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BIOTECNOLOGIA VEGETAL I
Universidade de Évora
2002
Micropropagação
!Introdução
!Multiplicação conforme
!Etapas
!Automatização
!Dupla fase
!Robotização
!Bioreactores
A Micropropagation é a propagação fiel de um genótipo
seleccionado por meio das técnicas da cultura in vitro.
Geralmente a micropropagação é também associada com a
produção em grande escala a preços competitivos.
O Prof. Murashige (Univ. de California, Riverside) definiu 3 fases
principais na multiplicação in vitro de plantas, tanto para os
laboratórios comerciais como para os de investigação.
Estas fases descrevem passos a seguir no processo, como
assim também momentos na cultura nos quais as necessidades
do ambiente da cultura devem ser modificados.
A figura seguinte representa um esquema das diferentes fases
do processo de micropropagação como proposto por Deberg e
Maene (1981).
Fase 2: multiplicação
"Fase 0
"Fase 1
"Fase 2
"Fase 3
"Fase 4
Fase 0. Preparação das plantas mãe
1. Plantas saudáveis
2. Evitar rega excessiva das plantas mães
3. Induzir crescimento vigoroso nas plantas
mães
Fase 0. Foi originalmente concebido
para melhorar as condições higiénicas
das plantas mãe.. Prévio ao inicio da
cultura deverá prestar-se uma atenção
especial da planta da qual serão
retirado/s o/s explants. As plantas
mães poderão ser previamente
tratadas com hormonas,
desinfectantes, fazer testes de viroses,
etc. todo em vista ao êxito da cultura in
vitro.
A desinfecção do material vegetal é
essencial nesta fase. O crescimento, a
morfogénese e as taxas de
crescimento e propagação da cultura
dependerão do tratamento prévio da
planta mãe.
Fase O
Possíveis pre-tatamentos
Injecção de
citocininas
Enxertia em
cascada
Fase1: Estabelecimento da cultura
1. Selecção do explant
2. Desinfecção superficial
3. Meio de cultura
4. Acastanhamento do meio
5. Consistência do meio
6. Condições ambientais
Objectivos
#Dar início á cultura
#Em princípio o método usado deve ser
reproduzível
Deve existir um compromisso entre uma adequada
desinfecção do material vegetal e uma boa taxa de
sobrevivência dos explants não contaminados.
Procedimento
Frequentemente para o início da cultura são usados
gomos axilares ou meristemas. Em certos casos são
usados outras partes da planta. Ex. Sendo difícil
obter gomos axilares não contaminados em Ficus
lyrata e Anthurium spp. Gomos adventícios são
primeiramente obtidos sobre folhas, os rebentos
assim obtidos são então seccionados para ser os
explants iniciais da fase 2.
É recomendável não iniciar a propagação durante a
fase de iniciação.
Plantas mãe São retirados São retiradas as folhas Lavar com 80% etanol,
com rega ramos jovens. ficando os pecíolos desinfectar em lexivia
gota -a gota Cortar os ápices e nas secções cortadas. comercial 10% (NaOCl)
as bases dos por 15 minutos
ramos
Transladar os tubos
Colocação de um nó para a sala de
em um tubo de ensaio. cultura
Fase 2. Multiplicação
O objectivo desta fase é a multiplicação propriamente dita dos
órgãos e estruturas que são capazes de dar origem a plantas
completas. De acordo com os métodos de propagação que sejam
empregues estas estruturas poderão ser: rebentos axilares ou
adventícios, embriões o órgãos em miniatura como
microtubérculos, cormos, etc.
Em alguns programas de micropropagação este estado inclui
uma indução prévia de centros ou zonas meristemáticas a partir
da qual se desenvolverão os órgãos adventícios.
Os rebentos produzidos na fase 2 são considerados como
propágulos pois podem ser propagados ou multiplicados para
aumentar o seu número em sucessivas subculturas.
A- O explant é
constituído de um
fragmento de órgão, de
uma porção de tecido ou
mesmo de células
isoladas (grãos de
pólen, protoplastos, etc.
B- Os rebentos são neo-
formados (formados de
novo) a partir de células
do explant inicial.
C- Estes rebentos
desenvolvem-se em
caules, geralmente
sobre um meio de
alongamento
D- As células do explant
inicial dividem-se
rapidamente e formam,
de maneira
desorganizada, um calo
primário ligado ao
E- O calo primário pode ser subcultivado explant de partida
em meio sólido para crescimento do calo
F- O calo forma rebentos sob um meio de indução apropriado
G- Todos os ramos obtidos são transferidos para um meio neutro ou
enriquecido em auxinas que provocam o posterior enraizamento.
A conformidade do material das plantas obtidas por este método, não
pode ser garantida.
Multiplicação Vegetativa por
gomos (rebentos) Axilares.
A- O explant pode
conter um meristema
isolado, um gomo
terminal ou axilar, uma
extremidade de um
ramo, um fragmento de
ramo que possua pelo
menos 1 gomo axilar
B- Num meio com
citocininas o meristema
cresce, o gomo
desenvolve-se em um
ramo folhoso
C- Este ramo pode ser
cortado em fragmentos
(nós que permanecem
sobre o mesmo meio
dando novos ramos
folhosos
D- Se o explant inicial é depositado num meio rico em citocininas, os
gomos desenvolvem-se dando um ramo folhoso que se ramifica ele
próprio dando ramos secundários e posteriormente terciários, e assim
sucessivamente
E- Os tufos de rebentos são fragmentados e a multiplicação realiza-se
nesta fase
F- Os rebentos são transferidos para meio de alongamento para preparar
os mesmos para a fase de enraizamento
G- Os ramos podem ser agora transferidos par um meio neutro
(S/hormonas) ou com auxinas para enraizarem.
A taxa de multiplicação pode variar entre 2 a mais de 20 por mês.
Fase 2
Multiplicação
Taxa de
Multiplicação
A Fig. 1. Teoricamente o
numero de plantas que
podem ser produzidas
em 1 ano quando a
taxa de multiplicação é
de 2 (A) ou 4 (B) por
mes.
A embriogénese
somática aparece a
maior parte das vezes
em suspensões
celulares, ocasional-
mente sobre calos, e
mais raramente
directamente sobre
órgãos
A- O explant de partida
pode ser um fragmento
de órgão, de tecido, ou
células isoladas.
B- Forma-se um calo
primário (em órgãos) ou
um micro calo (em
células isoladas).
C- Subcultura de calo
primário ou de micro-
calos
Fase 3: Enraizamento
Os rebentos ou plântulas derivadas da fase 2, são muito
pequenas e incompletas, não sendo possível a sua
transferência directa para o solo ou outro substrato, pelo
que nesta fase, são seguidos certos procedimentos para
que estas pequenas plantas desenvolvam a sua
capacidade fotossintética e sejam capazes de sobreviver
em condições naturais sem a adição artificial de
carbohidratos.
Fase 4: Aclimatação
Factores ambientais
Humidade relativa
Luz
Enfermidades patogénicas
Factores da Planta
Morfologia estomática
Funcionamento estomático
Dormência
Formação da cera epi-cuticular
Capacidade fotossintética
Fase 4: aclimatação
(cont.)
Fase 2 cultura
transferidas para 22.4 ± 0.139 ±
23.3 ± 5.5 0.174
meio fresco no 5.5 0.013
início da Fase 3
Fase 2 cultura na
qual foi adicionado 51.4 ± 0.191 ± 0.269
28.0 ± 1.6
meio fresco na Fase 6.9 0.022
3
Vantagens da Micropropaga!"o
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TM filter
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