O que é Cromatografia??

MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS

Profa. Lucia Regina R. Martins

O que é Cromatografia??
A cromatografia é um método físico-químico de
separação dos componentes de uma mistura.
Está fundamentada na migração diferencial dos
componentes de uma mistura, que ocorre devido a
diferentes interações, entre duas fases imiscíveis:
a fase móvel (FM) e a fase estacionária (FE).
Cromatografia: definição
International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) - “Técnica
usada para a separação dos componentes de uma amostra, os quais
se distribuem entre duas fases, uma estacionária e a outra móvel”.
FASE ESTACIONÁRIA Sólido ou líquido
FASE MÓVEL Líquida, gasosa, fluido supercrítico
Passagem da fase móvel componentes distribuídos e retidos
seletivamente pela fase estacionária
MIGRAÇÕES DIFERENCIAIS
CROMATOGRAFIA Princípio básico CROMATOGRAFIA Princípio básico
Separação de misturas por interação diferencial: Separação de misturas por interação diferencial:
• maior interação com a FE = maior retenção • maior interação com a FE = maior retenção
• menor interação com a FE = eluição mais rápida • menor interação com a FE = eluição mais rápida

FASE MÓVEL

FASE ESTACIONÁRIA

os componentes da mistura são separados em bandas.

AFINIDADE ⇒ SEPARAÇÃO (migração diferencial)

Por que a Cromatografia é importante?

Permite: SEPARAR
IDENTIFICAR
QUANTIFICAR

... diversas espécies químicas...

associada a outras técnicas instrumentais de análise:

Ex.: espectrofotometria, espectrometria de massas,...
 PRINCIPAIS FATOS HISTÓRICOS PRINCIPAIS FATOS HISTÓRICOS
Primeira publicação
em fase gasosa
Martin e Synge Mikhael Semenovich Tswett
Separação de pigmentos;
1952 (Prêmio Nobel) nascido em Asti (Itália) a 14 de Maio de 1872, sendo a família
proposição do termo
cromatografia Cromatografia em papel Equipamentos CG originária da Rússia.
Mikhael Tswett Izmailov e Shraiber comerciais
1903-1906 1938 1955
É considerado o pai da
1897-1903 1930 1941 1958 cromatografia moderna,
David T. Day Kuhn e Lederer Martin e Synge Golay: colunas através dos vários trabalhos
Separação de Cromatografia Particição em capilares em CG
experimentais que efetuou.
HC do em coluna: cromatografia
petróleo Xantofilas de gema líquida; Princípios
de ovo de fase gasosa

M.TSWEET (1906): Separação de misturas de

pigmentos vegetais em colunas recheadas com
adsorvente sólido (F.E.) e solvente (F.M.).

éter de CLASSIFICAÇÃO DAS

petróleo
mistura de
pigmentos
TÉCNICAS
CaCO3 pigmentos CROMATOGRÁFICAS
separados

Cromatografia =
kroma [cor] + graph [escrever] (Grego)
 CLASSIFICAÇÃO DAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
CLASSIFICAÇÃO DAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
Técnica Planar
Critérios: suporte físico, estado físico das fases móveis e estacionárias

Cromatografia Líquido
Fase móvel
(FM)

Suporte Planar Em Coluna Fase estacionária Líquido Sólido Fase

ligada
(FE)

Tipo de
Fluido CP CCD CCD
Fase móvel Líquido Gás Líquido Cromatografia
Supercrítico*
CP = cromatografia em papel
CCD = cromatografia em camada delgada
*Fluido Supercrítico: vapor pressurizado, em temperatura e pressão acima de seu ponto crítico

Cromatografia em papel
CLASSIFICAÇÃO DAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

Critérios: suporte físico, estado físico das fases móveis e estacionárias

Cromatografia

Cromatografia em camada delgada

Suporte Planar Em Coluna

Fase móvel Líquido Gás Fluido Líquido

Supercrítico*

*Fluido Supercrítico: vapor pressurizado, em temperatura e pressão acima de seu ponto crítico
CLASSIFICAÇÃO DAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS CLASSIFICAÇÃO DAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

Técnica Em Coluna Cromatografia em coluna:

• de acordo com o diâmetro interno e objetivo da separação:

FM Gás Fluido Líquido - preparativa (6-50 mm)
Supercrítico
- analítica (2-6 mm)
FE Líquido Sólido Fase Fase
Sólido Ligada Líquido Sólido Fase - microdiâmetro (1-2 mm)
Ligada Ligada
- capilar (<1 mm)
TC CGL CGS CGFL CSS CSFL CLL CE
CLS • Pressão:
- clássica (sob pressão atmosférica, colunas de vidro)
CLFL CTI CB
CLL = cromatografia líquido-líquido
- média pressão
CLS = cromatografia líquido-sólido - alta pressão
CE = cromatografia por exclusão
CLFL = cromatografia líquida com fase quimicamente ligada
CTI = cromatografia por troca iônica ... há outros critérios
CB = cromatografia por bioafinidade

Cromatografia em coluna - CL Cromatografia em coluna - CG

Coluna aberta CLAE - HPLC

 CLASSIFICAÇÃO DAS TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
Tipos básicos de colunas:

- Colunas empacotadas ou “recheadas”: preenchida com partículas de
suporte que contém a FE
- Colunas tubulares abertas (típicas de CGAR): FE é colocada
diretamente sobre a parede interior da coluna.
Critério: polaridade relativa das fases
- em gasosa: fase móvel é inerte (“gás de arraste”)
- em líquida: Fase Normal (FE > FM)
Fase Reversa (FM > FE)

Critério: mecanismo de separação

processos: - químicos (troca iônica, quiral, afinidade),
- físicos (sorção – adsorção ou
absorção/partição) ou
- mecânicos (exclusão por tamanho
molecular)

Mecanismos de separação
1. Processos físicos: forças de atrações dipolares, formação de
ligação de H.

- adsorção: FE sólida com grupos ativos na superfície (ex.: sílica,

MECANISMOS DE SEPARAÇÃO alumina); ocorre na interface com FM; dessorção por volatilidade
(CG) ou solubilidade na FM (CL e CFS); é o processo mais
comum em CCD, CGS, CLS, CSS

CCD (camada delgada), CGS (gás-sólido), CLS (líquido-sólido), CSS (supercrítica com FE sólida)
 Mecanismos de separação Mecanismos de separação
1. Processos físicos: Com fases estacionárias quimicamente ligadas:
- absorção (partição): FE líquida e espalhada na mistura de partição e adsorção
superfície de um suporte sólido e inerte (ou paredes do
tubo cromatográfico); processo intrafacial; baseia-se na
solubilidade dos compostos da amostra na FE; o retorno à
FM depende da volatilidade (CG) ou solubilidade na FM;
ocorre na CP, CGL, CLL.

CP = cromatografia em papel; CGL = cromatografia gás-líquido

CLL = cromatografia líquido-líquido

Mecanismos de separação Mecanismos de separação

2. Processos químicos: 2. Processos químicos:

- troca iônica: FE contém grupos funcionais ionizáveis
(trocadores de íons – catiônico ou aniônico), FM consiste em
solução iônica compatível (propriedades tamponantes) que
promove a eluição dos compostos da amostra por substituição
ou deslocamento.
- afinidade (bioafinidade): FE contém grupos químicos com
especificidade biológica quimicamente ligados ao suporte (ex.:
antígenos, enzimas), retiram da FM somentes as substâncias
complementares da amostra; a eluição ocorre por modificação
de propriedades da fase móvel ou por deslocamento.
 Mecanismos de separação
3. Processo mecânico:
- exclusão por tamanho molecular: FE tem composição
inerte, com partículas de forma, tamanho e porosidade
uniformes; moléculas grandes são excluídas dos poros e eluem Acompanhamento da separação cromatográfica
com a FM intersticial, moléculas menores penetram facilmente
nos poros e eluem com velocidades variáveis.

Acompanhamento da separação cromatográfica

Exemplo de cromatografia em camada delgada:
análise visual, luz UV, reveladores
Visualização ou detecção de bandas: manchas na superfície
 Cromatografia em coluna: coleta de frações
Cromatografia em coluna: coleta de frações

Cromatografia em coluna: uso de detectores

Cromatografia em coluna: coleta de frações
Cromatografia líquida em coluna: uso de detectores ANÁLISE CROMATOGRÁFICA

Separação em coluna
A resposta do detector é
traduzida em um gráfico, ou
CROMATOGRAMA, que
relaciona o seu sinal com o
tempo necessário para a eluição
de cada componente.

Eluição típica em cromatografia líquida