Universidade Estadual

de Londrina

Roteiro Descritivo de Projeto de Pesquisa

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· TÍTULO DO PROJETO: Avaliação do efeito de extratos naturais sobre células
planctônicas e sésseis de Staphylococcus pseudintermedius.

· COORDENADOR (A) DO PROJETO: Profa. Dra. Sueli Fumie Yamada-Ogatta

· Resumo
Dentro do gênero Staphylococcus, o grupo SIG (Staphylococcus intermedius group)
compreende cocos Gram-positivos, coagulase positivos muito semelhantes a S. aureus, de
difícil diferenciação por testes fenotípicos e/ou bioquímicos. Estas espécies fazem parte da
microbiota oral e anal de animais domésticos, e eventualmente atuam como patógenos
oportunistas. S. pseudintermedius tem chamado a atenção dos pesquisadores, uma vez que
isolados clínicos resistentes a meticilina já foram identificados em infecções em seres
humanos. Estas infecções podem ser adquiridas de mordidas de cães e gatos; a bactéria adere
às células epiteliais humanas por meio de adesinas, coloniza o hospedeiro e pode vir a
expressar fatores de virulência que permitirão sua disseminação pelo organismo e,
consequentemente, o surgimento de uma infecção. Isolados clínicos de S. pseudintermedius
apresentam multirresistência aos antimicrobianos comumente utilizados, sobretudo à classe
dos beta-lactâmicos. O uso de produtos naturais vem despertando interesse, permitindo
tratamentos alternativos com novos antimicrobianos que podem oferecer novos mecanismos
de ação e menor toxicidade. Neste trabalho, a concentração inibitória mínima (CIM) e
concentração bactericida mínima (CBM), para diversos isolados clínicos obtidos de infecções
caninas, de cinco extratos naturais serão determinados pelo método de microdiluição em caldo
segundo protocolo preconizado pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). A
cinética de crescimento de S. pseudintermedius em presença dos extratos naturais será
analisada a fim de verificar o tempo de morte das células. Além disso, verificar-se-á se os
extratos são capazes de inibir a formação e desenvolvimento do biofilme; fator de virulência de
extrema importância para a clínica médica. Com este trabalho será possível avaliar o potencial
antimicrobiano de extratos naturais e o possível desenvolvimento de novas formulações
farmacêuticas que podem melhorar a eficiência terapêutica contra infecções bacterianas
ocasionadas por S. pseudintermedius, na medicina humana e veterinária.

· Palavras-chave: Staphylococcus intermedius group. Stryphnodendron adstringens. Ricinus

communis L.. Melaleuca alternifolia. Copaifera spp..

· Objetivo geral: Avaliar o perfil de sensibilidade dos isolados clínicos de Staphylococcus

pseudintermedius ao óleo de mamona (Ricinus communis L.), extrato de barbatimão-
verdadeiro (Stryphnodendron adstringens), óleo de melaleuca (Melaleuca alternifolia) e óleo de
copaíba (Copaifera officinalis e Copaifera reticulata).

· Objetivos específicos: Determinar os valores de concentração inibitória mínima (CIM) e

concentração bactericida mínima (CBM) para os isolados clínicos; Analisar a cinética de
crescimento dos isolados; Verificar a atividade dos compostos sobre o metabolismo de células
sésseis durante a formação do biofilme; Verificar a ação dos compostos sobre o biofilme
maduro; Investigar a presença de genes de adesinas e o efeito dos produtos naturais sobre a
sua expressão.
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· Identificação e caracterização do problema: Descrever a importância do problema e as

propostas de solução, com base em literatura pertinente.
Staphylococcus intermedius é uma bactéria Gram-positiva, anaeróbica facultativa, catalase e
coagulase positivas pertencente ao gênero Staphylococcus. Por muito tempo, foi identificada
como Staphylococcus aureus pela semelhança fenotípica e similaridades de resultados em
testes bioquímicos. Passou a ser considerada S. intermedius em 1976, a partir da utilização de
testes bioquímicos mais refinados que mostraram características distintas dos demais
Staphylococcus coagulase-positiva. São bactérias residentes da microbiota normal da pele e
mucosa de diversos animais, como cães, cavalos, gatos, pombos e algumas espécies de
mustelídeos (HAJEK, 2009; SASAKI et al., 2007).
É provável que os casos de infecção invasiva por S. intermedius sejam subestimados, uma vez
que é possível uma “falsa”-identificação como S. aureus por testes bioquímicos e/ou
moleculares pouco específicos (WANG; NEILAN; KLOMPAS, 2013). A descoberta de S.
pseudintermedius por Devriese e colaboradores (2005) por meio do uso de técnicas
moleculares modernas estimulou uma nova reclassificação dos isolados anteriormente
classificados como S. intermedius.
Atualmente S. intermedius é um grupo composto por três espécies bacterianas (SIG –
Staphylococcus intermedius Group): S. intermedius, S. pseudintermedius e S. delphini. Além
disso, sabe-se que S. intermedius não é o principal agente etiológico de infecções em animais
de companhia, sendo predominante o isolamento de S. pseudintermedius. Sendo assim,
recomenda-se que os isolados caninos de S. intermedius, identificados apenas por testes
fenotípicos, sejam reclassificados como S. pseudintermedius, tornando incerta a relevância
desse microrganismo no desenvolvimento de infecções caninas e humanas (BOND et al.,
2012). (DEVRIESE et al., 2005; SASAKI et al., 2007; VAN DUIJKEREN et al., 2011).
O uso indiscriminado de antibióticos possibilitou a seleção de S. aureus meticilina-resistentes
(MRSA – Methicillin-resistant S. aureus), provocando grande alarde na comunidade científica e
complicações na terapêutica de infecções em humanos. A aquisição do cassete cromossômico
(SCCmec), que contém o gene mecA que confere resistência contra penicilinas, por S.
pseudintermedius levou à uma emergência drástica de S. pseudintermedius meticilina-
resistentes (MRPS – S. pseudintermedius methicillin-resistant) (BOND et al., 2012). Devido a
esse fato, a clínica veterinária tem grande dificuldade de combater as piodermas e otites
externas caninas, além disso, os longos períodos de tratamento e/ou escolha equivocada do
antibiótico têm intensificado o processo de seleção de cepas resistentes e surgimento de cepas
multirresistentes.
Os fatores de virulência sintetizados pelo SIG são bastante semelhantes com aqueles
produzidos por S. aureus, e são primordialmente mecanismos que auxiliam: a colonização no
organismo, degradação do tecido com absorção dos nutrientes, crescimento populacional e
defesa contra o sistema imune (VAN DUIJKEREN et al., 2011). S. pseudintermedius produz
toxinas e enzimas como proteases, coagulases, enterotoxinas, hemolisinas, termonucleases,
leucotoxinas e toxinas esfoliativas, que são particularmente importantes no desenvolvimento de
pioderma canino. Além disso, S. pseudintermedius também expressa proteínas de superfície
do tipo adesinas, sendo capazes de interagir com fibronectinas, citoqueratinas e fibrinogênio do
epitélio do hospedeiro (FUTAGAWA-SAITO et al., 2004; GEOGHEGAN et al., 2009; VAN
DUIJKEREN et al., 2011). Para mais, a convivência com animais de companhia poder-se-á
facilitar a transferência de MRSP para seres humanos e provocar danos inestimáveis à saúde
pública (MOODLEY; DAMBORG; NIELSEN, 2014; PERRETEN et al., 2010; RUSCHER et al.,
2010; VAN DUIJKEREN et al., 2011; YOON et al., 2010).
As pesquisas mais recorrentes são realizadas a partir de células planctônicas, deixando uma
grande lacuna na literatura sobre o papel do biofilme na sobrevivência e virulência de SIG.
Contudo, há evidência de que S. pseudintermedius seja capaz de formar biofilme,
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apresentando-se como moderadamente e fortemente formadores, como observados em S.

aureus (STEFANETTI et al., 2017).
O biofilme é uma comunidade composta por microrganismos embebidos em uma matriz
extracelular polimérica que facilita o metabolismo, multiplicação e proliferação dos
microrganismos. Inicia-se a partir da capacidade de adesão que a bactéria possui por
superfícies bióticas ou abióticas. A matriz polimérica, contendo elevada gama de carboidratos,
proteínas e DNA extracelular, é produzida ao redor das colônias, promovendo a maturação do
biofilme. Em Staphylococcus epidermidis, uma espécie coagulase-negativa cujo biofilme é
extensivamente estudado, os polissacarídeos de adesão intercelular (PAI) permitem adesão ao
substrato, desenvolvimento e maturação do biofilme. Esses carboidratos representam elevada
porcentagem da biomassa do biofilme e são codificados pelo operon ica, que contém quatro
genes (icaA, icaB, icaC e icaD) além do gene regulatório icaR. Poucos estudos reportam a
expressão desses genes na formação de biofilme por S. pseudintermedius (CRAWFORD et al.,
2016; PROIETTI et al., 2015). A partir do biofilme maduro há a multiplicação e dispersão de
células para a periferia, possibilitando a extensão do biofilme pré-formado e formação de novos
biofilmes (SINGH et al., 2013).

· Metodologia:
4.1 Amostragem e condições de cultivo
Serão utilizados 23 isolados clínicos de Staphylococcus pseudintermedius de infecções caninas
provenientes do Hospital Veterinário da Universidade do Oeste Paulista (Presidente Prudente –
SP). Os microrganismos estão estocados em microtubos eppendorf, contendo meio de cultivo
caldo Tryptic Soy broth (TSB) em 30% (v/v) de glicerol, mantidos à temperatura de -20°C. Os
microrganismos serão cultivados, com agitação, em meio TSB a 37°C, durante 24 horas antes da
realização dos testes.

4.2 Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração

Bactericida Mínima (CBM) sobre células planctônicas
Inicialmente será feito um screening com os 23 isolados. A CIM será obtida segundo
metodologia preconizada pelo Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI – documento
M7-A7). Os produtos naturais serão diluídos seriadamente (1:2) em placa de poliestireno
esterilizada de 96 poços em formato em U, contendo 100 µL de meio de cultivo Mueller-Hinton
broth (MHB). O controle de crescimento conterá 100 µL de meio MHB e 100 µL de inóculo, o
controle de esterilidade conterá apenas 200 µL de MHB. Uma suspensão celular de cada isolado
será preparada em solução salina 0,85% e ajustada à escala 0,5 McFarland através de leitura de
densidade óptica com turbidímetro, em no máximo 15 minutos antes de inoculação em placa.
Um inóculo de 100 µL será adicionado a cada poço teste a fim de que a densidade celular final
seja de 5,0 x 105 unidades formadoras de colônias (UFC)/mL. O valor de CIM será determinado
como sendo a menor concentração capaz de promover inibição visual de 100% do
microrganismo em comparação ao controle de crescimento (inóculo sem tratamento), após 24
horas de incubação a 37°C. Para determinar a CBM, 10 µL dos poços que não apresentarem
crescimento visível serão inoculados em Mueller-Hinton agar (MHA) e as placas serão
incubadas a 37ºC por 24 horas. A CBM será definida como a menor concentração capaz de
promover redução de 100% no crescimento visível de UFC em comparação às bactérias não
tratadas. Os testes serão realizados em duplicata e em mais de uma ocasião.
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4.4 Cinética de crescimento

Três isolados, que exibirem menor valor de CIM, serão utilizados para se avaliar a cinética de
sobrevivência. A curva de sobrevivência dos microrganismos em presença dos produtos naturais
será realizada a partir dos valores de CIM/CBM obtidos nos testes de microdiluição em caldo.
Inóculos com densidade celular de 5 x 105 células/mL serão incubados em placa de poliestireno
de 96 poços com os extratos naturais. Em tempos determinados (0, 2, 4, 8, 12 e 24 horas) um
volume de 20 µL será retirado de cada poço e diluído seriadamente (1:10) em solução salina
0,85%. Uma alíquota de 10 µL de cada diluição será inoculada em MHA. Após 24 horas de
incubação, a 37°C, será contado o número de UFC para os isolados. Os testes serão feitos em
duplicada e a metodologia em mais de uma ocasião.

4.5 Ação sobre a formação do biofilme

Para verificar se os produtos naturais possuem efeito antibiofilme sobre S. pseudintermedius 20
µL de cada isolado, previamente ajustada à densidade celular 0,5 McFarland, serão inoculados
em placa de 96 poços de fundo chato contendo 180 µL de MHB com diferentes concentrações
dos produtos. O controle de esterilidade conterá apenas meio MHB e o controle de crescimento
meio MHB e células sésseis não tratadas. A placa será incubada por 24 horas para a formação e
desenvolvimento do biofilme. A viabilidade metabólica das células sésseis será verificada através
do ensaio de redução do XTT (2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-
Carboxanilide). Preparar-se-á uma solução de 0,5 mg/mL de XTT (Sigma) em PBS e 0,1mM de
menadiona. Uma alíquota de 200 µL dessa solução será transferida para cada poço da
microplaca. A placa será incubada no escuro a 37°C por 3 horas e após, será feita leitura de
densidade óptica no comprimento de onda de 490 nm em leitora de placas (Synergy HT, Biotek).
A interferência de fundo será eliminada subtraindo-se os valores de absorbância do controle de
crescimento pelos valores do teste. O teste será feito em quadruplicata e em duas ocasiões
diferentes.

4.6 Ação sobre o biofilme formado

Para avaliar a o efeito dos produtos naturais sobre os biofilmes maduros, estes serão previamente
formados em placas de poliestireno de 96 poços de fundo chato contendo meio TSB acrescido de
glicose, como descrito por Stepanovic et al. (2007). Após 24 horas o meio será retirado e os
poços serão lavados com PBS para retirada das células planctônicas. Uma alíquota de 200 µL de
meio TSB contendo diferentes concentrações dos produtos será adicionada em cada poço e as
placas serão incubadas por mais 24 horas a 37 ºC. Seis poços de cada placa contendo apenas 200
µL de meio TSB acrescido de glicose (1% m/v) serão usados como controle de esterilidade. O
controle de crescimento conterá TSB acrescido de glicose (1% m/v) e inóculo. A viabilidade
celular será mensurada através do ensaio de redução do XTT, como descrito anteriormente. A
CIM para as células sésseis será a menor concentração da substância capaz de inibir 50% e 90%
(SCIM50 e SCIM90) das células quando comparadas com o controle não tratado. Os testes serão
realizados em quadruplicata e em duas ocasiões.
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4.7 Análise molecular de adesinas

4.7.1. Extração de DNA

Para analisar a presença do operon ica será extraído o ácido desoxirribonucléico (DNA) dos
isolados clínicos segundo metodologia proposta por Ausubel e colaboradores (1999).
Resumidamente, cada isolado será semeado em 3 mL de TSB e a cultura será incubada a 37°C
por 24 horas. Um volume de 1,5 mL da cultura será transferido para microtubo eppendorf, esse
será centrifugado por 3 minutos a 5.000 rotações por minuto (rpm) para obtenção de um
sedimento de células. O sedimento será ressuspendido em 500 µL de solução tampão TENTS e
400 µL de fenol saturado será adicionado. Duas pérolas de vidro serão adicionadas ao microtubo
e a suspensão será homogeneizada em vortex (por 3 minutos). O microtubo será centrifugado por
10 minutos a 13.000 rpm. Um volume de 400 µL da fase aquosa será recolhida e purificada com
300 µL de solução contendo fenol, clorofórmio e álcool isoamílico (na proporção 25:24:1). Após
homogeneização por inversão o microtubo será novamente centrifugado a 13.000 rpm por 10
minutos. A fase aquosa (300 µL) será recuperada e serão adicionados 2,5 volumes de etanol
absoluto gelado, e o sistema será incubado no gelo por no mínimo 2 horas. O DNA em solução
será precipitado após centrifugação por 10 minutos a 13.000 rpm. O sedimento será lavado com
1mL de etanol 70% (v/v) e após seco, o DNA será ressuspendido em 30 µL de água ultrapura.

4.7.2. Amplificação in vitro

Para verificar a presença dos genes de interesse, a amplificação será realizada por meio da reação
em cadeia da polimerase convencional (PCR), utilizando os iniciadores e metodologia descritos
por Campbell et al. (2008). As condições da reação serão: 95°C por 5 minutos para desnaturação,
seguido de 35 ciclos de 1 minuto a 95°C, 1 minuto a 60°C e 1 minuto a 72°C, seguido de uma
extensão final de 10 minutos a 72°C, finalizando a 4°C. Os produtos de PCR serão analisados
por eletroforese em gel de agarose (1,5%).

4.7.3. Extração de RNA

Para analisar o efeito dos produtos naturais sobre a expressão de adesinas, células planctônicas
dos isolados serão incubadas em presença de 0,25xMIC, 0,5xMIC, MIC por tempo determinado
de acordo com a cinética de morte. O RNA das células tratadas e não tratadas será extraído
utilizando-se o RNeasy mini kit (Qiagen) segundo recomendações do fabricante e a quantidade
será determinada por espectrofotometria.

4.7.4. Análise da expressão de adesinas

O RNA extraído no item anterior será utilizado como molde para a confecção de cDNA por
incubação com o iniciador antisenso e M-MLV reverse transcriptase (Invitrogen, USA). O ensaio
de quantificação será realizado em termociclador Rotor-Gene Q 5Plex HRM platform (Qiagen,
Paises Baixos) utilizando-se 2x High-Resolution Melt (HRM) PCR Master Mix (Qiagen) como
sistema de detecção. As condições ótimas de amplificação serão padronizadas previamente em
ensaios de Standard-PCR, em termociclador Applied Biosystems® Veriti® Thermal Cycler (Life
Technologies, Reino Unido). Os valores de Ct (Cycle Threshold) obtidos serão utilizados para
determinar os níveis de expressão, utilizando a ferramenta REST software 2009 (Qiagen, Paises
Baixos). O gene que codifica para subunidade B da DNA girase (gyrB) será utilizado como
normalizador. A análise da expressão será avaliada por quantificação relativa, utilizando células
planctônicas não tratadas como referência.
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4.8 Análise estatística

As análises estatísticas serão realizadas pelo software GRAPHPAD PRISM versão 5.0
(GRAPHPAD Software, San Diego, CA). Para o teste de sensibilidade das substâncias sobre o
biofilme, os valores médios serão testados por análise de variância simples (ANOVA One Way).
Valores de p < 0,05 serão considerados significativos.

· Local (is) de realização / Órgão(s) envolvido(s): Laboratório de Biologia Molecular de

Microrganismos / Departamento de Microbiologia

· Cronograma de Atividades:

Meses (2019 – 2020)

Atividade A S O N F M A M J J A S
Manutenção dos X X X X X X X X X X X X
isolados
Determinação da CIM X X X X
para células
planctônicas
Avaliação da X
citotoxicidade sobre
células mamíferas
Análise sobre a X X X
cinética de
crescimento
Ação sobre a formação X X X
do biofilme
Ação sobre o biofilme X X X
maduro
Análise dos resultados X X X X X X X X
Dissertação do X X
relatório final

· Resultados esperados: Este projeto permitirá avaliar a possível ação antimicrobiana de

diversos compostos naturais que são rotineiramente utilizados na medicina popular, de forma a
contribuir na terapêutica de infecções causadas por microrganismos patogênicos. Se
confirmado o efeito antimicrobiano dos compostos, esses poderão ser mais acessíveis às
populações de baixa renda, que não possuem acesso aos antimicrobianos convencionais
utilizados no tratamento de infecções bacterianas. Por serem de origem natural, os extratos
são mais facilmente obtidos do que os fármacos sintéticos, necessitando de menos tempo e
menor aparato tecnológico para sua extração, purificação e formulação. Os novos
antimicrobianos podem apresentar menos efeitos colaterais e menor toxicidade para células
humanas, contribuindo com a diminuição da seleção de cepas resistentes que a prática clínica
enfrenta.
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· Referências bibliográficas: Listar as principais referências bibliográficas, de acordo com as

normas da ABNT.
BOND, R. et al. What ’ s happened to Staphylococcus intermedius ? Taxonomic revision and
emergence of multi-drug resistance. v. 53, n. March, 2012.
DEVRIESE, L. A. et al. Staphylococcus pseudintermedius sp. nov., a coagulase-positive
species from animals. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,
v. 55, n. 4, p. 1569–1573, 2005.
FUTAGAWA-SAITO, K. et al. Prevalence and characterization of leukotoxin-producing
Staphylococcus intermedius in isolates from dogs and pigeons. Journal of Clinical
Microbiology, v. 42, n. 11, p. 5324–5326, 2004.
GEOGHEGAN, J. A. et al. Staphylococcus pseudintermedius expresses surface proteins that
closely resemble those from Staphylococcus aureus. Veterinary Microbiology, v. 138, n. 3–4,
p. 345–352, 2009.
HAJEK, V. Staphylococcus intermedius, a New Species Isolated from Animals. International
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MOODLEY, A.; DAMBORG, P.; NIELSEN, S. S. Antimicrobial resistance in methicillin
susceptible and methicillin resistant Staphylococcus pseudintermedius of canine origin:
Literature review from 1980 to 2013. Veterinary Microbiology, v. 171, n. 3–4, p. 337–341,
2014.
PERRETEN, V. et al. Clonal spread of methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius in
Europe and North America: An international multicentre study. Journal of Antimicrobial
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RUSCHER, C. et al. Widespread rapid emergence of a distinct methicillin- and multidrug-
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SASAKI, T. et al. Reclassification of phenotypically identified Staphylococcus intermedius
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VAN DUIJKEREN, E. et al. Review on methicillin-resistant Staphylococcus pseudintermedius.
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WANG, N.; NEILAN, A. M.; KLOMPAS, M. Staphylococcus intermedius infections: Case report
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YOON, J. W. et al. Antibiotic resistance profiles of Staphylococcus pseudintermedius isolates
from canine patients in Korea. Journal of microbiology and biotechnology, v. 20, n. 12, p.
1764–8, 2010.

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· Formato da página: Tamanho A4, margem esquerda com 2,5 cm e as demais com 2 cm.
· Fonte: Arial, tamanho 11.
· Parágrafo: Simples, justificado.
· Formato eletrônico: nome do documento.pdf