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Instituto biomédico
Departamento de Microbiologia e Parasitologia
Bacteriologia
Nutrição
2007
Universidade Federal Fluminense
Instituto biomédico
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Apresentação
Lembre-se, qualquer dúvida, não hesite em perguntar ao seu professor ou aos monitores!
Os autores.
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Índice
Bibliografia ........................................................................................................................ 80
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É importante que falemos brevemente obre como devemos nos portar dentro de um
laboratório de microbiologia em geral, não importando se o microorganismo estudado será uma
bactéria, um fungo ou um vírus.
Cuidados fundamentais
Alguns experimentos que nós realizaremos podem ser perigosos se você manipular os
materiais impropriamente ou executar os procedimentos incorretamente.
São necessárias algumas medidas de segurança quando se trabalha com
microorganismos e substâncias químicas, além de vidros, banhos-maria ferventes, instrumentos
cortantes e outros materiais.
Se você tiver qualquer problema com materiais ou procedimentos, não hesite em chamar o
professor ou o monitor para te auxiliar.
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2 – Antes de entrar no laboratório, retire casacos, jaquetas, etc. Estes itens devem ser deixados
em uma prateleira com sua bolsa ou mochila, papéis e outros itens que não serão utilizados na
aula prática.
3 – Para entrar no laboratório, todos os estudantes devem estar usando seu jaleco, de preferência
limpo e branco.
4 – No início e no final de cada aula prática, os alunos devem limpar e desinfetar a sua bancada
com uma solução desinfetante própria. Este espaço deve ser mantido limpo e arrumado durante o
decorrer de toda a aula prática.
6 – Lembre-se de trazer uma caneta que escreva em vidro (caneta para retro, cd, marcador, etc.)
7 – Anote todos os detalhes da aula prática e faça os exercícios de fixação de cada assunto.
9 – Se respingar cultura em suas mucosas (boca, olhos) ou qualquer tipo de acidente ocorrer,
chame o professor ou monitor imediatamente. Limpe o local com papel toalha e ponha
desinfetante sobre o local (superfícies inanimadas) por 15 minutos, retirando com papel toalha.
10 – Avise ao professor ou monitor sobre qualquer acidente (corte, queimadura) que ocorra.
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Em primeiro lugar é essencial que você conheça as partes ópticas e mecânicas dos microscópios:
- Mantenha o microscópio livre de poeira, vapores ácidos e do contato com reagentes. Para
mantê-lo seco, cubra com capa de flanela, pois evita o pó e a multiplicação de fungos (Obs: as
capas devem ser lavadas periodicamente).
- Na remoção do equipamento, segure-o firmemente com uma das mãos no braço e outra na
base, ou com as duas no braço, a depender do modelo. Coloque-o bem apoiado sobre a mesa de
trabalho de superfície plana, evitando qualquer movimentação brusca. Nunca desloque o
aparelho com a lâmpada acesa ou logo após ter sido apagada.
- Muita atenção é necessária quando se observa a preparação em meio líquido, pois há sempre o
risco de molhar a lente frontal da objetiva; portanto o conselho é retirar o excesso de líquido com
papel de filtro, antes de colocar a lâmina sobre a platina; em de acidente, enxugar
imediatamente com papel absorvente macio.
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- Na observação de uma preparação, inicie sempre pela objetiva de menor aumento; para
focalizar com aquelas de 20 ou 40 vezes, proceda da seguinte forma:
à Escolha uma estrutura na preparação, mova a lâmina até que o objeto fique exatamente
no centro do campo, em seguida mude para a objetiva de maior aumento, olhando por fora para
evitar o choque com a lamínula.
à Olhar pela ocular e abaixar o tubo ou elevar a platina com o macrométrico muito
lentamente; assim que a imagem aparecer, mesmo confusa, parar e completar a focalização com
o micrométrico.
à O uso da objetiva de imersão é mais delicado, pois a distância focal entre a face da
objetiva e a parte superior da lamínula, diminui quando a ampliação é aumentada.
à Em primeiro lugar, assegure-se da existência de algo no campo, posicionando a objetiva
de menor aumento.
à Certifique-se que a iluminação e o objeto estão bem centrados, suspenda o tubo e
coloque uma gota de óleo no centro da operação; o óleo deve ter o mesmo índice de refração da
objetiva;
à Abaixe o tubo até colocar a lente frontal em contato com a gota de óleo ainda convexa,
até a mudança de forma da mesma; suspenda levemente o tubo, mas sem perda de contato com
a gota, coloque os olhos nas oculares e abaixe o tubo muito lentamente; assim que a imagem
aparecer, complete a focalização com o micrométrico.
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Introdução
O estudo de bactérias exige o prévio isolamento e identificação, para tanto, são utilizados
diversos meios de cultura diferentes.
Meio de cultura é uma mistura de nutrientes que possibilitam o crescimento in vitro de
microorganismos.
A maioria das bactérias cresce em meios de cultura. As exceções são as ricketsias,
clamídias, Mycobacterium leprae e Treponema, que são parasitos intracelulares obrigatórios.
Neste caso, estes microorganismos podem ser cultivados em culturas de células e ovos
embrionados.
Inoculação é a contaminação proposital de um meio de cultura, ou seja, é a transferência
de um determinado número de microorganismos para um meio de cultura a fim de que estes se
desenvolvam e permitam a sua identificação. A inoculação das bactérias em diferentes meios
envolve várias técnicas de semeadura.
Toda a manipulação realizada em laboratório (com meios, cultura e material utilizado)
requer certos cuidados para evitar a contaminação. Esses procedimentos são denominados
técnicas assépticas.
Fundamentação teórica
® Meios de Cultura
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® Técnicas de Semeadura
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è flambar a boca dos frascos e tubos ANTES e DEPOIS das inoculações, evitando a
contaminação da cultura/material a ser analisado e garantindo que somente o microorganismo
desejado será inoculado. (4)
De acordo com as características físicas dos meios de origem e destino, além da finalidade
da inoculação, podem-se utilizar diferentes técnicas de inoculação.
A transferência de inóculo de um meio para outro também é denominada genericamente
como repique.
A seguir, veremos quais são as técnicas de inoculação:
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Objetivos
Material
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Execução da prática
- a partir de um crescimento isolado obtido em placa, pegar uma colônia com auxílio de uma alça
bacteriológica e transferir para o tubo com caldo, através do processo de difusão.
1. Com auxílio de uma alça bacteriológica, transferir o inóculo para o tubo com caldo, através da
técnica de difusão.
2. Com auxílio de uma alça ou agulha bacteriológica, transferir o inóculo para o tubo com Agar
inclinado, através da técnica de estria (sinuosa ou reta).
3. Com auxílio de uma alça bacteriológica, transferir o inóculo para a placa com Agar, através da
técnica de esgotamento em estrias (3 ou 4 estrias).
4. Com auxílio de uma agulha bacteriológica, transferir o inóculo para o tubo com Agar semi-
sólido, através da técnica de picada central.
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- com o auxílio de uma pipeta estéril, transferir 1 ml da amostra de água para uma placa estéril e
adicionar o meio fundido, realizando a técnica do pour plate.
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Exercícios de fixação
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Observações
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Introdução
Fundamentação teórica
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Objetivos
Material
Execução da prática
® Bactérias no ambiente:
- 1 placa com Agar deve ser exposta ao ambiente, fora da área de segurança. Cada grupo deixará
a placa em exposição por um tempo diferente (5 / 10 / 15 / 20 minutos)
- em cada quadrante deve ser inoculado um material diferente, para a verificação de bactérias em
diversas superfícies, de acordo com o diagrama representado a seguir:
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Exercícios de fixação
Observações
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Introdução
Fundamentação teórica
è Assepsia: conjunto de técnicas e/ou medidas assépticas, que visam a não contaminação de
algo (por exemplo, de alimentos durante o preparo)
· Calor
Pode ser utilizado em duas formas: calor seco e calor úmido.
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O calor úmido é mais eficaz que o calor seco, pois a água é melhor condutora de calor quando
comparada com o ar.
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· Radiações
Não ionizantes Luz Ultravioleta
- possui atividade máxima num comprimento de onda de 260 nm
- é desinfetante
- geralmente é utilizado em ambientes
- não é penetrante à desinfecção apenas superficial
- a lâmpada tem vida útil de 200 horas (aproximadamente)
- age no DNA microbiano, gerando mutações letais
Ionizantes Radiação Gama
- é esterilizante
- mais energético que UV, atua num comprimento de onda menor
- age ionizando componentes celulares, levando à morte
- muito utilizado em produtos hospitalares descartáveis
- seu uso nas indústrias de alimentos está crescendo
- possui baixo poder de penetração à desinfecção apenas superficial
· Filtração
Clarificante - retém as impurezas grosseiras
- é desinfetante
Esterilizante - possui poros iguais ou menores que 1 mm, podendo reter, inclusive, alguns vírus.
· Outros
Pressão osmótica Adição de NaCl
- também conhecida como salga
- reduz a atividade de água do alimento, impedindo o metabolismo
microbiano. Também pode causar lise osmótica da célula bacteriana.
- muito utilizada em produtos cárneos (carne seca, pescado)
Adição de outros sólidos (açúcares)
- utilizado na fabricação de compotas e alimentos em calda
- reduz a atividade de água do alimento, impedindo o metabolismo
microbiano
- muito empregado para conservação de frutas e hortaliças
Dessecação - retirada umidade do alimento em maior ou menor grau
- reduz a atividade de água do alimento, impedindo o metabolismo
microbiano
Liofilização - aplicação de dessecação em vácuo (pressão negativa)
- reduz a atividade de água do alimento, impedindo o metabolismo
microbiano
- seu emprego na indústria de alimentos é crescente
Baixas temperaturas Refrigeração
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· Álcool Etílico
É um dos métodos químicos mais empregados para controle microbiano, por seu baixo
custo, relativa eficácia e fácil aplicação. Pode ser usado como desinfetante ou anti-séptico.
Possui maior atividade germicida quando hidratado (60 – 70%), pois nessa condição
possui maior poder penetrante.
O álcool absoluto possui poder bacteriostático, enquanto o álcool hidratado a 70% possui
poder bactericida.
São apontados diversos mecanismos de ação para o etanol:
- ação detergente: solvente de lipídeos
- ação desidratante: retira água das células
- ação desnaturante: agindo sobre proteínas celulares
· Fenóis e Derivados
O fenol é um desinfetante fraco, porém é utilizado como um desinfetante de referência
para ser comparado com outros produtos. Um coeficiente maior que 1 indica que o produto é mais
ativo que o fenol.
Atua como desnaturantes de componentes protéicos
Dentre os cresóis, o mais importante é a creolina, uma mistura de cresóis muito utilizada
para pisos e sanitários.
O hexaclorofeno é muito utilizado na antissepsia cirúrgica.
· Halogênios
Os principais halogênios utilizados no controle microbiano são o Cloro e o Iodo.
è Cloro: É usado como desinfetante de águas, alimentos e pisos. Seu mecanismo de ação é
dado pela reação:
Cl2 + H2O à HCl + HClO
O ácido hipocloroso é instável, se decompondo espontaneamente em HCl + 1/2 O2, que eliminará
os microorganismos através de oxidação de componentes celulares.
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como anti-séptico na prática cirúrgica vem diminuindo, sendo substituído por clorexidine e
similares.
· Detergentes catiônicos
Alteram a permeabilidade da membrana. É mais ativo contra Gram negativos.
Exemplo: compostos quaternários de amônio à cloreto de benzalcônio.
è Mercúrio (Hg): já foi muito utilizado como anti-séptico, mas seu uso está decaindo devido ao
risco de intoxicação por absorção cutânea.
· Ácidos
Tanto os ácidos orgânicos quanto os inorgânicos são muito utilizados na conservação de
alimentos. São mais utilizados os ácidos fracos, e na forma de sal, pois assim apresentam maior
solubilidade.
A atividade antimicrobiológica dos ácidos fracos é atribuída a sua forma não dissociada
(HA), pois esta penetra através da membrana tornando-se ionizada após alcançar o interior da
célula. A concentração intracelular destes ácidos orgânicos altera o funcionamento normal do
gradiente envolvido no sistema de transporte da membrana celular.
A concentração da forma não dissociada do conservante químico no alimento é
determinada pelo pKa (pH n qual 50% da molécula está na forma dissociada) do ácido e do pH do
meio, como mostra a fórmula a seguir:
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· Álcalis
Os principais álcalis utilizados são o NaOH, o KOH e o Ca(OH)2. O NaOH, principalmente,
está presente nos sabões, conferindo-lhes relativa ação anti-séptica.
· Corantes básicos
São mais eficiente contra Gram-positivos.
Exemplo: Cristal Violeta, Azul de Metileno.
· Redutores
Reduzem compostos celulares, levando as células à morte.
Aldeídos e derivados: formaldeído e formalina são utilizados para desinfetar paredes e pisos, mas
causam irritações cutâneas.
· Oxidantes
Oxidam componentes celulares levando à morte das células. São muito utilizados como
desinfetantes.
Exemplo: Ozônio, água oxigenada, permanganato de potássio, peróxido de zinco.
Óxido de etileno (gás): é um agente alquilante, age inativando proteínas e ácidos nucléicos. À
temperatura de 52°C o óxido de etileno passa do estado líquido para o gasoso. Seus vapores são
utilizados para esterilização de materiais de borracha ou plástico.
· Antimicrobianos
Possuem ação seletiva contra microorganismos, ao contrário dos anteriores. São um
método biológico de controle microbiano. Serão abordados num próximo assunto.
Objetivos
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Material
- Culturas bacterianas
- 2 Placas de Petri com Agar
- Soluções anti-sépticas
- Gaze estéril
- Tripé e tela de amianto
- Recipiente com água em ebulição
Execução da prática
® Agentes Químicos
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- dividir uma placa de Petri em 8 partes e semear as culturas bacterianas no espaço respectivo ao
tempo 0
- para os próximos espaços, colocar as culturas em banho-maria fervente até atingir o tempo
especificado:
- 5 minutos à reinocular
- 10 minutos à reinocular
- 20 minutos à reinocular
Exercícios de fixação
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Observações
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Introdução
Colorações simples tornam possível a visualização das bactérias ao microscópio, mas isso
não faz distinção entre organismos de morfologia similar. Para tanto, é necessário realizar uma
coloração diferencial.
Existem diversos métodos de coloração utilizados para a análise de bactérias. Entre estes,
o mais utilizado é a coloração desenvolvida por Christian Gram em 1884. Usando duas
seqüências de coloração, com diferentes corantes, este método permite a divisão das bactérias
em 2 grandes grupos.
O primeiro grupo, que retém a cor do primeiro corante (o cristal violeta), é denominado
Gram positivo.
O segundo grupo perde a cor do primeiro corante e retém a cor do segundo corante
utilizado (fucsina) e é denominado Gram negativo.
Uma solução de iodo (lugol) é utilizada como mordente (um composto químico que fixa um
corante ou outra substância ao se combinar com o mesmo e formar um composto insolúvel) para
a primeira etapa da coloração.
Há também um agente descorante entre a utilização de um e outro corantes. Pode-se
utilizar diferentes descorantes, de acordo com a velocidade de descoloração desejada. O álcool
etílico a 95% é um agente descorante mais devagar, enquanto a acetona agiliza essa etapa.
Geralmente utiliza-se uma mistura de álcool etílico e acetona (95:5), obtendo uma
velocidade de descoloração intermediária.
A maioria dos cocos é Gram positiva com exceção dos gêneros Neisseria e Veillonella que
são os únicos Gram negativos.
Assim também acontece com os bacilos, sendo a maioria Gram negativos. Entre os bacilos
Gram positivos incluem-se aqueles pertencentes aos gêneros Corynebacterium, Listeria, Bacillus,
Lactobacillus e Clostridium. Os víbrios são Gram-negativos.
A investigação das características morfológicas e de coloração (morfo-tintoriais) das
bactérias é etapa inicial de grande importância no isolamento e identificação de bactérias de
material clínico bem como de alimentos. No entanto, a identificação completa de uma bactéria
sempre necessitará de dados fisiológicos ou genéticos da mesma.
Fundamentação teórica
A coloração de Gram baseia-se na diferença das paredes celulares das diversas bactérias
e como estas serão coradas de forma distinta.
As bactérias denominadas Gram negativas possuem uma fina camada de glicoproteína
recoberta por uma espessa camada formada principalmente por lipoproteínas e substâncias
lipídicas. Já as consideradas Gram positivas possuem uma única e espessa camada de
glicoproteína.
Antes de iniciar a coloração, é necessário fazer um esfregaço, ou seja, pegar uma colônia
previamente isolada ou uma alçada de uma cultura pura e transferir para uma lâmina limpa. Se for
utilizada uma colônia, deve-se adicionar uma gota/alçada de solução salina a 0,9%,
homogeneizando-a. É importante que o esfregaço seja bem preparado, para que, ao final da
coloração, seja possível a visualização das bactérias. Também é importante não esquecer de fixar
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o esfregaço na chama do Bico de Bunsen, evitando que a massa de células a ser analisada se
perca durante as etapas da coloração.
Na primeira etapa da coloração, o corante violeta é adicionado sobre o esfregaço. O
corante, então, penetra na parede da bactéria, independente se esta é Gram positiva ou Gram
negativa.
Ao adicionar o lugol, este se combina com o corante Cristal Violeta, formando um grande
complexo, o Cristal Violeta-Iodo (CV-I), fixando o corante na parede a bactéria.
O álcool tem papel fundamental neste método. Ao ser adicionado sobre o esfregaço
corado com o Cristal violeta vai diferenciar as bactérias:
à as Gram positivas, com sua parede rica em complexas cadeias de peptidoglicano serão
desidratadas, e os poros na parede serão reduzidos, impedindo a saída do complexo CV-I e
tornando a parede permanentemente corada de roxo (a cor do complexo CV-I).
à as bactérias Gram negativas possuem uma fina camada de peptidoglicano, mas acima
desta camada encontra-se uma outra, de caráter lipídico (rica em LPS, lipoproteínas e outros
componentes). Essa camada lipídica, em contato com o álcool, dissolve-se, deixando a camada
de peptidoglicano desprotegida e permitindo a saída do complexo CV-I, tornando a célula
descorada neste momento.
É importante lembrar de lavar a lâmina após a etapa de descoloração, pois se restar algum
resíduo de álcool, a próxima etapa não será realizada adequadamente, e os resultados poderão
ser alterados.
O esfregaço então é tratado com fucsina, que não terá efeito algum sobre as células Gram
positivas, que estão com os poros de sua parede reduzidos; mas penetrará na parede das células
Gram negativas, corando-as de vermelho.
Esta coloração é utilizada para a maioria das bactérias, mas há algumas que não se coram
por este método, como as micobactérias, as bactérias espiraladas e as bactérias que não
possuem parede celular. Para estes, há outros métodos de coloração, como o método de Zihel-
Neelsen, o de Fontana-Tribondeau e o método de visualização em campo escuro.
Objetivos
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è relacionar a composição química da parede celular das bactérias com os corantes de Gram;
Material
- Lâminas
- Culturas bacterianas em meio líquido e sólido
- Alças e agulhas
- Bateria da coloração de Gram (corantes cristal de violeta e fucsina, lugol, álcool, água)
- Papel de filtro
- Óleo de cedro (óleo de imersão)
- Microscópio
- Bico de Bunsen
Execução da prática
Etapas Observações
Transferir uma alçada da cultura ou uma colônia Ao fazer o esfregaço a partir de diferentes
da placa para uma lâmina de microscópio limpa. culturas deve-se observar alguns detalhes:
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Passar a lâmina com o esfregaço sobre a chama É importante fixar o esfregaço para que este não
do Bico de Bunsen, até que este esteja se perca durante as etapas de lavagem entre a
completamente seco. utilização de um e outro corantes
® Coloração do esfregaço
A seguir, lavar em água corrente com o A lavagem com água é importante após cada
pissete. etapa para que uma substância utilizada não
interfira na ação da próxima.
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Cobrir o esfregaço com solução de Lugol fraco O Lugol é uma solução de Iodo e funciona como
por cerca de 1 minuto. mordente neta etapa da coloração, ou seja, ele
fixa o corante Cristal Violeta na parede da célula,
pois forma um complexo grande: o CV-I
Novamente lavar com água, e então lavar com O álcool absoluto, ou solução de álcool-acetona,
álcool absoluto até que não saia mais corante funciona como diferenciador da coloração:
da lâmina (10 – 15 segundos). è nas Gram +, o álcool desidrata a matriz
glicoproteica (peptidoglicano), reduzindo os
poros da parede e impedindo a saída do
complexo CV-I, corando a célula de roxo:
Lavar com água corrente em abundância, É importante prestar com bastante atenção nesta
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para que não reste álcool sobre a lâmina. etapa, pois se restar algum álcool na lâmina a
coloração não prosseguirá, já que o próximo
corante não se fixará na lâmina.
Cobrir o esfregaço com fucsina por cerca de A fucsina age de diferentes formas nas
30 segundos. diferentes células:
è nas Gram +, os poros estão reduzidos,
impedindo que a fucsina penetre na parede
celular, não alterando a cor roxa:
Lavar com água e secar suavemente com Após secar suavemente a lâmina, observar ao
papel. microscópio na objetiva de imersão (100x), com
óleo de cedro/mineral e identificar a célula
corada.
Para decorar!!!
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Exercícios de fixação
Observações
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Introdução
Fundamentação teórica
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substâncias nos meios podem influenciar o tamanho do halo de inibição. Para minimizar os riscos
de resultados errôneos, utilizamos o Agar Mueller-Hinton como meio de crescimento, pois este é
um meio padronizado e sem componentes que possam interferir nos resultados. Deve-se ressaltar
que o teste de sensibilidade deve ser realizado com uma cultura pura, devendo-se fazer uma
coloração de Gram antes de qualquer TSA para a confirmação da pureza da cultura.
A base para o julgamento de sensibilidade é o tamanho real do halo de inibição (zona sem
crescimento em volta dos discos de antibiótico). O tamanho do halo sozinho não é uma medida
quantitativa da atividade do antibiótico, assim, é errôneo pensar que quanto maior o halo, mais
potente seja o antibiótico. Por essa razão, comparações diretas dos diâmetros dos halos
produzidos por antibióticos não relacionados são falsos e não devem ser realizados. Deve-se
interpretar a sensibilidade de acordo com os dados obtidos (diâmetro do halo) em comparação
aos dados da tabela de interpretação do antibiograma, com antibacterianos de uso corrente na
terapêutica clínica.
Os antimicrobianos podem ser classificados de acordo com sua ação na célula bacteriana:
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Padrão da 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
escala
MacFarland
Concentração 300 600 900 1.200 1.500 1.800 2.100 2.400 2.700 3.000
aproximada de
microrganismos
(x106/ml)
Objetivos
è citar alguns grupos microbianos aonde o TSA deve ser feito através de outras técnicas.
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Material
- Cultura bacteriana
- Tubo com solução salina estéril
- Swab estéril
- Tubo no 0,5 da escala de Mac Farland
- Pipeta estéril
- Placa de Agar Mueller-Hinton
- 4 discos de antibióticos diferentes
- Pinça
- Régua graduada
Execução da prática
- ajustar a densidade do inóculo acrescentando a cultura à solução salina até esta se igualar à
turvação do tubo 0,5 da escala de Mac Farland (lembrando que o ajuste é feito por turbidez, e não
pela cor que o caldo se apresenta).
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- aguardar um tempo para que o Agar absorva o inóculo (mais ou menos 10 minutos) e, com o
auxílio de uma pinça estéril, colocar os discos de antibióticos sobre o Agar, pressionando
levemente cada disco para que este fique aderido ao meio. Deixar entre eles e deles à borda da
placa um espaço não inferior a 15 mm.
Agar Mueller-Hinton
Composição do Meio (g/L) Observações
Infusão desidratada de carne 300,0 pH do meio: 7,4 ± 0,2
Caseína hidrolisada 17,5 O meio não apresenta nenhum agente seletivo
Amido 1,5 ou inibidor que possa interferir nos resultados
do Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos.
Agar 17,0
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Exercícios de fixação
Observações
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Introdução
Fundamentação teórica
® Staphylococcus
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São inibidos pela presença de corantes do tipo azul de metileno e violeta de genciana.
Crescem em meio de Agar simples, Agar Sangue e Chapman. Suas colônias são redondas,
elevadas, opacas e de coloração amarelo dourado a branca.
A intoxicação por S. aureus é causada quando se ingerem alimentos onde haja a toxina
pré-formada, que só é liberada em concentrações entre 105 a 106 UFC/ g do alimento. Logo, se for
controlada a proliferação do microorganismo não haverá risco de intoxicação. As enterotoxinas
produzidas por S. aureus são proteínas simples, higroscópicas, facilmente solúveis em água e
soluções salinas, resistentes a tripsina, quimiotripsina, renina, papaína e pepsina, e algumas
cepas são resistentes até a vancomicina. São também termorresistentes. É importante observar
esse detalhe, já que a maioria dos alimentos sofre um tratamento térmico durante o
processamento, mas se já houver a toxina formada no alimento, esta não será inativada.
Como já foi dito, mecanismo de prevenção deve ser feito no sentido de evitar a proliferação
do microorganismo para a não formação das enterotoxinas, o que pode ser feito através da
manutenção dos alimentos sob refrigeração, ou manter os alimentos a uma temperatura ≥ 60ºC
pós-preparo.
As principais provas para identificação das principais espécies de Staphylococcus estão
descritas na tabela a seguir:
® Streptococcus
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pressão osmótica (até 6,5 % de NaCl). São membros da microbiota normal do trato gastrintestinal
de diversas pessoas.
O gênero Streptococcus é composto de bactérias anaeróbias facultativas, com maior
crescimento em atmosfera com 10% de CO2.
Possuem atividade hemolítica, fator importante para a classificação das cepas patogênicas
em a (hemólise parcial), b (hemólise total) e g (anemolítico).
Os estreptococos a hemolíticos apresentam zonas de hemólise, possuindo hemácias
íntegras na parte mais interna junto a colônia, e hemólise maior na parte mais externa.
Freqüentemente, aparece uma coloração esverdeada na área de hemólise (devido a alteração da
hemoglobina pelo sistema oxi-redutor da célula bacteriana e conseqüente liberação de biliverdina
e bilirrubina), que originou a qualificação "estreptococos do grupo esverdescente" ou
Streptococcus viridans. Os Streptococcus pneumoniae, principais agentes bacterianos de
pneumonia, apresentam hemólise a, uma colônia puntiforme com um aprofundamento no ápice da
colônia (parecendo um pequeno vulcão).
Os estreptococos b hemolíticos produzem uma zona de hemólise total, não se observando
hemácias íntegras (microscópio óptico com objetiva de 10x). O Streptococcus pyogenes
apresenta dois tipos de hemolisinas O e S. A hemolisina O é destruída pela ação do oxigênio
atmosférico e, portanto, só demonstrada em colônias crescidas em profundidade no Agar sangue.
A hemolisina S é estável ao oxigênio do ar e produz hemólise mesmo nas colônias
crescidas na superfície do meio de cultura. Como cerca de 15% dos Streptococcus apresentam
hemolisina O, se torna necessária a semeadura do germe pela técnica em profundidade ("pour-
plate") , ou a realização de perfurações ("stabs") nos quadrantes de esgotamento ou a incubação
em atmosfera pobre em oxigênio (técnica da jarra com vela).
Os estreptococos g não produzem hemólise, são anemolíticos, isso significa que não têm
capacidade lítica nenhuma sobre as hemácias. Muitas das espécies saprófitas são deste grupo.
Para o isolamento pode-se recorrer previamente ao uso de meios seletivos ou de enriquecimento.
O meio de seletivo específico para estreptococos mais usado é o Caldo Hitchens-Pike.
Um meio alternativo para enriquecimento é o Caldo Tioglicolato de Sódio, adequado para o
crescimento de bactérias, inclusive aquelas microaerófilas e anaeróbias.
O meio clássico de isolamento de estreptococos é o Agar Sangue aonde pode-se observar
o perfil hemolítico dos mesmos.
As colônias de estreptococos isoladas em Agar Sangue são puntiformes (< 1mm de
diâmetro), transparentes à luz transmitida e peroladas à luz refletida.
Na identificação de estreptococos além do perfil hemolítico, utilizam-se outras provas
auxiliares para a identificação das principais espécies. O esquema abaixo apresenta estas provas:
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Objetivos
Material
- swabs estéreis
- tubo com solução salina
- Agar Chapman
- Caldo Tioglicolato (ou Hitchens-Pike).
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- Agar sangue
- Caldo simples ou BHI
- Agar inclinado
- Agar DNAse
- dessecador com vela.
Execução da prática
- colher material da nasofaringe (fossas nasais) com o auxílio de swab previamente umedecido
em solução salina estéril e inocular o meio Chapman com a técnica de esgotamento em estria e
incubar a 37oC por 24 horas, conforme o esquema a seguir:
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- utilizando os reativos próprios, fazer as leituras das provas de catalase (H2O2), DNAse (HCl 1N)
e coagulase (plasma de coelho citratado)
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OBSERVAÇÃO:
As principais provas bioquímicas utilizadas para a identificação de bactérias do gênero
Staphylococcus são:
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teste em tubo, por este detectar tanto coagulase livre como coagulase ligada, sendo a prova de
escolha.
A coagulase livre reage com o fator de coagulação do plasma, o CRF, formando uma substância
semelhante, mas não idêntica à trombina, que converte fibrinogênio em fibrina. Para o teste
utilizamos plasma citratado humano ou de coelho, estéril, diluído na proporção 1:5 em solução
salina; a reação ocorre volume a volume (0,5ml de plasma + 0,5 ml da cultura) a 37º C.
Estudos recentes demonstraram que a produção da enzima coagulase se intensifica quando o
germe é crescido em meio contendo alta concentração de NaCl. Desta forma, aconselha-se a
utilização de colônias para a prova, crescidas em Agar Manitol Salgado (Chapman), este
procedimento aumentaria a sensibilidade do teste.
Semear uma alçada do germe em estudo em um tubo contendo o plasma diluído e incubar a
37ºC. Devem ser feitas leituras periódicas a cada30 minutos por um período de até 4 horas e uma
leitura final após 24 horas, pois algumas espécies produzem também fibrinolisina, que dissolve o
coágulo formado. A menor coagulação é considerada prova positiva. Aconselha-se, também
utilizar sempre um teste positivo com uma amostra de S. aureus, previamente conhecida, como
comprovação do teste.
à Sensibilidade a Novobiocina: Este teste não será realizado na aula prática, mas é muito
utilizado na rotina de laboratório. Esta prova é diferenciadora de espécie, pois apenas S.
epidermidis é resistente a este antimicrobiano. O teste é realizado semelhantemente ao TSA
(Teste de Sensibilidade a Antimicrobianos): inocula-se a cultura suspeita em Agar Mueller-Hinton,
de modo a obter crescimento confluente e adicionar o disco de Novobiocina com concentração de
5 mg/ml. Após a incubação verificar o tamanho do halo de inibição e comparar com uma tabela
específica.
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à Crescimento em Agar Chapman: Esta prova também diferencia os enterococos, pois estes
toleram a alta concentração de NaCl presente no meio, como acontece com os estafilococos.
à Crescimento em Agar EMB: Outra prova para identificação de enterococos, pois estes
suportam a presença de corantes como o azul de metileno (que é inibidor para a maioria dos
Gram positivos).
Agar Chapman
Composição do Meio (g/L) Observações
Extrato de carne 1,0 pH do meio: 7,5 ± 0,2
Peptona 10,0
Manitol 10,0 Este meio possui agentes seletivo (NaCl a uma
Cloreto de sódio 75,0 concentração de 7,5%), indicador (vermelho de
fenol) e diferencial (manitol).
Vermelho de fenol 0,025
Ou seja, além de restringir o crescimento de
Agar 15,0
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Agar Sangue
Composição do Meio (g/L) Observações
Triptona 14,0 pH do meio: 7,3 ± 0,2
Peptona neutralizada 4,5
Extrato de levedura 4,5 O meio é altamente nutriente, além de ser
Cloreto de sódio 5,0 suplementado com sangue, o que o torna um
meio muito utilizado em etapas de
Sangue de carneiro 7,0
enriquecimento e para visualização de
Agar 12,5 propriedades hemolíticas de diversos
microorganismos. Como na possui agentes
seletivos, deve ser manipulado com bastante
cuidado.
Agar DNAse
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** O Caldo simples (TSB) e o Agar inclinado (TSA) são meios simples, sem nenhum nutriente de
enriquecimento ou nenhum componente inibidor ou indicador, por isso, suas composições não
serão estabelecidas aqui. Caso haja interesse, disponibilizamos os Manuais de Meios aos alunos.
Exercícios de fixação
Observações
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Introdução
Algumas bactérias não se coram pelo método de coloração de Gram, pelo simples fato de
apresentarem composição da parede celular diferenciada das bactérias Gram positivas e Gram
negativas.
Entre estas bactérias estão as micobactérias, como o Mycobacterium tuberculosis, um
bacilo álcool-ácido resistente de importância médica, por ser o causador da tuberculose humana e
o Mycobacterium bovis, de grande interesse na nutrição por causar tuberculose em bovinos,
sendo esta uma zoonose veiculada por alimentos. As micobactérias penetram pela mucosa da
orofaringe e do trato digestivo chegando aos nódulos mesentéricos e a partir daí pode se
disseminar para outros tecidos e órgãos, quando inaladas podem provocar tuberculose pulmonar
idêntica à causada pelo Mycobacterium tuberculosis.
A coloração de Ziehl-Neelsen é a técnica mais utilizada na identificação das micobactérias
e de bactérias álcool-ácido resistentes em geral, como as bactérias espiraladas..
Muitas bactérias espiraladas estão associadas a doenças humanas: Leptospira
(leptospirose); Treponema (sífilis) e Borrelia (doença de Lyme). Como são microrganismos muito
delgados e recobertos por uma bainha protéica, a coloração de Gram não é útil na sua
visualização. Para tanto são empregados métodos de impregnação com sais de prata (método de
Fontana-Tribondeau) que permite sua observação em microscopia de campo claro e a observação
direta em microscopia de campo escuro.
A presença de bacilos álcool-ácido resistentes no escarro é forte sugestão de tuberculose
pulmonar. Além disso, sangue colhido do lóbulo da orelha ou material colhido da própria lesão
indica o diagnóstico da lepra (Mycobacterium leprae).
Faz parte da prática do Nutricionista conhecer o assunto e atentar para a importância na
orientação do consumo de leite pasteurizado, de origem conhecida e inspecionado, pois as
infecções causadas por essas bactérias são graves.
Fundamentação teórica
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Objetivo
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è diferenciar microscopia de campo claro e campo escuro e associar a importância desta última
na observação de espiroquetas.
Material
Execução da prática
Etapas Observações
Transferir uma alçada da cultura ou uma Ao fazer o esfregaço a partir de diferentes
colônia da placa para uma lâmina de culturas deve-se observar alguns detalhes:
microscópio limpa.
è de placa: deve-se coletar apenas 1 colônia,
espalhando-a pela lâmina à isso evitará a
observação de colônias diferentes na lâmina e
que seja coletado um inóculo muito carregado, o
que dificultará a visualização das células
coradas.
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Com o auxílio da alça, espalhar a cultura. Se Para o inóculo coletado de caldo não é
tiver sido colhida colônia da placa, adicionar necessário adicionar solução salina. Mas para
salina estéril para facilitar o espalhamento. colônia coletada de placa é necessário fazer a
diluição na lâmina, evitando que o esfregaço
fique muito concentrado o que dificulta a
visualização das células coradas ao
microscópio.
Passar a lâmina com o esfregaço sobre a É importante fixar o esfregaço para que este não
chama do Bico de Bunsen, até que este esteja se perca durante as etapas de lavagem entre a
completamente seco. utilização de um e outro corantes
® Coloração do esfregaço
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Lavar rapidamente com água. Essa etapa é realizada para que não haja
excesso de corante sobre o esfregaço na
próxima etapa.
Lavar a lâmina inclinada a 45° com solução de A solução álcool-ácida é responsável por fixar o
álcool etílico:ácido clorídrico (97:3) até que corante na parede da célula, impedindo sua
não haja mais desprendimento de corante saída. Como essas bactérias são álcool-ácido
(aproximadamente 2 minutos). resistentes, não há dissolução da parede,
mesmo esta tendo alto caráter lipídico.
Lavar o esfregaço com solução de álcool É importante que esta etapa seja realizada, pois
etílico:ácido clorídrico (97:3) até que não haja se restar algum corante na lâmina, o próximo
mais desprendimento de corante. corante a ser utilizado não se fixará na lâmina,
não cumprindo seu papel.
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Cobrir o esfregaço com corante Azul de È importante que esta etapa seja realizada, pois
Metileno por 30 segundos. se restar algum corante na lâmina, o próximo
corante a ser utilizado não se fixará na lâmina,
não cumprindo seu papel..
Lavar com água e secar suavemente com Após secar, observar no microscópio, objetiva de
papel. imersão (100x), com óleo de cedro/mineral.
Exercícios de fixação
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Observações
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Introdução
Fundamentação teórica
O uso de Escherichia coli como um indicador de contaminação de origem fecal foi proposto
uma vez que este microorganismo é encontrado no trato intestinal do homem e de animais de
sangue quente. O indicador ideal de contaminação fecal deveria ser de rápida e fácil detecção, ser
facilmente distinguível de outros microorganismos da microbiota do alimento, ter como hábitat
exclusivo o trato intestinal do homem e de outros animais, ocorrer em números muito altos nas
fezes, entre outras características importantes.
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Objetivos
Material
- Reativo de Kovacs
- Vermelho de Metila
- a-naftol VM
- solução de KOH
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Execução da prática
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OBSERVAÇÃO:
- os reativos necessários para a prática são:
- Reativo para verificação de Indol: Reativo de Kovac’s à paradimetilaminobenzaldeído;
- Reativo para prova de Vermelho de Metila (VM): Corante Vermelho de Metila;
- Reativos para prova de Voges Proskauer (VP): VP1 à a-naftol e VP2 à KOH
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- conferir os resultados obtidos nas provas bioquímicas e compará-los com a tabela abaixo,
caracterizando a bactéria analisada:
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Água Peptonada
Composição do Meio (g/L) Observações
Peptona 10,0 pH do meio: 7,2 ± 0,2
Cloreto de sódio 5,0
A peptona é fonte de triptofano, que pode ser
utilizado pelo microorganismo com produção de
indol, que pode ser verificado quando da
adição ao meio do Reagente do Kovacs (para-
dimetilaminobenzaldeído), com o aparecimento
de um anel vermelho na parte superior do tubo.
* Água triptonada: a única diferença é a substituição de peptona por triptona, que é melhor fonte
de triptofano.
Caldo Uréia
Composição do Meio (g/L) Observações
Peptona 1,0 pH do meio: 6,8 ± 0,2
Glicose 1,0
Fosfato dissódico 1,0 O meio é tamponado, para evitar mudanças
Fosfato monopotássico 20,8 bruscas de pH no meio. A produção de urease
resulta em alcalinização do meio, o que pode
Cloreto de sódio 5,0
ser verificado através da viragem da cor do
Vermelho de fenol 0,004 meio de salmon (ou laranja claro) para rosa
Solução de uréia a 40% 50 (ml) brilhante (pink).
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Exercícios de fixação
1. Por que não podemos dizer que os alimentos são fonte de contaminação?
2. Quais são as provas que compõem o conjunto de provas IMVC? Qual o fundamento de cada
prova?
3. Por que o Agar EMB é utilizado na primeira etapa? Qual o seu mecanismo de ação?
4. Por que é importante observar e registrar a cor de cada meio no momento da inoculação e após
a incubação?
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Observações
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Introdução
Fundamentação teórica
® Contagem em Placa
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· Coleta de Amostras
A coleta de amostras para exame microbiológico deve ser feita em garrafas esterilizadas
que tenham sofrido tratamento prévio de limpeza e rinsagem com água destilada.
è Água clorada: adiciona-se 0,1 mL de tiossulfato de sódio 10% para cada 250 mL de
água para neutralizar-se o cloro livre presente, impedindo que continue com propriedades
desinfetantes entre o período da coleta e o momento da inoculação.
è Água com alto teor de zinco e cobre: coletar na presença de um agente quelante, de
forma a reduzir a toxicidade provocada pelos metais (0,3 mL de EDTA a 15%, pH = 6,5 para cada
120 mL de água).
Quando a amostra for coletada, deve ser deixado um espaço livre na garrafa (a amostra
deve ocupar 4/5 da garrafa) para facilitar a homogeneização antes da inoculação. As garrafas
devem ser mantidas vedadas até o momento da coleta da amostra e deve-se tomar todos os
cuidados de assepsia no momento da coleta, de forma a evitar-se contaminações secundárias.
· Ponto de Coleta
Água da torneira Abrir a torneira e deixar a água correr por 5 minutos, para eliminar as
impurezas e a água acumulada na tubulação.
Com algodão embebido em álcool, passar na abertura e internamente e em
seguida flambar.
Abrir a torneira novamente por mais 1 a 2 minutos.
Abrir o frasco esterilizado e coletar a água. Introduzir água no frasco até
cerca de ¾ do seu volume.
Tampar o frasco e transportar imediatamente ao laboratório.
Poços e Cisternas Preparação do frasco - amarrar o frasco e uma pedra como contrapeso com
um barbante para facilitar a descida no poço.
Descer o frasco dentro do poço sem permitir que o mesmo toque nos lados.
Submergir o frasco completamente na água.
Uma vez que o frasco estiver cheio, recolher e derramar parte da água para
criar um espaço de ar e colocar a tampa no frasco imediatamente.
Rios, Lagoas e Coleta da amostra de água de rios e lagoas - nestes casos, deve-se
Mares mergulhar o frasco até uma profundidade de 20cm, com a abertura voltada
em direção contrária a corrente, a fim de evitar a contaminação da água com
as mãos.
Coleta da água do mar - a coleta deve ser feita na região onde as pessoas
costumam banhar-se, que corresponde à profundidade aproximada de 1,0m,
que é a região das praias mais utilizada para a recreação de contato
primário, na maré baixa e 24 horas sem chuvas.
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A técnica do número mais provável consiste no exame de uma série de tubos onde foram
inoculados volumes diferentes de amostra.
O valor obtido resulta da consulta a tabelas que foram estimadas com base em fórmulas
de probabilidade. Considerações teóricas e determinações repetidas em grande escala, indicam
que este tipo de técnica tende a fornecer valores mais elevados do que o número real. As
disparidades tendem a diminuir quando adota-se séries com maior número de tubos em cada
diluição. Portanto, a sensibilidade do teste depende do número de tubos adotados.
Existem várias tabelas de NMP e a escolha da série a ser adotada é função das
características microbiológicas da amostra.
Na aula prática, utilizamos o sistema de 3 séries de 3 tubos, com diluições decimais
sucessivas.
A colimetria consta de 2 etapas: teste presuntivo, onde verificamos a existência de
coliformes na amostra analisada, através da fermentação de lactose com produção de gás; e o
teste confirmativo, onde podemos verificar se os coliformes da amostra são totais ou fecais.
· Teste Presuntivo
Inocular a amostra em 3 séries de tubos contendo Caldo Lauril Sulfato Triptose ou Caldo
Lactose, de modo que cada série seja inoculada com um volume de amostra 10 vezes menor que
a série anterior. Os tubos devem conter tubos de Durhan invertidos. Após incubação a 35 - 37ºC
por 24 - 24 horas, o crescimento com formação de gás significa teste presuntivo positivo para
coliformes. Os tubos que não apresentarem formação de gás com 24 horas de incubação, devem
ser incubados até 48 horas. Os tubos positivos com 24 horas devem ser imediatamente
inoculados nos meios de confirmação para se evitar que um crescimento muito abundante
provoque o abaixamento do pH, o que pode provocar resultados falsamente negativos.
· Testes de Confirmação
Para coliformes totais: A partir dos tubos com formação de gás obtidos na aula anterior,
transferir uma alçada para tubos contendo Caldo Verde Brilhante Bile Lactose. Após incubação a
35 – 37º C por 48 horas, a formação de qualquer quantidade de gás constitui teste positivo para
coliformes totais.
Para coliformes fecais: A partir dos tubos com formação de gás obtidos na aula anterior,
transferir uma alçada para tubos contendo caldo EC. Após incubação a 44,5 - 45º C por 24 horas,
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a presença de gás no interior dos tubos de Durhan é considerada reação positiva, indicando
contaminação de origem fecal. A ausência de gás, mesmo com evidência de crescimento indica a
presença de coliformes de outra fonte que não intestinos de animais de sangue quente.
Para completar o teste, podemos estriar uma alçada de cada tubo positivo na estapa
confirmativa (dos caldos VBBL e EC) para placas com Agar EMB ], incubando a 35-37°C por 24
horas e analisar a morfologia através da coloração de Gram e observação ao microscópio (bacilos
pequenos, Gram negativos, não esporulados)
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3 1 0 43
3 1 1 75
3 1 2 120
3 2 0 93
3 2 1 150
3 2 2 210
3 3 0 240
3 3 1 460
3 3 2 1100
3 3 3 >2400
Objetivos
Material
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Execução da prática
® Primeiro dia
· Contagem em placa
- Antes de realizar a técnica, devemos realizar diluições decimais da amostra, para que a chance
de obtenção de placas com números de UFC contável (30 - 300) seja maior.
- A técnica utilizada será a do pour plate, ou seja: transferir, com auxílio de uma pipeta estéril, 1 ml
da amostra para uma placa de Petri vazia estéril. Adicionar o Agar PCA (padrão para contagem)
fundido e resfriado sobre a amostra e homogeneizar suavemente com movimentos circulares,
conforme mostra a figura a seguir:
- Deve-se fazer em duplicata a inoculação das diluições 100 (amostra não diluída) e 10-1, ou 10-1 e
10-2.
· Técnica do NMP
- Homogeneizar por agitação a amostra de água e inocular os tubos de caldo lactosado utilizando
as pipetas estéreis, da seguinte forma:
- Na primeira série, note que a concentração do caldo é dupla, devemos inocular 10 ml de
amostra;
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® Segundo dia
- Contar as colônias no Agar, calcular o número médio de colônias obtidas, multiplicar pelo fator
de diluição e expressar o resultado em UFC/mL.
OBSERVAÇÃO.: No nosso caso, o fator de diluição, ou fator de correção, será 1, pois o volume
inoculado na placa de Petri foi 1 ml. O fator de correção é importante para a expressão do
resultado, que deve ser em UFC/ml, pois transforma o resultado obtido em um resultado por 1ml.
Muitas vezes na rotina, utilizamos volumes de inóculo diferentes de 1ml, como 0,1ml, ou
utilizamos inóculos provenientes de diluições (10-1, 10-2, etc.). Nesse caso, para a expressão do
resultado devemos multiplicar o número de UFCs obtido por um número que irá corrigir a
distorção do resultado.
Uma dica: se o inóculo utilizado for diluído decimalmente, o FD será o inverso da diluição utilizada.
Ex.1: se o inóculo utilizado for 0,1ml, qual será o FD? 10, pois 10 x 0,1 = 1ml, ou de outra
maneira: 1 ÷ 0,1 = 10.
Ex.2: se o inóculo for 1ml da diluição 10-2, qual será o FD? 100, pois 100 x 10-2 = 1, ou de
outra maneira 1 ÷ 10-2 = 100.
Ex. 3: se o inóculo utilizado for 0,5, qual será o FD? 2, pois 2 x 0,5 = 1, ou de outra
maneira 1 ÷ 0,5 = 2.
- Proceder à leitura dos tubos positivos no caldo lactose (ou LST) e consultar a tabela para
expressar o resultado em NMP/100 mL (teste presuntivo).
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- Inocular os tubos positivos na colimetria para caldos EC e VBBL através da técnica de difusão
(teste confirmativo), conforme o esquema a seguir:
- Incubar os tubos de calo VBBL a 35 – 37ºC por 24- 48 horas e os tubos de caldo EC a 44,5 –
45ºC por 24 – 48 horas.
® Terceiro dia
- Proceder à leitura dos tubos dos caldos EC e VBBL (teste confirmativo), considerando positivos
os tubos com formação de gás no tubo de Durhan. Vale a pena lembrar que os coliformes totais
serão positivos apenas no caldo VBBL e os coliformes fecais serão positivos em ambos os
caldos.
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Caldo Lactose
Composição do Meio (g/L) Observações
Extrato de carne 3,0 pH do meio: 6,9 ± 0,2
Peptona 5,0
Lactose 5,0 A lactose presente no meio é o indicador da
presença de coliformes, através da verificação
da fermentação com produção de gás no tubo
de Durhan invertido introduzido no meio.
* podemos substituir o caldo lactose por caldo LST (lauril sulfato triptose), procedendo a
incubação e a leitura da mesma forma.
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Exercícios de fixação
Observações
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Bibliografia
- Morello, J. A.; Granato, P. A.; Mizer, H. E. Laboratory Manual and Workbook in Microbiology:
Applications to Patient Care. 7th Edition. The McGraw−Hill Companies, 2003.
- Vicente, E. J.; Apostila de Aulas Práticas de Microbiologia. USP – ICM – Disciplina Microbiologia
Básica. 2007.
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