DISCIPLINA: GENÉTICA GERAL

REPLICAÇÃO DO DNA PROFª DRA ADÉLIA CRISTINA

MEDICINA - UNICERRADO
MITOSE / MEIOSE
COMO ACONTECE A SÍNTESE DO DNA?
REPLICAÇÃO SEMI-CONSERVATIVA
ORIGENS DE REPLICAÇÃO
• Locais com um
contexto de
sequência específico

• Ligam proteínas
específicas

• Quando acionadas,
essas proteínas
permitem o início da
replicação
ORIGENS DE REPLICAÇÃO
ORIGENS DE REPLICAÇÃO
 Se o DNA começasse a síntese a partir de uma das
extremidades do cromossomo e avançasse até chegar a outra
extremidade, a replicação tardaria em média cerca de 30
dias.

 No entanto, a fase S - tempo que o DNA demora em se

duplicar- é de aproximadamente 7 horas:
 múltiplas origens de replicação, entre 20 e 80 por cada laço de cromatina, ou
seja, por cada unidade de replicação.
ORIGENS DE REPLICAÇÃO
 Não surgem todas simultaneamente
 Aparição mais precoce ou mais tardia depende do grau de enrolamento
e de outras características da cromatina nos lugares onde se formam
 Contêm segmentos de DNA especiais, compostos por centenas de
nucleotídeos.
 Apesar de serem diferentes entre si, todos possuem uma sequência
comum denominada ARS (do inglês, autonomous replication sequence), de
cerca de 11 nucleotídeos.
 O DNA das origens de replicação está associado a um complexo de seis
proteínas chamadas ORC (do inglês, origin recognition complex), o qual se
une à origem porque invade sulcos do DNA e reconhece certas
singularidades químicas em suas superfícies externas
ORIGENS DE REPLICAÇÃO
 A origem de replicação da bactéria E. coli consiste de uma sequência de
cerca de 245 nucleotídeos.
 Existem dois motivos repetidos que são fundamentais para a origem
oriC. Um motivo de 9 nucleotídeos, repetido 5 vezes, é o sítio de ligação
para uma proteína iniciadora de E. coli, chamada de DnaA.
 Um motivo de 13 nucleotídeos, repetido três vezes, é o local inicial da
formação de DNA em simples-fita no início da replicação.
 Partes dessas sequências estão presentes nas origens de replicação de
outras espécies de bactérias estudadas.
 Embora as sequências nucleotídicas sejam diferentes, as estruturas gerais
das origens de replicação de alguns vírus, eucarióticos e da levedura
Saccharomyces cerevisae guardam semelhanças com a origem de
replicação bacteriana.
 REPLICAÇÃO

 DNA Polimerase III

 Sentido 5’ → 3’
 Nucleotídeos 3P
são adicionados
 Liberação de
Pirofosfato

http://207.207.4.198/pub/flash/24/menu.swf
 REPLISSOMO
 A maioria das proteínas que atuam na replicação do DNA ficam associadas
formando um grande complexo multienzimático denominado replissomo
 Polimerases III do DNA (uma que sintetiza a cadeia leading e outra que
sintetiza a cadeia lagging) associadas a um subcomplexo enzimático chamado
primossomo.
 DNA polimerase III: alta processividade - não se solta facilmente e sintetiza
continuamente a nova cadeia complementar até encontrar algum bloqueio ao
seu deslocamento.
 Está associada a uma proteína que forma um anel ao redor da cadeia
molde, mantendo dessa forma a polimerase firmemente presa ao molde.
Essa proteína desliza livremente sobre a cadeia molde de DNA, mas se solta
dela tão logo a polimerase pare
 Proteína do grampo deslizante.
REPLISSOMO
 Assim, as polimerases III do DNA que atuam na forquilha de replicação,
apesar de equivalentes, são ligeiramente diferentes: uma delas, a que
sintetiza a cadeia leading, possui alta processividade, nunca se soltando da
cadeia molde;

 As outras, que sintetizam a cadeia lagging, podem se soltar da cadeia

molde quando encontram a extremidade 5’ de um primer em seu caminho,
reiniciando a síntese na extremidade 3’-OH do primer seguinte.
 PRIMASE
 Ribonucleoproteína

 Liga-se à helicase em
procariotos formando o chamado
primossomo

 Sintetiza um primer de RNA

contendo aproximadamente 11
bases; fornece 3’ OH

 DNA polimerase lenta e sujeita a

erros

 Evita a progressão da forquilha uma

vez que a fita líder anda mais rápido
MICROGRAFIA, BOLHA DE REPLICAÇÃO

Forquilhas de replicação
FORQUILHA DE REPLICAÇÃO
 REPLICAÇÃO DAS FITAS
• Fita líder
– Primase age uma vez

• Fita retardada
– Primase age várias vezes
– 1967, Fragmentos de Okasaki
Okazaki R, Okazaki T, Sakabe K, Sugimoto K. Mechanism of DNA replication
possible discontinuity of DNA chain growth. Jpn J Med Sci Biol. 1967
Jun;20(3):255-60
DIREÇÕES DE REPLICAÇÃO NA FORQUILHA
 DESENOVELAMENTO DO DNA
• Retirada das histonas
• Proteínas de ligação a fita simples (SSBPs)
• DNA helicase
– Quebra pontes de H

• DNA topoisomerases
– Tiram a tensão
FORQUILHA DE REPLICAÇÃO
 DNA POLIMERASE
• Enzimas que catalisa a reação
de síntese do DNA
• Adiciona nucleotídeos tri-
fosfato à extremidades 3’OH
livre
• Alongamento da cadeia de
DNA sempre é feito na direção
5’>3’ (endonuclease 5’>3’)
• Incapaz de fazer DNA do zero
(precisa ter extremidade 3’OH
livre)
• Possui mecanismo de
correção de erros
(exonuclease 3’>5’)
TIPOS DE DNA POLIMERASE - PROCARIOTOS
• DNA polimerase I
– Descoberta em 1956 (Kornberg pai)
– Função precisa descoberta apenas em 1969: remove
o primer de RNA da fita descontínua
• DNA polimerase III
– Descoberta em 1970 (Kornberg filho)
– Principal enzima que realiza a replicação em
procariotos
• DNA polimerase II
– Lenta, envolvida em reparo do DNA
REPLICAÇÃO DO DNA

 DNA Pol precisa de um molde inicial

 Primase: gera um molde de RNA

complementar

 A DNA Pol III agora é capaz de adicionar

bases à extremidade 3’OH
ENZIMAS - RESUMO
 DNA helicases: interferem e separam a dupla hélice, deslizam-se
rapidamente sobre a fita simples de DNA quebrando ATP
 Proteínas ligadoras de fita simples de DNA (SSB): proteínas
desestabilizadoras de hélices. Ligam-se fortemente e de maneira cooperativa
para expor a fita simples de DNA (deixam as bases disponíveis para o
pareamento). Auxiliam as helicases
 Grampo deslizante: fixam a polimerase na fita de DNA. Tendência a se
desprenderem com facilidade. Forma um grande anel ao redor da hélice de
DNA
 DNA primase: utiliza tri-fosfatos de ribonucleosídeos para sintetizar
pequenos iniciadores de RNA. Em eucariotos, esses iniciadores possuem cerca
de 10 nucleotídeos. Produzidos em intervalos de 100 a 200 nucleotídeos na
fita descontínua
 DNA ligase: liga os novos fragmentos de Okasaki à cadeia crescente
 DNA topoisomerases: nuclease reversível. Tem I e II. Produz uma quebra
temporária, permitindo que as duas porções da hélice girem livremente.
Alivia a tensão
 Telomerase: recupera fragmentos perdidos nos telômeros
E AS EXTREMIDADES DOS CROMOSSOMOS?
Telômeros, apesar de sua localização, pode fundir-se ao
DNA de outros telômeros ou degradar-se mediante uma
nuclease;
Em condições normais não corre esse risco porque se dobra
sobre si mesmo e as proteínas TRF formam um capuz protetor
A cadeia descontínua do DNA telomérico é sintetizada de
uma maneira singular:
 A DNA polimerase não pode produzir o segmento de DNA que deve substituir
o último primer que é eliminado dessa cadeia porque não tem uma extremidade
3'
 Em consequência, em cada uma das sucessivas divisões celulares, com a
eliminação do último primer se perde um segmento do DNA telomérico, o que
provoca o seu encurtamento progressivo
E AS EXTREMIDADES DOS CROMOSSOMOS?
 Naturalmente, se ao final de um determinado número de divisões os
cromossomos não reverterem esse encurtamento, não somente perderão os
telômeros, mas também começarão a perder informação genética
 Telômeros – contém várias repetições consecutivas de GGGTTA. Mil vz
em cada telômero, em humanos
 Na maioria das células isto não ocorre porque depois de cerca de 50
divisões o encurtamento telomérico chega a um nível que lhes impede de
iniciar uma nova divisão – senescência. Impede proliferação descontrolada
 Além disso, essas células envelhecem e morrem, porque dos seus
telômeros esgotados surgem sinais que ativam o gene da proteína P53, o
que bloqueia a divisão e determina a morte das células.
 Assim, a morte sobrevém antes que as células percam informação
genética.
TELOMERASE
Em algumas células pertencentes às linhagens germinativas
do testículo e do ovário e células totipotentes – esse
encurtamento não ocorre

Complexo enzimático ribonucleoproteico desenhado para

recuperar o DNA telomérico que perdem durante as divisões
- telomerase, composto por várias proteínas e um RNA de
cerca de 450 nucleotídeos chamado RNAte
que inclui a sequência do AUCCCAAUC
Idade
REPARO DO DNA

 Existem vários mecanismos:

 DNA polimerase corrige os erros que ela
mesma comete
 Nuclease reparadora: remove primers;
reconhece a fita recém sintetizada e remove
nucleotídeos errados (metilação de adeninas)
 DNA gligosidase: remove uracilas
(emparelhadas devido desaminação), no lugar
de citosinas
 REPARO PELA POLIMERASE
• Mecanismo de verificação (Proof-reading)

• DNA-polimerase possui
Uma atividade de
polimerização 5’→ 3’
Uma atividade de
exonuclease 3’→ 5’