acordo com a teoria TCM, disfunção do fígado
Zangé a causa da depressão e a síndrome mais comum na depressão é “ estagnação do qi do fígado e
deficiência do baço ”. 3 Sini San , que dispersa o qi estagnado do fígado e fortalece o baço, é uma receita
que se provou benéfica para curar a depressão. 4 , 5 Portanto, o estudo da base biológica da síndrome de
“depressão com estagnação do qi do fígado e deficiência do baço” é necessário para entender a etiologia
da doença e desenvolver estratégias terapêuticas eficazes.

TCM postula que a resposta do organismo ao stress está associada com a função do fígado Zang . 6
Assim, o stress crónico imprevisível leve (Cums), que imita os níveis de stress por dia em seres humanos,
tem sido utilizada na investigação fígado Zang disfunção. Expostos ao estresse, diferentes tecidos e
órgãos têm que interagir extensivamente para se adaptar aos desafios ambientais. Entre esses órgãos, o
fígado, como definido por sua anatomia, é de particular interesse, dado seus papéis vitais na
manutenção da homeostase e da saúde, bem como na regulação da utilização de nutrientes e do
metabolismo geral. 7 Além disso, em teoria TCM, a função do fígado, conforme definido pela anatomia
moderna, é um componente importante do fígado Zang. 8 Portanto, especulamos que mudanças no
fígado devem ser uma parte importante da base biológica da “depressão com estagnação do qi do fígado
e síndrome de deficiência do baço”.

Com base na especulação acima, primeiro estabelecemos um modelo confiável de depressão em ratos
com estagnação do qi do fígado e síndrome de deficiência do baço, de acordo com o método estabelecido
em nossos estudos anteriores. 9 Segundo, o perfil de expressão gênica digital (GDE), que pode analisar as
mudanças globais no transcriptoma de mRNA , foi conduzido para analisar as alterações genéticas no
fígado. Finalmente, a prescrição clássica, Sini San , composta de raiz chinesa da mandíbula ( Bupleurum
chinense DC), fruta laranja imatura ( Citrus aurantium L), raiz de peônia vermelha (Paeonia lactiflora Pall) e
alcaçuz ( Glycyrrhiza uralensis Fisch), foi administrada aos ratos modelo para observar se poderia reverter
as alterações genéticas no fígado.
materiais e métodos

Animais
Cento e dez ratos machos Sprague-Dawley (pesando aproximadamente 200 ± 20 g) (Licença Animal No:
SCXK Beijing 2012-0001) foram adquiridos do Centro de Pesquisa de Animais de Laboratório Beijing
Vitalriver, China. Todos os ratos foram criados em uma sala comum com temperatura entre 18 e 24 ° C e
umidade entre 40 e 60%. Os ratos receberam livre acesso a alimentos e água convencionais. Os
protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da
Universidade de Pequim de Beijing (número de ética: 2013BZHYLL1001B). Todos os esforços foram
feitos para minimizar o sofrimento dos animais.

Agrupamento
Após alimentação adaptativa por 2 semanas, os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos de
acordo com o peso corporal : grupo CUMS (n = 89) e grupo controle (n = 21). Os ratos do grupo CUMS
foram alojados em isolamento, enquanto os outros ratos foram alojados em grupos de quatro a cinco.
Após 6 semanas, os ratos CUMS foram considerados o modelo de depressão com estenose do qi do
fígado e síndrome de deficiência do baço e divididos aleatoriamente em três grupos de acordo com
testes comportamentais: (1) grupo modelo (grupo M) - 21 ratos recebendo água destilada e submetidos
para o procedimento CUMS; (2)  Grupo Sini San + CUMS (grupo S) - 14 ratos que recebem Sini
Sandissolvido em água destilada e depois submetido ao procedimento CUMS; (3) fluoxetina  + grupo
CUMS (grupo F) - 18 ratos que receberam fluoxetina em água destilada e depois submetidos ao
procedimento CUMS. Ratos no grupo controle (grupo C) permaneceram os mesmos.

Administração de Sini San e fluoxetina

Sini San é composto de raiz de mandíbula chinesa ( Bupleurum chinense DC.), Laranja imatura ( C.
aurantium L), raiz de peônia vermelha ( P. lactiflora Pall) e alcaçuz ( G. uralensis Fisch) na proporção de 1: 1:
1: 1. As ervas foram compradas do Grupo Beijing Tong Ren Tang (Pequim, China) e identificadas de
acordo com a Farmacopéia da República Popular da China (edição de 2010), pela Farmácia Hospitalar
Amizade China-Japão , em Pequim. Sini SanOs grânulos foram preparados pela Beijing Kang Ren Tang
Pharmaceutical (Pequim, China). Os grânulos foram dissolvidos em água destilada para fazer uma
suspensão Sini San , contendo matérias-primas na concentração de 0,25 g / mL. A dosagem de Sini San
para adultos humanos é de 24 g / dia (assumindo um peso corporal de 60 kg para um adulto humano).
Esta dosagem é de 2,5 g / kg / dia, calculada usando um coeficiente de conversão de dose de humano
para rato. 10 A fluoxetina foi adquirida na forma de cápsulas de 20 mg da Lilai Suzhou Pharmaceutical
(Jiangsu, China) e foi dissolvida em água destilada na concentração de 0,2 mg / mL. Antes da exposição
diária ao CUMS, os ratos do grupo S foram tratados com Sini San suspensão (1 mL / 100 g), os ratos do
grupo F foram colocados em gaveta com suspensão de fluoxetina (1 mL / 100 g) e os ratos nos grupos M
e C foram tratados com água destilada (1 mL / 100 g).

Procedimentos de estresse leve imprevisível crônico (CUMS)

De acordo com modelos anteriores de ratos CUMS , as seguintes estimulações foram aplicadas aos
animais experimentais e incluíram: privação alimentar por 24 h; privação de água por 24 h; alojamento
molhado durante a noite; natação forçada a 4 ° C por 5 min; contenção por 2,5 h; iluminação durante a
noite ; inclinação da gaiola (45 °) por 12 h; fixação da cauda, na qual uma pinça hemostática foi colocada
na cauda perto da base por 1,5 min, com pressão suficiente para causar a vocalização do rato; 36 sessões
de estimulação elétrica que foi administrada como choque inescapável nos pésem câmara com
intensidade de 1,5 mA e 30 choques em 1 min, com intervalo de 30 s entre as sessões. Os ratos foram
expostos a uma seleção aleatória de dois estressores das estimulações acima por dia, sem repetição do
mesmo tipo em dias contínuos, o que garantiu que o animal enfrentaria estímulos imprevisíveis.

Métodos para identificar o modelo de rato com depressão com estagnação do qi do fígado e
síndrome de deficiência do baço
De acordo com os métodos estabelecidos em nosso estudo anterior, 9 atribuímos sintomas, que são
usados para discriminar a doença e a síndrome na clínica, 11 para características macroscópicas visíveis
nos ratos. As atribuições específicas foram as seguintes:

Critérios para discriminação clínica Critérios para discriminação de ratos

Sintomas principais Principais características visíveis macroscópicas

Sentindo-se deprimido Preferência reduzida de sacarose e atividade locomotora

Distensão da dor no hipocôndrio ou dor de estômago Reaja violentamente contra pegar

Pouco apetite Aumento lento do peso corporal

Fezes soltas Fezes soltas

Sintoma secundário Recurso visível macroscópico secundário

Borborygmus e flatos O número de defecações aumenta quando a cauda é puxada

Ratos exibindo três características visíveis macroscópicas principais, ou os dois primeiros principais
com a característica visível macroscópica secundária foram diagnosticados como ratos deprimidos com
estagnação do qi do fígado e síndrome de deficiência do baço.

Testes comportamentais relacionados

Teste de campo aberto (OFT)

O OFT foi realizado para avaliar a atividade exploratória espontânea. A arena de campo aberto era um
piso quadrado preto de 100 cm × 100 cm dividido por oito linhas em 25 quadrados iguais, rodeado por
um muro de 35 cm de altura. Uma câmera digital foi colocada 2 m acima do campo aberto para capturar
todo o campo. Durante o OFT, os ratos foram colocados no centro do campo e gravados usando um
pequeno gravador de comportamento animal por 3 min. Rearings foram contados manualmente
durante a gravação. Um sistema de análise de comportamento animal foi usado para analisar a distância
total do movimento durante os 3 min.

Teste de preferência de sacarose (SPT)

O TDE foi utilizado para avaliar a anedonia potencial nos animais experimentais. Os ratos foram
treinados para o SPT, fornecendo uma escolha contínua de duas garrafas, que contêm 2% de sacarose,
por 24 h. Depois disso, uma das garrafas foi substituída por água por 24 horas. Durante este período de
24 horas, as garrafas foram trocadas após 12 horas para controlar qualquer viés lateral. Após este
procedimento de adaptação, os ratos foram privados de água e comida por 12 horas. O SPT foi realizado
às 9:00 da manhã. Os ratos foram alojados em gaiolas individuais e receberam livre acesso às duas
garrafas de água e sacarose, que foram pesadas com antecedência. Após 4 h, o peso da solução de
sacarose consumida e da água foi registrado. A preferência de sacarose foi calculada como

Teste de natação forçada (FST)

O FST foi realizado para avaliar o grau de desespero. Um animal experimental foi colocado em um
recipiente de vidro redondo com um diâmetro de 25 cm e uma altura de 45 cm. A água foi cheia a uma
altura de 30 cm com uma temperatura de 25 ± 5 ° C. O paradigma FST incluiu duas fases: um pré-teste
inicial de 15 min seguido por um teste de 5 min 24 h depois. A duração da imobilidade dos animais nos
5 minutos foi registrada. Os critérios para o reconhecimento da imobilidade dos animais foram: (1)
cessação da luta; (2) postura flutuante vertical; e (3) movimentos ocasionais dos membros para manter a
cabeça acima do nível da água, sem movimento corporal observado .

Amostragem
Antes do meio dia do segundo dia após o término do experimento de 8 semanas, os ratos foram
sacrificados por decapitação . Seus fígados foram imediatamente removidos e congelados em nitrogênio
líquido , em seguida, armazenados a -80 ° C até o uso.

Extração de RNA total, construção de bibliotecas e RNA-Seq

Seis amostras do grupo C e quatro amostras do grupo M foram selecionadas aleatoriamente para análise
de GDE. O RNA total foi extraído das amostras utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA,
EUA) de acordo com o manual de instruções. A concentração de RNA e pureza foram medidas usando
um espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, EUA). A integridade
do RNA foi avaliada utilizando o kit de ensaio RNA Nano 6000 do sistema Agilent Bioanalyzer 2100
(Agilent Technologies, CA, EUA). RNA de alta qualidade foi enviado para a Biomarker Technologies
Corporation (Pequim, China) para construção e sequenciamento de bibliotecas de cDNA . O ARNm foi
purificado pela interacção de caudas poli (A) com esferas oligo (dT) magnéticas. Sequenciamento de
RNAbibliotecas foram gerados utilizando o NEBNext ® Ultra ARN Biblioteca Prep Kit de Illumina (New
England Biolabs, Ipswich, MA, EUA) com os iniciadores de multiplexagem, de acordo com o protocolo
do fabricante. A biblioteca de cDNA foi construída de acordo com a preparação da biblioteca sem
encordoamento com inserções médias de 200 pb (150 a 250 pb). Os cDNAs foram purificados usando
AMPure XP Beads (Beckman Coulter, CA, EUA). Os fragmentos de cDNA curtos foram sujeitos a
reparação de fim e ligadura de adaptador . Em seguida, os fragmentos adequados foram selecionados
utilizando esferas de Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter) e enriquecidos por amplificação por
reação em cadeia da polimerase (PCR). O sequenciamento foi realizado por meio de uma corrida rápida
de 125 ciclos emparelhados na plataforma Illumina HiSeq2500.

Análise dos dados do transcriptoma e identificação da expressão gênica diferencial

Os dados brutos contendo sequências adaptadoras, leituras com sequências de baixa qualidade e
nucleótidos desconhecidos foram filtrados para obter leituras limpas. Todas as leituras limpas foram
então mapeadas para o genoma de Rattus norvegicus (rn5) usando TopHat2. 12 Os níveis de expressão
gênica foram estimados usando valores de FPKM (fragmentos por kilobase de exon por milhão de
fragmentos mapeados) usando Abotoaduras. 13
Os valores de DESeq 14 e Q foram empregados para avaliar a expressão gênica diferencial entre os grupos
C e M. As diferenças de abundância de ARNm entre as amostras foram calculadas com base na razão
entre os valores do FPKM. O método de controle de taxa de descoberta falsa (FDR) foi usado para
identificar o limiar do valor P em vários testes para calcular a significância das diferenças. Apenas os
genes com um valor absoluto de razão log2 ≥2 e pontuação de significância de FDR <0,01 foram
utilizados para análise posterior.

Análise bioinformática do perfil diferencial de expressão gênica

Os genes foram comparados usando BLASTX 15 contra dois bancos de dados de proteínas , o banco de
dados de proteínas não redundantes (Nr) e o banco de dados da via de Kyoto com um valor de corte de
10 −5 . Os genes foram recuperados com base no melhor hit BLAST (maior pontuação), juntamente com
sua anotação funcional de proteína.

Um fator de enriquecimento baseado no KEGG 16 ( http://www.genome.jp/kegg ) foi usado para

identificar as vias marcadamente enriquecidas em genes diferencialmente expressos, em comparação
com o fundo do genoma inteiro. A fórmula para calcular o fator de enriquecimento é:

onde N é o número de todos os genes com anotação KEGG, n é o número de genes diferencialmente
expressos (DEGs) com anotação KEGG, M é o número de todos os genes anotados em vias específicas e
m é o número de DEGs anotados em vias específicas . Os valores de P foram calculados pelo teste exato
de Fisher e corrigidos pelo método de Bonferroni para obtenção dos valores de Q.

Análise quantitativa de PCR em tempo real (qRT-PCR)

O qRT-PCR foi realizado para verificar a regulação positiva da expressão de Cyp1a1 , Cyp1a2 e Cyp7b1 e a
regulação negativa da expressão de Hnf4α e Hnf4γ . Sequências iniciadoras de PCR são mostradas na
Tabela 5 . Seis amostras de cada um dos quatro grupos foram selecionadas aleatoriamente para
verificação dos possíveis efeitos de Sini San e fluoxetina no fígado. Primers foram sintetizados pela
Sangon Biotech Company. A qRT-PCR foi realizada usando o Master Mix de PCR em tempo real SYBR
Green em um sistema StepOne Plus Realtime PCR (Applied Biosystems, CA, EUA). As reações de PCR
consistiram em 1 μL de sistema de reação PCR, 1 μL de modelo de cDNA, 1 μL de primer a montante, 1
μL de primer a jusante e 5 μL de SYBR Green I. As condições da reação foram as seguintes: desnaturação
durante 10 min a 95 ° C; 40 ciclos de 95 durante 15 s, 58 durante 30 s e 72 durante 30 s; placa de leitura e
curva de solubilidade foram realizadas a 60-95 ° C. A reacção foi terminada e a temperatura foi reduzida
para 4 ° C. O método 2 - △△ CTfoi usado para determinar os níveis relativos de mRNA. 16

Análise de dados de comportamento e PCR

O SPSS 17.0 (SPSS v.17.0 para Windows; SPSS Inc., Chicago, IL, EUA) foi utilizado para analisar os dados.
Um teste de Shapiro-Wilk foi usado para examinar a normalidade dos dados. Se os dados se ajustassem
a uma distribuição normal, uma análise de variância unidirecional seria usada para comparar os quatro
grupos. Para cada comparação de dois grupos selecionados, um teste post hoc de diferença menos
significativa foi usado para dados com uma homogeneidade de variância. Se os dados não tivessem uma
distribuição normal com uma homogeneidade de variância, umteste U de Mann-Whitneyfoi usado para
comparar dois grupos selecionados dos quatro grupos. Umaanálise de correlaçãoentre os resultados dos
testes comportamentais e os níveis de expressão gênica verificados por qRT-PCR também foi realizada.
Todos os dados são expressos como a média (SD). Um valor deP  <0,05 foi considerado significativo.
Resultados

Identificação de ratos deprimidos com estagnação hepática e síndrome de deficiência no

baço
Após 6 semanas do esquema CUMS, dois ratos morreram após o procedimento de estresse de nado
forçado, vinte ratos foram identificados como não deprimidos de acordo com o OFT e SPT, e quatorze
ratos foram identificados como deprimidos, mas não com estagnação do fígado e síndrome de
deficiência do baço . Entre os 89 ratos expostos a 6 semanas de CUMS, 53 ratos (60%) foram
identificados como deprimidos com estagnação do fígado e síndrome de deficiência do baço. Estes 53
ratos foram novamente divididos aleatoriamente em três grupos (grupos M, S e F) e continuaram a ser
expostos a CUMS por mais 2 semanas. Após 8 semanas de CUMS, todos os ratos no grupo M, sete ratos
no grupo S e nove ratos no grupo F permaneceram com estagnação do fígado e síndrome de deficiência
do baço.

Testes comportamentais
Como mostrado na Tabela 1 , Tabela 2 , Tabela 3 , em comparação com ratos no grupo C, os ratos nos
grupos M e S têm diferenças significativas no OFT, SPT e FST após 6 semanas de exposição ao CUMS.
No entanto, não houve diferenças significativas entre os grupos M, S e F nos três testes
comportamentais antes da administração do medicamento . Após um tratamento de 2 semanas, em
comparação com o grupo S, tanto a administração de Sini San como a de fluoxetina aumentaram
significativamente o número de elevações ( Tabela 1 , M vs. S: P  = 0,012; M vs. F P  = 0,005). No OFT e
SPT, Sini Sane a administração de fluoxetina tendeu a aumentar a distância total de movimento ( Tabela
1 ) e a preferência por sacarose ( Tabela 2 ), embora essas diferenças não tenham sido significativas em
comparação com o grupo M. No FST ( Tabela 3 ), a administração de Sini San tendeu a aumentar o tempo
de imobilidade , enquanto a administração de fluoxetina não teve um efeito significativo em comparação
com o grupo M.

Tabela 1 . Efeitos da administração de medicamentos no OFT.

Rearings Distância total de movimento

Antes do tratamento Depois do tratamento Antes do tratamento Depois do tratamento

Grupo C 8,30 (3,84) 6,81 (4,51) 1603,00 (463,89) 1184,60 (472,69)

Grupo M 2,06 (0,90) ∗ 0,88 (1,32) ∗ 1043,81 (569,89) ∗ 474.86 (358.40) ∗

Grupo S 3,54 (2,73) ∗ 4,08 (3,85) # 875,01 (476,41) ∗ 717,57 (421,90) ∗

f grupo 2,94 (2,48) ∗ 3,22 (3,22) ∗ # 734,08 (449,84) ∗ 441,73 (300,08) ∗

∗P  ≤ 0,05 em comparação ao grupo C, # P  ≤ 0,05 em comparação ao grupo M; valores são médias (SD) (unidade: s) (N =
21, 17, 13,18).

Tabela 2 . Efeitos da administração de medicamentos no SPT.

N Porcentagem de preferência de sacarose no SPT

 N Porcentagem
Antes do tratamento
de preferência de sacarose no SPT
Depois do tratamento

Antes do tratamento Depois do tratamento

Grupo C 21 0,71 (0,17) 0,79 (0,14)

Grupo M 21 0,46 (0,20) ∗ 0,50 (0,20) ∗

Grupo S 14 0,44 (0,23) ∗ 0,57 (0,23) ∗

Grupo F 17 0,40 (0,20) ∗ 0,55 (0,21) ∗

* P  ≤ 0,05 em comparação ao grupo C, os valores são médias (SD) (unidade:%).

Tabela 3 . Efeitos da administração de medicamentos no FST.

N Tempo de imobilidade em FST

Antes do tratamento Depois do tratamento

Grupo C 21 8,00 (6,84) 12,90 (11,08)

Grupo M 19 35,75 (33,88) ∗ 60,53 (57,95) ∗

Grupo S 13 29,86 (29,30) ∗ 38,08 (24,98) ∗

Grupo F 16 48,33 (53,53) ∗ 73,00 (56,47) ∗

* P  ≤ 0,05 em comparação ao grupo C; valores são médias (SD) (unidade: s).

Detecção de genes diferencialmente expressos

Comparado com o grupo de controle, 46 genes expressos diferencialmente foram identificados no grupo
M, dos quais 12 foram regulados para cima e 34 foram reprimidos.

Vias de KEGG associadas a genes diferencialmente expressos

Para explorar ainda mais as interações e funções biológicas de genes diferencialmente expressos, eles
foram pesquisados contra as vias de referência em KEGG. Um total de 26 genes foram anotados e
atribuídos a 36 vias KEGG. Como mostrado na Fig. 1 , os caminhos estavam envolvidos principalmente
com o processamento de informações ambientais, doenças humanas, processos celulares, metabolismo,
processamento de informações genéticas e sistemas de organismos. Entre as 36 vias, as seis vias mais
confiáveis foram identificadas por fatores de enriquecimento e valores de Q, como mostrado na Tabela 4
. Estas seis vias estão principalmente envolvidas com cinco genes regulados positivamente ( Cyp1a1 ,
Cyp1a2 , Cyp7b1 , Map2k6 e Slc1a2) e dois genes regulados para baixo ( Hnf4α e Hnf4γ ).
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Figura 1 . Anotação KEGG e classificação de DEGs.

Tabela 4 . Enriquecimento KEGG de DEGs (as seis vias mais marcadamente enriquecidas).

Caminho DEGs Fator de enriquecimento Valor Q

Diabetes de início da maturidade dos jovens Hnf4α, Hnf4γ 0,03 5.3446e-02

Metabolismo do triptofano Cyp1a1, Cyp1a2 0,06 1.9532e-01

Biossíntese de hormônios esteroides Cyp1a1, Cyp7b1 0,06 2.1088e-01

Metabolismo do retinol Cyp1a1, Cyp1a2 0,07 3.2530e-01

Esclerose lateral amiotrófica (ELA) Map2k6, Slc1a2 0,07 3.3503e-01

Metabolismo de xenobióticos pelo citocromo P450 Cyp1a1, Cyp1a2 0,09 4.8476e-01

O eixo y indica os nomes das vias e o eixo x indica o número de genes e a proporção do total de genes
anotados.

QPCR em tempo real

Com base na análise do KEGG, cinco genes ( Tabela 5 ) foram escolhidos para validação por qPCR
quantitativa em tempo real. As amostras dos grupos C e M foram diferentes daquelas utilizadas na
análise de GDE. Adicionalmente, seis amostras aleatórias dos grupos S e F foram selecionadas para
análise de qPCR em tempo real, para investigar os efeitos da administração de Sini San e fluoxetina nas
mudanças na expressão desses genes no fígado. Como mostrado na Tabela 6 , os níveis de expressão de
Hnf4α e Hnf4γ foram significativamente reduzidos no grupo M comparado com o grupo C ( Hnf4α : P  =
.037; Hnf4γ : P = .000), que foi consistente com os resultados do GDE. A administração de Sini San e
fluoxetina aumentou significativamente os níveis de expressão de Hnf4α e Hnf4γ em comparação com o
grupo M [ Hnf4α : P (S vs. M) = 0,045, P (F vs. M) = 0,016; Hnf4y : P (S vs. M) = 0,039, P (F vs. M) = 0,001].
Como mostrado na Tabela 7 , o nível de expressão de Cyp1a1 foi significativamente aumentado no grupo
M comparado com o grupo C ( P  = 0,006), o que foi consistente com os resultados de GDE. Cyp1a2 e
Cyp7b1 mostrou uma tendência de aumento da expressão no grupo M comparado com o grupo C, mas
sem significância.

Tabela 5 . Primers utilizados para análise de validação.

ID do gene Nome do gene Primer

ENSRNOG00000008895 Hnf4α F: GGGAGGAGACGAGAGAGGAT

R: GGCGTGAAGTCCGTGATTAG

ENSRNOG00000008971 Hnf4γ F: GTCGCCAGTGTGTTGTTGAC

R: CGTGCTTCTTCTTGTGCTGA

ENSRNOG00000019500 Cyp1a1 F: GACCACGATGACCAAGAGC

R: GGGAGGTAACGGAGGATAGG

ENSRNOG00000016173 Cyp1a2 F: GTGGAATCGGTGGCTAATGT

R: AGTCCTTGCTGCTCTTCACG

ENSRNOG00000009730 Cyp7b1 F: TTGAGGTTCTGAGGTTGTGC

R: TGGGTCATTGTGTATCATTGG

Tabela 6 . Níveis de expressão de Hnf4α e Hnf4γ em cada grupo.

Hnf4α Hnf4γ

Grupo C 7,37 (6,04) 3,01 (1,64)

Grupo M 1,24 (0,91) ∗ 0,00 (0,87) ∗

Grupo S 2,69 (1,35) # 1,50 (1,30) ∗ #

Grupo F 3,12 (0,98) # 2,55 (0,45) #

* P  ≤ 0,05 em comparação ao grupo C, # P  ≤ 0,05 em comparação ao grupo M; valores são médias (SD).
 Tabela 7 . Níveis de expressão de Cyp1a1 , Cyp1a2 e Cyp7b1 em cada grupo.

Cyp1a1 Cyp1a2 Cyp7b1

Grupo C 0,31 (0,15) 1,38 (0,40) 0,76 (0,43)

Grupo M 1,24 (0,93) ∗ 1,57 (1,33) 1,13 (0,53)

Grupo S 0,42 (0,36) 3,64 (1,91) 1,03 (0,46)

Grupo F 1,02 (0,76) 1,14 (1,12) 0,94 (0,86)

* P  ≤ 0,05 em comparação ao grupo C.

Correlações entre comportamento e genes

A expressão de três genes, Hnf4α , Hnf4γ e Cyp1a1 , foi verificada por qPCR. Analisamos as correlações
entre os resultados dos testes comportamentais e os níveis de expressão dos três genes no fígado. A
única correlação significativa foi entre o número de criações no OFT e o nível de expressão de Hnf4γ no
fígado (r = 0,472, P  = 0,041).

Discussão
Na teoria da MTC, uma síndrome é o resumo patológico da localização, causa, natureza e condição de
uma doença em um determinado estágio, e esse é o núcleo do tratamento da MTC. Estudos para
entender a base biológica de uma síndrome são imperativos para a popularização e aplicação da teoria
da MTC na medicina moderna.

O estabelecimento de um modelo confiável de doença em ratos combinado com a síndrome

correspondente é importante para a investigação da base biológica de uma síndrome. Pesquisadores
modernos de TCM considerar que a resposta do corpo ao estresse está associado com a função do fígado
Zang . Assim, um modelo de rato de depressão, que usa um regime de Cums, tem sido comumente
usado para investigar a base biológica do fígado Zang disfunção. Nós demonstramos anteriormente que,
de acordo com o método de transformar sintomas clínicos em características visíveis macroscópicas
equivalentes em ratos, havia sintomas de depressão com estagnação do qi do fígado e síndrome de
deficiência do baço na maioria dos ratos testados após 6-8 semanas de CUMS.9 No presente estudo, pelo
mesmo método, 60% de todos os ratos testados foram identificados como deprimidos com estagnação
do qi do fígado e síndrome de deficiência do baço após 6 semanas de CUMS, o que foi consistente com o
nosso estudo anterior. Com base neste modelo de rato confiável, um método DEG foi usado para
explorar a expressão gênica diferencial no fígado. Como resultado, 46 degs foram identificadas com base
em critérios rigorosos de rastreio (razão log2 ≥2 e uma pontuação FDR significado <0,01), demonstrando
que o fígado estava envolvida na disfunção do fígado Zang. Entre os 46, a expressão dos cinco genes mais
importantes, determinados pela análise KEGG, foi verificada por qPCR em tempo real. A expressão de
três dos cinco genes foi verificada, enquanto os outros dois tiveram a mesma tendência de mudança de
expressão com o identificado por DEG. Isso indicou que os cinco genes, especialmente os três genes
verificados, estão envolvidos na base biológica da “depressão com estagnação do qi do fígado com a
síndrome de deficiência do baço”.

Os níveis de expressão de Hnf4α e Hnf4γ foram significativamente menores no grupo M. A Hnf4α é um

membro da superfamília de receptores nucleares , que é altamente expressa no fígado, com níveis mais
baixos nas células renais, intestinais e β pancreáticas. 17 Hnf4α regula importantes funções hepáticas ,
como glicólise , gliconeogênese , gênese da uréia , metabolismo de ácidos graxos , síntese de ácidos
biliares , metabolismo de drogas , síntese de apolipoproteínas e coagulação sanguínea., regulando a
transcrição de muitos dos genes envolvidos em cada uma dessas funções. 18 Devido ao seu envolvimento
em uma ampla gama de funções hepáticas, o Hnf4α é conhecido como o principal regulador da função
hepática. 19 Além disso, as alterações do Hnf4α no cérebro têm sido associadas à patogênese da depressão
. 20 Mas não foi estabelecida uma associação entre as alterações no fígado e a patogênese da depressão
pelo Hnf4α . No entanto, há um relatório demonstrando aumento da regulação de Hnf4α no fígado após
quatro consecutivos de estresse psicológico procedimentos, 21o que é contrário aos nossos resultados.
Por isso, especulamos que o nível de Hnf4α no fígado pode ser primeiro regulado e depois regulado para
baixo com o tempo de estresse prolongado. Há uma variedade de estudos fornecem evidências de que a
sub-regulação de Hnf4α está associada com a patogénese da fibrose hepática 22 e cirrose , 23 doença
hepática não-alcoólica , 24 e carcinoma hepatocelular desenvolvimento. 25 Como a maioria dessas
doenças demonstra sintomas de distensão da dor no hipocôndrio , falta de apetite e fadiga, a síndrome
do qi do fígado estagnação e deficiência no baço foram consideradas como a síndrome mais comum
nessas doenças crônicas do fígado. 26 Na teoria da MTC, diferentes doenças com a mesma síndrome
devem compartilhar a mesma base patológica. No presente estudo, a mudança na expressão de Hnf4α
encontrada no modelo de depressão indicou que a Hnf4α no fígado está envolvida na estagnação do qi
do fígado e na síndrome de deficiência do baço, e também indica que pacientes com depressão e
estagnação do qi do fígado e síndrome de deficiência do baço risco de doença hepática. Hnf4γ é um gene
recentemente descoberto homólogo a Hnf4α , 27que é expresso no intestino, fígado, ilhotas pancreáticas
e cérebro. 28 Em comparação com Hnf4α , a função fisiológica de Hnf4γ é menos bem compreendida.
Vários estudos sugeriram que o Hnf4γ está associado à inflamação 29 e ao câncer 30 no intestino e no
estômago. Mas a função de Hnf4γ no fígado não foi relatada. No entanto, camundongos knockout Hnf4γ
mostram comportamento depressivo que pode ser revertido quando administrada 3a, 5a-
tetrahydroprogesterone (3a5a-THP). Os autores deste achado especularam que a inativação de
Hnf4γpode diminuir a transcrição de 3a-hidroxiesteróide desidrogenase (3a-HSD), resultando em uma
diminuição da redução de 5a-dihydroprogesterone (5a-DHP) para 3a5a-THP, o que pode causar sinais
de depressão. Notavelmente, no presente estudo, descobrimos que o nível de expressão de Hnf4γ no
fígado foi regulado para baixo e foi positivamente correlacionado com o número de criações no OFT,
sugerindo uma possível relação entre o comportamento depressivo e o Hnf4γ no fígado. Mas se o Hnf4γ
é uma causa da patogênese da depressão, precisa de mais pesquisas.

Há um crescente corpo de evidências sugerindo que o estresse pode modificar os citocromos P450 ( Cyps
) no fígado. 31 , 32 , 33 , 34 Dois efetores primários do sistema de resposta ao estresse, chamados
glicocorticóides e vias adrenérgicas , são os principais responsáveis pelas alterações das cits no fígado,
por meio de várias vias de sinalização. 35 , 36 , 37 No presente estudo, confirmamos que o citocromo
P4501A1 ( Cyp1a1) expressão no fígado foi supra-regulada na depressão induzida por estresse com
estagnação do qi do fígado e modelo de síndrome de deficiência do baço. Cyp1a1 é uma enzima chave na
biotransformação de agentes tóxicos e carcinogênicos ambientais, tais como aminas aromáticas e
hidrocarbonetos aromáticos policíclicos . A indução e a atividade elevada de Cyp1a1 têm sido associadas
à toxicidade e ao aumento do risco de câncer em indivíduos expostos à fumaça do tabaco ou outros
poluentes ambientais, incluindo esses compostos. 32 Cyp1a2 , que compartilha as principais funções do
Cyp1a1 , 35também demonstrou aumento dos níveis de expressão. Assim, combinado com os resultados
do Hnf4α , o modelo de depressão com estagnação do qi do fígado e síndrome de deficiência do baço
também pode estar em risco de câncer. Além da subfamília Cyp1a , o presente estudo demonstrou uma
tendência de aumento da expressão de Cyp7b1 . Como o Cyp7b1 tem uma relação estreita com a síntese
do ácido biliar, 38 ele pode ser responsável pela síndrome da deficiência do baço.
Além de investigar alterações no fígado no modelo de rato, também avaliamos o efeito do tratamento
com Sini San e fluoxetina . Tanto o Sini San quanto o tratamento com fluoxetina podem melhorar os
comportamentos relacionados à depressão, embora o efeito não tenha sido notável. Este resultado pode
ser devido ao fato de que a terapia medicamentosa de 2 semanas foi relativamente curta. Os fenótipos do
comportamento depressivo podem melhorar significativamente com um tempo de tratamento
prolongado. Notavelmente, a administração de Sini San reduziu significativamente as alterações na
expressão do subtipo Hnf4 e teve uma tendência a reduzir as alterações na expressão do Cyp1a1 . Na
teoria do TCM, Sini Sané uma prescrição clássica que tem a função de dispersar o qi estagnado do fígado
e fortalecer o baço. Estes resultados confirmaram ainda que Hnf4α , Hnf4γ e Cyp1a1 estão envolvidos na
base biológica da estagnação do qi do fígado e da síndrome de deficiência do baço.

Em conclusão, usando a tecnologia DEG para investigar mudanças globais no transcriptoma de mRNA e
q-PCR para verificar os maiores DEGs, e avaliando o efeito de Sini San nestes DEGs, nós demonstramos
três genes no fígado que estão envolvidos na depressão com qi do fígadoestagnação e síndrome de
deficiência do baço. Esses achados sugerem um alto risco de doença hepática nesse modelo. No entanto,
existem algumas limitações em nosso estudo. Primeiro, apenas verificamos cinco DEGs com base na
análise do KEGG. Mais estudos para verificar os outros DEGs são garantidos. Em segundo lugar, poucos
estudos foram realizados para investigar alterações no fígado em modelos de depressão; portanto, mais
pesquisas são necessárias para investigar o mecanismo dessas mudanças na expressão gênica. Isso
ajudará no desenvolvimento de remédios mais direcionados para a depressão. Apesar dessas limitações,
acreditamos que nosso estudo demonstrou um grupo de genes que estão envolvidos na depressão
combinada com a estagnação do qi do fígado e com a síndrome de deficiência do baço, o que é
importante para a exploração futura da doença.etiologia da depressão e desenvolver estratégias
terapêuticas eficazes.

Conflito de interesses
Os autores declaram não haver conflitos de interesses.

Reconhecimento
Este trabalho foi apoiado por uma doação do Programa Nacional de Pesquisa Básica da China (973
Programa No. 2011CB505106 ).

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