Predisposição Genética associada ao cancro

Cancro hereditário da mama e do ovário

Laboratório aberto - IPATIMUP

Escola Básica e Secundária Ferreira de Castro

Disciplina: Biologia/Geologia
Professora: Teresa Valente
Relatório realizado por:
 Eduardo Teixeira
 Flávia Rodrigues
 Joana Oliveira, 11ºC

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Objetivos
 Respeitar as regras de segurança em laboratório.
 Manusear corretamente o material utilizado para a realização da atividade.
 Executar corretamente o protocolo experimental.
 Observar, caracterizar e distinguir um ácido nucleico - DNA - em termos de composição,
estrutura e função.
 Observar e distinguir homozigóticos negativos, positivos e heterozigóticos através de
bandas.

Introdução teórica

O DNA é uma biomolécula. É uma macromolécula dos ácidos nucleicos juntamente com o RNA.
Cada organismo possui a sua própria informação genética, que o torna único: o seu DNA ((ácido
desoxirribonucleico) - ácido nucleico que armazena toda a informação genética; material genético) . O DNA é uma
molécula eletronegativa constituída por nucleótidos. Estes são constituídos por um glícido
(pentose-desoxirribose), um grupo fosfato, e uma base azotada que pode ser de adenina (A),
timina (T), guanina (G) ou citosina (C). Os vários nucleótidos ligam-se entre si formando cadeias
polinucleotídicas. Estas ligações de natureza covalente designam-se por ligações fosfodiéster e
envolvem o carbono 3 de um nucleótido e o grupo fosfato do nucleótido seguinte.
No ácido desoxirribonucleico, uma cadeia polinucleotídica liga-se com outra, formando uma
estrutura em dupla cadeia. A união entre duas cadeias é estabelecida através de pontes de
hidrogénio entre as bases complementares de cadeias opostas (a adenina estabelece duas ligações
com a timina, e a guanina estabelece três ligações com a citosina). Para que o plano de
complementaridade das bases seja estabelecido, as cadeias apresentam-se orientadas em sentido
oposto, isto é, são antiparalelas.
O DNA controla todas as funções possíveis das células e fornece instruções para
milhões de processos celulares.

Como se encontra maioritariamente no núcleo, mas também nas mitocôndrias (nas células
eucarióticas animais), o material genético tem que ser extraído para ser estudado. Pode ser
extraído do sangue, sémen, saliva ou raízes de cabelos, por vezes, até de uma única célula.
O DNA é útil para identificar um indivíduo porque, embora seja bioquimicamente igual em todos os
organismos, a sequência de nucleótidos é diferente, tornando-nos únicos. Sendo a sequência de
nucleótidos única, o código genético de cada indivíduo é único (exceto no caso de gémeos
idênticos) porque diferentes nucleótidos codificam diferentes aminoácidos. A sequência de
nucleótidos do DNA de uma pessoa pode, deste modo, ser usada como uma espécie de código de
barras para a identificar. Mais do que isso, o DNA é partilhado com familiares e pode, portanto,
ajudar a identificar os seus pais, filhos ou até parentes mais distantes.

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Um gene é uma porção de DNA, onde podem ocorrer mutações. Mutações genéticas são alterações
que ocorrem na sequência de bases azotadas constituinte dos genes, impossibilitando o seu
trabalho normal. Podem ser causadas por erros de cópia do material durante a divisão celular, por
exposição a radiação ultravioleta ou ionizante, medicamentos, tabaco, alimentos, fumo ou vírus.
Algumas mutações podem ser benéficas, trazendo funções inesperadas à célula (são um dos
motores da evolução das espécies). Outras mutações não trazem efeitos visíveis, são neutras. As
que são prejudiciais podem aumentar o risco de uma célula degenerar, e desenvolver uma doença,
como o cancro.
Estas mutações podem ser silenciosas ou com perda de sentido. Mutações silenciosas são
alterações que não se expressão devido a redundância do código genético, ou seja, podemos ter
um aminoácido a ser codificado por mais que um codão. Devido a esta caracteristica do código
genético, neste erro, o codão mutado codifica o mesmo aminoácido. Já nas mutações com perda de
sentido, o codão mutado não codifica o mesmo aminoácido que o codão não mutado. Codificando
diferentes aminoácidos, pode-se sintetizar uma proteína com uma função diferente da pretendida,
podendo gerar doença.
As mutações podem ocorrer em células somáticas ou em células germinativas. Neste último caso,
podem ser transmitidas ao longo das gerações, de pai para filhos.
As mutações somáticas ficam restritas ao indivíduo em que ocorrem e não são transmitidas aos
descendentes.

A contar com possíveis erros no DNA, a célula possui mecanismos de reparação. Quando as células
se multiplicam, para renovar os tecidos e órgãos do corpo, são feitas cópias da molécula de DNA
com o objectivo de as distribuir pelas células-filhas.
Neste processo de cópia é comum ocorrerem erros, que estão, em parte, previstos pela célula, que
os repara quase sempre (nos eucariontes). Quando as células estão envelhecidas e perdem a
capacidade de verificar e corrigir alguns erros, dá-se a apoptose, que é a morte celular programada.

De facto, existem mecanismos celulares que ajudam a reconhecer erros em novas cadeias de DNA.

Se a sequência molecular das duas cadeias não corresponder perfeitamente, os mecanismos de
reparação repõem a estrutura original.

Se não houver reparação, a molécula de DNA fica definitivamente alterada, com o gene “mutado”
ou “geneticamente alterado”.
Sempre que a célula se multiplicar, o erro será copiado, formando um grupo (clone) de células com
a mesma mutação.

O cancro é uma doença na qual as células do nosso organismo, por terem sofrido mutações no seu
DNA, se dividem sem controlo e adquirem propriedades durante esse processo de divisão
descontrolada de invadir outros tecidos e de não morrer. As células de cancro têm a capacidade de
se espalharem pelo organismo usando os sistemas circulatório e linfático, dando origem a
metástases (maligno). Quando esta divisão descontrolada (anómala) é limitada (está no mesmo
tecido) estamos perante um tumor e não perante um cancro. Todos nascemos com uns genes que

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têm como função promover mitoses normais (quando a célula precisa/quando é necessária/de
forma controlada e organizada) - Prontooncogénes. Quando ocorre uma mutação num destes
genes, estes passam a chamar-se oncogenes, e promovem mitoses anómalas (divisões
descontroladas), originando muitos tecidos, ou seja, massas tumorais que podem originar cancro
(alteração no ciclo celular; resultam de muitos erros que não foram corrigidos).

O cancro da mama é um dos cancros mais incidentes em Portugal, mas não é o que causa maior
mortalidade por ser num orgão que está exposto, sendo mais fácil a perseção da dor e, a partir de
uma certa idade, são realizados rastreios.

Pode ser classificado como esporádico (70-75%), multifactorial (20-25%), ou hereditário (5-10%).
O cancro esporádico é a forma mais comum de cancro, e aquela a que quase sempre nos referimos
(casos pontuais, não previsíveis, que até podem afectar mais do que um
elemento da família, mas que não têm qualquer relação com um risco familiar). Surge quase
sempre em idades mais avançadas, aos 60-70 anos, resultado de várias alterações que se foram
processando ao longo da vida. É causado pela exposição a factores de risco
ambientais importantes, mas também por características pessoais genéticas, que aumentam a
vulnerabilidade a estes factores de risco.

O cancro hereditário da mama não é muito comum.

Nestes casos, esta doença tem origem numa mutação hereditária que é transmitida de pais para
filhos, e que aumenta a susceptibilidade à doença.

Esta mutação:
 pode ser transmitida pelo pai ou pela mãe - geralmente não tem uma associação aos
cromossomas sexuais;
 é diferente para vários tipos de cancro (ex: neste tipo de cancro, da mama, são quase
sempre mutações bem determinadas nos genes BRCA1 ou BRCA2);
 tem uma probabilidade de transmissão de 50%, isto significa que o filho de um portador da
mutação, tem 50% de probabilidade de a herdar ou não.

O aconselhamento genético está indicado em indivíduos de famílias com histórico familiar

sugestivo de predisposição hereditária para cancro. O estudo genético da família deve ser iniciado
por um familiar afetado com idade jovem.
Existem critérios de referenciação para aconselhamento genético por suspeita de cancro
hereditário, são:

 três casos de cancro da mama em familiares de 1º grau (ou de 2º grau se na linha paterna)
do mesmo ramo da família, um deles diagnosticado antes dos 50 anos;
 dois casos de cancro da mama em qualquer idade, desde que exista no mesmo ramo da
família um caso de carcinoma do ovário;

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  um caso de cancro da mama antes dos 45 anos e de cancro do ovário em qualquer idade;
 cancro da mama bilateral antes dos 50 anos e um familiar com cancro da mama ou do
ovário;
 duas familiares com cancro da mama antes dos 40 anos ou uma delas com cancro do ovário
antes dos 50 anos;
 cancro da mama ou do ovário antes dos 30 anos;
 cancro da mama antes dos 40 anos com o diagnóstico histológico de carcinoma da mama
pouco diferenciado, medular ou com recetores hormonais e de HER2 negativos;
 cancro da mama no homem;
 indivíduo pertencente a família com mutação patogénica identificada.

No sentido de fornecer um consentimento informado, é necessário aconselhamento genético antes

da eventual colheita de amostras de sangue para testes genéticos de predisposição hereditária para
cancro.
Os testes genéticos de cancro hereditário não são “apenas mais uma análise ao sangue” nem são
adequados para a população em geral. Existem critérios de elegibilidade estabelecidos para garantir
uma abordagem coerente e equitativa.
O objetivo, no âmbito dos recursos atuais, é maximizar a disponibilidade dos testes genéticos
adequados que têm impacto sobre a gestão médica dos indivíduos e suas famílias.
Um teste genético pode ser um processo laboratorial longo e complicado. Depois de verificados os
critérios de elegibilidade, existem duas abordagens principais para testar um gene específico de
cancro hereditário: teste de índice ou teste de portador.

Neste aconselhamento é feito uma análise nos genes BRCA1 e BRCA2, ou seja, pesquisa-se
mutações nos mesmos. Estes são genes supressores de tumores, e controlar a divisão da célula é
uma das suas funções. Se existir mutações nestes genes, passam a ser genes tumorais, porque não
há controlo da divisão celular, podendo originar o desenvolvimento de tumores que,
consequentemente, podem vir a originar cancro (ter uma mutação nestes genes não quer dizer que
tenhamos obrigatóriamente cancro, mas ao ter uma mutação nestes, a probabilidade de
desenvolver é muito maior do que se a não tivermos).

Estes genes, BRCA1 e BRCA2, estão situados nos cromossomas 17 e 13, respetivamente, e têm
sequências de nucleótidos diferentes. São genes em que algumas mutações são comuns. As
mutações podem ser herdadas de forma autossómica ou heterossómica. Autossómica quando
estão nos autossomas (significa que esta herança não é ligada ao sexo) e heterossómicas quando
estas alterações estão nos cromossomas ligados ao sexo (unimos o x com o y).
Denominamos de genótipo o conjunto de todos os genes de um indivíduo, ou seja, a sua
composição genética. A maneira como esses genes se expressam, ou seja, as características que
observamos em cada ser vivo, é chamada de fenótipo. É muito importante salientar que apesar de

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indivíduos apresentarem o mesmo genótipo, pode ocorrer os fenótipos serem diferentes. Isso deve
se ao fato de que o ambiente afeta essas características.
Os genes estão localizados em cromossomas. Na espécie humana, os cromossomos são
encontrados em pares, um herdado da mãe e outro do pai, possuindo mesmo tamanho e forma.
Esses cromossomas são chamados de homólogos.
Em cromossomas homólogos, os genes para determinada característica estão distribuídos da
mesma maneira. Esses genes, entretanto, podem se apresentar de maneiras distintas, que são
chamadas de alelos. Porém, mesmo contendo informações diferentes, eles estão relacionados com
determinada característica e são o mesmo gene.

Os alelos podem ser dominantes ou recessivos. Denominamos de alelo dominante aquele que
sozinho consegue expressar uma determinada característica, temos 2 alelos (um de cada
progenitor) e basta que um deles tenha mutação para passar para a descendencia (para se
expressar). Já o alelo recessivo só se consegue expressar aos pares, ou seja, ambos os alelos têm de
ter mutação para esta se expressar.
Os recessivos estão escondidos no nosso genoma e so se manifestam exteriormente (no nosso
fenotipo).
O cancro hereditário da mama e ovário tem uma transmissão autossómica dominante.

Para saber se o gene BRAC1 tem ou não mutação utilizamos a eletroforese em gel, que é uma
técnica de separação de moléculas (partículas com carga) que envolve a migração de partículas
(movimento) durante a aplicação de uma diferença de potencial. Permite visualizar os fragmentos
causados pelas enzimas de restrição. Neste caso, o gel utilizado é o gel de agarose*.
Enzimas de restrição são proteinas que procuram uma sequência específica de nucleótidos para a
qual estão programadas. Estas enzimas são assim altamente específicas. Cada tipo de enzima
reconhece apenas uma sequência especifica de nucleótidos fragmentando-a, quebrando as ligações
fosfodiéster entre os nucleótidos numa das cadeias.
Nesta técnica, as moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, porque as de menor
massa migram mais rapidamente que as de maior. Colocamos as amostras de DNA que são
negativas no polo negativo para gerar movimento, sendo este o objetivo. E com isto, separar os
fragmentos de tamanhos diferentes e assim saber se o paciente tem ou nao mutação nestes genes.
Normalmente, é utilizada para separar proteínas e moléculas de DNA e RNA.
Para preparar um gel de agarose faz-se a mistura entre o pó de agarose e a solução tampão TBE.

*agarose - é um polissacarídeo e forma uma rede que prende as moléculas durante a migração. Dependendo da
concentração de agarose, há uma diferença no gradiente de separação, isto é, quanto maior a concentração de
agarose, menor o tamanho dos poros e maior a dificuldade da migração dos fragmentos de DNA e de RNA,
aumentando o tempo de migração.

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O gene BRCA1 tem na sua sequência (normal) os nucleótidos AG, ou seja, apresenta 610 p.b. Tendo
estes a enzima de restrição, Micrococus lylae (Mlyl), sintetizada a partir de uma bacteria, identifica
a sequência GAGTC, fragmentando a molécula 5 nucleótidos após esta sequencia
(..NNGAGTCNNNNN/NN..), obtendo-se assim, 2 fragmentos, um com 197 pares de bases (p.b) e
outro com 413 p.b.
Pode haver uma mutação por deleção, na posição 187 deste gene, onde são excluídos 2
nucleótidos, ou seja, a sequência mutada não tem AG, ficando mais curta (608 p.b). Sendo assim, a
enzima não vai reconhecer a sequência, logo não a vai fragmentar.

Em toda a realização de trabalhos experimentais é necessária existência de controlos, para que os

resultados sejam fiáveis, porque temos de ter a certeza se uma dada amostra tem, ou não,
mutação, ou seja, comparar se o indivíduo tem ou não mutação, e se tem o mesmo perfil genético
que o controlo. Existem dois tipos de controlos, controlo homozigótico positivo e controlo
homozigótico negativo.
Sabemos que o controlo homozigótico positivo (amostra com mutação) apresenta como resultado
apenas uma banda com 608 p.b, porque as duas cadeicas polinuclotídicas sobrepõem-se, visto que
a enzima de restrição não atua. Já o controlo homozigótico negatico (amostra sem mutação)
apresenta 2 bandas, uma com 413 p.b e outra com 197 p.b, porque a enzima atua, visto que
reconhece a sequência.

Procedimento experimental

 Material:

 amostras de DNA sintetizado

 controlos positivos (com mutação) e negativo (sem mutação)
 enzima Mlyl
 gel de agarose
 micropipeta
 microtubos coloridos
 estufa
 tina de eletroforese
 corantes

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 Procedimento:

Etapa 1: preparação das amostras

1. Cada grupo possui um microtubo colorido e um frasco de vidro com ADN:

2. Colocar 10 μl de cada amostra de ADN para o respetivo microtubo colorido.

3. Adicionar 10 μl da enzima Mlyl a cada microtubo colorido.
4. Colocar os microtubos na estufa a 37°C, durante 45 minutos.
5. Retirar os microtubos da estufa e proceder à etapa seguinte.

Etapa 2: eletroforese e observação dos resultados

1. No gel de agarose (1%), que se encontra na tina de eletroforese, carregar as amostras

pela seguinte ordem (as amostras já possuem o corante de carregamento de agarose
(Loading Dye):

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 2. Fechar a tina de eletroforese e ligara fonte de alimentação.
3. Programar a fonte para 100V durante 30 minutos.
4. Desligar a fonte de alimentação e proceder à coloração/revelação do gel de agarose
com solução de Fast Blast DNA Stain (100x).
5. Observar/interpretar os resultados.

Resultados obtidos
1 2 5
3 4 6

7
8
9

Resultado da eletroforese em gel de agarose

(diagnóstico genético)

7
8
9

Desenho esquemático dos resultados obtidos através da

eletroforese em gel de agarose
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Legenda:
1. Controlo positivo (+/+)
2. Controlo negativo (-/-)
3. Amostra 1 - Heterozigótico (+/-)
4. Amostra 2 - homozigótico positivo (+/+)
5. Amostra 3 - homozigótico negativo (-/-)
6. Amostra 4 - heterozigótico (+/-)
7. Bandas mais pesadas - 608 p.b
8. Bandas com 413 p.b
9. Bandas mais leves - 197 p.b

Discussão dos resultados

Primeiramente, deu-se a extração de DNA e de seguida fizeram-se cópias do gene BRCA1 (reações
de PCR), sugeitando-as à ação de enzimas de restrição - Mlyl. Adicionam-se estas enzimas com o
objetivo de saber se a sequência nucleotídica é, ou não, fragmentada.
Para a realização da técnica de eletroforese, tivemos de preparar um gel - gel de agarose
(consistência gelatinosa) - em que para este ganhar consistência foi colocado a altas tempeturas.
Este funciona como suporte para a separação das partículas. Seguidamente, colocámo-lo numa tina
de eletroforese, onde foi fundamental a colocação do pente no gel durante o seu endurecimento.
Este pente cria poços que são utilizados como pontos de partida para as nossas amostras (visto que
não as podemos colocar em qualquer sítio), estando localizados numa das extremidades do gel,
onde uma corrente elétrica é aplicada para fazê-las avançar por este.
Colocando os fragmentos DNA, que são eletronegativos, no pólo negativo faz com que haja uma
repulsão. Esta gera movimento e faz com que estes fragmentos se movam em direção ao pólo
positivo. E como todos estes fragmentos têm a mesma quantidade de carga por massa, os
fragmentos menores atravessam o gel mais rapidamente do que os maiores.
Quando o gel é pigmentado com corante que se liga ao DNA, os fragmentos de DNA podem ser
vistos como bandas, em que cada uma representa um grupo de fragmentos do mesmo tamanho.
No diagnóstico genético pudemos observar essas bandas. Na primeira coluna, referente ao controlo
homozigótico positivo (amostra com mutação), observamos apenas uma banda com 608 p.b, pois
ambos os alelos apresentam mutação. Apresentando mutação, não têm na sua sequência os
nucleótidos AG, e sendo assim, a enzima de restrição não fragmenta, deixando a sequência intacta.
Podemos também observar uma coloração mais intensa nessa banda, devido à inexistência
fragmentação. As duas cadeias de DNA ficam intactas e sobrepõem-se, visto que têm o mesmo
número de bases (há uma sobreposição de bandas).
Já na segunda coluna, referente ao controlo homozigótico negativo (sem mutação), observamos 2
bandas, pois ambos os alelos não apresentam mutação. Não apresentando mutação, têm na sua
sequência os nucleótidos AG e a enzima Mlyl fragmenta 5 nucleótidos após os encontrar. A enzima
fragmenta cada alelo (cada sequência) em 2 porções, uma com 413 p.b, que por ser a mais pesada

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encontra-se mais perto do poço, e outra com 197 p.b, sendo a mais leve encontra-se mais afastada
do respetivo.
Ou seja, temos 4 fragmentos (2 em cada cadeia), mas como dois deles tem 413 p.b e os outros 2
têm 197 p.b, sobrepõem-se, sendo apenas visíveis 2 bandas.
Na terceira coluna, referente à amostra 1, não encontramos nem uma, nem dua bandas, mas sim
três. Isto acontece porque apenas um dos alelos apresenta mutação, não sendo fragmentado. O
não mutado é, porque tem na sua sequência os nucleótidos AG. Assim, temos, depois da ação da
enzima, 3 fragmentos. Um com 608 p.b (não foi fragmentado), outro com 413 p.b e outro com
197p.b. Como nenhum destes tem o mesmo número de pares de base, nenhum se sobrepõem a
outro, sendo possível a observação de 3 bandas, como já referimos anteriormente. Quando isto
acontece dizemos que o paciente é heterozigótico.
Na coluna referente à amostra 2 encontramos, novamente, apenas uma banda. E comparando com
os controlos, chegamos à conclusão que é de um paciente homozigótico positivo.
Na da amostra 3, comparando novamente com os controlos, deduzimos que é de um paciente
homozigótico negativo, visto que apresenta duas bandas distintas.
A amostra 4, como apresenta o mesmo número de bandas que a amostra 1, podemos concluir que
o paciente é heterozigótico.

Conclusão
Podemos, com este trabalho experimental, concluir que um paciente pode ser homozigótico
positivo, homozigótico negativo ou heterozigótico.
O paciente é homozigótico positivo quando ambos os alelos têm mutação. Este tem uma grande
probabilidade de desenvolvever cancro da mama e do ovário, porque há mutação nos 2 alelos. No
diagnóstico genético, ou seja, nos resultados obtidos através da eletroforese, podemos observar
apenas uma banda com 608 p.b, pois a enzima de restrição, ao não encontrar a sequência, não
fragmenta. Ao não fragmentar, as duas cadeias polinucleotídicas sobrepõem-se.
Quando observamos 2 bandas, uma com 413 p.b e outra com 197 p.b, podemos dizer que o
paciente é homozigótico negativo, ou seja, nenhum dos alelos tem mutação. Este paciente
Mas se no diagnóstico podemos observar 3 bandas, o paciente é heterozigótico (apenas um dos
alelos tem mutação). Este paciente tem probabilidade de desenvolver cancro da mama e do ovário.

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