UNIVERSIDADE ESTADUAL DA PARAÍBA – UEPB

CENTRO DE CIENCIA E TECNOLOGIA – CCT

CAMPUS I – CAMPINA GRANDE PB QUIMICA INDUSTRIAL
LAB. MICROBIOLOGIA PROF: HELVIA WALEWSKA

RELATÓRIO UNIDADE I

José Jonathan Monteiro Guedes

10 de Maio de 2019 - Campina Grande – PB

OBJETIVO

Relatar em sequencia o que foi visto e praticado em laboratório sobre segurança,

manuseio e técnicas de esterilização e cultivo de material biológico, de forma que ao final
da unidade tenhamos boas práticas e noções básicas de como funcionam e se comportam
os microrganismos que nos cercam.

INTRODUÇÃO

O laboratório de microbiologia tem papel fundamental nos sistemas de qualidade de

produtos industrializados. Para o desempenho adequado deve contar com estrutura,
equipamentos e pessoal treinado em procedimentos específicos. Este curso apresenta os
aspectos imprescindíveis para o laboratório garantir a qualidade de seus resultados.
REGRAS DE CONDUTA EM LABORATÓRIO

 Não comer, beber ou fumar dentro do laboratório

 O uso do avental de algodão é obrigatório
 As mesas ou bancadas de trabalho devem ter superfície lisa, de fácil limpeza e de
desinfecção
 Quando da manipulação de material tóxico ou infectante, usar luvas de proteção;
 As pipetas usadas devem ser colocadas horizontalmente em solução desinfetante
imediatamente após o uso, antes de se proceder a sua limpeza e esterilização
 Não colocar materiais contaminados sobre a bancada. Esses materiais devem ser
colocados em recipientes apropriados e esterilizados em autoclave
 Cuidado ao acender o bico de gás (bico de Bunsen). Verificar se não existem
substâncias inflamáveis por perto
 Flambar alças, agulhas e pinças antes e após o uso
 Todo o material deve ser identificado. As etiquetas devem ser autoadesivas

ESTERELIZAÇÃO DE MATERIAL

Um dos fatores mais cruciais para o laboratório de microbiologia é evitar a

contaminação do material que se esta trabalhando, para isso existem métodos de
esterilização para eliminar qualquer contaminação biológica exterior, alguns métodos
como uso de álcool 70%, luz UV, estufa, autoclave e entre outros. No entando o
procedimento mais comum e mais eficiente para a esterilização é lavar com água e
detergente, utilizando esponja e escove-te.. Caso os materiais apresentem incrustações
ou resíduos gordurosos, proceder à imersão destes em solução de hipoclorito de sódio
a 2% e detergente neutro. Enxaguar dez vezes com água corrente, enchendo e
esvaziando totalmente a vidraria. Utilizar no último enxágue, água destilada ou
deionizada. Deixar drenar a água das vidrarias e secar em estufa a 100 °C

Colocar tampão de algodão hidrófobo e gaze no bocal dos frascos erlenmeyer. Cobrir
com folha de alumínio ou papel Kraft e fixar com barbante, atilho ou fita adesiva tipo
crepe. Cobrir os bocais das provetas e dos béqueres com folha de alumínio ou papel
Kraft e fixar com fita adesiva tipo crepe, atilho ou barbante. Esterilizar em autoclave
 a 121 °C, por 30 min ou em estufa a 170 °C – 180 °C por 2 horas. Identificar o material
com data de esterilização e prova de esterilização.

MEIOS DE CULTURA

A utilização dos meios de cultura são muito importante na identificação de micro-

organismos que provocam, por exemplo, infecções e alergias nos seres humanos e
contaminações em alimentos e água. É através deste procedimento, que a bactéria
causadora é identificada.

Existem diversos tipos de meios de cultura, e variadas especificidades. Abaixo, consta os

Meios de Cultura mais utilizados em laboratórios, na identificação e cultivo de micro-
organismos.

Meio de Cultura Caldo Verde Brilhante (Agar Bile Verde Brilhante) – meio de cultura
para coliformes, identifica as bactérias presentes na água contaminada e limpa.

Meio de Cultura Agar Mueller Hinton – usado para a determinação da Concentração

Inibitória Mínima (MIC) de antimicrobianos para as bactérias aeróbicas.

Meio de Cultura Agar Nutriente – utilizado no cultivo de micro-organismos menos

exigentes.

Meio de Cultura Extrato de Malte – detecção, isolamento e contagem de leveduras e

bolores.

Meio de Cultura Extrato de Carne – por ser preparado com carne fresca, fornece
crescimento máximo de microorganismos.

Meio de Cultura Caldo EC – usado para enumeração seletiva de coliformes fecais e não
fecais em água, esgoto e frutos do mar.
PREPARAÇÃO DO MEIO

INTRODUÇÃO

Hoje o mais comum é a utilização de meios comerciais prontos e/ou semiprontos. A

preparação desses meios é bastante simples consistindo basicamente em dissolvê-lo
como uma gelatina e distribuir nos tubos ou placas de petri que serão usados. Porém,
alguns cuidados gerais devem ser usados para o preparo e validação dos meios de
cultura.

PREPARAÇÃO

A seguir segue uma descrição simplificada do procedimento de preparo de um meio de

cultura geral.

1. Pesar o ágar (pó) e colocar em um béquer ou erlenmeyer com capacidade maior do

que o volume que será usado por exemplo, se for preparar um meio de 100 ml usar um
erlenmeyer de 250 ml.

2. Medir o volume de água destilada necessário em uma proveta. A adição da água no

meio deve ser realizada colocando-se primeiro uma pequena quantidade de água até que
o meio fique úmido e depois acrescentar o restante devagar.

3. Homogeneizar o meio agitando o frasco devagar, com movimentos circulares.

4. Aquecer o frasco em bico de bunsen, sobre uma tela de amianto. Como é preciso
agitar constantemente é recomendado uso de luvas térmicas.

5. O meio não deve chegar à fervura. Deve apenas ser aquecido até se fundir
completamente.

6. Os meios para diagnóstico microbiológico passam por algum processo de

esterilização antes do uso. Pode ser em autoclave, por 15 minutos a 121ºC.
7. A distribuição dos meios em tubos ou placas pode ser feita antes ou depois da
esterilização. Se for feita antes, as placas podem ser não estéreis, se for depois é preciso
usar placas já esterilizadas.

8. Se for feita a autoclavação do meio, tanto distribuído em placas, tubos ou em maior

quantidade, deve ser feita com o recipiente semiaberto para a esterilização completa e
por igual.

CONTROLE DE QUALIDADE

Para a validação de um meio de cultura preparado é preciso retirar uma parcela de tubos
ou placas prontas, em geral 10% do lote, e submetê-los a uma incubação a 35ºC durante
24 horas. Depois deste período não deve haver nenhuma alteração do meio: nem de cor
ou presença de colônias. Se houver alguma modificação no meio o lote deverá ser
esterilizado novamente e se persistir a contaminação, deverá ser descartado. Outro
controle de qualidade que deve ser realizado é o Controle de Crescimento. Para esse
controle são utilizadas cepas de referência ou com origem definida e viabilidade
comprovada. A cepa deve ser inoculada no meio e após o período de incubação,
específico para a cepa usada, a leitura deve ser obrigatoriamente positiva.

IDENTIFICAÇÃO DE BACTERIAS

TECNICA DE COLORAÇÃO DE GRAM

O método consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em

meio sólido ou líquido, com um corante primário, o cristal violeta, seguido de
tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactérias Gram-positivas quanto Gram-
negativas absorvem de maneira idêntica o corante primário e o fixador, adquirindo uma
coloração violeta devido à formação de um complexo cristal violeta-iodo, insolúvel, em
seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgânico, o etanol-acetona
(1:1 v:v). O solvente dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias
Gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido, descorando as células.
Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactérias Gram-
positivas e provoca a contração dos poros do peptidoglicano, tornando-as impermeáveis
ao complexo; o corante primário é retido e as células permanecem coradas. A etapa da
descoloração é crítica, pois a exposição prolongada ao solvente provoca a remoção do
cristal violeta dos dois tipos de bactérias, podendo produzir resultados falsos. A
retenção ou não do corante primário é, portanto, dependente das propriedades físicas e
químicas das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e
integridade.

Em seguida, a amostra é tratada com um corante secundário, a fucsina básica. Ao

microscópio, as células Gram-positivas aparecerão coradas em violeta escuro e as
Gram-negativas em vermelho ou rosa escuro. Células de bactérias Gram-positivas,
células velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes físicos ou químicos,
tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou
todas as células coradas como Gram-negativas.

PROCEDIMENTO

1. Confeccionar o esfregaço;
2. Corar com violeta de cristal por 60 segundos;
3. Lavar com esguicho de água destilada;
4. Cobrir com Iodo de Gram ou Lugol por 60 segundos;
5. Lavar com esguicho de água destilada;
6. Descorar com álcool a 95%, ou acetona, 10-20 segundos;
7. Lavar com esguicho de água destilada;
8. Corar com safranina por 60 segundos
9. Lavar com água destilada, secar e observar ao microscópio.

A TÉCNICA DE ESGOTAMENTO DO INÓCULO

A técnica de esgotamento do inóculo é uma técnica de rotina para o isolamento de

bactérias em culturas puras. Se a semeadura não for satisfatória, não se obtêm colônias
isoladas, devendo-se requisitar nova amostra. A placa de Petri deve conter um meio de
cultura, no qual o organismo a ser isolado cresça caracteristicamente. O meio de cultura
deve estar bem seco, pois se estiver úmido, a água de condensação pode arrastar as
bactérias sobre a superfície da placa. As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao
bico de Bunsen, para evitar contaminação com germes do ar. A figura abaixo mostra as
três formas possíveis de segurar a placa durante o procedimento. Experimente as três com
uma placa vazia antes de escolher a que melhor se adapte a suas possibilidades.

Uma alça do material a ser semeado é colocada na parte superior do meio de cultura.
Tocar somente a superfície do meio, tratar de não perfurar o ágar. Esse é o chamado
inóculo inicial. Flambar a alça de platina e, a partir do inóculo inicial, semear em ângulos
retos ao inóculo, retirando linhas de semeadura, paralelas umas às outras. Virar a placa e
semear em ângulos retos às linhas paralelas já feitas, de modo que o resultado seja uma
série de linhas formando pequenos quadrados sobre a superfície do meio.

As colônias isoladas devem aparecer no final da semeadura. Se houver crescimento de

bactérias nos centros dos quadrados formados pelo processo da semeadura, será
obviamente contaminação. Uma vez semeadas, as placas devem ser incubadas com a
tampa voltada para baixo.

CONCLUSÃO

Ao fim das práticas do primeiro módulos é possível se ter noção do quanto as análises
biológicas podem ser diversas e complexas, justamente devido a variedade exorbitante de
microrganismos distintos e complexos que exigem cuidados específicos para seu
manuseio, estas técnicas descritas neste relatório são uma pequena parte da inúmeras
outras mais completas para identificação de organismos mais perigosos que exijam
experiencia e cuidado com seu manuseio.

Contudo ao final do modulo fomos capazes de preparar, cultivar e identificar bactérias

em meio de cultura, uma vez que na indústria alimentícia por exemplo, tratar no controle
de microrganismos pode ser extremamente importante, e estas técnicas são apenas o
básico dos métodos utilizados atualmente.