Apóstila de Aulas Práticas de Engenharia Bioquímica 2019

Manual de práticas de
Engenharia Bioquímica
Responsável: Prof. Dr. Jean Carlo Alanis
Sorocaba (2019)
SUMÁRIO
Cronograma................................................................................................................................... 2
Instruções sobre relatórios ............................................................................................................ 3
Segurança no laboratório .............................................................................................................. 5
Noções Básicas de Assepsia e Esterilização ........................................................................... 107
Técnica de Assepsia e Esterilização ........................................................................................... 10
Preparo das placas de Petri com Meio de Cultura...................................................................... 17
Formas de Contaminação Microbiana ........................................................................................ 22
Caracterização Morfológica das Colônias e Coloração Gram .................................................... 25
Necessidades Nutricionais .......................................................................................................... 34
Permeabilidade celular – transporte passivo de nutrientes ........................................................ 37
Permeabilidade celular – Plasmolise e Turgescênncia Celular .................................................. 39
Determinação de Protease e Lipase ........................................................................................... 42
Determinação de Amilase e Celulase ......................................................................................... 47
Ação fermentativa das leveduras em processos de panificação ................................................ 51
Determinação de micro-organismos produtores de amilases.....................................................55
Preparo de soluções ................................................................................................................... 59
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CRONOGRAMA DE ENGENHARIA BIOQUÍMICA 2019
Aula Data Aula Prática
01 09/08 Instruções sobre relatórios e Segurança no laboratório
02 16/08 Atividade discente orientada no Canvas
03 23/08 Técnicas de assepsia e esterilização
04 30/08 Preparo das placas de Petri com meio de cultura

05 06/09 Formas de contaminação microbiana
06 13/09 Caracterização Morfológica das Colônias
07 20/09 Técnicas de coloração Gram

08 27/09 Permeabilidade celular – Plasmolise e Turgescênncia Celular
09 04/10 Permeabilidade celular – transporte passivo de nutrientes
10 11/10 TecnoFacens
11 18/10 Necessidades Nutricionais
12 25/10 Análise e interpretação dos resultados do experimento anterior
13 01/11 Determinação de micro-organismos produtores de amilase

14 08/11 Análise e interpretação dos resultados do experimento anterior
15 15/11 Atividade discente orientada no Canvas
16 22/11 Ação fermentativa das leveduras em processos de panificação

17 29/11 Determinação de Lipase – experimento 02
18 06/12 Entrega dos relatórios
19 13/12 Devolução dos relatórios
20 20/12 Plantão de dúvidas; encerramento do semestre
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INSTRUÇÕES SOBRE RELATÓRIOS
Os relatórios das aulas práticas serão elaborados em grupo e deverão ser

disponibilizados para correção na próxima semana após a aula prática. O
cumprimento do prazo de entrega e a qualidade da apresentação dos relatórios, além
da participação nas aulas práticas farão parte da avaliação dos mesmos. O aluno que
faltar a uma aula prática não poderá ser incluído no relatório a ser entregue na
próxima semana.
O relatório deverá ser digitado, obedecendo a seguinte ordem:
• CAPA
- Deverá conter o logotipo da instituição na parte superior da pagina;
- O nome da aula pratica realizada;
- O nome e RA de todos os participantes.
• INTRODUÇÃO
- Deve ser escrita de forma clara em no máximo 2 páginas e o conteúdo obtido
através de pesquisa bibliográfica em artigos e livros com a citações
mencionadas ao longo do texto de acordo com as normas da ABNT.
- A introdução contida no roteiro de aula não poderá ser utilizada para a
produção do relatório.
• MATERIAIS E METODOS
- Deverá apresentar todas as etapas realizadas durante a aula prática, mesmo
que estiver descrito no roteiro;
- Quando não for incluído no roteiro da aula prática, descrever em etapas ou
fluxograma a metodologia utilizada.
• RESULTADOS E DISCUSSÃO
- Deverão constar os fatos observados no desenvolvimento do experimento,
bem como as discussões destes resultados com base científicas contidas na
literatura;
- As Tabelas e Gráficos quando apresentados deverão ter legendas que as
identifiquem de forma clara e breve o que está contido nas respectivas,
incluindo símbolos quando for o caso e citadas ao longo do texto antes de
serem inseridas;
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• CONCLUSÃO
- Apresentar uma afirmação conclusiva sobre a aula prática, apresentado
hipóteses/argumentações sobre os resultados obtidos.
• REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICA
- Deverão ser apresentadas todas as referências utilizadas na construção do
texto. Siga normas de citação bibliográficas (ABNT 6023).
ATENÇÂO: Não deixem de fazer e entregar os relatórios, pois eles corresponderão a

20% da nota final.
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SEGURANÇA NO LABORATÓRIO
CUIDADOS FUNDAMENTAIS
Alguns experimentos podem ser perigosos quando se manipula os materiais

inadequadamente ou os procedimentos executados incorretamente. São necessárias
algumas medidas de segurança quando se trabalha com micro-organismos ou
substâncias químicas, além de vidros, banhos-maria ferventes, instrumentos cortantes
e outros materiais. Sempre que ocorrer qualquer problema com materiais ou
procedimentos, não hesite em chamar o professor ou o técnico para lhe auxiliar.
PROCEDIMENTOS DE PRECAUÇÃO E SEGURANÇA
O laboratório será um lugar onde culturas de micro-organismos serão

manipuladas e examinadas. Este tipo de atividade deve ser realizado em conjunto com
boas técnicas assépticas, num local de trabalho limpo e organizado. Todos os
materiais que serão utilizados nas aulas práticas serão esterilizados para eliminar
todos os micro-organismos presentes, tomando muito cuidado para não haver
recontaminação deste material.
Geralmente, os micro-organismos estudados não são patogênicos, mas ainda
assim, deve-se manipular qualquer cultura como se fosse potencialmente patogênico,
lembrando que muitos micro-organismos que geralmente não são patogênicos podem
causar doenças oportunistas.
Cada estudante deve aprender e praticar as técnicas assépticas no laboratório.
Isto é importante para prevenir a contaminação de suas mãos, cabelos e roupas com
material contaminado, além de evitar a contaminação do seu trabalho e proteger seus
colegas que estarão trabalhando na bancada ao lado.
CONDUTA GERAL NO LABORATÓRIO

1 – Antes de entrar no laboratório, retire casacos, jaquetas e etc. Estes itens devem
ser deixados em local apropriado com sua bolsa ou mochila, papéis e outros itens
que não serão utilizados na aula prática.
2 - O avental (ou jaleco) é de uso obrigatório. Não será permitida a entrada do aluno
no laboratório em horário de aula ou fora dela sem o mesmo.
3 – Antes de começar devemos lembrar:
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- prenda os cabelos, quando longos para evitar o contato com a chama do Bico de
Bunsen;
- não use joias e acessórios durante a aula prática;
- mantenha seus dedos, lápis, canetas ou qualquer objeto longe da sua boca;
- não comer, beber ou fumar dentro do laboratório;
- sempre lavar as mãos com água e sabão antes e após terminar o trabalho prático;
- limpar e desinfetar a bancada antes e após o seu uso;
- não fique andando pelo laboratório, pois atividades desnecessárias podem causar
acidentes, distrair os outros alunos e promover contaminação.
4 – Em caso de algum acidente, comunicar imediatamente o professor. No caso de
quebra, durante a manipulação com tubos ou placas contendo meios contaminados,
não remover os fragmentos quebrados, deixando-os no local para remoção adequada.
5 – Se você está em dúvida quanto ao procedimento, confira o manual da aula prática.
Se a dúvida persistir, chame o professor ou técnico.
6 – Todo o material utilizado nos experimentos, como por exemplo, as placas de Petri
e os tubos de ensaio contendo meios de cultura ou soluções, deverão ser
devidamente identificados para observações posteriores.
(Estes devem conter: disciplina, data, curso, equipe, micro-organismo ou material
utilizado).
7 – Lembre-se de trazer uma caneta que escreva em vidro (caneta para retro, cd,
marcador e etc.)
8 – Anote todos os detalhes da aula prática.
9 – Nunca retire culturas ou equipamentos do laboratório em quaisquer circunstâncias.
10 – Terminado o trabalho prático, deixar a bancada em ordem.
11 – Descartar todo o material contaminado em local apropriado e seguro.
OBS: Cada aula prática deverá iniciar-se com uma explicação e um período de
demonstração. O trabalho não deve ser iniciado pelo aluno, até que tenha recebido
todas as instruções necessárias.
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NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA E ESTERILIZAÇÃO
Alguns cuidados devem ser tomados para se evitar a contaminação do

manipulador, dos meios de cultura empregados e das culturas microbianas.
Técnica de semeadura
Toda a vez que se fizer uma semeadura é importante seguir as regras abaixo
mencionadas para evitar a contaminação dos meios de cultura por microrganismos
presentes no ambiente, e evitar acidentes laboratoriais.
1-) Flambagem da alça ou fio de platina: tanto a alça quanto o fio de platina devem ser
flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura. Para tanto devem ser
aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama 2 a 3 vezes.
A posição correta para a flambagem da alça é onde ela faça um ângulo de 45o em
relação à mesa de trabalho (Figura 01). Deve ser utilizado o cone interno da chama do
bico de Bunsen. Para retirar o material, seja para fazer um esfregaço ou para uma
semeadura, esfriar previamente a alça. Esta deverá ser esfriada na parte interna do
tubo de ensaio ou na tampa da placa de Petri.
Figura 01- Posição correta para a flambagem da alça.
2-) Toda vez que fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio, deve-se flambar a
boca dos tubos imediatamente após a retirada da tampa (ou tampão de algodão).
Esta deverá ser mantida segura pelo dedo mínimo, da mão que está segurando a alça
(Figura 02). Após a retirada do material com a alça, flambar novamente a boca do tubo
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e colocar a tampa. Não pousar os tampões sobre a bancada !!! Flambar a alça após
o uso.
Figura 02 – Removendo o tampão de algodão
3-) As pipetas utilizadas em microbiologia são previamente esterilizadas, são

oferecidas embrulhadas em papel (às vezes, dentro de um cilindro metálico). Para
uso, torcer o papel na região central da pipeta, retirar primeiramente o papel da parte
superior e depois a parte inferior (correspondente à ponta da pipeta). Esta sequência
evite que a pipeta seja contaminada pelas mãos do operador. Uma vez utilizada, a
pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba contendo solução desinfetante.
4-) As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen para evitar
contaminação com germes do ar. Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas
em estufas com a tampa voltada para baixo.
5-) Na semeadura usando placas de Petri, após flambar a alça até o rubro, e introduzi-
la na cultura de bactéria, semear na placa de Petri (Figura 03).
Figura 03 – Semeadura em placa: primeiro conjunto de estrias.
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6-) Após a primeira estria, flambar novamente a alça, girar a placa cerca de 30˚ e
puxar nova estria. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes (Figura 04) Essa
técnica é conhecida também por esgotamento.
7-) As placas serão incubadas a 37˚C por 24h, e depois guardadas a 4˚C até a
próxima aula.
Figura 4 – Semedura em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias
Não esqueça !
- Sempre resfrie a alça (nas paredes do tubo de ensaio quando usar o mesmo, ou num
pedaço do Agar sem cultura), antes de colocar a alça em contato com a cultura,
lembre-se: ela está muito QUENTE !
- Antes e depois da semeadura em placa mantenha a mesma, sempre invertida.
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TÉCNICAS DE ASSEPSIA E ESTERILIZAÇÃO
INTRODUÇÃO
Os micro-organismos estão presentes em todos os ambientes e superfícies e

não é desejável que muitos materiais se contaminem com eles, como os alimentos,
utensílios utilizados na sua preparação, medicamentos, entre outros. Para tanto,
aplica-se diversos métodos de controle microbiano.
O controle microbiano compreende uma série de procedimentos com a
finalidade de reduzir a quantidade, eliminar, diminuir/impedir a multiplicação de micro-
organismos existente em ambientes, utensílios e superfícies.
Antes de conhecer os processos utilizados para controle microbiano e
compreender seu modo de ação, é importante que alguns conceitos muito utilizados
sejam definidos:
• Desinfecção: é um processo menos rigoroso de eliminação de micro-
organismos, envolvendo usualmente o uso de um agente químico,
denominado desinfetante ou germicida;
• Esterilização: e um processo físico ou químico que destrói ou inativa todas as
formas de vida presentes em um determinado material;
• Antissepsia: redução do número de micro-organismos em matéria viva (pele);
• Assepsia: conjunto de técnicas e/ou medidas assépticas, que visam a não
contaminação de algo (por exemplo, de alimentos durante o preparo);
• Pasteurização: tratamento térmico utilizado para redução drástica no número
de micro-organismos;
• Tindalização: processo de esterilização capaz de eliminar esporos altamente
resistentes ao calor;
• Biocidas: agentes capazes de causar a morte de micro-organismos;
• Biostáticos: agentes capazes de impedir a reprodução de micro-organismos,
sem necessariamente eliminá-los.
Definidos estes conceitos, apresenta-se a seguir os principais meios de

controle microbiano através de agentes físicos ou químicos.
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CONTROLE MICROBIANO POR AGENTES FÍSICOS
Os principais agentes físicos utilizados são: calor seco, calor úmido, radiação
ultravioleta e radiação gama e sonicação.
CALOR
- Ação esterilizante (causa a morte do micro-organismo).
- Condições de esterilização: de 150 a 180°C, de 3 a 4 horas.
Forno ou Estufa - Utilização: esterilização de substâncias imiscíveis em água
(como pós, óleos), instrumentos cortantes (tesouras) e
vidrarias limpas e secas (placas de Petri, pipetas etc.)
- Ação esterilizante (leva à carbonização do material e dos
Calor micro-organismos).
seco Incineração - Para descartáveis: animais usados em experimentos e
produtos contaminados (cotonetes, curativos e ataduras
contaminadas, seringas plásticas contaminadas etc.).
- Ação esterilizante (carbonização do micro-organismo).
- O material é submetido à ação direta da chama.
Flambagem
- Uso: apenas na rotina microbiológica (alças e agulhas de
platina, estiletes, bocas dos tubos).
- Aparelhos que utilizam vapor saturado sob pressão. Ação
esterilizante. Causa a morte por promover a desnaturação
das proteínas que constituem os micro-organismos.
Autoclave - Condições para esterilização: 121°C por 15 a 30 minutos a
1 atm.
- Substâncias miscíveis com água (meios de cultura, solução
Calor salina, água etc.).
úmido - Processo utilizado para alimentos. Elimina apenas micro-
organismos patogênicos: Salmonella typhi, Brucella abortus
etc.
Pasteurização - Condições: 63°C por 30 minutos ou 72°C por 15 segundos,
seguido de resfriamento rápido (leite e vinho). UHT: leite
aquecido a 74°C, em seguida aquecido a 140°C (5
segundos) e resfriamento imediato.
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RADIAÇÕES
- Baixo poder de penetração: comprimento de onda longo
(carreia menos energia). Utilizado apenas em superfícies.
Radiações Não Ionizantes
Causam danos ao DNA.
(raios Ultra Violeta)
- Utilizado: eliminação de micro-organismos em superfícies
do material exposto e o ar ao redor.
- Alta penetrabilidade. Comprimento de onda curto (muita
energia). Promove a excitação de elétrons, formando
radicais altamente reativos (OH-, H+, H2O2 ). Promove lesão
Radiações Ionizantes
no DNA.
(raios Gama)
- Esterilização de materiais como vidrarias, metais, e
materiais sólidos como pós, solo, alimentos, sementes,
embalagens etc.
FILTRAÇÃO
- Remove os micro-organismos através da passagem por
Esterilizante membranas ou cartuchos.
- Promove a remoção por meio físico.
SONICAÇÃO
- Os micro-organismos são destruídos por lise e
Vibrações sônicas
extravasamento do conteúdo celular.
CONTROLE MICROBIANO POR AGENTES QUÍMICOS
ÁLCOOL ETÍLICO
É um dos métodos químicos mais empregados para controle microbiano, por
seu baixo custo, relativa eficácia e fácil aplicação. Pode ser usado como desinfetante
ou antisséptico. Possui maior atividade germicida quando hidratado (70%), pois nessa
condição possui maior poder penetrante.
O álcool absoluto possui poder bacteriostático, enquanto o álcool hidratado a
70% possui poder bactericida. São apontados diversos mecanismos de ação para o
etanol:
- ação detergente: solvente de lipídeos
- ação desidratante: retira água das células
- ação desnaturante: agindo sobre proteínas celulares
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FENÓIS E DERIVADOS
O fenol é um desinfetante fraco, porém é utilizado como um desinfetante de
referência para ser comparado com outros produtos. Atuam como desnaturantes de
componentes protéicos. Dentre os cresóis, o mais importante é a creolina, uma
mistura de cresóis muito utilizada para pisos e sanitários. O hexaclorofeno é muito
utilizado na antissepsia cirúrgica.
HALOGÊNIOS
Os principais halogênios utilizados no controle microbiano são o cloro e o iodo.
- Cloro: é usado como desinfetante de águas, alimentos e pisos. Seu mecanismo de
ação é dado pela reação:
Cl2 + H2O → H+ + Cl- + HClO

Ácido hipocloroso
O ácido hipocloroso é a forma mais eficaz do que o cloro, pois tem carga
elétrica neutra e se difunde tão rapidamente quanto a água por meio da parede
celular.
O ácido hipocloroso é instável, se decompondo espontaneamente em H+ + OCl-
, que eliminará os micro-organismos através de oxidação de componentes celulares.
- Iodo: reage de forma irreversível com aminoácidos aromáticos de proteínas celulares
(fenilalanina e tirosina), desnaturando-as.
DETERGENTES CATIÔNICOS
Alteram a permeabilidade da membrana. É mais ativo contra Gram negativos.
Exemplo: compostos quaternários de amônio solução aquosa até 0,2%.
SAIS DE METAIS PESADOS

Os metais pesados agem na inativação de enzimas, por sua alta afinidade por
apoproteínas. Os principais metais pesados utilizados no controle microbiano são:
- Mercúrio (Hg): já foi muito utilizado como antisséptico, mas seu uso está
decaindo devido ao risco de intoxicação por absorção cutânea.
- Sulfato de Cobre (CuSO4): utilizado como desinfetante para águas de
recreação
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- Nitrato de Prata (AgNO3): é um antisséptico altamente eficiente contra
gonococos, que causam oftalmia em recém-nascidos.
ÁCIDOS
Tanto os ácidos orgânicos quanto os inorgânicos são muito utilizados na
conservação de alimentos. São mais utilizados os ácidos fracos, e na forma de sal,
pois assim apresentam maior solubilidade.
A atividade antimicrobiológica dos ácidos fracos é atribuída a sua forma não
dissociada (HA), pois está penetra através da membrana tornando-se ionizada após
alcançar o interior da célula. A concentração intracelular destes ácidos orgânicos
altera o funcionamento normal do gradiente envolvido no sistema de transporte da
membrana celular.
ÁLCALIS
Os principais álcalis utilizados são NaOH, KOH e Ca(OH)2. O NaOH,
principalmente, está presente nos sabões, conferindo-lhes relativa ação antisséptica.
REDUTORES
Reduzem compostos celulares, levando as células à morte. Aldeídos e
derivados: formaldeído e formalina são utilizados para desinfetar paredes e pisos, mas
causam irritações cutâneas.
OXIDANTES
Oxidam componentes celulares levando à morte das células. São muito
utilizados como desinfetantes. Exemplo: Ozônio, água oxigenada, permanganato de
potássio, peróxido de zinco.
- Óxido de etileno (gás): é um agente alquilante, age inativando proteínas e
ácidos nucleicos. À temperatura de 52°C o óxido de etileno passa do estado líquido
para o gasoso. Seus vapores são utilizados para esterilização de materiais de
borracha ou plástico.
OBJETIVOS
Após a realização da atividade prática o aluno deverá ser capaz de conceituar
e diferenciar os termos utilizados no controle microbiológico; descrever os agentes
físicos e químicos utilizados no controle microbiano; entender o funcionamento de
autoclaves e estufas de esterilização, diferenciando calor úmido de calor seco;
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compreender as diferenças encontradas na ação dos diferentes métodos de
antissepsia utilizados.
MATERIAIS
Na aula prática serão necessários os seguintes equipamentos:
➢ Equipamentos e Materiais (uso comum):
• Estufa de esterilização;
• 3 estojos em aço inox para esterilizar placas de Petri;
• Autoclave;
• Água deionizada para enxague das placas (aproxim. 1 L por grupo);
• Detergente;
• 2 Rolos de papel Kraft;
• 5 rolos de Fita adesiva;
• 2 rolos de filme de PVC;
• 2 rolos de papel alumínio.
➢ Vidrarias e Materiais (por equipe):

• 04 Placas de Petri lavadas adequadamente;
• 01 pisseta de 500 mL com água deionizada;
• 01 frasco borrifador contendo álcool 70%;
• 2 pares de luvas de látex;
• Toucas descartáveis para cada membro do grupo;
• Máscara descartável em TNT para cada membro do grupo
• 01 tesoura.
MÉTODOS
- Lavar com detergente cada uma das placas de Petri e enxaguá-las com água
abundante. Após a retirada de todo o detergente, realizar um último enxague com
água deionizada. Deixar escorrer o excesso de água sobre papel toalha na bancada
borrifada anteriormente com álcool 70%;
- Acomodar todas as placas com suas tampas nos estojos em aço inox e levá-las ao
tratamento térmico em autoclave.
Utilizando a autoclave
- Verificar se a resistência da autoclave (fundo do aparelho) está coberta com água;
- Colocar o material devidamente acondicionado no cesto em aço inox;
15
- Fechar a tampa, rosqueando as válvulas sempre em diagonal, ligar o aparelho,
deixando a válvula de escape aberta;
- Quando o vapor sair de forma contínua, fechar a válvula;
- Quando a temperatura atingir 121ºC, iniciar a contagem do tempo de esterilização,
geralmente 15 a 30 minutos;
- Desligar o aparelho e aguardar a pressão chegar a zero, para então abrir a válvula
de escape, pois em caso contrário a água entra em ebulição;
- Abrir a autoclave somente quando a pressão interna for igual à externa.
QUESTÕES PARA O RELATÓRIO
1- Cite quais os agentes esterilizantes são utilizados por diferentes setores industriais?
(ex: Na indústria de laticínios, os processos de pasteurização são utilizados para
esterilização de leite etc.).
2- Indique o modo de ação dos agentes físicos e químicos sobre os micro-

organismos?
3- Dentre os métodos de controle microbiano, porque o calor seco e calor úmido são
os métodos mais empregados para destruição de micro-organismos?
4- Por que o calor úmido é mais eficaz que o calor seco?
5- Quando os agentes químicos são utilizados para esterilização de equipamentos e

materiais?
6- Qual é o princípio da esterilização por filtração?
REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS
BORZANI, W., SCHMIDELL, W., LIMA, U. A., AQUARONE, E. Biotecnología
Industrial: Fundamentos. vol. 1. São Paulo, SP: Edgard Blucher LTDA, 2001.
SCHMIDELL, W., LIMA, U. A., AQUARONE, E., BORZANI, W. Biotecnología
Industrial: Engenharia Bioquímica. vol. 2. São Paulo, SP: Edgard Blucher LTDA,
2001.
TORTORA, G. J., FUNKE, B. R., CASE, C. L. Microbiologia. Porto Alegre, RS:
Editora 8, 2005.
16
PREPARO DAS PLACAS DE PETRI COM O MEIO DE CULTURA
INTRODUÇÃO
O cultivo de micro-organismos requer a formulação de meios de cultura e o
estabelecimento de condições que favoreçam seu crescimento fora do seu habitat
natural. Assim, para cultivar e manter micro-organismos vivos em laboratório é
necessário colocá-los em meios de culturas, contendo os nutrientes apropriados para
o seu crescimento. Além de nutrientes é igualmente necessário que as condições de
oxigênio (presença ou ausência), pH e pressão osmótica sejam adequadas ao
crescimento desses micro-organismos. Os meios de cultura mais comumente
utilizados podem ser SINTÉTICOS (componentes químicos puros e em quantidades
conhecidas) ou COMPLEXOS (quantidade e o tipo de nutrientes não são
determinados). Existem ainda os meios SELETIVOS (contém uma ou mais
substâncias que inibem o crescimento de um determinado grupo de micro-organismos,
mas permitem o desenvolvimento de outros), de ENRIQUECIMENTO (aumentam a
possibilidade de crescimento da espécie desejada, quando a mesma se encontra em
pequeno número) e DIFERENCIAL (permite a distinção de colônias de micro-
organismos).
Dependendo da finalidade a que se destinam os meios podem ser líquidos,
usados em estudos de crescimento, de fermentação e na produção de biomassa, e
sólidos, úteis para contagem e isolamento de micro-organismos. No preparo dos
meios sólidos e utilizado como agente solidificante o Agar, devido a sua propriedade
de se fundir a 96oC e solidificar á 45oC, e por não ser utilizado como nutriente pela
maioria dos micro-organismos.
OBJETIVOS
Com a aula prática o aluno deverá ser capaz de conceituar e identificar quais
os tipos de meios mais comumente utilizados; preparar meios de cultura em estado
sólido; praticar as técnicas de esterilização e de assepsia.
MATERIAIS
Para aula prática será necessário:
➢ Equipamentos, Materiais e Reagentes (uso comum):
• Autoclave;
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• Balança semi análitica;
• Papel alumínio;
• Plástico filme do tipo PVC;
• Agar nutriente;
• Caixa de fósforos;
• pHmetro calibrado;
• Soluções de NaOH 0,1 N e HCl 0,1 N;
• 04 espátulas para pesagem;
• 1 rolo de algodão;
• 1 rolo de gaze;
• 01 capela equipada com bico de Bunsen, tripé, tela de amianto e papel
toalha.

• 02 placas de Petri estéreis;
• 01 frasco lavador com água destilada;
• 01 borrifador com álcool 70%;
• 01 erlenmeyer de 250 mL;
• 01 béquer de 250 mL;
• 04 béqueres de 50 mL;
• 01 bico de Bunsen;
• 1 tripé;
• 1 tela de amianto;
• 01 proveta de 100 mL;
• 01 pipeta graduada de 10 mL;
• 01 adaptador de pipeta de 10 mL;
• 01 bastão de vidro;
• 01 par de luvas descartáveis de látex;
• 01 touca descartável em TNT;
• 01 máscara descartável em TNT;
• 01 rolo de papel toalha;
• 01 tesoura.
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MÉTODOS
Preparo do meio de cultura
1- Inicialmente pese a quantidade correta do meio ágar nutriente;
2- Após a pesagem, misture todos os reagentes em um béquer de 250 mL com
um pouco de água destilada;
3- Acerte o pH para 7,0. Use as soluções de NaOH 0,1 N ou HCl 0,1 N;
4- Complete o volume para 100 mL com auxílio de uma proveta de 100 mL;
5- Transfira o meio de cultivo para um erlenmeyer de 250 mL;
6- Os frascos com o meio devem ser tampados com tampão feito de gaze e
algodão, e após, o tampão deve ser recoberto com papel Kraft;
7- Leve os frascos para serem autoclavados.
Esterilização do meio de cultura

Para a esterilização do meio de cultura será utilizado à autoclave, a qual é um
agente físico que utiliza o calor úmido no processo.
Para o uso do equipamento, deverão ser seguidas as seguintes instruções:
Retire o cesto interno da autoclave e complete o nível com água destilada
Introduza o material a ser esterilizado e feche a autoclave
Inicie o aquecimento
Abra a válvula de equalização para a remoção do ar em seu interior, deixando

o vapor sair continuamente por 5 minutos. Esta etapa obtém vapor saturado
Feche a válvula de equalização
Observe a elevação da pressão de vapor e temperatura da autoclave. Após

atingir 1 atm (temperatura de 121oC) inicie a contagem do tempo de
esterilização (20 minutos)
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Desligue o equipamento e espere a autoclave esfriar, ate que o manômetro
alcance o valor zero, só então abra a autoclave.
Preparo de placas com o meio de cultura

Após a esterilização do meio de cultura o mesmo será adicionado às placas de
Petri, da seguinte forma:
1- Inicialmente limpe bem a bancada de trabalho com álcool 70%;
2- Ligar o bico de Bunsen;
3- Posicionar todo o material necessário atrás do bico de Bunsen;
4- Abra as placas de Petri e adicione aproximadamente 20 mL de meio de
cultura (temperatura aproximada de 45oC) em seu interior de acordo com a
representação esquematizada abaixo (Figura 05):
Figura 05: Preparo da placa de Petri com o meio nutriente
5- Após a adição do meio, fecha as placas de Petri com a tampa e deixe-as

em repouso ate que ocorra a solidificação do meio de cultura;
6- Após solidificar vede as placas com plástico PVC e conservá-las em
geladeira.
QUESTÕES PARA O RELATÓRIO

1- Sugira as funções dos componentes do meio de cultura;
2- Qual é a diferença entre meio sintético e meio complexo ? Qual tipo de cultura
que foi preparada na aula prática ?
3- Cite em quais tipos de trabalhos se usam meios líquidos ou sólidos?
20
NEDER, R. N. M. Microbiologia: manual de laboratório. São Paulo, SP: Novel,
1992.
BORZANI, W., SCHMIDELL, W., LIMA, U.A., AQUARONE, E. Biotecnología
21
Formas de contaminação microbiana
INTRODUÇÃO
Um aspecto importante da contaminação biológica está relacionado com os micro-
organismos. Este grupo de organismos microscópicos constituído principalmente de
bactérias, protozoários e vírus, assim como fungos e algas em geral unicelulares. Eles
estão presentes no solo, na água, no ar e inclusive em outros organismos, exercendo
as mais diversas funções como também causando os mais diversos problemas. Várias
técnicas buscam eliminar ou minimizar a quantidade ou os danos causados por estes
organismos: pasteurização, esterilização e uso de antissépticos são comuns
principalmente em indústrias alimentícias e farmacêuticas, além das que são
empregadas nas boas práticas da manipulação de alimentos e em centros de saúde.
OBJETIVOS
• Observar o grau de contaminação do ar e sua importância como veículo de
transmissão de micro-organismos;
• Observar a presença de diferentes micro-organismos no jaleco, cabelo e mãos;
• Avaliar a eficiência de diferentes substâncias utilizadas na assepsia das mãos;
MATERIAIS

• Estufa de esterilização a 37 ºC;
• 1 caixa de cotonetes;
• 500 mL de álcool iodado 0,1%;
• Detergente líquido;

• 02 placas de Petri contendo meio nutriente (preparadas na aula 02)
• 01 Pisseta de 500 mL com água destilada;
• 01 borrifador com álcool 70%;
• 01 bico de Bunsen;
• 01 par de luvas descartáveis de látex;
• 01 touca descartável;
22
• 01 máscara descartável em TNT;
• 01 caixa de fósforos;
• 01 bastão de vidro.
MÉTODOS
Parte 1: Micro-organismos no ar
Procedimento: Abrir uma Placa de Petri contendo meio de cultura Agar Simples
durante 20 minutos, deixando-as exposta ao ar. Após esse tempo, fechá-la, identificá-
la e incubar em estufa a 37 ºC por 24 horas. Analisar o resultado obtido.
Parte 2: Pesquisa de micro-organismos em superfícies
Procedimento A: Na zona de segurança do bico de Bunsen, pressionar a superfície

de Placas de Petri contendo o meio de cultura Agar simples com o jaleco, utilizando
um bastão de vidro. Fechar a placa e incubar em estufa à 37ºC por 24 horas.
Procedimento B: Esfregar um cotonete na superfície do couro cabeludo ou pele do

rosto. Semear em movimentos de zigue-zague a superfície do meio de cultura Agar
Simples. Incubar a placa em estufa a 37º C por 24 horas.
Procedimento C: Utilizando uma caneta para retroprojetor, marcar a Placa de Petri

contendo o meio de cultura Agar Simples (fundo da base) dividindo-a em 4 partes e
numerar cada parte.
4 1
3 2
Tocar a superfície do meio de cultura com o dedo indicador, seguindo o seguinte

3 2
procedimento:
- Situação 1: mão sem lavar
- Situação 2: mão lavada com água e sabão
- Situação 3: mão lavada com água + sabão + álcool a 70 %
- Situação 04: mão lavada com água + sabão + álcool iodado
23
OBS: Após cada procedimento deixar secar a mão sem tocar em nenhum material.
Trabalhar na zona de segurança do bico de Bunsen. Identificar a placa e incubá-la a
37ºC por 24 horas em estufa. Analisar os resultados obtidos
NEDER, R. N. M. Microbiologia: manual de laboratório. São Paulo, SP: Novel,
1992.
BORZANI, W., SCHMIDELL, W., LIMA, U.A., AQUARONE, E. Biotecnología
24
Caracterização Morfológica das Colônias e Coloração Gram
INTRODUÇÃO
Em um meio sólido (Agar nutriente), as células bacterianas se multiplicam

formando colônias. O critério morfológico (tamanho, forma, estrutura etc.) permite
diferenciar uma espécie de outra e pode servir inicialmente de base para medidas de
biodiversidade (Figura 06). Contudo, outros critérios complementares (bioquímicos,
fisiológicos, genéticos etc.) são indispensáveis para classificar adequadamente os
micro-organismos.
A morfologia individual e as reações tintoriais constituem, em geral, os critérios
preliminares para identificação das bactérias e sua posterior classificação. O exame
microscópico direto de um micro-organismo é comumente suplementado com exame
microscópico após coloração que, além de facilitar sua observação, permite a
visualização de determinadas estruturas. Porém, antes de ser corado, o micro-
organismo deve ser fixado à lâmina, através de secagem por simples exposição ao ar
ou secagem na chama.
Figura 06: Variedade de colônias microbianas, desenvolvidas em Agar nutriente, em uma placa
de Petri exposta durante 10 minutos ao ar e incubada a temperatura ambiente durante quatro dias.
25
A Figura 07 apresenta as principais análises morfológicas utilizadas para classificar os
micro-organismos. Além destas, incluem-se Brilho (transparente, translucido e opaco)
Cor (incolor, pigmentada) e Aspecto (viscosa, úmida, membranosa, gelatinosa, leitosa
etc.).
Tamanho
Estrutura
Figura 07: Principais elementos utilizados na classificação morfológica
OBJETIVOS
Visualização das colônias crescidas em placas contendo meio sólido e análise por
microscopia óptica e Morfologia dos micro-organismos.
MATERIAIS
26
- Detergente líquido;

- 01 borrifador com álcool 70%;
- óleo de imersão (1 gota para cada lâmina);
- Solução de violeta de genciana 1% (cristal violeta ou corante púrpura);
- Solução de Lugol;
- Solução Diferenciadora álcool-acetona;
- Solução de Fucsina;
- Algodão;
- 01 frasco lavador com água destilada;
- 02 Placas de Petri preparadas na aula anterior;
- 01 alça de plástico para inoculação;
- 04 lâminas para microscópio;
- 01 microscópio óptico;
- 01 bico de Bunsen;
- 01 caixa de fósforos;
- 01 pinça de madeira;
- 04 pipetas de Pasteur;
- 01 béquer de 500 mL;
MÉTODOS
Preparação do esfregaço
- Limpar uma lâmina de vidro (passar algodão embebido em álcool);
- Flambar a alça corretamente;
- Esfriá-la na tampa da placa de Petri, ou no meio sólido numa região sem colônia.
- Quando se tratar de uma cultura em meio líquido, com uma alça de inoculação,
tomar uma pequena porção da cultura, observando as precauções de assepsia, e
colocá-la sobre a lâmina espalhando-a para formar um esfregaço fino e uniforme;
- Quando a cultura é em meio sólido, colocar uma gota de água destilada sobre a
lâmina e com uma alça de inoculação, colher uma pequena quantidade de
crescimento bacteriano da superfície do Agar e suspendê-la na gota de água
destilada, espalhando suficientemente para obter um esfregaço fino;
- Deixar a lâmina secar a temperatura ambiente próximo ao bico de Bunsen;
- Fixar na chama do Bico de Bunsen, cortando a chama por 3x.
27
Etapa de Coloração
1) Cobrir o esfregaço com cristal violeta a 1% durante 1 minuto. Atenção para não
colocar a lâmina invertida !
2) Após 1 minuto, lavar rapidamente em água corrente;
3) Cobrir todo o esfregaço com Lugol por 1 minuto;
4) Lavar rapidamente em água corrente;
5) Lavar uma ou duas vezes, rapidamente, com a solução diferenciadora: álcool-
acetona;
6) Lavar rapidamente em água corrente;
7) Cobrir todo o esfregaço com solução de Fucsina básica por 30 segundos;
8) Lavar novamente em água corrente;
9) Secar a lâmina, tomando o cuidado de não remover o esfregaço;
10) Observar ao microscópio com objetiva de imersão.
* observar a lâmina: colocar uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço corado e
observar a lamina no microscópio, com objetiva de 100x
28
Cobrir o esfregaço com violeta de genciana por 1 minuto na lâmina preparada.
As células absorvem a solução e ficam coradas de púrpura.
29
Aplicar a solução de iodo (mordente) por 1 minuto
As células ficam azuis escuras depois de aplicada a solução na lâmina preparada.
30
Lavar com agente descorante por 15 segundos na lâmina preparada.
As células gram-positivas ficam azuis escuras e as gram-negativas ficam sem cor.

31
Aplicação de agente contrastante safranina ou fucsina por 30 segundos na lâmina.
As células gram-positivas (+) ficam azuis escuras e as gram-negativas (-) ficam róseas
ou vermelhas na lâmina preparada.
32
Observações importantes para obtenção de bons resultados na coloração de
Gram:
➢ A solução de violeta genciana deve ser semanalmente renovada, devendo ser

filtrada para a remoção de precipitados.
➢ A etapa de descoloração é um passo crítico na coloração. Ela deve ser
efetuada rapidamente. Porém, não tão rapidamente que a descoloração não possa ser
completada.
➢ Os esfregaços não devem ser muito espessos, pois são mais difíceis de
descorar e de permitir observações.
➢ Esfregaços obtidos com culturas velhas mostram irregularidades na coloração,
com bactérias G (+) apresentando-se como G(-) e bactérias G(-) corando-se
fracamente. Evitar estas culturas !
NEDER R. N. Microbiologia: manual de laboratório. São Paulo, SP: Nobel, 1992.
33
Necessidades nutricionais
INTRODUÇÃO
Os micro-organismos necessitam de uma variedade de substâncias nutritivas

capazes de promover o seu crescimento. Esses elementos são necessários para a
síntese e para as funções normais dos componentes celulares. No ambiente, os micro-
organismos encontram os nutrientes nas formas de compostos orgânicos e/ou
inorgânicos. Desta forma, podem desenvolver-se em meios inteiramente inorgânicos,
outros em meios orgânicos ou mistos. Os micro-organismos necessitam de fontes de
energia, fontes de carbono, fontes de nitrogênio, sais minerais, água, fatores de
crescimento (vitaminas e outras substâncias). Estas substâncias são fornecidas a
partir de fontes orgânicas e/ou inorgânicas. Como princípio básico, o meio de cultura
deve ser o mais próximo das condições reais onde habita o micro-organismo, para que
este cresça satisfatoriamente. Existem micro-organismos que crescem em diversos
meio de cultura, outros crescem apenas em meios especiais. Sendo assim, não existe
um meio de cultura universal, de forma que cada micro-organismo tem suas
exigências nutricionais.
OBJETIVOS
Observar o crescimento de uma população de leveduras (Saccharomyces cerevisiae),
em diferentes condições.
MATERIAIS

- 08 garrafas plásticas do tipo PET de 500 mL;
- 1 kg de açúcar cristal;
- 05 cubos de caldo de carne;
- 01 batata;
- Fermento biológico Saccharomyces cerevisiae (aproximadamente 10 g);
- 01 banana; 01 mamão papaya; 01 maçã;
- 03 Folhas de alface e 01 cenoura;
- 01 caixa pequena de amido de milho;
34
- 08 balões (bexiga);
- 08 Elásticos para dinheiro em látex;
- 07 tábuas de corte;
- 07 facas;
- 01 proveta de 500 mL;
- 01 balança semi analítica;
- 08 béqueres de 500 mL;
- 08 bastões de vidro;
- 07 bicos de Bunsen;
- 07 tripés + 07 telas de amianto;
- 08 funis de haste curta em vidro;
- 07 almofarizes acompanhados dos pistilos;
- 07 frascos borrifadores com álcool 70%;
- 07 frascos lavadores com água destilada;
- 07 colheres de sopa;
- 01 ralador;
- 01 tesoura.
PROCEDIMENTO
1-) Preparar os seguintes meios, adequando as quantidades ao volume das garrafas
disponíveis:
- Garrafa 01: 300 mL de água;
- Garrafa 02: Solução de açúcar (60 g de açúcar em 300 mL de água);
- Garrafa 03: Solução de amido (10 colheres das de sopa de amido de milho em 300
mL de água);
- Garrafa 04: Solução de água com proteína (dissolver 1 tablete de caldo de carne em
300 mL água aquecida);
- Garrafa 05: Solução de água com proteína e açúcar (30g de açúcar e metade do
tablete de caldo de carne dissolvido em 300 mL de água aquecida);
- Garrafa 06: a mesma composição da garrafa 05, mas com 10 colheres de amido de
milho;
- Garrafa 07: Solução de água com proteína e frutas esmagadas (dissolver 1 tablete
de caldo de carne em 300 mL água aquecida e acrescentar as frutas esmagadas);
- Garrafa 08: Solução de água com proteína e folhas de verduras picadas + metade da
cenoura ralada (dissolver 1 tablete de caldo de carne em 300 mL água aquecida e
acrescentar as folhas de verduras picadas + a cenoura ralada);
2-) Preencher as garrafas com água até a metade do volume.
35
3-) Prender um balão de látex (bexiga) na boca do frasco.
4-) Analisar e interpretar as observações diariamente até completar 01 semana
(registro fotográfico)
MALAJOVICH, M. A. Biotecnologia: Fundamentos. Rio de Janeiro, RJ: Edições da
Biblioteca Max Feffer do Instituto de Tecnologia ORT, 2009. Disponível em
http://www.bteduc.bio.br.
36
Permeabilidade celular – transporte passivo de nutrientes
INTRODUÇÃO
Todas as células são rodeadas pela membrana plasmática que permite o
intercâmbio de substâncias com o meio ambiente. Os processos de difusão (transporte
de um soluto) e de osmose (transporte do solvente) são fenômenos físicos devido ao
movimento espontâneo das moléculas do soluto ou do solvente através de uma
membrana semi permeável. Ambos os processos tendem a igualar a concentração de
uma substância dentro e fora da célula (Figura 08). Gases (O2, CO2), água, sais,
monossacarídeos e aminoácidos atravessam a membrana diretamente (difusão
simples e osmose) ou por meio de proteínas transportadoras (difusão facilitada). Trata-
se de um transporte passivo que não envolve gasto de energia. Vários experimentos
permitem evidenciar esses processos. Neste, será apresentada uma maneira de
abordar experimentalmente a difusão da molécula de iodo utilizando elementos
simples.
Figura 08: O transporte passivo de substâncias (difusão). A membrana semipermeável permite

a passagem das moléculas de soluto da região mais concentrada para a região menos
concentrada, até alcançar um equilíbrio dinâmico.
OBJETIVO
Observar a passagem diferencial das moléculas de iodo e de amido através de uma
película semi permeável inerte.
MATERIAIS

• 01 rolo de Filme de PVC (Rolopac ou equivalente);
37
• Solução coloidal de amido (1%);
• Reativo de Lugol;
➢ Vidrarias e Materiais (por grupo):

• 01 azulejo 10x10 branco;
• 02 pipetas de Pasteur;
• 02 elásticos de dinheiro em latex;
• 02 bastões de vidro;
• 01 tesoura.
MÉTODOS
A-) Identificação do amido

1-) Colocar umas gotas de amido no azulejo;
2-) Deixar cair uma gota do reativo de Lugol;
3-) Observar a cor azul característica.
B-) Experimento 01
1-) Preparar um saquinho de filme de PVC com a solução coloidal de amido;
2-) Fechá-lo com um elástico;
3-) Pendurar o saquinho em um bastão de vidro e colocá-lo no béquer com o reagente
de Lugol;
4-) Observar a mudança de cor.
C-) Experimento 2
1-) Repetir o experimento anterior invertendo a posição da solução de amido e do
reativo de Lugol;
2-) Observar a mudança de cor.
D-) Análise dos resultados

1-) Comparar e interpretar as observações realizadas nos experimentos 1 e 2.
CAMPBELL N., J. R. Biology, 8th Edition. California: The Benjamin Cummings
Publishing Company, Inc., 2008.
38
Permeabilidade celular – Plasmolise e Turgescênncia Celular
INTRODUÇÃO
Células vegetais colocadas em um meio hipertónico sofrem uma retração do
volume (plasmólise) em função da perda de água devida ao fenômeno de osmose. Em
um meio hipotônico, essas células recuperam o volume inicial (deplasmólise), podendo
inclusive ficar túrgidas (Figura 09). Sendo a parede celular uma estrutura relativamente
rígida, células vegetais colocadas em um meio hipotônico não sofrem líse. Contudo, a
entrada de água está limitada pela pressão exercida pela parede celular.
Figura 09: células vegetais em meios de diferente concentração.
OBJETIVOS
Observar microscopicamente a plasmólise de células de cebola roxa.
MATERIAIS

➢ 01 cebola roxa;
• 10 g de sal;
• 10 g de açúcar.

• Microscópio;
• 04 lâminas;
• 02 pinças metálicas;
• 01 faca.
MÉTODOS
1-) Limpar cuidadosamente com álcool as lâminas que serão utilizadas;

2-) Tirar uma camada de cebola e retirar com a pinça um fragmento de película da
cebola. Estender esse fragmento em uma gota d’água, sobre uma lâmina (Figura 09);
39
Figura 09:Montagem das lâminas.
3-) Colocar a lamínula sobre o fragmento de tecido e observar as células ao

microscópio;
4-) Adicionar um pouco de sal na lateral da lamínula. Aguardar uns minutos e observar
novamente as células. Repetir o procedimento com o açúcar em outra lâmina. As
Figuras 10 e 11 apresentam a visualização no microscópio para as células de cebola
roxa em água e sacarose, respectivamente.
Figura 10: Em água (células túrgidas)
40
Figura 11: células plasmolisadas).
CAMPBELL N., J. REECE. Biology, 8th Edition. California: The Benjamin Cummings
Publishing Company, Inc., 2008.
41
Determinação de Protease e Lipase
INTRODUÇÃO
Nos produtos comerciais para a lavagem de roupa, as enzimas se encontram
em proporção de 1% a 2%, às vezes ainda menor. No entanto, esta quantidade é
considerada suficiente porque, sendo catalisadores, as enzimas se recuperam intactas
ao finalizar a reação química que promovem. Seu papel é aproximar as moléculas,
diminuindo a energia necessária para formar ou romper uma ligação química. Além de
eficientes, as enzimas são específicas. Como um sistema de chave e fechadura, cada
uma exerce sua ação sobre um substrato específico: as proteases atuam sobre as
proteínas; as amilases, sobre o amido; as lipases, sobre gorduras e azeites; e as
celulases, sobre a celulose. As enzimas são proteínas e, por conseguinte,
biodegradáveis.
As enzimas incluídas nos produtos para lavagem de roupa eliminam a
necessidade de esfregar, um trabalho pesado e que desgasta as roupas. Contudo, é
necessário deixar as peças de molho durante um tempo para facilitar a ação das
enzimas. Estas hidrolisam as substâncias orgânicas específicas, fragmentando-as e
facilitando sua remoção. Na lavagem de roupas, as enzimas utilizadas respondem a
condições determinadas de temperatura (200 a 500 C) e pH (alcalino, entre 9 e 11).
Evita-se, assim, o aquecimento da água para lavar a roupa, assegurando-se também a
coexistência da enzima com o surfactante.
As manchas podem ser constituídas por proteínas, amido e outros
carboidratos, ácidos graxos e lipídios, sais inorgânicos, argila e pigmentos. As
principais enzimas dos lava-roupas são as proteases e as amilases. Em geral, estas
hidrolisam seus respectivos substratos quando os encontram na roupa, mas também
eliminam as manchas por digestão das proteínas que as grudam ao tecido. Durante a
lavagem, as lipases não eliminam mais do que a quarta parte das manchas
específicas; porém, elas apresentam um efeito de tipo residual particularmente
interessante. Adsorvidas pelos lipídios, as lipases não são eliminadas totalmente no
enxágue. Além de continuar agindo durante a secagem, facilitam a remoção da
mancha na lavagem seguinte. Também são incluídas celulases para remover as
fibrilas que formam bolinhas desagradáveis no tecido, com o objetivo de melhorar o
aspecto das roupas, suavizando-as ao tato e realçando suas cores.
42
OBJETIVOS
Identificar a presença de protease e lipase nos produtos comerciais para a lavagem de
roupas.
MATERIAIS
Experimento 01 – determinação da presença de protease


• 4 tipos de diferentes marcas de detergente em pó;
• 1 caneta para retroprojetor;
• Geladeira.

• Um envelope de gelatina sem sabor;
• 05 colheres de plástico para homogeneizar;
• 01 béquer de 250 mL;
• 01 bico de Bunsen com tripé e tela de amianto;
• 01 colher de sopa de cada um dos 4 produtos comerciais para lavagem
de roupas;
• 01 tesoura.
MÉTODOS
1-) Rotular os copos (controle, produto 01, produto 02, produto 03 e produto 04);
2-) Preparar a gelatina conforme as instruções da embalagem;
3-) Distribuir quantidades iguais nos 5 copos e completar os passos 4, 5 e 6;
4-) Colocar 01 colher de água em um dos copos (controle) e misturar bem;
5-) Colocar 01 colher do primeiro produto no copo correspondente e misturar bem;
6-) Repetir o item anterior com os produtos restantes;
7-) Depois de duas horas colocar na geladeira, até que a gelatina do copo controle
solidifique;
8-) observar se a gelatina solidificou ou não nos copos restantes;
9-) Interpretar os resultados.
43
A Figura 12 apresenta os possíveis resultados.
Figura 12: Resultados obtidos: 1 = Controle, 2 = Produto sem enzimas, 3 = Produto com enzimas
Experimento 02 – determinação da presença de lipase


• 3 diferentes marcas de detergente em pó;
• 02 caixas de creme de leite de 250g;

• 03 espátulas;
• Alíquotas dos 03 produtos comerciais para a lavagem de roupa;
• 01 colher de sopa;
• 1 frasco conta-gotas com fenolftaleína (indicador);
• 01 tesoura.
• 01 pipeta de Pasteur;
• 01 proveta de 50 mL;
44
MÉTODOS
1-) Rotular os béqueres de 50 mL (controle, produto 1, produto 2 e produto 3);
2-) Adicionar 20 mL de creme de leite em cada béquer;
3-) Dissolver 3 colheres das de sopa de cada produto em 100 mL de água em
béqueres de 250 mL rotulados (produto 1, produto 2 e produto 3). Deixar decantar.
4-) Acrescentar 30 mL do sobrenadante do produto nos béqueres de 50 mL rotulados
em produto 1; produto 2 e produto 3. Misturar bem.
5-) Incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
6-) Em cada béquer, adicionar o indicador de pH, gota a gota. Se o produto testado
não apresentar lipase, o conteúdo do copo ficará rosa.
A Figura 13 apresenta os possíveis resultados
Figura 13: Possíveis resultados dos experimentos
MALAJOVICH, M. A. Lava roupas biológicos. Biotecnologia na vida cotidiana: manual
de atividades práticas de Biotecnologia. Rio de Janeiro, RJ: Biblioteca Max Feffer do
Instituto de Tecnologia ORT, 2009.
45
Determinação de Amilase e Celulase
INTRODUÇÃO
Enzimas são proteínas, polímeros de cadeia longa com aminoácidos
sucessivamente ligados uns aos outros através de ligações peptídicas em uma
sequência determinada geneticamente, que apresentam atividade catalítica. As
enzimas são catalisadoras das reações bioquímicas, isto é, atuam tornando possível
uma nova reação com energia de ativação menor. Isso significa que simplesmente
com a sua presença e sem serem consumidas durante o processo, as enzimas
conseguem acelerar os processos bioquímicos. A eficiência das enzimas como
catalisadores é medida pelo número de transformações moleculares, que é explicada
pelo número de moléculas de substrato que uma enzima converte por unidade de
tempo.
As enzimas são sintetizadas por células vivas e atuam em quase todas as
reações químicas do metabolismo dos organismos vivos e, portanto, também estão
presentes nos vários alimentos, atuando na hidrólise do material alimentício em
compostos mais simples, por exemplo, as lipases que hidrolisam as gorduras sem
glicerol e ácidos graxos, e as amilases que hidrolisam amido em açúcares mais
simples. As enzimas convertem uma substância, chamada de substrato, em outra
denominada produto, e são extremamente específicas para a reação que catalisam.
Isso significa que, em geral, uma enzima catalisa um e só um tipo de reação química.
Consequentemente, o tipo de enzima encontrado em uma célula determina o tipo de
metabolismo que a célula efetua.
OBJETIVOS
Identificar a presença de amilases e celulases nos produtos comerciais para a
lavagem de roupas.
MATERIAIS
Experimento 01 – determinação da presença de amilase


46
• 200 g de areia grossa lavada e seca;
• Geladeira.

• 01 caixa de pó para preparar pudim de sobremesa sabor baunilha;
• 04 colheres de plástico;
• 01 tesoura.
MÉTODOS
1-) Rotular os béqueres (controle, produto 1, produto 2, produto 3 e produto 4);
2-) Preparar o pudim conforme as instruções da embalagem;
3-) Distribuir quantidades iguais do pudim nos 4 béqueres e completar os passos 4, 5
e 6;
4-) Colocar 1 colher de areia em um dos béqueres (controle) e misturar bem.
5-) Colocar 1 colher do primeiro produto no béquer correspondente e misturar bem.
6-) Repetir o item anterior com os produtos restantes.
7-) Colocar na geladeira até que o pudim do béquer controle solidifique.
8-) Observar se o pudim solidificou ou não nos béqueres restantes.
47
Figura 14: Resultados: À esquerda, controle; à direita, produto com enzimas.
MATERIAIS
Experimento 02 – determinação da presença de celulase


• 01 cebola;

• 01 pisseta de 500 mL com água destilada;
• 04 colheres de plástico;
• 01 faca de serra;
• 01 colher de sopa.
MÉTODOS
1-) Rotular os béqueres (controle, produto 01, produto 02, produto 03);
2-) Cortar a casca de uma cebola em pedaços de igual tamanho;
48
3-) Colocar em cada béquer um pedaço de casca de cebola e 100 mL de água
destilada;
4-) Acrescentar no controle 1 colher das de sopa de água.
5-) Acrescentar 1 colher do produto 01 no béquer correspondente;
6-) Repetir o procedimento com os produtos restantes;
7-) Aguardar umas horas e observar se a casca da cebola conservou ou perdeu a cor;
Figura 15: Resultados - 1 = Água, 2 = Produto sem enzimas, 3 = Produto com enzimas
MALAJOVICH, M. A. Lava-roupas biológicos. Biotecnologia na vida cotidiana: manual
de atividades práticas de Biotecnologia. Rio de Janeiro: Edições da Biblioteca Max
Feffer do Instituto de Tecnologia ORT, 2009.
49
Ação fermentativa das leveduras em processos de panificação
INTRODUÇÃO
A arte da panificação surgiu entre 7.000 e 5.000 a.C., em diferentes lugares.
Os primeiros pães eram umas bolachas planas, de cereais moídos e água, cozidas
sobre pedras quentes. Mais tarde, deve ter sido observado que tanto a textura como a
digestibilidade melhoravam quando a massa era deixada em repouso por um tempo. O
passo seguinte foi deixar sem cozinhar uma pequena parte da massa (massa ácida ou
pé de massa), para acrescentá-la na preparação seguinte. Este procedimento já era
conhecido por egípcios e hebreus, 5.000 anos atrás.
Os estudos microbiológicos atuais indicam que no pé de massa coexistem
bactérias lácticas e leveduras. As enzimas do cereal hidrolisam o amido, formando
açúcares que são transformados em ácido láctico pelas bactérias e em etanol pelas
leveduras. A liberação de CO2 na fermentação alcoólica forma bolhas que conferem
porosidade e leveza à massa. Além de acelerar a levedação, a preparação de um pé
de massa possibilita a seleção e o enriquecimento dos micro-organismos dos cereais.
Durante muitos séculos a preparação do pão envolveu uma fermentação natural, para
a qual cada padeiro preparava o seu fermento. A passagem a uma panificação em
escala industrial começa no século XIX com o descobrimento das leveduras
(Saccharomyces cerevisiae) seguido de sua produção comercial como fermento de
padaria, por fermentação aeróbia de matérias-primas açucaradas. Apesar de alguns
padeiros conservarem a prática da fermentação natural, pouco a pouco os processos
artesanais vão desaparecendo, substituídos por uma panificação industrial, em que a
massa se prepara misturando farinhas de um ou mais tipos com água, leveduras e
diversos aditivos: emulsificadores, agentes oxidantes e redutores, enzimas ( e -
amilases, hemicelulases, lípases e etc.) e aceleradores da fermentação.
OBJETIVOS
Acompanhar a ação fermentativa das leveduras na massa do pão.
MATERIAIS
• 01 régua de 30 cm;
50
• 02 folhas de papel milimetrado;
• 02 sacos plásticos para freezer;
• 03 elásticos de dinheiro (látex);
• 01 tesoura;
• 02 xícaras de café de farinha de trigo;
• 02 colheres das de chá de açúcar cristal;
• 01 colher da de chá de fermento biológico seco instantâneo (levedura);
• 06 colheres de chá de água;
• 01 kit de aquecimento (tripé; bico de Bunsen e tela de amianto);
MÉTODOS
1-) Colar na parte externa do béquer uma tira do papel milimetrado;
2-) Dissolver a levedura em água morna;
3-) Preparar no saco plástico um mingau espesso com farinha de trigo, açúcar, água e
leveduras;
4-) Cortar uma ponta do saco para despejar o mingau no copo, com cuidado para não
tocar as bordas;
5-) Medir a altura inicial da massa;
6-) Repetir as medições de 5 em 5 minutos até o colapso da massa.
7-) Controle: repetir o experimento sem acrescentar leveduras.
A Figura 16 apresenta a transferência do conteúdo do saco plástico para o béquer.
51
Figura 16: Transferência do conteúdo do saco plástico para o béquer
Obs: O colapso da massa é provocado pela ruptura da camada de glúten e a liberação

de parte do gás acumulado (Figura 17).
Figura 17: detalhe do experimento após 40 minutos
Através dos resultados obtidos, elaborar um gráfico de altura (H) x tempo (t) para o
controle e o béquer contendo a levedura, como apresentado na Figura 18.
52
Figura 18: Gráfico de H x t para o controle e o béquer contendo a levedura
VITI, P. Pão. In: Aquarone E. et al. Biotecnologia Industrial Vol. 4. Biotecnologia na
produção de alimentos. São Paulo, SP: Edgar Blücher Ltda., 2001.
WYMER, P. Practical microbiology and biotechnology for schools. London, UK:
Macdonald Educational, 1987.
53
Determinação de micro-organismos produtores de Amilase
INTRODUÇÃO
Apesar de sua grande importância na manutenção da biosfera, estima-se que
menos de 10% dos micro-organismos existentes no planeta tenham sido
caracterizados e descritos (STALEY1998). Do ponto de vista histórico, micro-
organismos cultiváveis do solo têm sido uma fonte inestimável para a produção de
compostos naturais com atividades biológicas importantes para a humanidade (BULL
et al., 2000). Os produtos de metabólitos microbianos têm sido usados como
antibióticos, drogas anticarcinogênicas, antifúngicos, agentes imunossupressores,
probióticos; enzimas e polímeros para aplicações industriais, entre outros. As enzimas
microbianas são importantes para pesquisa acadêmica e desenvolvimento de
aplicações biotecnológicas, incluindo as enzimas de restrição e polimerases de ácidos
nucléicos, as quais são rotineiramente utilizadas na tecnologia do DNA recombinante
(OLIVEIRA et al., 2006).
Dentre as enzimas microbianas, salienta-se que as amilases estão entre as
mais importantes e são de grande interesse na biotecnologia, devido à sua ampla
aplicação em vários campos, incluindo a química clínica, produção de medicamentos,
indústria têxtil, produção de papel, indústria de alimentos, liquefação do amido e
produção de açúcar (PANDEY et al., 2000). As amilases estão entre as mais
importantes enzimas industriais, apresentando grande importância biotecnológica, tais
como aplicações nas indústrias têxteis, cervejas, bebidas destiladas, panificação,
cereais para alimentação infantil, liquefação e sacarificação do amido, ração animal,
indústria química e farmacêutica. Apesar de poderem ser derivadas de diversas
fontes, incluindo plantas, animais e microrganismos, enzimas microbianas geralmente
encontram grande demanda industrial. Atualmente, grandes quantidades de amilases
microbianas estão disponíveis comercialmente e têm aplicação quase completa na
hidrólise do amido em indústrias de processamento do amido (GUPTA et al., 2003;
PANDEY et al., 2000).
OBJETIVOS
Identificar qualitativamente micro-organismos produtores de amilases presentes no
solo.
54
MATERIAIS
➢ Equipamentos, materiais e reagentes (uso comum):
✓ Estufa incubadora a 27oC;
✓ 01 placa com meio ágar-amido para controle (Figura 19);
➢ Equipamentos, Materiais e Reagentes (por equipe):

✓ 01 espátula;
✓ 01 proveta de 10 mL;
✓ 02 béqueres de 50 mL;
✓ 01 frasco lavador com água destilada;
✓ 01 placa com meio ágar-amido;
✓ 03 cotonetes;
✓ 02 pipetas de Pasteur;
✓ 20 mL de solução de Lugol;
✓ fita adesiva.
Obs: o preparo do meio ágar-amido encontra-se no item I da página 62.
MÉTODOS
1-) Coletar uma ponta de espátula da amostra de solo e transferi-la ao ubo de diluição.
Misturar bem com a espátula;
2-) Umedecer o cotonete na suspensão de terra e espalhar o líquido na superfície do
ágar nutriente, formando um “tapete”;
3-) Vedar a placa com fita adesiva e incubar a temperatura de 27oC durante 48 horas;
4-) Após a incubação, aplicar sobre a formação microbiana a solução de Lugol,
cobrindo-a completamente. Onde cresceram micro-organismos produtores de
amilases se formará um halo incolor. Já onde o amido não foi digerido, o ágar irá
adquirir coloração azul característica (Exemplo na Figura 20);
55
Figura 19: Placa controle contendo meio ágar-amido
Figura 20: Placas com micro-organismos produtores de amilases
BULL, A. T.; WARD, A. C.; GOODFELLOW, M. Search and discovery strategies for
biotechnology: the paradigm shift. Microbiology and Molecular Biology Reviews,
64(3): 573–606. 2000.
GUPTA, R. et al. Microbial α-Amylases: Biotechnological Perspective. Process
Biochemistry, v. 38, n. 11, p. 1-18, 2003.
OLIVEIRA, A. N.; OLIVEIRA, L. A.; ANDRADE, J. S.; JUNIOR, C. Enzimas Hidrolíticas
Extracelulares de isolados de Rizóbia nativos da Amazônia centra, Amazonas, Brasil1.
56
Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 26, n. 4, p. 853-860, out./dez,
2006.
PANDEY, A.; NIGAM, P.; SOCCOL, C. R.; SOCCOL, V. T.; SINGH, D.; MOHAN, R.
Advances in Microbial Amylases. Biotechnology Applied and Biochemical, 31:135–
152. 2000.
STALEY, J. 1998. Microbial Diversity and the Biosphere. Disponível em:
www.bdt.org.br/oea/sib/staley. Acessado em: 03/08/2019.
57
Preparo das soluções
58
A-) Reagente de Somogyl e Nelson
Forma de preparo:
REAGENTE SN1:
Dissolve-se 4 g CuSO4 .5H2O, 24 g Na2CO3, 16 g NaHCO3, 12 g Tartarato de
sódio e potássio, 18 g Na2SO4 em 1000 mL de água destilada (conservar em frasco
escuro).
REAGENTE SN2:
Solução A = 50 g de Molibdato de amônio em 900 mL H2O + 42 mL de H2SO4
Solução B = 6 g de Arseniato dissódico (Na2HAsO4) em 50 mL de água
destilada (conservar em frasco escuro)
Misturar A e B e manter a 37oC por 24 horas
➢ SOLUÇÃO SALINA 0,85%

Preparo da solução salina 0,85% tamponada (estéril):
Utiliza 0,85 g de NaCl para 100 mL de água destilada.
B-) Solução de Iodo – Iodeto de Potássio
Solução concentrada
- Dissolver 10,0 g de iodeto de potássio (KI) e 5,0 g de iodo (I2) em 50 mL de água
destilada e completa-se a 100 mL;
Solução para a identificação de amido e para a coloração de bactérias (Lugol de

Gram)
1-) Dissolver 2,0 g de iodeto de potássio (KI) em 100 mL de água destilada;
2-) Acrescentar 1,0 g de cristais de iodo;
3-) Completar a 300 mL de água destilada;
Em presença do reagente de Lugol o amido adquire uma coloração azul característica.

A hidrólise da molécula de amido libera dextrinas que, em presença de Lugol adquirem
uma cor marrom avermelhada.
59
C-) Solução de Cristal Violeta
- Para o preparo do cristal violeta é necessário o uso de duas soluções, sendo a
solução A composta por 2,0 g de cristal violeta e 20 mL de etanol, e a solução B
composta por 0,8 g de oxalato de amônia e 80 mL de água destilada. As duas
soluções devem ser misturadas e transferidas para um frasco âmbar.
D-) Solução Diferenciadora álcool-acetona

- Para preparar álcool acetona deve-se colocar em uma proveta de 1000 mL, 800mL
de álcool comercial 92,8º INPM e completar o volume para 1L com acetona. A proveta
deve ser tampada e agitada para que ocorra a mistura do álcool e da acetona. A
solução deve ser armazenada em frasco âmbar.
E-) Solução de Fucsina

- Para o preparo da fucsina é preciso fazer duas soluções, a fucsina concentrada
composta por 2,5 g de fucsina e 100 mL de etanol, e a fucsina diluída (para uso na
coloração) composta pela fucsina concentrada (10mL) e 90mL de água destilada.
Tudo preparado em béquer ou provetas.
F-) Solução de álcool 70%
- Para preparar o álcool 70 deve-se colocar em uma proveta de 1000 mL, 700 mL de
álcool comercial e completar o volume da proveta com água deionizada. Em seguida,
deve-se tampar a proveta e promover a mistura do álcool com a água.
G-) Solução de álcool iodado

- Para o preparo do álcool iodado deve-se colocar 8 mL de lugol forte em um balão
volumétrico de 1000 mL e adicionar 300 mL de água deionizada. Completar o volume
do balão com álcool 70%. Deve-se misturar bem e armazenar o álcool iodado em
frasco âmbar.
H-) Solução de safranina

- Pesa 2,5 g de safranina. Dissolver bem o pó em 500 mL de água destilada,
misturando bem até conseguir a completa dissolução. Guarde em frasco escuro
previamente lavado, seco e rotulado.
I-) Solução Coloidal de Amido (Goma de Amido)

Preparação de uma goma de amido a 1%
60
1-) Diluir 1,0 g de amido em 10 mL de água fria;
2-) Verter em 90 mL de água fervendo;
3-) Misturar e deixar ferver por 3 minutos;
4-) Resfriar.
OBS: O amido é insolúvel na água fria, de modo que para se obtiver uma goma é
indispensável seguir a risca todas as etapas indicadas no procedimento. No
laboratório de ensino, a goma de amido pode ser preparada com maisena. A goma de
amido deve ser preparada no momento, ou conservada no refrigerador por no mais de
24 a 48 horas.
J-) Solução de fenolftaleína

Dissolver 1,0 g de fenolftaleína em 60 mL de álcool e diluir com água até 100 mL. Usar
de uma a duas gotas para cada 100 mL de solução a titular.
L-) Meio de ágar-amido

Procedimento para preparo de 100 mL
1-) Preparar uma suspensão de 1,3 g de ágar em 90 mL de meio nutriente (caldo de
carne). Aquecer até dissolver o ágar.
2-) Acrescentar 10 mL de goma de amido a 1%, preparada como indicado no item I;
3. Misturar bem e esterilizar;
5. Esfriar a uma temperatura de 60oC, aproximadamente, antes de distribuir nas placas
de Petri previamente esterilizadas.
Observação: 100 mL de meio permitem preparar entre 5 e 8 placas de Petri de 9 cm

de diâmetro, dependendo do operador.
61

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Manual de práticas de

Responsável: Prof. Dr. Jean Carlo Alanis

03 23/08 Técnicas de assepsia e esterilização

04 30/08 Preparo das placas de Petri com meio de cultura

06 13/09 Caracterização Morfológica das Colônias

07 20/09 Técnicas de coloração Gram

09 04/10 Permeabilidade celular – transporte passivo de nutrientes

12 25/10 Análise e interpretação dos resultados do experimento anterior

13 01/11 Determinação de micro-organismos produtores de amilase

15 15/11 Atividade discente orientada no Canvas

16 22/11 Ação fermentativa das leveduras em processos de panificação

18 06/12 Entrega dos relatórios

19 13/12 Devolução dos relatórios

20 20/12 Plantão de dúvidas; encerramento do semestre

Os relatórios das aulas práticas serão elaborados em grupo e deverão ser

ATENÇÂO: Não deixem de fazer e entregar os relatórios, pois eles corresponderão a

Alguns experimentos podem ser perigosos quando se manipula os materiais

PROCEDIMENTOS DE PRECAUÇÃO E SEGURANÇA

O laboratório será um lugar onde culturas de micro-organismos serão

CONDUTA GERAL NO LABORATÓRIO

Alguns cuidados devem ser tomados para se evitar a contaminação do

Figura 01- Posição correta para a flambagem da alça.

Figura 02 – Removendo o tampão de algodão

3-) As pipetas utilizadas em microbiologia são previamente esterilizadas, são

Figura 03 – Semeadura em placa: primeiro conjunto de estrias.

Figura 4 – Semedura em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias

Os micro-organismos estão presentes em todos os ambientes e superfícies e

Definidos estes conceitos, apresenta-se a seguir os principais meios de

CONTROLE MICROBIANO POR AGENTES QUÍMICOS

Cl2 + H2O → H+ + Cl- + HClO

SAIS DE METAIS PESADOS

➢ Vidrarias e Materiais (por equipe):

QUESTÕES PARA O RELATÓRIO

2- Indique o modo de ação dos agentes físicos e químicos sobre os micro-

4- Por que o calor úmido é mais eficaz que o calor seco?

5- Quando os agentes químicos são utilizados para esterilização de equipamentos e

6- Qual é o princípio da esterilização por filtração?

➢ Vidrarias e Materiais (por equipe):

Esterilização do meio de cultura

Retire o cesto interno da autoclave e complete o nível com água destilada

Introduza o material a ser esterilizado e feche a autoclave

Abra a válvula de equalização para a remoção do ar em seu interior, deixando

Feche a válvula de equalização

Observe a elevação da pressão de vapor e temperatura da autoclave. Após

Preparo de placas com o meio de cultura

Figura 05: Preparo da placa de Petri com o meio nutriente

5- Após a adição do meio, fecha as placas de Petri com a tampa e deixe-as

QUESTÕES PARA O RELATÓRIO

➢ Equipamentos, Materiais e Reagentes (uso comum):

➢ Vidrarias e Materiais (por equipe):

Parte 2: Pesquisa de micro-organismos em superfícies

Procedimento A: Na zona de segurança do bico de Bunsen, pressionar a superfície

Procedimento B: Esfregar um cotonete na superfície do couro cabeludo ou pele do

Procedimento C: Utilizando uma caneta para retroprojetor, marcar a Placa de Petri

Tocar a superfície do meio de cultura com o dedo indicador, seguindo o seguinte

Em um meio sólido (Agar nutriente), as células bacterianas se multiplicam

Figura 07: Principais elementos utilizados na classificação morfológica

➢ Vidrarias e Materiais (por equipe):

As células absorvem a solução e ficam coradas de púrpura.

As células ficam azuis escuras depois de aplicada a solução na lâmina preparada.

As células gram-positivas ficam azuis escuras e as gram-negativas ficam sem cor.

➢ A solução de violeta genciana deve ser semanalmente renovada, devendo ser

Os micro-organismos necessitam de uma variedade de substâncias nutritivas