UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

MARÍLIA DA SILVA NASCIMENTO SANTOS

EFEITO DE GLUCANAS DO FUNGO Caripia montagnei EM

MODELO DE INFLAMAÇÃO INTESTINAL INDUZIDA POR TNBS
EM RATOS WISTAR E EM CÉLULAS DE CARCINOMA DE
CÓLON HUMANO HT-29

NATAL
2014
 MARÍLIA DA SILVA NASCIMENTO SANTOS

EFEITO DE GLUCANAS DO FUNGO Caripia montagnei EM

MODELO DE INFLAMAÇÃO INTESTINAL INDUZIDA POR TNBS
EM RATOS WISTAR E EM CÉLULAS DE CARCINOMA DE
CÓLON HUMANO HT-29

Tese apresentada ao Departamento de

Bioquímica da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte como requisito parcial para
obtenção do título de Doutora em Bioquímica.
Orientadora: Edda Lisboa Leite

NATAL
2014
 MARÍLIA DA SILVA NASCIMENTO SANTOS

EFEITO DE GLUCANAS DO FUNGO Caripia montagnei EM

MODELO DE INFLAMAÇÃO INTESTINAL INDUZIDA POR TNBS
EM RATOS WISTAR E EM CÉLULAS DE CARCINOMA DE
CÓLON HUMANO HT-29

Tese apresentada ao Departamento de

Bioquímica da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte como requisito
parcial para obtenção do título de
Doutora em Bioquímica

Aprovado em:

BANCA EXAMINADORA

___________________________________________________
Dr. Edda Lisboa Leite
Orientador

___________________________________________________
Dr. Ana Katarina Menezes da Cruz
1º Examinador

____________________________________________________
Dr. Giulianna Paiva Viana de Andrade Souza
2º Examinador

____________________________________________________
Dr. Adeliana Silva de Oliveira
3º Examinador

___________________________________________________
Dr. Eduardo Henrique Cunha de Farias
4º Examinador
 Dedico esta Tese:

À Edda Lisboa Leite, melhor orientadora do mundo, os meus sinceros e amorosos

agradecimentos por todos esses anos de aprendizado e, principalmente, de
crescimento pessoal e profissional.

À minha mãe, Creuza, por ser o meu anjinho de guarda e zelar tanto por mim em
todos os momentos da minha vida. Te amo!

Ao meu marido, Alexsandro, que com toda a sua paciência e amor, torna a minha
vida mais leve e feliz e que me deu o meu bem mais precioso, meu filho!

Aos meus irmãos, Abraão e Daniel, pelo apoio, torcida e amor incondicional, e a
Juju e Davi, meus sobrinhos, por colorirem minha vida.
 AGRADECIMENTOS

À Deus, por me guiar e proteger em todos os momentos. “À ele toda honra e glória
todos os dias da minha vida.”

Ao meu pai, Manoel, e a Cecília por todo o amor!

À minha família: aos meus avós, Lindalva e Pedro, e às Marias (in memoriam), e
aos meus tios, tias, cunhadas, primos e primas, por todo amor, apoio e presença
constante na minha vida!

Às tias Cleide e Iracema, por todo o mimo e cuidado que sempre tiveram comigo.

À minha segunda família: D. Liduina e Nivaldo, meus queridos sogros, sempre nos
ajudando e nos enchendo de amor. Grazi, Gilda, Juliana e D Alice, meu carinho
por vocês é imenso. Muito obrigada por nos cuidarem sempre tão bem e agradeço a
Deus por me trazer uma família tão especial junto com Alexsandro.

A Joedyson Emmanuel de Macedo Magalhães, por todas as noites/madrugadas

que ele ficou me ensinando e ajudando na realização dos experimentos. Mas, muito
mais pela companhia e amizade. Você foi fundamental para a realização deste
trabalho!

Ao pessoal do laboratório, que entre tapas e beijos, formamos uma grande família.
Hugo, Thiago, Celina, Kahena, Joedyson, Almino, Allisson, Luiza, Thuane e
Monique. Muito obrigada mesmo por exercitarem minha paciência (hahaha) e por
todos os momentos felizes que passamos juntos. E o que fica é muita saudade... E
aos antigos também: Lissandra, Cybelle, Micheline, Tarciana, Leila, Mila,
Adriane, Júlio César...

À Huguinho, por todos os momentos alegres do laboratório. Inclusive por nos provar
o quanto a bancada é resistente e por cair da cadeira sempre que necessário!
hahaha

A Almino, pelas boas conversas nessa longa jornada desde o mestrado.

Ao casal mais des-gracioso que existe: Allisson e Luiza. Amor, amizade e lealdade
é o que sei que transborda em vocês e que posso buscar sempre que precisar. Lu,
valeu pelas madrugadas amedrontadoras e elétricas no laboratório.

À Adriane. A vida, às vezes, nos faz tomar rumos diferentes e a distância afasta o
que é matéria. Mas essa mesma distância não consegue afastar as boas
lembranças, o carinho, a amizade e a gratidão que sentimos. Muito obrigada por
tudo e sinto sua falta.

À Thuane, uma pessoa linda que Deus colocou pra dar leveza a minha vida e pra
me mostrar que ainda existem pessoas de espírito iluminado nessa vida... Muito
obrigada pela imensa ajuda na Cultura e por me poupar de muitos cabelos
brancos...

À Monique, que me mostrou que existe “amizade à segunda vista”! Muito bom ter
descoberto essa pessoa super especial que você é e melhor ainda foi ter encontrado
uma amizade verdadeira em você!

Aos colegas do BIOPOL por toda a ajuda em todas as etapas deste trabalho.

Aos meus amigos de sempre: Jéssica, Érica, Bruna, Silvia, Álvaro, Humberto,
Géssica, Tiago DK, Roseane... Muito obrigada por tudo mesmo!

À Érica Cristina Pinheiro de Castro e ao Prof. João Paulo Santos Lima, pela
ajuda com as análises de catalase.

À Leonardo Nobre e Prof. Helena B. Nader INFAR (UNIFESP), pela ajuda com as
análises de apoptose a ciclo celular.

Á Diego de A. Sabry e ao Prof. Guilherme Sassaki (UFPR), pela ajuda com as

análises de ressonância magnética nuclear.

Ao Prof. Ademir Oliveira da Silva, pela ajuda com as análises de infravermelho.

Aos funcionários do Dep. de Bioquímica por toda a ajuda em todas as etapas da

realização deste trabalho, em especial aos sempre prestativos Ângela e Jonas.

À banca de qualificação pelos valiosos questionamentos e correções realizados.

Aos professores do Departamento por transmitir o conhecimento necessário e

ajudar na caminhada dessa longa jornada.

À CAPES e ao CNPQ pelo suporte financeiro.

“Crianças gostam de fazer pergunta sobre tudo.
... Nem todas as respostas cabem num adulto.”

Arnaldo Antunes
 RESUMO

Compostos derivados de fungos tem sido alvo de muitos estudos a fim de

desenvolver o conhecimento acerca de seu potencial bioativo. Polissacarídeos de
Caripia montagnei já foram descritos por possuírem propriedades anti-inflamatória e
antioxidante. Neste estudo, os polissacarídeos extraídos do fungo Caripia montagnei
foram caracterizados quimicamente e seus efeitos sobre as lesões intestinais foram
avaliados em diferentes intervalos de tratamento no modelo de colite induzida por
ácido 2,4,6 - trinitrobenzenossulfónico (TNBS), verificou-se ainda sua ação sobre
células do carcinoma de cólon humano, HT-29. Na análise realizada no extrato
obtido de C. montagnei foi verificado que este é formado principalmente, por
carboidratos (96%) apresentando um baixo teor de compostos fenólicos (1,5%) e
baixa contaminação protéica (2,5%). As análises por espectroscopia de infra
vermelho (FT-IR) e ressonância magnética nuclear (RMN) mostraram que os
polissacarídeos desta espécie de fungo são α e β -glucanas. O dano colônico foi
avaliado por análises macroscópicas, histológicas, bioquímicas e imunológicas. Os
resultados mostraram a redução das lesões no cólon em todos os grupos tratados
com as glucanas (GCM). GCM reduziram significativamente os níveis de IL-6 (50 e
75 mg/Kg, p < 0,05), uma importante citocina inflamatória. As análises bioquímicas
mostraram que essas glucanas atuaram na redução dos níveis de fosfatase alcalina
(75 mg/Kg, p < 0,01), óxido nítrico (p < 0,001) e mieloperoxidase (p < 0,001). Estes
resultados foram confirmados pela redução da infiltração celular observado
microscopicamente. O aumento da atividade da catalase, sugere um efeito protetor
de GCM no tecido do cólon, o que confirma o seu potencial anti-inflamatório. GCM
mostraram atividade citostática sobre as células HT-29, causando acúmulo de
células na fase G1 e impedindo, assim, a progressão do ciclo celular. As glucanas
deste estudo também mostraram habilidade em modular a adesão de células HT-29
ao Matrigel® e reduzir o estresse oxidativo nessas células. A atividade
antiproliferativa contra células HT-29 exibida por GCM pode ser atribuída à sua ação
citostática ou indução da apoptose por essas glucanas.

Palavras-chave: Glucanas; Caripia montagnei; Colite; TNBS; inflamação;

Proliferação celular; HT-29.
 ABSTRACT

Compounds derived from fungi has been the subject of many studies in order
to broaden the knowledge of their bioactive potential. Polysaccharides from Caripia
montagnei have been described to possess anti-inflammatory and antioxidant
properties. In this study, glucans extracted from Caripia montagnei mushroom were
chemically characterized and their effects evaluated at different doses and intervals
of treatment. It was also described their action on colonic injury in the model of colitis
induced by 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS), and its action on cells of the
human colon carcinoma (HT-29). Compounds extracted of C. montagnei contain
high level of carbohydrates (96%), low content of phenolic compounds (1.5%) and
low contamination with proteins (2.5%). The (FT-IR) and (NMR) analysis showed
that polysaccharides from this species of mushroom are composed of α- and β-
glucans. The colonic damage was evaluated by macroscopic, histological,
biochemical and immunologic analyses. The results showed a reduction of colonic
lesions in all groups treated with the glucans of Caripia montagnei (GCM). GCM
significantly reduced the levels of IL-6 (50 and 75 mg/kg, p < 0.05), a major
inflammatory cytokine. Biochemical analyses showed that such glucans acted on
reducing levels of alkaline phosphatase (75 mg/kg, p < 0.01), nitric oxide (p < 0.001),
and myeloperoxidase (p < 0.001). These results were confirmed microscopically by
the reduction of cellular infiltration. The increase of catalase activity suggest a
protective effect of GCM on colonic tissue, confirming their anti-inflammatory
potential. GCM displayed cytostatic activity against HT-29 cells, causing
accumulation of cells in G1 phase, blocking the cycle cell progression. Those glucans
also showed ability to modulate the adhesion of HT-29 cells to Matrigel® and
reduced the oxidative stress. The antiproliferative activity against HT-29 cells
displayed by GCM (p <0.001) can be attributed to its cytostatic activity and induction
of apoptosis by GCM.

Keywords: Glucans; Caripia montagnei; Colitis; TNBS; Inflammation; Cell

proliferation; HT-29.
 LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: Sequência de eventos envolvidos no recrutamento de leucócitos.

Fonte: Adaptado de BOGLIOLO, 2006......................................................................20

FIGURA 2: Receptores de adesão celular. Fonte: HYNES, 1994..........................21

FIGURA 3: Esquema simplificado do ínício da cascata imunológica. Fonte:

Adaptado de POVOA, 2009.......................................................................................23

FIGURA 4: Estágios da carcinogênese química e a evolução de cada etapa.

Fonte: Adaptado de OLIVEIRA et al., 2007...............................................................31

FIGURA 5: Fórmulas estruturais de algumas glucanas. I. α-(1.4)(1.6)- glucana; II.

β-(1.3)(1.6)-glucana, substituída por unidades glucosídicas com freqüência variada;
III. β - (1 .3)(1 .6)-glucana, substituída por unidades glucosídicas e/ou
gentiobiosídicas a cada cinco unidades da cadeia principal. Fonte: SILVA et al.,
2006............................................................................................................................40

FIGURA 6: Fungo Caripia montagnei. Fonte: Arquivo próprio................................45

FIGURA 7: Desenho experimental do estudo desenvolvido com o fungo Caripia

montagnei.................................................................................................................48

FIGURA 8: Fluxograma de obtenção dos polissacarídeos de C. montagnei.

Legenda: PPT: Precipitado.........................................................................................50

FIGURA 9: Esquema do ensaio de colite induzida por TNBS..............................54

FIGURA 10: Composição química do composto extraído dos corpos de
frutificação do fungo Caripia montagnei...............................................................61

FIGURA 11: Espectro FT-IR dos polissacarideos obtidos por extração aquosa
seguido de precipitação com etanol do fungo montagnei Caripia......................62

FIGURA 12: Caracterização química das glucanas de Caripia montagnei (GCM).

(A) Espectro de RMN de 1H; (B) Espectro de HSQC................................................64

FIGURA 13: Lesões macroscópicas no cólon de ratos (n = 3) com colite

induzida por ácido 2,4,6-trinitrobenzenossulfónico (TNBS). (A): Animais do
controle positivo - TNBS, (B): controle negativo, (C e D): tratado a cada 12 e 24 h,
respectivamente, com 25 mg / Kg de GCM, (E e F): tratado a intervalos 12 e 24 h,
respectivamente, com 50 mg / Kg de GCM, (G e H): tratada a cada 12 e 24 h,
respectivamente, com 75 mg / Kg de GCM, (I e J): tratada a cada 12 h e 24 h,
respectivamente, com 1 mg / Kg de dexametasona; (K) o efeito de GCM na
inflamação do cólon. Os dados são expressos como a média ± desvio padrão. *** p
<0,001........................................................................................................................66
FIGURA 14: Efeito de GCM na atividade da enzima mieloperoxidase na
inflamação intestinal de animais (n = 4) com colite induzida por TNBS. Os
dados foram expressos como a média ± desvio padrão. *** p <
0,001...........................................................................................................................67

FIGURA 15: Avaliação do efeito de GCM sobre a atividade da fosfatase alcalina

no tecido do colônico de animais (n = 4) com colite induzida por TNBS. Os
dados foram expressos como a média ± desvio padrão. * p < 0,05; ** p <
0,01.............................................................................................................................68

FIGURA 16: Efeito de diferentes doses de GCM na catalase do tecido do cólon

em animais com colite induzida por TNBS. Os dados foram expressos como a
média ± desvio padrão. ** p < 0,01; *** p < 0,001......................................................69

FIGURA 17: Efeito de diferentes doses de GCM no teor de óxido nítrico no

tecido do cólon no modelo de colite induzida por TNBS. Os dados foram
expressos como a média ± desvio padrão. *** p < 0,001...........................................70

FIGURA 18: Efeito de GCM na modulação da liberação de citocinas (A) IL-1 e

(B) IL-6 no tecido do cólon (n = 4) com inflamação induzida por TNBS. Os dados
foram expressos como a média ± desvio padrão. * p < 0,05; ** p < 0,01.................72

FIGURA 19: Análise histológica do cólon de diferentes grupos de animais com

colite induzida por TNBS. (A): animais do controle positivo - TNBS, (B): controle
negativo, (C e D): tratado a cada 12 h e 24 h, respectivamente, com 25 mg / Kg de
GCM, (E e F): tratado a intervalos de 12 h e 24 h, respectivamente, com 50 mg / Kg
de GCM, (G e H): tratada a cada 12 h e 24 h, respectivamente, com 75 mg / Kg de
GCM, (I e J): tratada a cada 12 h e 24 h, respectivamente, com a 1 mg / Kg de
dexametasona............................................................................................................73

FIGURA 20: Efeito de diferentes doses de GCM na viabilidade de células do

carcinoma de cólon humano (HT-29) nos períodos de incubação de 24, 48 e 72
horas. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. (a): p < 0,01; (b):
p < 0,001....................................................................................................................75

FIGURA 21: Análise de citometria de fluxo com dupla marcação para anexina
V-FITC e PI em células do carcinoma de cólon humano (HT-29). As células foram
tratadas com 50 ou 100 μg de GCM por 24 horas. (A): controle negativo (sem
tratamento), (B): células tratadas com 50 μg de GCM, (C): células tratadas com 100
μg de GCM. Quadrante superior esquerdo: marcação negativa para anexina V-FITC
e positiva para PI (células não viáveis – necrose); quadrante superior direito:
marcação positiva para anexina V-FITC e PI (células não viáveis – apoptose tardia);
quadrante inferior esquerdo: marcação negativa para anexina V-FITC e PI (células
viáveis); quadrante inferior direito: marcação positiva para anexina V-FITC e
negativa para PI (células não viáveis – apoptose precoce).......................................76

FIGURA 22: Efeito de GCM na viabilidade das células de carcinoma de cólon

humano (HT-29) avaliada por citometria de fluxo. Células viáveis: marcação
negativa para anexina V-FITC (V) e PI; Células não viáveis: marcação positiva para
anexina V-FITC e negativa para PI (células em apoptose precoce); marcação
negativa para anexina V-FITC e positiva para PI (células em necrose); marcação
positiva para anexina V-FITC e PI (células em apoptose tardia). Valores foram
expressos por médias ± desvio padrão. (a): p < 0,005; (b): p < 0,001.......................77

FIGURA 23: Análise da distribuição no ciclo celular das células do carcinoma

de cólon humano (HT-29). (A): distribuição do ciclo celular das células não tratadas
(células controle), (B): distribuição do ciclo celular das células tratadas com 50 μg de
GCM, (C): distribuição do ciclo celular das células tratadas com 100 μg de
GCM...........................................................................................................................78

FIGURA 24: Efeito de GCM sobre a adesão de células do carcinoma de cólon

humano (HT-29) ao matrigel. Os dados foram expressos como a média ± desvio
padrão. *** p < 0,001..................................................................................................80

FIGURA 25: Avaliação da atividade antioxidante in vitro de GCM em células do

carcionoma de cólon humano (HT-29). Os dados foram expressos como a média ±
desvio padrão. * p < 0,05...........................................................................................81
 LISTA DE TABELAS

TABELA 1: Avaliação do efeito de GCM na distribuição das células do

carcinoma de cólon humano (HT-29) no ciclo celular. Os dados foram expressos
como a média ± desvio padrão. Fases do ciclo celular - G1: gap 1; G2: gap 2; S: fase
de síntese...................................................................................................................79
 LISTA DE ABREVIATURAS

µg micrograma
µL microlitro
CAT Catalase
CACRN Neoplasia colorretal associada a colite
CCR Câncer colorretal
CIN Instabilidade cromossômica
COX2 Ciclooxigenase 2
CUC Colite ulcerativa crônica
DC Doença de Crohn
DCFH Diclorofluoresceína
DCFH-DA Diclorofluoresceina-diacetato
DII Doença inflamatória intestinal
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
FA Fosfatase alcalina
FT-IR Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier
GCM Glucanas de Caripia montagnei
H2O2 Peróxido de hidrogênio
H&E Hematoxilina e Eosina
ICAMs Moléculas de adesão intercelulares
IFN-γ Interferon gamma
IL-1 Interleucina 1
IL-2 Interleucina 2
IL-6 Interleucina 6
iNOS Óxido nítrico sintetase induzível
MEC Matriz extracelular
MPO Mieloperoxidase
MTT brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazólio
NF-κB Fator nuclear κB
nm Nanômetros
NO Óxido nítrico
NO2 íon nitrito
NO3 íon nitrato
ºC graus centígrados
PI Iodeto de propídio
PPT Precipitado
RMN Ressonância magnética nuclear
ROS Espécies reativas de oxigênio
TNBS Ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico
UC Colite ulcerativa
VCAMs Moléculas de adesão vascular
 SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO 18
1.1 INFLAMAÇÃO 18
1.2 DOENÇAS INFLAMATÓRIAS INTESTINAIS 24
1.3 CÂNCER 29
1.4 COLITE E CÂNCER COLORRETAL (CCR) 32
1.4.1 Tratamentos atuais 36
1.5 POLISSACARÍDEOS FÚNGICOS E SEU POTENCIAL BIOATIVO 37
2 OBJETIVOS. 43
2.1 OBJETIVO GERAL 43
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 43
3 MATERIAIS E MÉTODOS 45
3.1 MATERIAIS 45
3.1.1 Fungo 45
3.1.2 Animais 46
3.1.3 Reagentes e aparelhos 46
3.2 MÉTODOS 47
3.2.1 Extração aquosa dos polissacarídeos de Caripia montagnei 49
3.2.2 Caracterização química dos polissacarídeos do fungo Caripia
montagnei 51
3.2.2.1 Análises colorimétricas 51
3.2.2.1.1 Açúcares totais 51
3.2.2.1.2 Proteínas 51
3.2.2.1.3 Sulfato 51
3.2.2.1.4 Fenóis totais 51
3.2.2.2 Análise da composição monossacarídica 52
3.2.2.3 Análise de infravermelho 52
3.2.2.4 Ressonância magnética nuclear (R.M.N) 52
3.2.3 Avaliação das atividades farmacológicas de GCM 53
3.2.3.1 Avaliação do efeito de GCM no modelo de colite ulcerativa induzida por
ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico (TNBS) 53
3.2.3.1.1 Tratamento 53
3.2.3.1.2 Análise macroscópica 54
3.2.3.1.3 Avaliação da atividade da mieloperoxidase 55
3.2.3.1.4 Avaliação da atividade da fosfatase alcalina 55
3.2.3.1.5 Avaliação da atividade da catalase 56
3.2.3.1.6 Análise de citocinas 56
3.2.3.1.7 Análises histológicas 56
3.2.4 Ação de GCM sobre células do carcinoma de cólon humano (HT-29)
56
3.2.4.1 Ação de GCM na proliferação celular in vitro (Ensaio de MTT) 56
3.2.4.2 Ensaio de apoptose (Anexina V-FITC/ PI) e distribuição do ciclo celular nas
células do carcinoma de cólon humano (HT-29) 57
3.2.4.2.1 Ensaio de apoptose (Anexina V-FITC/ PI 57
3.2.4.2.2 Ensaio da distribuição das células no ciclo celular 58
3.2.4.3 Ensaio de atividade antioxidante in vitro 59
3.2.4.4 Ensaio de adesão 59
3.2.5 Análises estatísticas 60
4 RESULTADOS 61
4.1 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA 61
4.1.1 Espectro FT-IR 62
4.1.2 Ressonância Magnética Nuclear 63
4.2 AVALIAÇÃO DO EFEITO DE GCM NO MODELO DE INFLAMAÇÃO
COLÔNICA INDUZIDA POR TNBS EM RATOS WISTAR 65
4.2.1 Análise macroscópica 65
4.2.2 Atividade da mieloperoxidase 67
4.2.3 Atividade da fosfatase alcalina 68
4.2.4 Atividade da catalase 69
4.2.5 Óxido nítrico 70
4.2.6 Análise de citocinas 71
4.2.7 Análises histológicas 72
4.3 EFEITO DE GCM SOBRE CÉLULAS DO CARCINOMA DE CÓLON
HUMANO (HT-29) 74
4.3.1 Ação de GCM na viabilidade celular in vitro (Ensaio de MTT) 74
4.3.2 Ensaio de apoptose 75
4.3.3 Ensaio de distribuição do ciclo celular 77
4.3.4 Ensaio de adesão 79
4.3.5 Ensaio de atividade antioxidante 80
5 DISCUSSÃO 82
6 CONCLUSÕES 92
REFERÊNCIAS 94
1 INTRODUÇÃO

1.1 INFLAMAÇÃO

A inflamação é um mecanismo de defesa natural do organismo a qualquer

agressão eventualmente sofrida (COTRAN; KUMAR; COLLINS, 2010). Sua
intensidade mostra-se diretamente proporcional ao tamanho do trauma sofrido.
Trata-se de um processo importantíssimo para a manutenção da saúde dos
indivíduos, sendo a maneira pela qual o organismo reage contra agentes
potencialmente danosos como: bactérias, vírus e outros patógenos (GROBMYER et
al., 2000).
O processo inflamatório consiste de fases ou momentos que são compostos
por eventos celulares e humorais inter-relacionados que muitas vezes superpõem-se
durante o processo. A fase irritativa corresponde à injúria tecidual, caracterizada por
modificações funcionais ou morfológicas nos tecidos e posterior liberação de
mediadores do processo inflamatório. As fases vascular e exsudativa correspondem
às alterações vasculares como vasodilatação e aumento da permeabilidade vascular
com posterior exsudação plasmática e celular. E por fim, ocorre proliferação
conjuntiva e vascular reparadora, e, nos casos crônicos, modificações das células do
exsudato, eventos que correspondem à fase reparativa (PEREIRA; BOGLIOLO,
2006).
A resposta inicial do corpo a um trauma ou a uma infecção é chamada de
resposta inflamatória aguda (JANEWAY et al., 2004). Com a persistência do agente
lesivo, inicia-se a fase crônica, de longa duração e, na maioria das vezes, também
associada à presença de células (linfócitos, macrófagos, dentre outras), bem como à
angiogênese, fibrose e necrose de tecidos (ROBBINS; KUMAR; ABBAS, 2005). A
inflamação envolve, entre outros fatores, a ação do sistema complemento, sistema
de coagulação, resposta imunológica humoral e celular, citocinas, hormônios,
angiogênese e processos de reparo.
Desta forma, a primeira linha de defesa do hospedeiro é realizada por células
fagocitárias (macrófagos e neutrófilos), cuja função é englobar e destruir os
microorganismos e pela via alternativa do complemento, agindo de maneira não-
específica. Logo após, as imunoglobulinas e os linfócitos iniciam uma resposta
imune específica (DAS, 2000).
 Um dos principais eventos que ocorre durante a inflamação é a migração de
leucócitos, sua marginação e adesão. A migração dos leucócitos para os sítios de
inflamação é crucial para as suas funções celulares tanto na imunidade inata quanto
na adaptativa (VAN MIERT, 2002).
Esse extravasamento dos leucócitos para o tecido extravascular está
relacionado a interações específicas entre os leucócitos e as células endoteliais. Os
eventos que estão envolvidos neste processo de recrutamento de leucócitos podem
ser visualizados na FIGURA 1. O recrutamento de leucócitos envolve a ativação;
marginação dos leucócitos circulantes no compartimento vascular; rolamento;
adesão; com posterior movimento através da barreira das células endoteliais,
diapedese (NOURSHARGH; MARELLI-BERG, 2005); seguido da migração
quimiotática dos mesmos (WAGNER; ROTH, 2000; WALZOG; GAEHTGENS, 2000).
Para que os leucócitos atravessem o endotélio e alcancem os locais de inflamação,
eles se utilizam de moléculas de adesão para se ligarem à superfície endotelial
vascular e migrarem para os tecidos adjacentes (MACKAI; ROSEN, 2000). Estes
fenômenos decorrem da ação de mediadores inflamatórios que induzem as células
do endotélio vascular a expressarem moléculas de adesão. Essas moléculas vão
interagir com receptores superficiais de leucócitos, os quais também passam a
expressar moléculas adesivas em sua superfície, que se ligam a receptores de
células endoteliais (MACKAI; ROSEN, 2000; NOURSHARGH; MARELLI-BERG,
2005).
FIGURA 1: Sequência de eventos envolvidos no recrutamento de leucócitos. Fonte: Adaptado
de BOGLIOLO, 2006.

As moléculas de adesão compõem um grupo heterogêneo de receptores de

superfície que medeiam o contato entre duas células ou entre a célula e a matriz
extracelular. Além disso, também atuam como moléculas sinalizadoras, participando
da regulação da inflamação e da resposta imunitária (VON ANDRIAN; MACKAI,
2000). Essas moléculas estão presentes nos leucócitos, células epiteliais e
endoteliais e são divididas em quatro grupos de acordo com características
moleculares comuns: integrinas, imunoglobulinas, caderinas e selectinas (FIGURA
2) (SZEKANECZ; KOCH, 2004). O rolamento de leucócitos é facilitado pelas
integrinas juntamente com as imunoglobulinas, que durante o processo inflamatório
estão aumentadas. As integrinas são heterodímeros que formam uma classe
especial de receptores constituídos por subunidades α e β, ambas cooperando para
a formação dos domínios usados para acoplamento (HYNES, 1987, 1992).
Diferentes interações entre essas subunidades possuem especificidade para
componentes da matriz extracelular e ligantes da superfície celular (BURRIDGE et
al., 1988; ARNAOUT, 1990; SPRINGER, 1994).

FIGURA 2: Receptores de adesão celular. Fonte: HYNES, 1994.

Na superfamília das imunoglobulinas estão incluídas as moléculas de adesão

intercelulares (ICAMs) e as moléculas de adesão vascular (VCAMs). Dentro deste
grupo podem ser destacadas a ICAM-1 (CD54), ICAM-2 e VCAM-1, como também
as moléculas ICAM-3, ICAM-4 e ICAM-5. Essas moléculas são homodímeros
glicoproteicos que possuem vários domínios extracelulares que mostram
semelhanças estruturais com os domínios das imunoglobulinas (VON ANDRIAN;
MACKAY, 2000).
As caderinas são proteínas membranares, dependentes de cálcio e
pertencentes à família de proteínas de adesão homofílicas, atuando como ligante e
receptor, sendo expressas por vários tipos de tecidos (KNUDSEN; WHEELOCK,
2005; MATOS et al., 2006).
As selectinas são glicoproteínas transmembranares, monoméricas e que se
ligam a açúcares de superfície conhecidos como lectinas. A interação das selectinas
aos seus ligantes resulta na diminuição da velocidade de migração dos leucócitos,
no qual as integrinas promovem a ligação dos neutrófilos ao endotélio. Denominadas
de acordo com os tecidos onde elas foram identificadas, as selectinas são
classificadas em L-selectina, E-selectina e P-selectina (LEY, 2003; KHAN; LANDIS;
MALHOTRA, 2003).
Um mecanismo essencial na resposta inflamatória é o recrutamento de
macrófagos para atuar contra microorganismos invasores ou suas toxinas
(HAVSTEEN, 2002). Macrófagos são células diversamente distribuídas pelo
organismo e são responsáveis por numerosos processos imunológicos,
homeostáticos e inflamatórios, constituindo uma defesa imediata contra elementos
estranhos ao corpo (ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2000).
Foram identificados dois meios distintos pelos quais os macrófagos podem
ser ativados: a ativação clássica e a ativação alternativa. A ativação clássica de
macrófagos desencadeia a produção de óxido nítrico e citocinas pró-inflamatórias,
além de estimular a fagocitose e a capacidade de eliminar o patógeno. Enquanto a
ativação alternativa leva a secreção de citocinas anti-inflamatórias e redução da
fagocitose e capacidade de eliminar o patógeno (GORDON, 2003).
Dentre as principais funções destas células relacionadas ao processo
inflamatório podem ser citados o processamento e apresentação de antígenos, a co-
ativação de linfócitos T e B, a capacidade de fagocitose, a angiogênese, o processo
de hematopoiese e reparo tecidual, além da atividade citotóxica contra células
tumorais e microorganismos (WING; REMINGTON, 1980; CAVAILLON, 1994;
POPOV et al., 1999; VADIVELOO et al., 2000; COOK et al., 2001). Além disso, os
macrófagos (FIGURA 3) secretam moléculas sinalizadoras, citocinas e quimiocinas,
as quais amplificam a resposta inflamatória e influenciam sua evolução (ABBAS;
LICHTMAN; POBER, 2000).
FIGURA 3: Esquema simplificado do ínício da cascata imunológica. Os macrófagos, estimulados
produzem citocinas como TNF-α e IL-1. Estes dois mediadores são responsáveis por uma série de
eventos que incluem adesão, ativação da coagulação e do sistema complemento bem como a
produção de outros mediadores pro-inflamatórios concomitante com a liberação de fatores anti-
inflamatórios. Fonte: Adaptado de POVOA, 2009.

1.2 DOENÇAS INFLAMATÓRIAS INTESTINAIS

Doenças inflamatórias intestinais (DII’s) são condições inflamatórias

progressivas ou crônicas remitentes que podem afetar todo o trato gastrointestinal e
mucosa do cólon, e estão associadas com um aumento do risco de desenvolvimento
do câncer de cólon (KASER; ZEISSIG; BLUMBERG, 2010).
 O primeiro relato de DII publicado na literatura médica ocorreu em 1761,
descrito por Giovanni Battista Morgagni, relatando um caso de “enterocolite
granulomatosa” fatal.
As principais manifestações clínicas das DII's são o desconforto ou dor
abdominal com alteração dos hábitos intestinais (disenteria ou constipação), perda
ponderal e náuseas (STEIDLER et al., 2000; SINGH et al., 2003).
A DII é caracterizada pelas suas duas maiores formas de desordem do trato
gastrointestinal que são a Colite Ulcerativa (UC) e a Doença de Crohn (DC). Essas
doenças compreendem condições multifatoriais por ter uma base genética que
confere predisposição ao indivíduo e que provavelmente envolve uma resposta do
sistema imunológico a algum agente ambiental (KASER; ZEISSIG; BLUMBERG,
2010).
As taxas mais altas de incidência de DII's são encontradas em países
desenvolvidos do hemisfério norte como os EUA, o Reino Unido, a Noruega e a
Suécia. Essas doenças afetam cerca de 1,4 milhões de pessoas nos Estados
Unidos e 2,2 milhões na Europa (FREITAS, 2002; LOFTUS, 2004; PICCO;
SANDBORN; LASHNER, 2007; LOFTUS et al., 2007; NEUMAN, 2007). Já os países
subdesenvolvidos apresentam menor incidência com taxas de 2-8 por 100.00
habitantes para a Colite ulcerativa e 0,1 a 4 por 100.000 habitantes para a Doença
de Crohn (FREITAS, 2002). Em um estudo desenvolvido no Estado de São Paulo
em 2009 foi observado que a incidência da UC (4,48 casos/100.000 habitantes) foi
maior que a da DC (3,5 casos/ 100.000 habitantes), embora a incidência da colite
ulcerativa tenha mostrado uma redução do período de 5 anos (VICTORIA;
SASSAK; NUNES, 2009). Entretanto, ainda não há uma relação causa-efeito bem
estabelecida para este fato.
Dados epidemiológicos acerca das DII’s no Brasil ainda são escassos, mas
nota-se uma tendência mundial para o aumento da incidência, principalmente nos
países em desenvolvimento, o que inclui o Brasil (SOUZA et al., 2002; TORRES et
al., 2011).
Este aumento da incidência poderá resultar de uma melhoria das condições
socioeconômicas neste país, uma vez que esta doença apresenta uma maior
incidência em países socioeconomicamente mais desenvolvidos (PICCO;
SANDBORN; LASHNER, 2007; FAUCI et al, 2008) .
 As DII’s geralmente afetam indivíduos de qualquer idade, no entanto, apresenta
duas faixas de maior incidência: uma entre os 15 e os 30 anos e uma segunda faixa
entre os 50 e 70 anos, sendo este último mais frequentemente associado a casos de
DC (LOFTUS, 2004).
A colite ulcerativa é uma doença caracterizada por episódios inflamatórios
recorrentes que acometem predominantemente a mucosa do cólon. A colite afeta o
reto e porções variáveis proximais do cólon de forma contínua (JEWELL, 1998;
GHOSH; SHAND; FERGUSON, 2000).
A doença de Crohn é um processo inflamatório crônico de origem
desconhecida e que acomete o trato gastrointestinal, mais freqüentemente o
intestino delgado e grosso, onde pode ocorrer a formação de abscessos severos e
recorrentes, aparecimento de perfurações, estenoses e fístulas com órgãos
adjacentes (GASCHE, 2000; KNIGGE, 2002; TEIXEIRA, 2000; FIOCCHI, 1998).
As doenças inflamatórias intestinais são condições clínicas complexas cuja
etiopatogenia envolve vários fatores condicionantes que são permissivos como o
fator genético, ambiental, flora entérica e a presença de possíveis agentes
infecciosos, bem como os mecanismos efetores que medeiam o tecido danificado. O
que geralmente acontece é que componentes de algumas destas categorias se
unem para induzir a manifestação clínica de doença inflamatória intestinal
(FIOCCHI, 2000; HANAUER, 2006).
Inicialmente na patogênese da DII há uma predisposição genética, ou seja,
genes levam a desregulação do sistema imune da mucosa e/ou a defeitos na função
de barreira, no suprimento vascular ou enervação. Posteriormente, um antígeno
inicia a resposta inflamatória (KIRSNER, 2000).
Um fator genético relacionado à fisiopatologia da DII estudado em 2001 foi o
gene CARD15. Neste estudo foi descrita uma associação entre mutações no gene
CARD15, o qual codifica a proteína NOD-2, com a ocorrência da DC, em indivíduos
com mutações neste gene ( HUGOT et al., 2001; OGURA et al., 2001). Mutações
em NOD-2 afetam a capacidade desta proteína ativar adequadamente a expressão
de NF-KB, um fator necessário para manter uma adequada homeostasia intestinal
(BELTRÁN et al., 2005; PAULSEN; ROSTION, 2007).
É provável que as DII também possam decorrer de anormalidades
imunológicas como a resposta anormal dos linfócitos T da mucosa gastrointestinal à
microflora normal não patogênica do indivíduo geneticamente susceptível
(MATSUMOTO et al., 2001).
Outras evidências sugerem, ainda, que a atividade inflamatória intestinal
crônica seja desencadeada a partir de bactérias pertencentes à flora normal que, em
condições ainda desconhecidas, passam a assumir um papel patológico capaz de
ativar o sistema imunológico local (PINHO, 2008; STROBER; FUSS; MANNON,
2007).
As causas exatas permanecem incertas, mas, o que se observou até agora é
que a inflamação intestinal é o resultado de uma ativação contínua e anormal do
sistema imunitário mucoso impulsionado pela flora normal de um hospedeiro
geneticamente suscetível (SARTOR, 2006; BAUMGART; CARDING, 2007).
Adicionalmente, ao desenvolvimento de uma resposta imunológica anormal
ocorre a resposta inflamatória, a qual é mediada predominantemente por neutrófilos
ativados, monócitos e macrófagos e caracterizada por uma maior formação de
espécies reativas de oxigênio e espécies de nitrogênio (MARTIN et al. 2006). A
resposta à ativação de células imunes na mucosa intestinal, incluindo os
macrófagos, é o desencadeamento da superprodução de citocinas, tais como TNF,
IL-12 e IL-23 (KAMADA et al., 2005; BAY; OUYANG, 2006). As células do sistema
imune em conjunto com estas citocinas pró-inflamatórias, contribuem para manter a
resposta inflamatória descontrolada culminando no dano tecidual intestinal
(MAHIDA, 2000; OGATA; HIBI, 2003).
Além disso, essas respostas podem ativar diversas vias de sinalização que
conduzem à ativação de fatores de transcrição como o fator nuclear kappa (NF-κB)
ou ativador da proteína 1 (AP-1), modulando uma série de diferentes etapas da
cascata inflamatória. Estes incluem a produção de citocinas pró-inflamatórias como
o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), IL -1, Interferon gamma (INF-γ), IL-12 e IL-6
em diferentes tipos de células, a desgranulação de neutrófilos, assim como a
expressão de importantes moduladores da resposta inflamatória como
ciclooxigenase (COX-2) e óxido nítrico sintase indutível (iNOS) (COLLINO et al.,
2006; PECCHI et al., 2009.). Dessa forma, o desequilíbrio entre citocinas pró-
inflamatórias e anti-inflamatórias e a alteração de proteínas inflamatórias incluindo
COX-2 e iNOS, que são expressas como uma resposta rápida a mediadores pró-
inflamatórios e estímulos mitogénicos, desempenham um papel importante na
fisiopatologia da doença (TALERO et al., 2008). Além disso, estudos recentes
relataram que a ativação de proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs),
tais como c-Jun N-terminal quinase (JNK) desempenha um importante papel na
inflamação intestinal em pacientes com DII (ROY et al., 2008).
A destruição imunológica na DII resulta em anormalidades funcionais como a
perda da capacidade absortiva normal e a secreção aumentada de eletrólitos e
fluidos intestinais, manifestando-se clinicamente como má absorção e diarréia
(KIRSNER, 2000).
Vários modelos animais de inflamação intestinal, têm sido desenvolvidos
(HIBI et al., 2002). Entre eles, a colite induzida com ácido trinitrobenzeno sulfónico
(TNBS), tem sido amplamente utilizada (TOZAKI et al, 2002; JUNG et al, 2006;
CRCAREVSKA et al, 2009). O TNBS é utilizado por ser um hapteno e presume-se
que ele se liga a proteínas endógenas na mucosa do cólon e induz uma resposta
imunológica local através de macrófagos e ativação da célula T (ISHIGURO et al.,
2010).
Inflamação da mucosa na UC é caracterizada por um infiltrado de células das
quais são citadas as células plasmáticas, eosinófilos e neutrófilos que se
correlacionam com a severidade da doença (GEBOES et al., 2000; 2003).
Intervenções direcionadas ao sistema imunológico, incluindo os anticorpos anti-
fator de necrose tumoral-α (TNF)-α têm demonstrado eficácia clínica em pacientes
com UC moderada e grave, incluindo a colite distal. Isto sugere a participação da
ativação de citocinas da cascata inflamatória na UC e o seu valor como um alvo
terapêutico potencial. No entanto, podem haver alvos alternativos neste grupo de
pacientes (RUTGEERTS et al., 2005; HUANG et al., 2011; FILIPPI et al., 2011).
Ainda é conflitante o perfil de resposta que direciona a liberação de citocinas
(MASUDA et al., 1995; INOUE et al., 1999; STROBER; FUSS, 2011).
Uma série de fatores podem contribuir para os achados inconsistentes na
literatura, como a heterogeneidade natural dos perfis basais de citocinas, bem como
a influência das características do paciente, incluindo regimes de medicamentos ou
fatores epidemiológicos (YAGOOB; NEWSHOLME; CALDER, 1999).
Também foram observados que as espécies reativas de oxigenio iniciam um
importante papel nas doenças inflamatórias intestinais. O aumento da produção de
espécies reativas de oxigênio (ROS) resultante da explosão respiratória (burst
respiratório) da infiltração de células fagocíticas que causam e diminuem a
capacidade antioxidante, é tido como um importante mecanismo patogênico
(MOHSEN et al., 2011).
O processo inflamatório tem sido epidemiologicamente associado com o câncer
desde 1863 por Virchom, mas apenas nos últimos 10 anos tornou-se evidente que
um microambiente inflamatório é um componente essencial na defesa e/ou
desenvolvimento de tumores (MANTOVANI et al., 2008; HANAHAN; WEINBERG,
2011).

1.3 CÂNCER

Segundo a última estimativa mundial, o câncer de cólon e reto configura-se

como o terceiro tipo de câncer mais comum entre os homens e o segundo entre as
mulheres. No entanto, o câncer colorretal figura entre as cinco primeiras causas de
morte por câncer no Brasil. Estima-se que para o ano de 2014, surjam 15070 novos
casos de câncer de cólon e reto em homens e 17530 em mulheres. Esses valores
correspondem a um risco estimado de 15,44 casos a cada 100 mil homens e 17,24 a
cada 100 mil mulheres. Mais especificamente no Nordeste, o câncer colorretal é o 3º
de incidência mais comum em homens e o 2º em mulheres (INCA, 2014).
Câncer é um termo genérico utilizado para designar uma doença que é
caracterizada pelo descontrole no crescimento e propagação de formas anormais de
células corporais (LEMKE; WILLIANS, 2008).
Carcinogênese é o processo de formação e desenvolvimento de neoplasias.
Este processo envolve mutações seqüenciais que dá as células mutantes
dominância no crescimento em relação às células vizinhas normais, resultando em
um aumento das células mutadas. A carcinogênese é um processo composto por
várias etapas e essas etapas refletem as alterações genéticas que conduzem para a
transformação progressiva do tecido normal a condições malignas (HANAHAN;
WEINBERG, 2000).
Em geral, os termos câncer, neoplasia maligna e tumor maligno são utilizados
como sinônimos e apresentam características que os diferem dos chamados
tumores benignos pela sua capacidade de invasão e metástase. Entretanto, tanto os
tumores malignos como os benignos apresentam proliferação descontrolada,
causando mutações genéticas que decorrem em conseqüência dos padrões
alterados das anormalidades celulares e perda de função (RANG, 2004).
As células cancerosas apresentam algumas características que as distinguem
das células normais: potencial replicativo ilimitado, perda de função, perda de
inibição por contato, poder de invasão, imortalidade e capacidade de sofrer
metástases (HANAHAN; WEINGERG, 2000). Com relação as características
morfológicas das células, podem ocorrer anormalidades nucleares, citoplasmáticas,
perda de inibição por contato e modificação na adesividade (APTSIAURI et al.,
2007).
No câncer ocorrem mudanças citogenéticas através de uma série de
mutações sequenciais somáticas em genes específicos. Este fato pode ocorrer em
decorrência da exposição a um ou vários agentes químicos ou físicos, erros de
replicação de genes, pelas mudanças nos genes que controlam a progressão do
ciclo celular e do processo de reparação do DNA. As alterações somáticas em
conjunto com os eventos epigenéticos que se relacionam com alterações na
expressão (fenótipo), determinam o desenvolvimento da transformação maligna
(FELLER et al., 2010).
Muita atenção tem sido dirigida para elucidar a relação entre a metilação do
DNA e o desenvolvimento de câncer. Na verdade, acredita-se que padrões
aberrantes de metilação do DNA podem servir como poderosos biomarcadores de
avaliação, diagnóstico e risco (LAIRD, 2005).
Foi sugerido que a organização complexa normal da metilação do DNA e
conformação da cromatina (conhecida por regular a homeostase celular normal de
padrões de expressão gênica) de alguma forma se torna
irreconhecível nas células cancerosas que levam a expressão de perfis aberrantes
de diversos genes (ESTELLER; HERMAN, 2002).
Especificamente, os dados indicam que a hipermetilação das regiões ricas em
GC (guanina e citosina) do DNA (chamadas ilhas CpG) desempenham um
importante papel no desenvolvimento do câncer, principalmente pela sua
capacidade de inativar e assim silenciar genes supressores de tumor (NEPHEW;
HUANG, 2003).
A carcinogênese, como um processo complexo, compreende algumas etapas
como a iniciação, a promoção e a progressão tumoral (FIGURA 4).
FIGURA 4: Estágios da carcinogênese química e a evolução de cada etapa. Fonte: Adaptado de
OLIVEIRA et al., 2007.

A iniciação tumoral é ocasionada por mudanças genéticas irreversíveis que

predispõem células normais suscetíveis a evolução maligna e imortalidade. A célula
iniciada não é uma célula neoplásica, mas tomou o seu primeiro passo para esse
estado, após sucessivas mudanças genotípicas e fenotípicas terem ocorrido. Do
ponto de vista fenotípico, a célula iniciada é semelhante às células restantes. A
proliferação das células é essencial para essa fase. Se a divisão celular ocorre antes
que os sistemas de reparo do DNA possam agir a injúria torna-se permanente e
irreversível. O desenvolvimento neoplásico depende da dose de carcinógeno, o
aumento da dose aumenta a incidência e a multiplicidade de neoplasias e também
reduz o período de latência da sua manifestação (TROSKO, 2001; SHACTER;
WEITZMAN, 2002; TROSKO, 2003; SANTELLA et al. 2005; PLAYER et al., 2004).
As células iniciadas podem reagir aos danos por mecanismos como a eliminação
das células danificadas por promover a apoptose ou morte celular durante a mitose,
reagindo contra as espécies reativas de oxigênio quando o aumento é provocado
por estresse oxidativo ou, ainda, estimulando os sistemas de reparo do DNA
(TUBIANA, 2008).
 Na etapa da promoção, as células que foram alteradas geneticamente sofrem
o efeito dos carcinógenos classificados como oncopromotores. A célula iniciada é
transformada em célula maligna, fato que ocorre de forma lenta e gradual. No
entanto, para que essa transformação ocorra, é necessário um longo e continuado
período de contato com o agente promotor. A suspensão do contato pode
interromper o processo nesse estágio (ALMEIDA et al., 2005).
As alterações podem ocorrer em genes denominados proto-oncogenes, que
são genes promotores de crescimento e diferenciação celular, que a princípio, são
inativos em células normais. Quando ativados, os proto-oncogenes transformam-se
em oncogenes, responsáveis pela malignização (cancerização) das células normais
(INCA, 2013).
Na progressão, um fenótipo neoplásico é adquirido através de mecanismos
genéticos e epigenéticos (SHACTER; WEITZMAN, 2002). Durante esta fase, a
proliferação das células ocorre independente da presença do estímulo. A progressão
é caracterizada pela irreversibilidade, instabilidade genética, o crescimento mais
rápido, invasão, metastização, e alterações nas características bioquímicas,
metabólicas e morfológicas de células (GUTIÉRREZ; SALSAMENDI, 2001; DIXON;
KOPRAS, 2004).
A angiogênese é essencial para a progressão neoplásica. A aquisição de um
fenótipo angiogênico precede o desenvolvimento de características que contribuem
para a malignidade e sua inibição atrasa o desenvolvimento neoplásico
(HAWIGHORST et al., 2001).

1.4 COLITE E CÂNCER COLORRETAL (CCR)

Tanto a colite ulcerosa (UC) e doença de Crohn (DC) estão associadas com
um risco aumentado de câncer colorretal (CCR) (ULLMAN; ITZKOWITZ, 2011).
Bargen, em 1928, foi o primeiro a relatar 20 casos de CCR em conseqüência da UC.
Em 1971, Dombal relatou um risco cumulativo de desenvolvimento de CCR em
pacientes com UC extensa em 5% depois de 10 anos e 41,8% após 25 anos. Trinta
anos mais tarde, uma estudo de meta-análise descobriu que o risco cumulativo de
CCR para qualquer paciente com UC foi de 2% em 10 anos, de 8% em 20 anos, e
18% em 30 anos (EADEN; ABRAMS; MAYBERRY, 2001).
O risco de câncer colorretal (CCR) na colite ulcerativa crônica (CUC) parece
depender de um equilíbrio de fatores diagnósticos e de proteção. Foi sugerido que a
inflamação crônica promove o carcinoma como seqüência da CUC (ITZKOWITZ;
YIO, 2004). Na DC, é aceita a hipótese de que a instalação precoce e a longa
evolução da doença inflamatória sejam fatores associados de risco associados ao
desenvolvimento do câncer (RIBEIRO et al., 1991; LASHNER, 1992; MARCHETTI,
FAZIO, OZUNER, 1996; RAMOS et al., 1997).
Mesmo com esse conhecimento, permanece incerto os motivos pelos quais
somente alguns pacientes irão desenvolver CCR mesmo em um grupo em cuja
duração da inflamação do cólon e a extensão da colite sejam similares. Ao
investigar a importância de algumas variáveis para CCR dentro da população do
mesmo estudo, importantes estratégias de prevenção do câncer e subgrupos de alto
risco podem ser identificados.
A importância dos vários conhecidos fatores de proteção associados com
CCR não é bem descrito. Isso pode ser em parte porque esses fatores não têm sido
avaliados dentro do mesmo estudo. Muitos estudos são preliminares, tornando-se
difícil de avaliar e ajustar essas diversas variáveis simultaneamente. O início da
CUC, histórico familiar de CCR, alergia a sulfa, colangite esclerosante primária
(PSC) e a atividade clínica foram relatados por serem fatores preditivos do risco de
câncer apenas em alguns casos. Já os estudos populacionais, consultas médicas
regulares, tabagismo, ácido fólico, colonoscopia de vigilância, e terapia crônica com
Ácido 5-aminossalicílico (5-ASA), têm sido relatados por serem protetores em
apenas alguns estudos. (GREENSTEIN 1979; PRIOR et al., 1982; LASHNER et al.,
1989; EKBOM et al., 1990; BERNSTEIN et al., 1994; PINCZOWSKI et al., 1994;
LOFTUS et al., 1996; KORNFELD et al., 1997; KARLEN et al., 1998; NUAKO et al.,
1998a; NUAKO et al., 1998b; SHETTY et al., 1999; EADEN et al., 2000; ASKLING et
al., 2001; HEUSCHENET et al., 2001; BERNSTEIN, 2003; RUTTER et al., 2004).
Evidências da forte ligação genética entre a doença inflamatória intestinal
(DII) e câncer são escassas e o risco de transformação neoplásica está mais
relacionada à duração e extensão da colite e confirmação histológica da inflamação
da mucosa (GUPTA et al., 2007).
 Apesar dos dados implicarem a inflamação no desenvolvimento da
tumorigênese, a avaliação de risco em pacientes individuais permanece imprecisa.
No entanto, a consideração do papel da inflamação na patobiologia da
transformação neoplásica tem implicações tanto para a compreensão da progressão
da doença quanto para a prática clínica (CAMPBELL; MAXWELL, 2009).
Relatos na literatura atestam que a inflamação tem um papel na homeostase
do tumor e, também é a chave para a transformação neoplásica (KORNFIELD,
1997; PERWEZ, HARRIS, 2007; GUPTA et al., 2007b).
Inversamente, as drogas anti-inflamatórias podem inibir o desenvolvimento de
tumores (ORII et al., 2003). Os radicais livres produzidos pela resposta inflamatória
são altamente reativos com praticamente todos os tipos de biomoléculas, incluindo o
DNA. O estresse oxidativo crônico pode promover eventos de mutação, incluindo
instabilidade cromossômica (CIN) (LIMOLI; GIEDZINSKI, 2003). Apesar da
instabilidade de microssatélites, as mudanças de metilação e outros eventos
mutacionais também estão envolvidos. CIN é considerada por representar a principal
via de carcinogênese na DII. As anormalidades moleculares na neoplasia colorretal
associada a colite (CACRN) são semelhantes a aqueles envolvidos no CCR embora
diferenças substantivas ocorram na temporização dos eventos (ITZKOWITZ; YIO,
2004).
Foi visto que CIN seminais, em particular, pode ocorrer em estágios iniciais de
desenvolvimento de CACRN (WILLENBUCHER et al., 1999).
A inflamação pode induzir diferentes categorias de proliferação celular em
tecidos afetados, dependendo da gravidade da lesão induzida. Citocinas pró-
inflamatórias tem um efeito mitogênico direto, enquanto a necrose do tecido é
normalmente seguida por uma cura regenerativa (PANJA et al., 1998; FARBER,
1995). Estudos utilizando o fígado como órgão modelo demonstraram que a
proliferação regenerativa de células têm um papel significativo na inflamação
associada a tumorigênese. Por outro lado, a proliferação mitogênica tem um risco
pouco demonstrável (LEDDA-COLUMBANO et al., 1992; 1993).
No intestino ou cólon, o fenômeno notável de rápida melhora após a lesão
inflamatória com restauração completa da morfologia da cripta/vilosidade em todas
as linhagens celulares ocorre pelo processo de regeneração da mucosa (PATEL et
al., 1996; POTTEN, 1991). As cicatrizações regenerativas recorrentes na colite, no
entanto, podem conferir aumento do risco de câncer (OKAYASU et al., 2002).
 Uma evidência suportou o conceito de que a cura regenerativa por si só
contribui para a instabilidade do genoma. O DNA isolado a partir da mucosa
regenerativa não-neoplásica na colite apresenta microssatélites de instabilidade,
considerados como indicativos de uma hipermutabilidade transiente, em vez que
mimetisa a reparação de genes do DNA sem qualquer alteração prévia (HEINEN,
1997).
A colite recorrente pode promover o desenvolvimento e expansão de
manchas mutantes das mucosas, antes da formação do tumor. Assim, a
regeneração poderia aumentar a tumorigênese por diminuição metabólica das
defesas contra as espécies oxidativas mutagênicas ou por aumento da frequência
de mutação celular e expansão clonal mutante. Episódios recorrentes poderiam
promover o desenvolvimento de subclones cada vez mais instáveis que re-
epitelizariam áreas ulceradas, levando, finalmente, para displasia multifocal ou
câncer, típico de CACRN (DONNELLY et al., 2004; 2005).
A transformação neoplásica na colite funciona em um longo curso
caracterizado por instabilidade genômica progressiva. A displasia progride através
da displasia de baixo grau para a displasia de alto grau (HGD) por aquisição de
mutações adicionais em k-ras, APC e outros genes. Manchas displásicas podem
atingir um tamanho grande (AHNEN, 1992).
Os cânceres são considerados por surgir dentro dessas manchas displásicas
circunscritas em 78-94% dos casos (CONNEL et al., 1994; VONHERBAY; OTTO,
1994). A displasia de alto grau tem 83% de valor preditivo positivo para câncer
(CONNEL et al., 1996). Em pacientes com estabelecida displasia de alto grau ou
câncer, CIN é detectável na mucosa morfologicamente normal em toda a área
lesionada ou no cólon inteiro (RABINOVITCH et al., 1999).

1.4.1 Tratamentos atuais para o câncer

Atualmente no tratamento do câncer são utilizados três principais tipos de

procedimentos: a radioterapia, a quimioterapia e a cirurgia.
No caso de não haver metástases, a técnica cirúrgica pode levar a remoção
de tumores.
 A radioterapia é um método comumente utilizado no tratamento que emprega
um feixe de radiações ionizantes (geralmente raios gama, radioisótopos como
cobalto-60, raios-X e outros) e que pode regredir o tamanho de tumores, atuar na
redução da recorrência e chance de metástase. É uma técnica muito utilizada em
conjunto com a cirurgia, para aumentar a eficiência do tratamento (MURAD, 1996;
ALMEIDA et al., 2005; INCA, 2013).
A quimioterapia tem como objetivo inicial a destruição de células malignas,
preservando as células normais. No entanto, a maioria dos agentes quimioterápicos
atua de forma não-específica, lesando tanto células malignas quanto as células
normais (MURAD, 1996; MACHADO, 2000). Esta técnica é uma associação de
medicamentos que são administrados nos pacientes por via intravenosa ou por via
oral. Entretanto, em um determinado estágio do tratamento, as células tumorais
submetidas a essa terapia passam a desenvolver mecanismos de resistência
(MARIUZZO, 2007). Essa perda de resposta é um dos maiores problemas
encontrados no tratamento com quimioterapia (LONGLEY; JOHNSTON, 2005).
Ultimamente, muitos estudos buscando maior eficiência na terapia contra
tumores enfocam a imunoterapia. Esta, é uma abordagem molecular na qual o
sistema imunológico autólogo é utilizado como braço efetor. Nesta técnica, as
moléculas alvo são antígenos de tumores. Estas moléculas podem ser peptidios,
proteínas ou carboidratos, por meio da qual o sistema imunológico reconhece os
tumores (LUCAS; COULIE, 2008). Embora o sistema imunológico seja capaz de
reconhecer os antígenos superexpressos, a discriminação entre tumores e tecidos
normais pode não ser o ideal. Antígenos novos criados por uma mutação no tumor
são alvos, teoricamente, mais apropriados para discriminação imunoterapêutica
entre as células malignas e normais. Além disso, mutações comuns compartilhadas
por tumores, mas não por tecidos normais também podem ser úteis (PARMIANI et
al., 2007).
Estudos estão sendo realizados a fim de buscar novos compostos que possam
contribuir para a prevenção e tratamento das DII's e CCR. Dentre estes, pode-se
destacar compostos derivados de plantas e fungos (SOCCA et al., 2014; SILVA et
al., 2012).
 1.5 POLISSACARÍDEOS FÚNGICOS E SEU POTENCIAL BIOATIVO

Os fungos, durante muito tempo, foram considerados vegetais e, somente a

partir de 1969, passaram a ser classificados em um reino à parte, o Reino Fungi
(WHITTAKER, 1969). Estes são organismos que possuem características comuns
tanto aos animais quanto aos vegetais, apresentando, desta forma, morfologia
bastante diversificada. Crescem rapidamente e formam filamentos celulares
microscópicos denominados hifas, cujo conjunto constitui uma espécie de tecido
próprio dos fungos, o micélio, responsável por todas as funções vegetativas do
organismo. Os fungos são heterótrofos, não sintetizando matéria orgânica a partir de
carbono inorgânico, eucariontes, maioria multicelulares e essencialmente terrestres.
Todos apresentam parede celular em alguma fase do ciclo de vida, sendo esta
constituída de quitina, conferindo rigidez e resistência à degradação microbiana e o
glicogênio é o carboidrato de reserva (RAVEN; EVERT; EICHHORN, 2001). Esses
organismos são divididos em quatro filos de acordo com seus mecanismos
reprodutivos: Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota e Basidiomycota
(ALEXOPOULOS; MIMS; BLACKWELL, 1996).
Os fungos representantes do filo Basidiomycota, comumente conhecidos
como basidiomicetos, constituem um grupo diverso, sendo os cogumelos e orelhas-
de-pau, os mais conhecidos (RAVEN; EVERT; EICHHORN, 2001).
Os cogumelos são utilizados desde a antiguidade pelo homem como alimento
de alto valor nutritivo e terapêutico. Na natureza, existem diversas espécies de
diferentes cogumelos, sendo alguns venenosos, alucinógenos e outros que possuem
propriedades medicinais e até afrodisíacas (ALEXOPOULOS; MIMS; BLACKWELL,
1996).
Os maiores produtores mundiais de cogumelos são os Estados Unidos,
França, Alemanha, Holanda, China e Japão e como principais consumidores podem
ser destacados a Alemanha, Holanda, Japão e China (MODA et al., 2005). Em
contraste, o consumo de cogumelos no Brasil ainda é muito pequeno quando
comparado aos povos europeu e asiático e está restrito a certos grupos étnicos ou
de maior status cultural e econômico (DIAS; ABE; SCHAWN, 2004).
Foi estimado que existam mais de 1,5 milhão de espécies de fungos no
mundo embora apenas 5% tenham sido descritas (HAWKSWORTH, 2001). Apesar
do pouco relato que se tem sobre esses organismos, reconhece-se que muitos deles
já se tornaram imprescindíveis para a saúde humana (HERRERA, 2001).
Polissacarídeos são moléculas naturais constituídos por monossacarídeos
conectados entre si por ligações glicosídicas. Esses polímeros diferenciam-se,
basicamente, pelos monômeros constituintes, tipo de ligação, comprimento da
cadeia e número de ramificações e grupos substituintes como fosfatos, carboxila e
sulfato, por exemplo (FREIMUND et al., 2003).
Uma porcentagem significativa da biomassa fúngica é devido à presença de
polissacarídeos como, por exemplo, a parede da hifa, que contém mais de 75%
deste tipo de biomolécula (BARBOSA et al., 2004).
Polissacarídeos isolados da parede celular de fungos têm sido comumente
caracterizados como homopolímeros, heteropolímeros ou, ainda, podem estar
associados a resíduos de proteínas formando complexos polissacarídeo-proteína
(ZHANG et al., 2002; KIM et al., 2003). E dentre os polissacarídeos mais
freqüentemente encontrados nestes organismos podem ser citados a quitina,
glucanas e galactomananas, embora sua quantidade varie entre as diferentes
espécies (ADAMS, 2004).
Dentre os diversos polissacarídeos isolados de basidiomicetos, estão
glucanas, heterogalactanas, heteromananas, entre outras (SCHEPETKIN; QUINN,
2006). Acerca destes polissacarideos, as glucanas são os mais abundantes nas
paredes celulares dos fungos (RUIZ-HERRERA, 1991).
As glucanas são polímeros de glucose amplamente distribuídos na natureza e
classificadas conforme o tipo de ligação glicosídica [α, β] da cadeia principal
(FIGURA 5). Nos fungos, estas moléculas participam como componentes menores
do citosol, da parede celular e como polissacarídeos excretados ao meio
(WILLIAMS, 1997). As funções desses polissacarídeos na parede celular, sejam
estruturais ou fisiológicas, são determinadas pelas suas propriedades físicas e estão
diretamente relacionadas às diferenças de composição, à estrutura (primária,
secundária e terciária) das cadeias poliméricas individuais e à maneira pela qual se
arranjam para formar a parede celular (BUSH; HORISBERGER, 1972; SUGAWARA
et al., 2004).
Muitas funções biológicas têm sido atribuídas às glucanas e muito se têm
investigado com relação ao seu potencial farmacológico. Muitas atividades já foram
relatadas na literatura por possuírem propriedades terapêuticas como, por exemplo,
efeitos antitumoral (HUANG; ZHANG; CHEUNG, 2006), imunomodulatórios e
antioxidantes (YUAN et al., 2009), anti-inflamatórios (SMIRDELE et al., 2008) e
antimutagênico (OLIVEIRA et al., 2006).

FIGURA 5: Fórmulas estruturais de algumas glucanas. I. α-(1.4)(1.6)- glucana; II. β-(1.3)(1.6)-

glucana, substituída por unidades glucosídicas com freqüência variada; III. β - (1 .3)(1 .6)-glucana,
substituída por unidades glucosídicas e/ou gentiobiosídicas a cada cinco unidades da cadeia
principal. Fonte: SILVA et al., 2006.

Esses polissacarídeos têm efeitos intensos sobre uma grande variedade de

leucócitos, incluindo macrófagos, neutrófilos, eosinófilos e células NK, assim como
as células não-imunes: como as células endoteliais, células do epitélio alveolar e
fibroblastos. Estas possuem receptores capazes de reconhecer as -glucanas,
resultando na ativação dessas células (BATTLE et al., 1998).
Recentemente, foram identificados três receptores celulares de β-glucanas:
CR3, dectin-1 e lactosilceramida (ZIMMERMAN et al., 1998; ROSS et al., 1999;
BROWN; GORDON, 2003). Os CR3 são receptores celulares responsáveis por
diversas atividades in vitro e in vivo, atuando, principalmente, na migração
transendotelial de neutrófilos ativados (TSIKITIS et al., 2004). Os receptores do tipo
dectina-1são responsáveis por uma série de respostas celulares incluindo a
fagocitose, endocitose, explosão respiratória, além da produção de citocinas pró-
inflamatórias e quimiocinas (BROWN et al., 2003; GANTNER et al., 2003; HERRE
et al., 2004). Alguns estudos demonstraram que esses receptores celulares e
também o lactosilceramida de linfócitos reconhecem β-glucanas, principalmente com
estrutura do tipo β-(1→3) e β-(1→6) (ZIMMERMAN et al., 1998; BROWN; GORDON,
2003).
Cerca de 700 espécies de fungos já foram descritas por possuírem
significativas propriedades farmacológicas (LULL, WICHERS, SAVELKOUL, 2005).
Dentre os inúmeros compostos testados, os polissacarídeos fúngicos vêm sendo
alvo de vários estudos.
Tem sido relatado na literatura o potencial anti-inflamatório de
polissacarídeos extraídos de fungos (PADILHA, 2009; CARBONERO et al., 2008,
SMIRDELE et al., 2008). Outros estudos, ainda, buscam explicar o possível
mecanismo pelo qual esses compostos agem (LIN et al., 2005; HAN et al., 2007).
Caripia montagnei (Berk.) Kuntze é um basidiomiceto presente em regiões
neotrópicas das quais podem ser citados os países da América Central e da América
do Sul, como o Brasil. Este fungo é encontrado em troncos de angiospermas
descascados ou deteriorados, como também em galhos caídos (GINNS, 2011).
Estudos iniciais com o extrato aquoso de Caripia montagnei constataram seu
potencial anti-inflamatório utilizando dois modelos de inflamação in vivo. Neste
estudo, os polissacarídeos foram capazes de reduzir o edema inflamatório, reduzir
os níveis de migração leucocitária, como também diminuir significativamente os
níveis de óxido nítrico. Além disso, também foi verificada diminuição dos níveis de
IL-10 e IFN-γ, bem como inibição da expressão do fator nuclear κB (QUEIROZ et al.,
2010).
Castro et al., (2014) também relataram efeitos anti-inflamatórios para os
polissacarídeos de C. montagnei no modelo de pleurisia induzida por carragenana.
Além disso, também constataram o potencial antioxidante e antiangiogênico destes
polissacarídeos.
Assim, as constatações de que polissacarídeos de Caripia montagnei são
compostos com importantes efeitos imunomoduladores motivaram este estudo que
visa ampliar o conhecimento e suas possíveis aplicações farmacológicas.
2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GERAL

Verificar as propriedades físico-químicas e farmacológicas como a atividade

anti-inflamatória intestinal em ratos e antitumoral contra células do carcinoma de
cólon humano (HT-29) dos polissacarídeos de C. montagnei.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Caracterizar fisico-quimicamente os polissacarídeos extraídos dos corpos de

frutificação do fungo C. montagnei através de dosagens de açúcares totais,
proteínas, sulfato e fenóis totais; espectroscopia de infravermelho, análise da
composição monossacarídica e ressonância magnética nuclear de 13C, 1H e HSQC;

• Analisar o efeito anti-inflamatório intestinal das glucanas do fungo Caripia

montagnei (GCM) no modelo de colite induzida por TNBS em ratos Wistar;

• Avaliar os efeitos macroscópicos e microscópicos de GCM no tecido colônico

de ratos com colite induzida por TNBS;

• Verificar a atividade de GCM utilizando marcadores bioquímicos (catalase,

mieloperoxidase e fosfatase alcalina) no tecido colônico de ratos com colite induzida
por TNBS;

• Analisar os efeitos de GCM sobre marcadores imunológicos da inflamação

colônica, IL-1 e IL-6, no modelo de colite induzida por TNBS;
• Avaliar in vitro a atividade antiproliferativa de GCM sobre células do
carcinoma de cólon humano HT-29;

• Verificar o possível efeito de GCM na apoptose e distribuição do ciclo celular

nas células HT-29;

• Avaliar o efeito antioxidante de GCM em células HT-29;

• Analisar a ação de GCM sobre a adesão de células HT-29.

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 MATERIAIS

3.1.1 Fungo

Os fungos Caripia montagnei (Berk.) Kuntze (FIGURA 6) foram coletados em

áreas de mata atlântica, na cidade de Natal (Rio Grande do Norte-Brasil), e, após a
coleta, os fungos foram identificados pelo Prof Dr. Iuri Goulart Baseia do
Departamento de Zoologia, Botânica e Ecologia da UFRN. Os especimes foram
depositados no Herbário da UFRN (UFRN-fungos 836).

Reino: Fungi
Filo: Basidiomycota
Classe: Holobasídiomycetes
Ordem: Aphylloporales
Família: Podoscyphaceae
Gênero: Caripia
Espécie: Caripia montagnei

FIGURA 6: Fungo Caripia montagnei. Fonte: Arquivo próprio.

 3.1.2 Animais

Os estudos para avaliação da atividade antiinflamatória foram realizados com

ratos Wistar (150-200 g) mantidos no biotério do Departamento de Bioquímica da
UFRN. Todos os animais utilizados na fase experimental foram submetidos à água e
alimentação ad libitum em condições de iluminação controlada (12 h de luz / escuro)
e temperatura constante a 23 ± 2 º C. Os animais foram aclimatizados no laboratório
durante pelo menos 24 horas antes das experiências e foram utilizados apenas uma
vez. Os ensaios realizados foram aprovados (n º 014/2010) pelo Comitê de Ética da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), e seguiu as normas
estabelecidas.

3.1.3 Reagentes e aparelhos

 Fenol, metanol, acetona, etanol, ácido etilenodiaminotetracético, acetato de

sódio, clorofórmio, ácido sulfúrico, formaldeído, Cloreto de sódio, Hidróxido de sódio,
ácido clorídrico, fosfato de sódio monobásico e dibásico da Reagen Quimibrás
Indústrias Químicas S.A. (Rio de Janeiro, RJ, Brasil);

 Citrato de sódio (Cromato produtos químicos Ltda, Diadema, SP, Brasil);

 Folin-Ciocalteu da Cromoline Qumica Fina Ltda (São Paulo, SP, Brasil);

 Bacto-gelatin da Difco Laboratories

 Coomasie brilliant blue R 250, peróxido de hidrogênio, brometo de

hexadeciltrimetilamônio, albumina sérica bovina, glicose, 3,3’,5,5’-
tetramethylbenzidine, ácido etilenodiaminotetracético, brometo de
hexadeciltrimetilamónio, ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico, MTT (brometo de 3-
[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolium), 2,2 diclorofluoresceina diacetato (DCFH-
DA) e padrões de monossacarídeos da Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA );
 Cristal violeta da Inlab (São Paulo, SP, Brasil);

 Citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, USA).

 Solução de EBSS (solução salina balanceada de Earle sem cálcio e sem

magnésio) preparada no INFAR, UNIFESP (São Paulo, SP) contendo 6,8 g NaCl;
0,4 g KCl; 1,14 g Na2HPO4; 0,2 g KH2PO4; 0,14 g Na2HPO4 x 1H2O; 2,2 g NaHCO3;
1,0 g D-glucose e 0,01 g de vermelho de fenol em um litro de água;

 Kit ELISA para detecção de IL-1 e IL-6, kit de detecção de apoptose BD

Pharmingen Annexin V-FITC e Matrigel (BD Pharmingen San Diego, CA, USAouri,
USA);

 Banhos e estufas de temperatura controlada da FANEM Ltda. (São Paulo, SP,

Brasil);

 Espectrofotômetros Varian - Series 634 da Varian Techtron PPTY Ltd.

(Springvale, Vico, Austrália) e Hitachi U-2000 (Tóquio, Japão);

3.2 MÉTODOS

Os corpos de frutificação foram coletados, secos a 40 ºC e pulverizados.

Estes, foram submetidos a extração aquosa para obtenção de polissacarídeos
seguida por precipitação com etanol. Após obtenção dos polissacarídeos, foram
realizadas sua caracterização química parcial além das análises de algumas
possíveis propriedades farmacológicas como as atividades anti-inflamatória e
antitumoral. A estratégia geral de estudo pode ser visualizada na FIGURA 7.
FIGURA 7: Desenho experimental do estudo desenvolvido com o fungo Caripia montagnei.
 3.2.1 Extração aquosa dos polissacarídeos de Caripia montagnei

A obtenção dos polissacarídeos de C. montagnei foi realizada por

modificações na metodologia proposta por Souza-Paccola et al., (2004). Para
obtenção dos polissacarídeos, os corpos de frutificação dos fungos foram lavados e
dessecados a 40 ºC em estufa, e, posteriormente foram pulverizados. Para a
extração dos polissacarídeos utilizou-se 50 g de tecido do fungo. A este pó foi
adicionado dois volumes de acetona 80% (2:1, p/v) permanecendo a mistura a 25 °C
por 24 horas e em seguida filtrado. Posteriormente, foi realizada extração com
clorofórmio-metanol (2:1, v/v) por 2 horas a 60 ºC, sob refluxo, e em seguida filtrado.
O sobrenadante foi descartado e ao precipitado adicionou-se 500 mL de água
destilada, permanecendo a mistura em banho-maria a 100 ºC por 3 h. O
sobrenadante foi tratado com três volumes de etanol resultando em um precipitado
que foi separado do sobrenadante por centrifugação (8000 rpm por 20 min, a 25º C).
A seguir o precipitado obtido foi seco e pulverizado (FIGURA 8).
 50g fungo

2V acetona 80%
25 °C/24 h
Filtração

SOBRENADANTE PPT

Clorofórmio-metanol,
60 ºC/2 h
Filtração

SOBRENADANTE PPT

Água destilada
100 °C/3 h
Filtração

SOBRENADANTE PPT

2V etanol
Centrifugação
8000 rpm/20 min

Secagem e pulverização

SOBRENADANTE PPT (GCM)

FIGURA 8: Fluxograma de obtenção dos polissacarídeos de C. montagnei. Legenda: PPT:

Precipitado.
 3.2.3 Caracterização química dos polissacarídeos do fungo Caripia
montagnei

3.2.2.1 Análises colorimétricas

3.2.2.1.1 Açúcares totais

Açúcares totais foram determinados pelo método do fenol/ácido sulfúrico

como previamente descrito (DUBOIS, 1956) empregando-se como padrão D-glicose,
sendo as leituras realizadas a 490 nm.

3.2.2.1.2 Proteínas

O conteúdo de proteínas foi determinado com o reagente de Coomassie blue

G 250 segundo o método de BRADFORD (1976) e a leitura realizada a 595 nm. A
curva de calibração foi feita utilizando albumina sérica bovina.

3.2.2.1.3 Sulfato

O teor de sulfato total foi determinado após hidrólise ácida (HCl 6 N, 6 horas,
100 ºC) por turbidimetria pelo método da gelatina-bário (DODGSON; PRICE, 1962).
O sulfato de sódio (1 mg/mL) foi utilizado como curva padrão sendo submetido as
mesmas condições das amostras em estudo.

3.2.2.1.5 Fenóis totais

A concentração de fenóis totais foi determinada colorimetricamente conforme

o procedimento padrão de Folin-Ciocalteu (SINGLETON; ROSSI, 1965) e as leituras
foram realizadas a 755 nm. Para a curva de calibração foram usadas soluções
aquosas de ácido gálico. O teor de fenóis totais foi determinado por interpolação das
absorbâncias das amostras contra a respectiva curva de calibração.
3.2.2.2 Análise da composição monossacarídica

Os polissacarideos foram hirolisados (HCl, 2N, 3 horas 100 °C).

Posteriormente, o material foi neutralizado, seco e aplicado em papel Whatman N°1.
Este foi submetido a cromatografia descendente em papel no seguinte sistema de
solvente: Butanol: Piridina: Água ( 2: 3: 1,5) v/v/v. Os monossacarídeos foram
revelados por redução com prata (TREVELYAN, 1950).

3.2.2.3 Análise de infravermelho

A espectroscopia de infravermelho foi realizada em espectômetro FT-IR ABB

Bomen modelo MB 104, de 4000 a 400 cm -1. O polissacarídeo foi analisado após
secagem sob a forma de pastilha de KBr. As análises foram realizadas no
Departamento de Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte sob
orientação do Prof. Ademir Oliveira da Silva.

3.2.2.4 Ressonância magnética nuclear (R.M.N)

As análises de R.M.N foram realizadas na Universidade Federal do Paraná

(UFPR), sob orientação do Prof. Guilherme Lanzi Sassaki, num magneto BRUKER,
modelo DRX 400, série AVANCE, em tubo (widebore probe) de 5 mm de diâmetro
externo. Os espectros foram obtidos a 80ºC utilizando 10mg dos polissacarídeos
dissolvidos em 0,5mL de água deuterada (D2O) a 99,75%.

3.2.3 Avaliação das atividades farmacológicas das glucanas do fungo

Caripia montagnei (GCM)

3.2.3.1 Avaliação do efeito de GCM no modelo de colite induzida por ácido 2,4,6-
trinitrobenzeno sulfônico (TNBS)
 A colite experimental é um modelo de inflamação intestinal bem estabelecido
e foi induzida em ratos Wistar (n=10) como descrito por MORRIS et al., (1989).
Animais em jejum por 24 horas antes do experimento e com livre acesso à solução
de glicose 5%, foram anestesiados com a administração intreperitonial de ketamina
(80 mg/Kg) e xilazina (10 mg/Kg). A indução da colite foi realizada pela
administração intracolônica de 30 mg de ácido 2,4,6-trinitrobenzeno sulfônico em
0,25 mL de solução de etanol a 40% (v/v) através de um catéter de polietileno
inserido no lúmen do cólon. Este mesmo procedimento foi realizado nos grupo
controle negativo, entretanto, os animais controle receberam 0,25 mL de solução
salina (0,9%) (FIGURA 9).

3.2.3.1.1 Tratamento

Os ratos foram tratados por via intraperitoneal e divididos em diferentes

grupos experimentais: 1) Ratos do grupo controle negativo e positivo receberam
como tratamento apenas solução fisiológica; 2) todos os outros ratos dos demais
grupos foram tratados com diferentes doses de glucanas (25, 50 e 75 mg/Kg). Os
tratamentos tiveram início 24h após a indução da colite experimental e foram
realizados de duas formas: de 12 em 12 horas ou de 24 em 24 horas, ambos
durante 60 h. Após 12 horas do último tratamento, os animais foram eutanasiados e
a cavidade abdominal foi rapidamente aberta, o cólon retirado e aberto para análise
do dano macroscópico e, posteriormente, foram realizados cortes transversais que
foram distribuídos aleatoriamente para as análises macroscópicas, microscópicas,
bioquímicas e imunológicas.
 FIGURA 9: Esquema do ensaio de colite induzida por TNBS.

3.2.3.1.2 Análise macroscópica

Para a analises macroscópica os animais foram avaliados quanto à presença

aos prejuízos intestinais pela atribuição de escore segundo uma escala previamente
descrita por BELL, GALL e WALLACE (1995).

Escore 0: Ausência de lesões.

Escore 1: Hiperemia, sem ulcerações.
Escore 2: Ulceração linear sem inflamação.
Escore 3: Ulceração linear com inflamação.
Escore 4: Duas ou mais ulcerações e inflamação.
Escore 5: Duas ou mais ulcerações e inflamação ou uma ulceração
com extensão superior a 1 cm longitudinalmente no cólon.
Escore 6-10: Se as lesões forem superiores a 2 cm de extensão
longitudinalmente, será atribuído 1 ponto para cada centímetro
adicional.

3.2.3.1.3 Avaliação da atividade da mieloperoxidase

Para avaliar a atividade da MPO, amostras do cólon dos diferentes grupos

foram obtidas e congeladas a -20 ºC até o uso. Após descongelamento, as amostras
foram pesadas e homogeneizadas em PBS 50 mM, pH 7,4. Os homogenatos foram
centrifugados a 8.000 rpm, por 20 min, a 4 ºC. Os pellets foram ressuspendidos em
PBS 50 mM, pH 6,0, contendo 0,5% brometo de hexadeciltrimetilamónio (HETAB) e
10 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Os homogenatos resultantes
foram submetidos a ciclos de congelamento/degelo e sonicados. A uma amostra do
homogeneizado (0,5 µL) foi adicionado 0,5 mL se solução contendo PBS 80 mM, pH
5,4, 0,5% de HETAB e 1,6 mM 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB). A mistura foi
incubada a 37 ºC e a reação foi iniciada pela adição de 0,3 mM de peróxido de
hidrogênio. As leituras foram realizadas a 655 nm. Uma unidade da atividade de
MPO foi definida como a quantidade de enzima presente que produzirá uma
mudança na absorbância de 1,0 U/min a 37 ºC no volume final da reação contendo o
acetato. Os resultados foram quantificados como mU/g da amostra (GRISHAM,
BENIOT, GRANGER, 1990).

3.2.3.1.4 Avaliação da atividade da fosfatase alcalina

Neste método a fosfatase alcalina age como catalisador para a hidrólise do

nitrofenilfosfato sódico (5,5 mM) em tampão glicina (50 mM, pH =10,5), que
incorpora MgCl2 e forma p-nitrofenol, molécula que apresenta absorção máxima de
405 nm. Os resultados foram expressos em mU/mg de proteína (Smith et al., 1985).
3.2.4.1.5 Avaliação da atividade da catalase

Amostras do cólon dos diferentes grupos foram utilizados para verificar a

atividade da catalase (CAT). A determinação da atividade da CAT presente nas
amostras de cólon foi realizada com base no método de LOCK (1963). Amostras do
cólon foram homogeneizadas em tampão fosfato 50 mM pH 7. Em uma cubeta de
quartzo a 2950 μL de solução reação (Tampão fosfato de potássio 50 mM, pH7,0 +
peróxido de hidrogênio 20 mM, 30 0C) foram adicionadas a 50 μL da amostra diluída.
A absorbância foi medida em comprimento de onda de 240 nm por 5 minutos.

3.2.3.1.6 Análise de citocinas

Amostras do cólon dos diferentes grupos foram pesadas e homogeneizadas

em solução de 0,3 mL de tampão fosfato (PBS, pH 7,2) a 4ºC. Em seguida, foram
centrifugados a 4000 rpm por 5 min. Os níveis de IL-1 e IL-6 foram determinados
utilizando-se kits específicos de Elisa (enzyme immuno sorbent assay) de acordo
com as recomendações do fabricante.

3.2.3.1.7 Análises histológicas

Amostras do cólon de todos os grupos foram removidos, fixados em formol,

incluídos em parafina e seccionados. As seções foram coradas em hematoxilina e
eosina.

3.2.4 Ação de GCM sobre células do carcinoma de cólon humano (HT-29)

3.2.4.1 Ação de GCM na viabilidade celular in vitro (Ensaio de MTT)

O método de MTT (brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolium)
é um ensaio de viabilidade celular utilizado para determinar a citotoxicidade após a
exposição das células a substâncias testes. A citotoxicidade de GCM foi avaliada
como previamente descrita por Mosmann (1983) utilizando células do carcinoma de
cólon humano HT-29. As culturas foram expostas a 25, 50 e 100 μg dos
polissacarídeos e incubadas a 37 °C por 24, 48 ou 72 horas. Após a incubação, 100
μL de meio DMEM contendo MTT (concentração final de 5 mg/mL), foi adicionado a
cada poço, e as placas foram incubadas a 37 °C por 4 horas. Decorrido o tempo, o
sobrenadante foi removido e 100 μL de etanol P.A. foram adicionados a cada poço
para solubilizar os cristais de formazan. Após homogeneização, a leitura foi
realizada a 570 nm. Para o controle da reação (100% de proliferação), os
polissacarídeos foram substituídos por meio DMEM.

3.2.4.2 Ensaio de apoptose (Anexina V-FITC/ PI) e distribuição do ciclo celular nas
células do carcinoma de cólon humano (HT-29)

3.2.4.2.1 Ensaio de apoptose (Anexina V-FITC/ PI)

A morte das células HT-29 foi avaliada utilizando a anexina V- isotiocianato de

fluorosceína – anexina V-FITC (detecção da exposição da fosfatidilserina na
membrana celular) e o iodeto de propídio (PI), de acordo com o kit de detecção de
apoptose BD Pharmingen Annexin V-FITC (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ). As
células HT-29 foram cultivadas em meio DMEM, a 37 °C sob atmosfera de 2,5% de
CO2. As células foram cultivadas em placas de 6 poços (100.000 células por poço) e
deixadas por 24 h, até atingirem confluência. Após a incubação, as células foram
carenciadas por 18 h e em seguida foram tratadas com 50 ou 100 μg de GCM
(diluído em meio DMEM) por 24 h. O sobrenadante, contendo as células não
aderentes, foi removido e reservado em um tubo Falcon, o qual foi centrifugado a
1000 g por 15 min. As células aderentes na placa foram lavadas duas vezes com
tampão EBSS (contendo o indicador de pH vermelho de fenol) e em cada poço foi
adicionado tripsina para descolar as células da placa. Em seguida, foi adicionado a
cada poço meio DMEM contendo soro bovino fetal e a suspensão de células
descoladas foi transferida para o tubo Falcon contendo as células não aderentes e
que já foram submetidas ao processo de centrifugação. A suspensão de células
aderentes e não aderentes na placa foram homogeneizadas e lavadas duas vezes
com tampão do kit diluído em PBS para ensaio de anexina V-PI e as células foram
ressuspendidas em 50 μL. As células foram incubadas com 3 μL de anexina V e 5
μL de iodeto de propídio por 20 minutos a temperatura ambiente no escuro. Após a
incubação, em cada tubo teste foi adicionado 350 μL do tampão do kit e as células
foram imediatamente analisadas em citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton
Dickinson, USA). O ensaio foi realizado em triplicata.
3.2.4.2.2 Ensaio da distribuição das células no ciclo celular

Para realização da análise da progressão do ciclo celular, as células de

carcinoma de cólon humano (HT-29) foram submetidas a mesma metodologia
aplicada para o ensaio de apoptose anexina V-FITC/ PI (item 3.2.4.3.1). A
suspensão de células aderentes e não aderentes foram fixadas com formaldeído
2%, e incubadas a 4 °C por 30 minutos. Após incubação, as células foram lavadas
com PBS (150 mM, pH 7,4). Posteriormente, foi adicionado PBS contendo 0,01% de
saponina, para permeabilizar as células. A seguir, foi adicionado uma solução
estoque de RNase a 4 mg/mL em tampão acetato de sódio 0,05M, pH 5,0 contendo
0,02 M de MgSO4. E a suspensão foi incubada por 1 h a 37 °C. Após este tempo, foi
adicionado 5 μL de solução estoque de PI (5 mg/mL) a temperatura ambiente, e as
células foram homogeneizadas e em seguida transferidas para tubo de FACS, no
qual foi adicionado 300 μL de PBS e as células foram analisadas em citômetro de
fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson, USA). O ensaio foi realizado em triplicata.

3.2.4.3 Ensaio de atividade antioxidante in vitro

Células HT-29 foram incubadas a uma densidade de 3x10 4 células por poço
em placas de 96 poços a uma atmosfera de 5% CO2 por 24 horas. Após esse
período, as células foram incubadas com 25, 50 ou 100 µg/100 µL de GCM
juntamente com 100 μL de DCFH-DA a 25 µM e deixadas ao abrigo da luz por 4
horas. Após esse período, o sobrenadante foi removido e os poços foram lavados 2
vezes com PBS (0,1M, pH 7,4). Para avaliar o efeito protetor de GCM, peróxido de
hidrogênio (15 µM) foi adicionado e deixado por 30 minutos em contato. A leitura foi
realizada em leitor de microplacas sigma D-6883, sob excitação de 485 nm e
emissão de 530nm.

3.2.4.4 Ensaio de adesão

 Células HT-29 foram incubadas em placas de 96 poços a uma densidade de
4
3x10 células por poço. Anteriormente a incubação de células, os poços foram
revestidos com Matrigel® (250 ng/mL) diluído em tampão PBS (0,1 M, pH 7,0) por
16 horas a 4ºC. O controle de adesão inespecífica foi avaliado em poços que não
continham Matrigel®. Em seguida cada poço foi lavado 4 x com PBS. Em seguida,
as células foram adicionadas, juntamente com solução de 25, 50 ou 100 µg/100 µL
de GCM ou DMEM. Após 4 horas de incubação a uma atmosfera de 5% CO 2, os
poços foram lavados novamente com PBS (por 3 vezes). as células aderidas foram
fixadas com metanol por 10 minutos e novamente lavadas com PBS por 3 vezes. as
células HT-29 foram, então, coradas com cristal violeta (0,2% em 2%) por 5 minutos
e, posteriormente, lavadas exaustivamente com PBS por 10 vezes. Então, as células
foram lisadas com citrato de sódio (0,1 M) em etanol (1:1) e a absorbancia medida
em leitor de microplacas a 550 nm sendo o branco substituido por solução de lise.

3.2.5 Análises estatísticas

Todos os resultados foram submetidos a análise estatística, sendo analisadas

as repetições e as formas de tratamento. Os resultados foram submetidos à análise
de variância ANOVA. Para avaliar as diferenças entre os tratamentos e controle foi
utilizado o teste de Tukey-Kramer, que permite estabelecer a diferença mínima
significante entre duas médias, com nível de significância de p < 0,001.
4 RESULTADOS

4.1 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA

O tecido do cogumelo Caripia montagnei foi submetido a extração e as

dosagens revelaram que o composto extraído é formado, principalmente, por
polissacarídeos (96%) e apresenta um baixo teor de proteínas (2,5%) e compostos
fenólicos (1,5%) (FIGURA 10). A composição monossacarídica foi realizada por
cromatografia descendente em papel e mostrou a glicose como açúcar
predominante existente na fração polissacarídica obtida de C. montagnei (dado não
mostrado). Não foi verificada a presença de sulfato na amostra. Estes dados são
similares aos encontrados também por QUEIROZ et al., (2010) estudando um
extrato rico em polissacarídeos de Caripia montagnei.

FIGURA 10: Composição química do composto extraído dos corpos de frutificação do fungo
Caripia montagnei.
 4.1.1 Espectro FT-IR

A análise de FT-IR (FIGURA 11) revelou a banga larga em torno de 3500 cm-
1
, cujo sinal é característico do estiramento axial do grupo OH. O sinal existente na
faixa de 2900 e 2800 cm-1 demonstrou a presença do grupamento aldeído (C-H) em
deformação axial. As análises também revelaram absorções entre 1300-1800 cm-1,
características da presença de carboidratos (PAGLIA; VALENTINE, 1967;
WORTHINGTON; ROSEMEYER, 1974). Além disso, foi observada a presença da
banda entre 1000 e 1100 cm-1, ou seja, 1045 cm-1 sendo característico da presença
de β-glucanas devido aos resíduos de glucose O-substituídos (MATHLOUTHI;
KOENIG, 1986; STONE; CLARKE, 1992). Um sinal foi encontrado na faixa dos 855
cm-1 o qual corresponde a presença de α-glucanas (FANG et al., 2012).

FIGURA 11: Espectro FT-IR dos polissacarideos obtidos por extração aquosa seguido de
precipitação com etanol do fungo Caripia montagnei.
 4.1.2 RMN

O espectro de 1H dos polissacarídeos de C. montagnei mostrou sinais na

região anomérica a 4-5 ppm (FIGURA 12A). Os sinais existentes em 5.07 e 5.09
ppm são atribuídos a presença de α-glucanas. Sinais existentes em 4.96 e 4.98 ppm
correspondem à presença de -glucanas (ROY et al., 2009). Os principais sinais
anoméricos (C-1/H-1) no “Heteronuclear single quantum correlation spectroscopy”
(HSQC) (FIGURA 12B) encontram-se 100.55/5.01 e 103.32/5.01 e 103.99/4.97
correspondendo ao C-1 das unidades A, B e C, respectivamente, de acordo com a
diminuição dos deslocamentos químicos anoméricos (PERLIN; CASU, 1969). Os
sinais em baixa freqüência de ressonância em C-1 a 100,32 e 103,55 e em alta
α-D-Glc
freqüência em H-1 a 5.01 apontam para a presença de (GHOSH
et al., 2008; HUANG; ZHANG, 2009). Enquanto o sinal a 103,99/4.97 indica a
presença de Glc terminal (β-Glc; H-1 a 4,97 ppm) (SADOVSKAYA et al., 2010).
Desta forma, podemos afirmar que as glucanas foram os polissacarídeos extraídos
de Caripia montagnei corroborando com os dados obtidos nas análises de FT-IR.
FIGURA 12: Caracterização química das glucanas de Caripia montagnei (GCM). (A) Espectro de
1
RMN de H; (B) Espectro de HSQC.
4.2 AVALIAÇÃO DO EFEITO DE GCM NO MODELO DE INFLAMAÇÃO COLÔNICA
INDUZIDA POR TNBS EM RATOS WISTAR

4.2.1 Análise macroscópica

Como podemos observar na FIGURA 13, a administração intracolônica de

TNBS promoveu um aumento significativo de lesões macroscópicas. No grupo
controle positivo foram comumente encontradas lesões como ulcerações e necrose
(13A) em contraste ao grupo controle negativo no qual não houve lesões (13B). O
tratamento dos animais com dexametasona (13I-J) e com GCM em diferentes
intervalos e doses foi capaz de reduzir os danos observados (13C-H). Na analise
macroscópica a extensão e a severidade do dano intestinal foram avaliadas de
acordo com uma escala descrita por BELL et al. (1995). Nesta análise, o escore, o
qual mostra a severidade do dano intestinal, mostrou que o grupo não tratado,
controle positivo, apresenta escore alto (13,6 ± 0,51) mostrando o prejuízo intestinal
dos animais induzidos à inflamação colônica (FIGURA 13K). Também pode ser visto
que há uma redução significativa do dano entre os grupos controle positivo e o grupo
tratado com dexametasona (0,5 ± 0,54) para ambos os intervalos de tempo e os
grupos tratados com glucanas a 75 mg/ Kg nos intervalos de 12 h (6,6 ± 0,81) e 24
h (6,5 ± 0,83). Os grupos tratados com dexametasona em diferentes intervalos de
tempo não exibiram diferenças estatísticas com o controle negativo (ns; p > 0,05).
 K

FIGURA 13: Lesões macroscópicas no cólon de ratos (n = 3) com colite induzida por ácido
2,4,6-trinitrobenzenossulfónico (TNBS). (A): Animais do controle positivo - TNBS, (B): controle
negativo, (C e D): tratado a cada 12 e 24 h, respectivamente, com 25 mg / Kg de GCM, (E e F):
tratado a intervalos 12 e 24 h, respectivamente, com 50 mg / Kg de GCM, (G e H): tratada a cada 12
e 24 h, respectivamente, com 75 mg / Kg de GCM, (I e J): tratada a cada 12 h e 24 h,
respectivamente, com 1 mg / Kg de dexametasona; (K) o efeito de GCM na inflamação do cólon. Os
dados são expressos como a média ± desvio padrão. *** p <0,001.
 4.2.2 Atividade da mieloperoxidase

A atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) foi avaliada como parâmetro

para verificar a atividade anti-inflamatória de GCM. A FIGURA 14 mostra que a
administração do TNBS elevou em mais de 6 vezes a atividade da MPO quando
comparado com o controle negativo. Os resultados mostraram também que os
tratamentos realizados em diferentes intervalos (24/24 h e 12/12 h) e com variadas
doses de GCM foram capazes de reduzir a atividade enzimática de forma
significativa. A dose de 75 mg/Kg de glucanas reduziu em cerca de 3,7 e 3,8 vezes a
atividade de MPO quando administrada em intervalos de 12 h e 24 h,
respectivamente. A redução da atividade enzimática com relação ao controle
positivo foi dose-dependente e os diferentes intervalos de tratamentos não mostrou
interferir de forma estatisticamente significativa no efeito de GCM.

FIGURA 14: Efeito de GCM na atividade da enzima mieloperoxidase na inflamação intestinal de

animais (n = 4) com colite induzida por TNBS. Os dados foram expressos como a média ± desvio
padrão. *** p < 0,001.
 4.2.3 Atividade da fosfatase alcalina

A atividade da enzima fosfatase alcalina (FA) colônica foi outro parâmetro

bioquímico analisado no modelo de colite induzida por TNBS. Foi verificado altos
níveis (1,14 ± 0,011 U/mg e 1,12 ± 0,097 U/mg, para os grupos tratados a cada 12 h
e 24 h, respectivamente) de FA nos grupos com colite induzida com TNBS (FIGURA
15). A razão para o aumento da FA colônica encontrado na retocolite ulcerativa é
desconhecida, mas essa relação foi demonstrada pela primeira vez por SÁNCHES
DE MEDINA et al. (1996) quando relataram que a FA constitui um marcador sensível
e seguro de colite experimental em ratos. A atividade da enzima fosfatase alcalina
(FA) colônica foi reduzida significativamente apenas nos grupos tratados com 50
mg/Kg (0,77 ± 0,13 U/mg; p < 0,05) e 75 mg/Kg (0,75 ± 0,028 U/mg; p < 0,01) de
GCM em intervalos de 24 horas. O efeito observado foi dose-dependente e foi
verificada a redução de até 33 ± 2,5% na atividade da FA. O grupo tratado com 75
mg/Kg de GCM em intervalos de 24 h não exibiu diferença estatística com os grupos
tratados com dexametasona (ns; p >0,05).

FIGURA 15: Avaliação do efeito de GCM sobre a atividade da fosfatase alcalina no tecido do
colônico de animais (n = 4) com colite induzida por TNBS. Os dados foram expressos como a
média ± desvio padrão. * p < 0,05; ** p < 0,01.
 4.2.4 Atividade da catalase (CAT)

O sistema antioxidante é usualmente utilizado para avaliar o efeito protetor de

compostos diversos na inflamação colônica. Os níveis de catalase na região
colônica de grupo de animais que não recebeu TNBS foi de 537,23 ± 17,5 nmol
H2O2/mim/g de proteina. A administração de TNBS aumentou os níveis de CAT para
723,52 ± 137 nmolH2O2/mim/g de proteina. Em todos os grupos tratados com GCM
foi verificado aumento moderado dos níveis de CAT de forma dose-dependente até
1300,61 ± 141 (p < 0.05) e 1577,28 ± 37,5 (p < 0,05) nos grupos tratados com 75
mg/Kg em intervalos de 12 h e 24 h, respectivamente, com relação ao grupo controle
positivo (FIGURA 16). O leve aumento da atividade da catalase observado no grupo
controle positivo não apresentou diferença estatística significativa com o grupo
controle negativo (ns; p > 0,05).

FIGURA 16: Efeito de diferentes doses de GCM na catalase do tecido do cólon em animais
com colite induzida por TNBS. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. ** p <
0,01; *** p < 0,001
 4.2.5 Óxido nítrico

O óxido nítrico, na maioria dos fluidos corporais é rapidamente metabolizado

em produtos estáveis, tais como nitrito e nitrato. De acordo com os resultados
obtidos (FIGURA 17), as glucanas mostraram reduzir significativamente (p < 0,001)
o teor de NO2/NO3 em todos os grupos (n = 4) tratados com GCM em intervalos de
12 e 24 h. Em reações inflamatórias, o oxido nítrico derivado de células estimuladas
pela ação de citocinas estão envolvidos com alterações na permeabilidade vascular
do tecido inflamado (CHANG; CHAN; CHAN, 2003). Assim, é possível que a redução
deste mediador inflamatório esteja relacionado com o potencial anti-inflamatório de
GCM.

FIGURA 17: Efeito de diferentes doses de GCM no teor de óxido nítrico no tecido do cólon no
modelo de colite induzida por TNBS. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. ***
p < 0,001
 4.2.6 Análise de citocinas

As alterações do ambiente colônico observadas no processo inflamatório

intestinal geralmente estão associadas a respostas imunes atípicas de células T que
frequentemente levam a alteração dos níveis de citocinas. Foi verificado que nos
grupos tratados com TNBS os níveis de IL-1 e IL-6 aumentaram cerca de 4,7 e 4,1
vezes, respectivamente, quando comparado ao grupo não-tratado. GCM não foram
capazes de alterar os níveis de IL-1 em nenhum dos grupos testados (FIGURA 18A).
Entretanto, foi verificado o efeito de GCM sobre a liberação de IL-6 nos grupos
tratados em diferentes intervalos e de forma dose-dependente chegando a reduzir
até 64,8 ± 4,11% e 57,2 ± 6,45% os níveis desta citocina no tecido colônico do grupo
tratado com 75 mg/Kg de glucanas nos intervalos de 12 h e 24 h, respectivamente
(FIGURA 18B).
FIGURA 18: Efeito de GCM na modulação da liberação de citocinas (A) IL-1 e (B) IL-6 no tecido
do cólon (n = 4) com inflamação induzida por TNBS. Os dados foram expressos como a média ±
desvio padrão. * p < 0,05; ** p < 0,01.

4.2.7 Análises histológicas

O alto infiltrado de neutrófilos é uma conseqüência bem característica deste

modelo experimental de inflamação aguda. A avaliação histopatológica revelou a
destruição das criptas e um proeminente infiltrado de células inflamatórias na
submucosa (FIGURA 19A). O grupo controle negativo não exibiu alteração
morfológica, no qual as camadas teciduais (mucosa, submucosa e muscular da
muscosa) podem ser claramente identificadas (FIGURA 19B).
 O tratamento com dexametasona (FIGURA 19I-J) e com GCM em diferentes
intervalos de tempo e dose (FIGURA 19C-H) foram capazes de reduzir o dano às
criptas intestinais bem como o infiltrado, fato corroborado com a redução observada
na atividade da enzima mieloperoxidase.

FIGURA 19: Análise histológica do cólon de diferentes grupos de animais com colite induzida
por TNBS. (A): animais do controle positivo - TNBS, (B): controle negativo, (C e D): tratado a cada
12 h e 24 h, respectivamente, com 25 mg / Kg de GCM, (E e F): tratado a intervalos de 12 h e 24 h,
respectivamente, com 50 mg / Kg de GCM, (G e H): tratada a cada 12 h e 24 h, respectivamente, com
75 mg / Kg de GCM, (I e J): tratada a cada 12 h e 24 h, respectivamente, com a 1 mg / Kg de
dexametasona.
4.3 EFEITO DE GCM SOBRE CÉLULAS DO CARCINOMA DE CÓLON HUMANO
(HT-29)

4.3.1 Ação de GCM na viabilidade celular in vitro (Ensaio de MTT)

Para avaliar o efeito de GCM sobre as células do carcinoma de colon humano

foi utilizado o método do MTT (FIGURA 20).
A viabilidade mitocondrial (através da avaliação da atividade de
desidrogenases mitocondriais), e conseqüentemente, a viabilidade celular, é
quantificada pela redução do sal MTT pelas células a um produto de coloração
arroxeada e insolúvel em água chamado formazan. Este produto, acumulado dentro
da célula, é extraído através da adição de um solvente apropriado (MOSMANN,
1983).
Neste ensaio foi verificado que as concentrações mais baixas (6,25, 12,5 e 25
µg/100 µL) não apresentaram efeito tóxico em até 72h de incubação com as
glucanas em estudo. Entretanto, o aumento da concentração para 50 e 100 µg/100
µL de GCM reduz a viabilidade em 46,7% e 64,8%, respectivamente, quando
incubadas por um período de 24 horas. Além disso, o aumento do período de
incubação para 48 e 72 horas resultou na inibição significativa da viabilidade das
células HT-29 da ordem de 90% em ambas as concentrações.
FIGURA 20: Efeito de diferentes doses de GCM na viabilidade de células do carcinoma de
cólon humano (HT-29) nos períodos de incubação de 24, 48 e 72 horas. Os dados foram
expressos como a média ± desvio padrão. (a): p < 0,01; (b): p < 0,001.

4.3.2 Ensaio de apoptose

Células em apoptose apresentam alterações na membrana plasmática como,

por exemplo, a transferência da fosfatidilserina da camada interior da membrana
plasmática para a exterior (BRATTON et al., 1997). A fosfatidilserina foi quantificada
pela sua ligação a anexina V, uma proteína de recombinação que apresenta uma
afinidade específica para moléculas de fosfatidilserina. Neste ensaio, as células
necróticas foram quantificados por coloração de PI, composto somente permeável a
células mortas.
As FIGURAS 21 e 22 mostram o efeito de GCM na apoptose em células HT-
29 por coloração com anexina V-FITC/PI. A porcentagem de células em apoptose
precoce (anexina V-positiva/PI-negativo) aumentou de 9,27% no grupo não tratado
para 11,66% no grupo tratado com 0,5mg/mL (p < 0,05) e para 14,06% no grupo
tratado com 1 mg/mL (p < 0,001) de GCM, resultando em um aumento de cerca de
20% e 36%, respectivamente. Além disso, houve uma considerável redução de
células necróticas (anexina V-positiva/PI-negativo) de 67,5% e 66,8% para os
grupos tratados com 0,5 e 1 mg/mL (p < 0,01) de GCM. Estes resultados
demonstraram que GCM suprimiram a proliferação de células HT-29 através da
indução de apoptose.

FIGURA 21: Análise de citometria de fluxo com dupla marcação para anexina V-FITC e PI em
células do carcinoma de cólon humano (HT-29). As células foram tratadas com 50 ou 100 μg de
GCM por 24 horas. (A): controle negativo (sem tratamento), (B): células tratadas com 50 μg de GCM,
(C): células tratadas com 100 μg de GCM. Quadrante superior esquerdo: marcação negativa para
anexina V-FITC e positiva para PI (células não viáveis – necrose); quadrante superior direito:
marcação positiva para anexina V-FITC e PI (células não viáveis – apoptose tardia); quadrante
inferior esquerdo: marcação negativa para anexina V-FITC e PI (células viáveis); quadrante inferior
direito: marcação positiva para anexina V-FITC e negativa para PI (células não viáveis – apoptose
precoce).
FIGURA 22: Efeito de GCM na viabilidade das células de carcinoma de cólon humano (HT-29)
avaliada por citometria de fluxo. Células viáveis: marcação negativa para anexina V-FITC (V) e PI;
Células não viáveis: marcação positiva para anexina V-FITC e negativa para PI (células em apoptose
precoce); marcação negativa para anexina V-FITC e positiva para PI (células em necrose); marcação
positiva para anexina V-FITC e PI (células em apoptose tardia). Valores foram expressos por médias
± desvio padrão. (a): p < 0,005; (b): p < 0,001.

4.3.3 Ensaio de distribuição do ciclo celular

A proliferação celular descontrolada é uma característica típica de câncer

(HANAHAN; WEINBERG, 2011). Controlando a progressão do ciclo celular das
células cancerosas pode-se impedir ou atrasar a progressão do tumor. Muitos
agentes anticâncer aprisionam o ciclo de células cancerosas em G1, S e G2 / M fase
(MORK; FALLER; SPANJAARD, 2005).
A análise da influência de GCM na progressão do ciclo celular das células HT-
29 foi avaliada pela coloração com iodeto de propídio e posterior analise por
citometria de fluxo (FIGURA 23 e TABELA 1). O iodeto de propídio é um agente que
se intercala às duplas fitas de DNA de células danificadas emitindo fluorescência. A
excitação do iodeto de propídio resulta na emissão de fluorescência celular
proporcionalmente ao conteúdo de DNA.
Não houve alteração significativa na fase S e uma leve alteração ocorreu na
fase G2/M de células tratadas com a concentração de 1 mg/mL de GCM (p < 0,05).
No entanto, foi verificado que o tratamento com as glucanas induziram um acúmulo
de células na fase G1 com relação às células não tratadas (37,93%). O aumento
verificado foi da ordem de 29% e 32,8% para as células tratadas com 0,5 e 1 mg/mL
(p < 0,001), respectivamente, de GCM.

FIGURA 23: Análise da distribuição no ciclo celular das células do carcinoma de cólon humano
(HT-29). (A): distribuição do ciclo celular das células não tratadas (células controle), (B): distribuição
do ciclo celular das células tratadas com 50 μg de GCM, (C): distribuição do ciclo celular das células
tratadas com 100 μg de GCM.
TABELA 1: Avaliação do efeito de GCM na distribuição das células do carcinoma de cólon
humano (HT-29) no ciclo celular. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. Fases
do ciclo celular - G1: gap 1; G2: gap 2; S: fase de síntese.

4.3.4 Ensaio de adesão

Este ensaio foi realizado visto que, eventos de adesão célula-célula e célula
matriz extracelular (MEC) são de grande importância no organismo.
Matrigel® é um composto constituído por diferentes proteínas da matriz
extracelular que incluem laminina, colágeno IV e entactina (KLEINMAN; MARTIN,
2005). A capacidade de células tumorais de alterar a sua migração e adesão aos
componentes da matriz extracelular (MEC), faz com que essas células contornem
obstáculos mais facilmente e alcançem a circulação, não se depositando em outros
locais do organismo.
Foi investigado a capacidade do tratamento com GCM de alterar a aderência
das células HT-29 (FIGURA 24). Os resultados mostram que o tratamento com as
glucanas na concentração de 25 mg/mL afetou de forma moderada (68,72%) a
aderência das células HT-29 ao matrigel. Além disso, o aumento das concentrações
para 50 e 100 mg/mL, reduziu significativamente em cerca de 84,75% e 85,25%,
essa aderência ao Matrigel.
FIGURA 24: Efeito de GCM sobre a adesão de células do carcinoma de cólon humano (HT-29)
ao matrigel. Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. *** p < 0,001.

4.3.5 Ensaio de atividade antioxidante

As concentrações intracelulares de ROS foram avaliadas de acordo com as

alterações na intensidade de fluorescência de DCF.
Diclorofluoresceína-diacetato (DCFH-DA) é um indicador útil de espécies
reativas de oxigênio (ROS) e estresse oxidativo. DCFH-DA atravessa as membranas
celulares e é hidrolisada por esterases intracelulares a um composto não
fluorescente diclorohidrofluoresceina (DCFH). Na presença de ROS, tal como
peróxido de hidrogénio (H2O2), hidroperóxidos lipídicos e peroxinitrito, DCFH é
oxidado para fluorescente diclorofluoresceína (DCF) (GIRARD-LALANCETTE;
PICHETTE; LEGAULT, 2009).
A FIGURA 25 mostra que a incubação das células com H202 provocou um
aumento na geração de ROS intracelular nas células HT-29. Entretanto, também foi
visto que quando as células foram tratadas com as diferentes concentrações de
GCM, foi verificado uma redução significativa de ROS intracelular para todas as
concentrações testadas.
FIGURA 25: Avaliação da atividade antioxidante in vitro de GCM em células do carcionoma de
cólon humano (HT-29). Os dados foram expressos como a média ± desvio padrão. * p < 0,05.
5 DISCUSSÃO

Polissacarídeos são compostos biologicamente ativos que podem ser úteis

para a utilização farmacêutica (ZHU et al., 2013; MA et al., 2013).
Diversos polissacarídeos fúngicos têm sido investigados por apresentarem
uma ampla variedade de ações farmacológicas. Entretanto, sua aplicação
terapêutica parece estar relacionada à estrutura química. A conformação espacial de
cada biomolécula e pequenas diferenças estruturais de cada polímero podem
resultar em características únicas para diferentes aplicações biotecnológicas
(WASSER, 2002; COLLEONI-SIRGHIE; FULTON; WHITE, 2003).
A extração aquosa de polissacarídeos é uma das técnicas mais utilizadas nos
estudos científicos (GIACOMINI et al., 2003; BELLINI et al., 2006; KOZARSKI et al.,
2011; FINIMUNDY et al., 2013). Sua eficiência na obtenção dos polissacarídeos, o
alto rendimento e o baixo custo podem ser os principais motivos de sua larga
utilização.
Jeong et al., (2004) também mostraram que extratos solúveis em água e o
precipitado etanólico obtido a partir dos corpos de frutificação do fungo Coriolus
versicolor apresenta altos teores de polissacarídeos (74%). Assim, após extração
aquosa do fungo Caripia montagnei, os valores ficaram em torno de 96% para
açúcares totais, demonstrando que o composto extraído de Caripia montagnei é
composto prioritariamente por polissacarídeos. Estudos anteriores com
polissacarídeos de C. montagnei obtidos após extração aquosa, também mostraram
altos teores de carboidratos (QUEIROZ et al., 2010; CASTRO et al., 2014). Esse
resultado mostra que a extração aquosa dos corpos de frutificação de fungos é uma
forma eficiente de obtenção de polissacarídeos.
Uma das primeiras medidas a serem tomadas a respeito da análise estrutural
de um polissacarídeo é conhecer os resíduos monossacarídicos que o constituem
(NELSON; COX, 2000). No presente estudo com C. montagnei foram encontrados
resíduos de glicose, como sendo seu principal constituinte. Esta mesma composição
monossacarídica foi encontrada por QUEIROZ et al., (2010) ao estudar um extrato
rico em polissacarídeos de C. montagnei.
A análise de infravermelho é comumente aplicada à identificação de
características estruturais específicas, como a configuração das ligações glicosídicas
e a presença de proteína (GUTIÉRREZ; PRIETO; MARTÍNEZ, 1996; KRCMAR et al.,
1999). Neste estudo, observamos a presença de sinais em algumas bandas do
espectro que estariam possivelmente relacionadas com a presença α- e β- glucanas.
Isto foi confirmado pelas análises de RMN.
Foi previamente relatado que o extrato aquoso rico em polissacarídeos dos
corpos de frutificação de Caripia montagnei apresentou potencial anti-inflamatório
utilizando-se modelos de edema plantar induzido por carragenana e peritonite
induzida por tioglicolato. Observou-se, também, redução no edema inflamatório e
nos níveis de migração leucocitária diminuindo os níveis de óxido nítrico, IL-10 e
IFN-γ, além da inibição da expressão do fator nuclear κB no lavado peritoneal de
camundongos (QUEIROZ et al., 2010). Polissacarídeos de C. montagnei também
apresentaram atividade anti-inflamatória no modelo de pleurisia induzida por
carragenana, além de ações anti-angiogênica e antioxidante (CASTRO et al., 2014).
Neste estudo, as glucanas extraídas do fungo Caripia montagnei (GCM)
foram utilizadas para avaliar seu potencial anti-inflamatório em um modelo bem
descrito de colite induzida por TNBS e sua ação sobre células do carcinoma do
cólon humano, HT-29.
Doenças inflamatórias do intestino (DII), que incluem a Colite Ulcerosa (UC) e
Doença de Crohn (DC), são inflamações idiopáticas crônicas no intestino,
caracterizadas por disfunção das células T da mucosa, produção anormal de
citocinas e inflamação celular resultando em danos no intestino delgado distal e
mucosa colônica, o que resulta em friabilidade difusa e sangramento (MAGALHAES,
1993; FIOCCHI, 1998; CHENG et al, 2007).
Ácido trinitrobenzeno sulfônico (TNBS) e sulfato de sódio utilizando dextrano
(DSS) ou oxazolina são normalmente utilizados em modelos de doenças
inflamatórias intestinais (DII) quimicamente induzidas devido à imediata inflamação,
a elevada reprodutibilidade e a simplicidade do processo de indução (HOFFMANN et
al., 2002).
Após a indução da colite com TNBS foi observada a presença de lesões
colônicas, como hiperemia e ulcerações. Nas análises histológicas também foram
observadas a destruição da camada mucosa e um proeminente e difuso infiltrado de
leucócitos.
A inflamação crônica e o aumento da proliferação de células epiteliais são
observados no exame patológico das DII’s. Em seguida, a infiltração de células
inflamatórias é encontrada na mucosa com inflamação crônica, resultando na
liberação de mediadores inflamatórios, espécies reativas de oxigênio e metabólitos
de nitrogênio (ZHOU et al., 2006; STROBER; FUSS; MANNON, 2007).
Três parâmetros bioquímicos associados com o desenvolvimento do processo
lesivo promovido pelo TNBS foram determinados para avaliar o possível mecanismo
de ação de GCM confirmado nas análises macroscópicas.
Dentre os parâmetros bioquímicos destacam-se as alterações da atividade da
mieloperoxidase (MPO), da fosfatase alcalina (FA) e da catalase (CAT).
A MPO é a enzima encontrada nos grânulos azurofílicos de neutrófilos e que
catalisa a conversão do peróxido de hidrogênio (H2O2), na presença de cloro, a
ácido hipocloroso (HClO). Este é um potente oxidante envolvido no mecanismo de
defesa contra agentes infecciosos, mas que também pode atuar sobre as células,
resultando em danos (KETTLE; WINTERBOURN, 1991).
Esses neutrófilos ativados produzem espécies reativas de oxigênio e
nitrogênio na mucosa intestinal induzindo estresse oxidativo, que desempenha um
papel significativo na patogênese das doenças inflamatórias intestinais (MARTIN et
al., 2006; TALERO et al., 2008). Neutrófilos também foram sugeridos por contribuir
marcadamente no dano tecidual e disfunção da mucosal em humanos com IBD bem
como em modelos animais de colite (GUO et al., 1999). Além disso, a inibição da
função dos neutrófilos levou a redução do dano tecidual (CASTRO, 1985; PALMEN
et al., 1995).
Assim, níveis teciduais de atividade da MPO são usados como um
quantitativo para medir a infiltração de neutrófilos na resposta inflamatória tanto na
clínica como em estudos experimentais (KRAWISZ et al., 1984).
Carlson et al., (2002) sugeriram que o influxo de neutrófilos ativos nos sítios
de inflamação governa o processo inflamatório de diversas doenças. As analises
histológicas corroboram com a redução dos níveis de MPO, de modo que pode ser
visualizada a redução da infiltração celular no tecido inflamado.
Um extrato aquoso de Innonotus obliquos mostrou também reduzir os níveis
de MPO no tecido colônico de camundongos com colite induzida por DSS (MISHRA
et al., 2012). Entretanto, o pleuran, uma beta-glucana isolada do cogumelo Pleurotus
ostreatus, mostrou não prevenir contra o aumento da MPO no tecido colônico de
animais com inflamação induzida por ácido acético (NOSÁL'OVÁ et al., 2001).
Os mediadores do processo inflamatório estão em intensa atividade após a
administração de TNBS, dados que podem ser observados pela atividade da
mieloperoxidase (FIGURA 13) e da fostatase alcalina (FIGURA 14), quando
comparados os animais do grupo controle positivo e negativo. As doses de 75 e 50
mg/Kg, respectivamente, conseguiram reduzir significativamente os níveis destas
enzimas no tecido colônico.
A fosfatase alcalina (FA) compreende um grupo de enzimas fosfohidrolases
que apresentam atividade máxima em pH alcalino próximo a 10. Esta é uma enzima
de ocorrência natural presente nas células e nos tecidos. A isoforma da FA intestinal
é expressa em grande quantidade no revestimento intestinal (GOLDBERG et al.,
2008; TUIN et al., 2009), sendo, assim, considerada um marcador de diferenciação
das células epiteliais do intestino (FUKUSHIMA et al., 1998; LEE et al., 2005).
A razão para o aumento da FA colônica encontrado na retocolite ulcerativa é
desconhecida, mas essa relação foi demonstrada pela primeira vez por Sánches de
Medina et al., (1996) quando relataram que a FA constitui um marcador sensível e
seguro de colite experimental em ratos.
Sánches de Medina et al., (2004) demonstraram que a atividade da fosfatase
alcalina estava aumentada em diferentes modelos de colite, fato que foi atribuído a
presença excepcional de células epiteliais e células da lâmina própria,
principalmente leucócitos.
A geração aumentada de espécies reativas de oxigênio também foi
considerada como um papel chave na patogênese da DII (BUFFINTON; DOE, 1995;
PAVLICK et al., de 2002).
Sob condições fisiológicas normais, as defesas antioxidantes protegem os
tecidos dos danos causados pelos radicais livres, que podem causar lesões nos
tecidos quando em excesso. Alguns mecanismos de defesa do organismo, como a
catalase, são relativamente deficientes no cólon quando comparados aos do fígado.
Este fato pode sugerir que o dano oxidativo na mucosa colônica ocorra de forma
intensa (THAM et al., 2002).
A catalase (CAT) é uma enzima presente no sangue, na medula óssea, nas
mucosas, no rim e no fígado (FERREIRA; MATSUBARA, 1997; RAHMAN et al.,
2006), que tem função antioxidante e atua catalisando a redução do peróxido de
hidrogênio (H2O2) a água (H2O) e oxigênio (O2).
GCM mostraram aumentar os níveis desta enzima no tecido colônico de
animais com colite induzida por TNBS. É possível que este aumento nos níveis da
catalase seja considerado um importante fator de proteção contra os altos índices de
oxidantes gerados durante o processo inflamatório colônico.
Um extrato do fungo Pleurotus ostreatus também mostrou elevar os níveis de
catalase em ratos Wistar com dano hepático induzido por tetracloreto de carbono
(CCL4-). Além disso, o tratamento com este extrato restabeleceu os níveis da
enzima fosfatase alcalina, que foram aumentados significativamente em decorrência
da administração do CCL4- (JAYAKUMAR; RAMESH; GERALDINE, 2006).
Os fármacos convencionais mais utilizados no tratamento da colite ulcerativa
são os aminosalicilatos que auxiliam a manter a remissão das crises, os corticóides
que são utilizados durante os episódios agudos e os imunomoduladores (HEAD;
JURENKA, 2003). Um grande número de drogas que atuam como anti-inflamatórios
gerais ou seletivos têm sido empregados, porém consegue-se a remissão das
crises, mas não a cura da doença (BIONDO-SIMÕES et al., 2003).
A maioria dos efeitos dos derivados de cogumelos inclui mitogenicidade e
ativação de células do sistema imunológico como células hematopoiéticas, linfócitos,
macrófagos e células NK, resultando na produção de citocinas (LULL; WICHERS;
SAVELKOUL, 2005). A ativação de macrófagos pela via clássica leva a secreção de
óxido nítrico e citocinas pró-inflamatórias enquanto a ativação pela via alternativa
leva a liberação de citocinas anti-inflamatórias (GORDON, 2003).
Diversos estudos já comprovaram efeitos dos polissacarídeos fúngicos sobre
macrófagos. O extrato aquoso de Clinopodium vulgare mostrou reduzir os níveis de
IL-1β e IL-10 em cultura de células RAW 264.7 (BURK et al., 2009). Polissacarídeos
isolados de Phellinus linteus apresentaram atividade tumoricida de macrófagos
induzida pelo aumento de óxido nítrico (HAN et al., 1999; KIM; OH; PARK, 2003).
O sistema imunológico do intestino juntamente com as citocinas
desempenham um papel fundamental no mecanismo de patogênese em UC. A IL-10
já foi estudada por ser uma citocina reguladora que influencia e contribui para
homeostasia da mucosa gastrointestinal e tem sido considerada uma citocina anti-
inflamatória em modelos de doenças inflamatórias do intestino (KUHN et al., 1993;
SANCHEZ-MUNOZ; DOMINGUEZ-LOPES; YAMAMOTO-FURUSHO, 2008; LIU et
al., 2012) . Além disso, a citocina pró-inflamatória IL-4 também foi estudada em
modelos de inflamação colônica e foi vista que sua superexpressão está associada
com colite ulcerosa grave (KAMPEN; GAULDIE; COLLINS, 2005).
 Dentre as substancias mais utilizadas nos tratamentos das doenças
inflamatórias intestinais pode-se destacar a tocilizumab que atua na inibição da Il-6
(STALLMACH; HAGEL; BRUNS, 2010). GCM também mostraram reduzir
potencialmente os níveis desta citocina no tecido colônico, bem como os níveis de
óxido nítrico (FIGURAS 16 e 17).
O óxido nítrico, um outro importante mediador inflamatório, participa da
regulação de muitas funções do intestino como absorção, secreção e motilidade. A
expressão da sua isoforma induzível (iNOS) e a alta concentração de NO produzido
desempenham um papel importante na patogênese da DII. Kolios et al., 2004,
observaram que biópsias do reto de pacientes com colite ulcerativa apresentaram
elevada concentração de citrulina, um co-produto do óxido nítrico.
Um extrato aquoso de Inonotus obliquus, também demonstrou efeito anti-
inflamatório no modelo de colite induzida por DSS atuando na redução da atividade
da MPO bem como nos níveis de citocinas como a IL-6 (MISHRA et al., 2012).
Há relatos que pacientes portadores de doenças inflamatórias intestinais
apresentam um aumento no risco de desenvolvimento de câncer colorretal,
principalmente na doença crônica (ITZKOWITZ; YIO, 2004; SHANAHAN;
BERNSTEIN, 2009).
A estrutura do polissacarideo fúngico está fortemente relacionada com o seu
potencial antitumoral. Estudos anteriores tem-se centrado principalmente na
estrutura da β-glucana e sugeriu que a (1,3) -β-glucana com ligações -β- (1,6) é
importante para a atividade antitumoral, aumentando a atividade das células imuno-
competentes (KODAMA et al, 2002;. WASSER, 2002). No entanto, existem alguns
polissacarideos antitumorais com diferentes estruturas químicas, tais como α-
glucana (KIHO et al., 1989).
O desenvolvimento e crescimento de tumores são consideradas como um
resultado da elevada capacidade proliferativa das células tumorais. A relação entre a
apoptose e suas vias de sinalização têm um profundo efeito sobre a progressão do
câncer (LOWE; LIN, 2000).
CASTRO et al., 2014 mostraram que polissacarídeos de C. montagnei
interferem na viabilidade de células normais e tumorais de forma diferenciada. Em
48 horas de tratamento, a concentração de 50 μg/100μL de polissacarídeos não
afetou a viabilidade de fibroblastos (3T3), enquanto que essa mesma concentração
matou em torno de 50% das células de câncer cervical (HeLa). A inibição da
proliferação de células HT-29 foi observada neste estudo no qual o efeito de GCM
mostrou ser dose e tempo-dependente.
A maioria dos agentes antineoplásicos podem atuar inibindo a proliferação de
células tumorais por induzir diretamente o dano ao DNA ou induzir indiretamente
vias de sinalização secundárias sensíveis ao estresse. Dessa forma, desencadeiam
a apoptose pela ativação da via apoptótica intrínseca, e alguns podem, ainda, ativar
simultaneamente a via do receptor extrínseco. Uma evidência crescente sugere que
proteínas da família a Bcl-2 desempenham um papel central na apoptose celular
(BURLACU, 2003)
Os resultados obtidos neste estudo mostraram que células HT-29 tratadas
com GCM aumentaram consideravelmente o número de células em apoptose, com a
concomitante redução do numero de células necróticas.
Ha muito tempo, a apoptose é reconhecida como o principal mecanismo pelo
qual os agentes quimioterapicos do câncer e da radioterapia matam as células. A
apoptose pode ser desencadeada por diversas formas de estímulos ou tensões
fisiológicas, tais como as citocinas, os radicais livres e dano ao DNA (BRUNNER et
al, 2003;. HARMAN, 1992; ROOS; KAINA, 2006).
Espécies reativas de oxigênio (ROS) podem iniciar a transformação das
células, causando alterações que levam a mutações durante a replicação do DNA,
enquanto que em células já transformadas, ROS desempenha um papel importante
na iniciação e execução da apoptose (GACKOWSKI et al., 2002; JUAN et al., 2008).
Neste sentido, as propriedades quimiopreventivas de antioxidantes para o câncer,
acredita-se ser devido à sua capacidade de sequestrar ROS endógeno. O estresse
oxidativo ocorre quando há um desequilíbrio entre a produção de oxidantes celular e
capacidade antioxidante. Estudos anteriores utilizando extratos polissacarídicos
aquosos de C. montagnei mostraram que estes polissacarideos atuavam na
varredura de radicais superoxido, hidroxila, como também na inibição da
peroxidação lipídica, demonstrando que estes polissacarídeos possuem forte
potencial antioxidante (CASTRO et al., 2014). Neste estudo foi verificado que GCM
nas concentrações de 25 e 50 μg/100μL apresentam apenas uma leve habilidade
varredora de ROS intracelular em células HT-29.
Por outro lado, também é possível que o fraco efeito de GCM sobre ROS
possa ser um fator importante na indução da apoptose.
 Em um outro estudo, o aumento na geração de ROS pelo tratamento com
EPS, um exoplissacarídeo extraido da levedura Trichoderma pseudokoningii, foi
apontado como um estímulo apoptótico para as células K562 (HUANG et al., 2012).
A indução de parada do ciclo celular tem sido considerada como a maior
causa de anti-proliferação (HSIAO et al., 2007)
A proliferação celular descontrolada é uma característica típica do câncer
(HANAHAN; WEINBERG, 2011). Portanto, a regulação do ciclo celular é
considerado como um importante alvo para terapia do câncer. Checkpoints do ciclo
celular são as vias-chave de regulação e monitoramento de transição de fases do
ciclo celular (HARTWELL; WEINERT, 1989). Resposta ao estresse celular, tais
como tóxico ou quebra do DNA, podem parar a divisão das aberrantes células
cancerosas (BJELLAND; SEEBERG, 2003).
Numerosos estudos tem mostrado que polissacarídeos podem induzir arrasto
do ciclo celular em diferentes fases (ALVES et al., 2012; DORE et al., 2012).
Neste estudo, células HT-29 tratadas com GCM mostraram a tendência a se
acumular em G1. Estudos anteriores têm demonstrado que um polissacarideo ligado
a proteínas do Phellinus Linteus induz apoptose e parada do ciclo celular em G2 / M,
diminuindo a Bcl-2 e ciclina B1 expressões em células SW480 (LI et al., 2004). Por
outro lado, outro estudo mostrou que polissacarídeos extraídos de P. linteus
mostraram indução de arrasto no ciclo celular na fase S mas sem indução de
apoptose (ZHONG et al., 2013).
Também foi investigado o efeito de GCM na adesão de células HT-29.
Metástase do câncer tem sido descrita como uma série complexa de etapas,
isto é, adesão de células cancerosas, invasão, migração e circulação no sangue e
linfa (STACKER et al., 2002; PLAYFORD; SCHALLER, 2004; HANNIGAN;
TROUSSARD; DEDHAR, 2005). Destes eventos, a adesão celular é um importante
fenómeno biológico necessário para o funcionamento dos organismos vivos. As
células dentro do corpo estão firmemente ligadas ao apoio matricial ou seja, a matriz
extracelular (MEC). Este MEC não só fornece suporte estrutural, mas também
fornece um meio de regular o comportamento celular (KIM et al., 2011).
As proteínas da MEC promovem adesão celular por ligação ao receptor de
superfície celular, as integrinas (KLEINMAN et al., 1986; KRAMER et al., 1989).
Após a ligação à MEC, as células cancerosas apresentam tendência a invadi-la.
Essas células partem do tumor primário, aos quais estão ligadas, e penetram nas
paredes do vaso sanguíneo, daí migrando para novos locais, e finalmente, formando
os tumores secundários.
Neste estudo, observou-se que GCM diminuiram a adesão de células HT-29
ao matrigel, mistura complexa de proteinas de matriz extraceular. Já que a adesão
celular desempenha um papel fundamental na migração celular, os efeitos de GCM
na adesão de células HT-29 pode estar relacionado com o retardamento da
migração celular, indicando seu possível potencial anti-metastático.
Assim, este estudo corrobora com os resultados obtidos em estudos
anteriores e vem ampliar os conhecimentos acerca dessas glucanas que
apresentam importante potencial imunomodulador, atuando como anti-inflamatório
no tecido colônico como demonstrado pelas análises bioquímicas, imunológicas e
histológicas no modelo de colite induzido por TNBS. Adicionalmente, GCM
apresentou potencial antitumoral contra células HT-29, atuando principalmente na
indução da apoptose, no arrasto do ciclo celular e na prevenção da adesão da celula
tumoral.
6 CONCLUSÕES

 As análises colorimétricas mostraram que o composto obtido de Caripia

montagnei apresenta prioritariamente carboidratos e indicam um baixo teor de
proteínas e compostos fenólicos;

 Os polissacarídeos extraídos de Caripia montagnei por cromatografia

descendente em papel apresentaram glicose como componente monossacarídico;

 As análises de infravermelho dos extratos do fungo C. montagnei

demonstraram a presença de polissacarídeos, enquanto as análises de RMN
confirmaram as α- e β- glucanas como constituinte polissacarídico deste composto
(GCM);

 A ação anti-inflamatória intestinal de GCM no modelo de colite induzida por

TNBS foi observada em análises macro e microscópicas, em que houve redução de
dano tecidual e de células inflamatórias;

 GCM mostraram habilidade em modular os níveis de importantes marcadores

bioquímicos como mieloperoxidase, fosfatase alcalina e catalase em animais com
colite induzida por TNBS;

 GCM também modularam os níveis de importantes marcadores imunológicos,

como óxido nítrico e IL-6, uma importante citocina inflamatória;

 A ação citostática foi promovida por GCM, uma vez que atuaram na inibição
da proliferação de células HT-29, fato este que pode ter sido ocasionado pela
parada do ciclo celular (não progressão da fase G1 para fase G2);

 GCM mostrou induzir apoptose em células HT-29 quando avaliadas por

citometria de fluxo;
 GCM também apresentaram leve antioxidante e alta ação antiadesiva em
células HT-29, sugerindo seu potencial como agente antimetastático.
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