ÉRICA MARA DANTAS

CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES

ANTIOXIDANTE E ANTIPROLIFERATIVA E DO EFEITO
CITOTÓXICO DE BEBIDAS FUNCIONAIS LIOFILIZADAS
COMPOSTAS POR FRUTAS E HORTALIÇAS (GREEN
SMOOTHIES)

Campinas-SP
2014

i
ii
 UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS

ÉRICA MARA DANTAS

CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES

ANTIOXIDANTE E ANTIPROLIFERATIVA E DO EFEITO
CITOTÓXICO DE BEBIDAS FUNCIONAIS LIOFILIZADAS
COMPOSTAS POR FRUTAS E HORTALIÇAS (GREEN
SMOOTHIES)

Tese apresentada à Faculdade de

Engenharia de Alimentos, da Universidade
Estadual de Campinas, como parte dos
requisitos exigidos para obtenção do Título
de Doutora em Ciência de Alimentos.

Orientador(a): Profª Drª Gláucia Maria Pastore

Este exemplar corresponde à versão final da tese

defendida pela aluna Érica Mara Dantas, aprovada pela
comissão julgadora em 29/07/2014 e orientada pela Profª
Drª Gláucia Maria Pastore.

______________________________________
ASSINATURA DO(A) ORIENTADOR(A)

Campinas-SP
2014

iii
iv
 BANCA EXAMINADORA

_______________________________________

Profª Drª Gláucia Maria Pastore

(Orientadora)

_______________________________________

Profª Drª Ana Lúcia Tasca Gois Ruiz

(Membro)

_______________________________________

Profª Drª Gisele Anne Camargo

(Membro)

_______________________________________

Profª Drª Marlene Maria Amaral Scheid

(Membro)

_______________________________________

Profª Drª Suzana Caetano da Silva Lannes

(Membro)

_______________________________________

Prof. Dr. Flávio Luis Schmidt

(Suplente)

_______________________________________

Prof. Dr. João Ernesto de Carvalho

(Suplente)

_______________________________________

Prof. Dr. Young Kun Park

(Suplente)

v
vi
Dedico toda a minha vida acadêmica,
especialmente estes cinco últimos anos de
muito estudo e trabalho, que culminaram
nesta tese de doutorado, aos meus
queridos e amados pais, Cleusa e Osimar,
que me apoiaram e incentivaram em todos
os momentos e que não me deixaram
desistir. Muito obrigada!!

vii
viii
 AGRADECIMENTOS

Os agradecimentos foram uma das últimas coisas a serem feitas nesta tese.
Não por ser menos importante, exatamente o contrário, tem tanta importância que
eu quis ter calma e atenção para escrever e tentar ser justa com todos que
marcaram estes últimos 5 anos da minha caminhada. Espero não esquecer
ninguém, mas caso isso aconteça, por favor, me perdoe! Agradeço desde já a
todos vocês que me ajudaram e estiveram presentes nesta fase que se encerra...

Agradeço primeiramente a Deus, pela minha vida, saúde e proteção, pelas

oportunidades e força para enfrentar as adversidades;

Aos meus espíritos mentores, por terem me guiado e me protegido em todos

os momentos de dificuldade e indecisão;

Aos meus pais Cleusa e Osimar, e minha irmã Évelin, pelo amor, carinho,
suporte, confiança, atenção e incentivo;

À minha família, pelo apoio e encorajamento. E especialmente à minha

querida avó, pelo amor e que, mesmo sem entendimento, teve a curiosidade e a
vontade de se inteirar a respeito do andamento da tese, e por sempre estar
presente, mesmo longe;

Ao meu namorido Rafael, pelo amor, carinho e paciência (mesmo que não
tenha sido muita haha), pela força, apoio, companheirismo, amizade, e,
principalmente, por ter feito um pacto com a minha mãe pra me pressionar e não
me deixar pensar em desistir ou jubilar (haha!);

Aos membros da banca, por terem aceitado de pronto o meu convite, pela
atenção, correção do boneco e sugestões valiosas;

À Profª Gláucia Pastore, pela orientação, oportunidade de trabalho e de

crescimento acadêmico e pessoal. Principalmente pela liberdade, confiança e por
ter acreditado no desenvolvimento deste trabalho, aceitando o desafio de sair um
pouco da linha de pesquisa do laboratório. Peço desculpa pelo susto e por ter
causado receio quando sugeri o tema, e aproveito para agradecer por não ter
desistido da minha orientação quando falei sobre a energia dos alimentos!
hahaha;

Ao Dr. Alberto Peribanez Gonzalez por ter aberto os meus olhos para o
mundo dos sucos verdes, alimentos crudívoros e orgânicos, para o poder que
esses alimentos têm na saúde e prevenção de doenças, e por ter me dado a ideia
de desenvolver e estudar estas bebidas funcionais;

ix
 Às minhas amigas e “co-orientadoras” Luciana Malta e Iramaia Angélica, por
me acolherem, ajudarem, pela atenção e amizade desde a minha chegada a
Campinas, pela paciência, acompanhamento, ensinamentos, orientação, sem
nunca terem me negado qualquer auxílio, e por tantas outras coisas;

Aos companheiros do Laboratório de Bioaromas, Verônica (amiga do bidê cor

de rosa), Jane, Michele, Jú, Molina, Gustavo, Renata, Daninha, Fábio, Juliano,
Xispita, Cristiano, Simi, Patrícia, e tantos outros, pela ajuda, companhia e risadas
durante toda a minha estada no laboratório;

Aos amigos que fiz em Campinas e que me ajudaram na adaptação, me

alegraram e incentivaram em todas as fases até que eu chegasse aqui, que se
tornaram a família que eu escolhi: Ricardo, Marcello, Lucão, Silvana, Lia, Laura,
Rodrigo, Jéssica, amigos vegs, amigos do CEIR, pessoal das repúblicas Parla e
Moita;

Aos funcionários da FEA que viraram amigos, que sempre estiveram

dispostos a me ajudar, Nadir, Aninha, Zezé, Marcão, Marquinhos, Dora, Jonas,
Marsal, Jardete, Cosme, o pessoal do CI, almoxarifado, manutenção,
administração e tantos outros;

Ao pessoal do Laboratório de Bioquímica, professores, funcionários e alunos,

principalmente Bia e Pri, que sempre estiveram à disposição para ajudar e dividir
seus conhecimentos;

Ao Prof. Flávio, à técnica Ana Koon e algumas alunas do Laboratório de

Frutas do DTA, pelo auxílio na liofilização e análises das minhas amostras, pela
atenção, paciência, pelos ensinamentos, dicas e conselhos;

Ao pessoal do CPQBA, que nunca negou ajuda e muito menos tempo ou

paciência pra me ensinar a lidar com as (não tão) queridas células. Agradecimento
especial à Sica e à Aninha, pela amizade, carinho, pelos ensinamentos, atenção e
confiança! Vocês ficarão bem guardadinhas no meu coração;

Ao Prof. Rodrigo Catharino e seu aluno Diogo, ambos do Laboratório

Innovare, pela parceria e análise de compostos fenólicos;

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)

e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES),
ambas pelos apoios financeiros que possibilitaram a execução desse projeto;

A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste

trabalho, ou que de alguma forma contribuíram para o meu crescimento pessoal e
profissional. Muitíssimo obrigada!

x
“Olhando daqui, percebo que pessoas e circunstâncias
tiveram um propósito maior na minha vida do que
muitas vezes, no momento de cada uma, eu soube,
pude, aceitei, ter. (...)
(...) Tudo o que eu vivi me trouxe até aqui e sou grata a
tudo, invariavelmente. Curvo meu coração em
reverência a todos os mestres, espalhados pelos meus
caminhos todos, vestidos de tantos jeitos, algumas
vezes disfarçados de dor.
Eu mudei muito nos últimos anos, mais até do que já
consigo notar, mas ainda não passei a acreditar em
acaso.”

(Ana Jácomo)

xi
 RESUMO

Considerando a necessidade de consumo de quantidade significativa de

frutas e hortaliças para alcançar a ingestão diária de nutrientes e compostos
bioativos, o presente estudo teve como objetivo desenvolver e caracterizar duas
bebidas funcionais liofilizadas a base de frutas e hortaliças (Green Smoothies). Na
composição centesimal, vitamínica e mineral, a BMFH (1) obteve os maiores
valores para a maior parte das determinações, exceto para o teor de fibra
alimentar, sódio, vitamina B2, vitamina C e zinco. As duas bebidas destacaram-se
pelos baixos valores calóricos e por conterem alto teor de fibra alimentar, por
serem fonte de vitamina A, manganês e, além disso, a BMFH (1) por ser fonte de
magnésio. Em relação ao equivalente de porções de frutas e vegetais supridos no
valor diário recomendado, as BMFHs apresentaram menores quantidades do que
de uma porção de banana apenas para os conteúdos de magnésio e de vitaminas
B6 e C e iguais em vitamina B2. Obtiveram quantidades equivalentes a 3 porções
de frutas e vegetais em relação aos lipídios, fibras, manganês, fósforo e zinco, e a
4 porções em relação a carboidratos, cálcio, ferro, potássio e cobre. Quando
comparadas a bebidas comerciais similares, o teor de 6 composições das duas
bebidas foram maiores do que a maioria das bebidas comerciais analisadas, e
menores em conteúdo 4 determinações. Entre as duas bebidas formuladas, não
foram encontradas diferenças significativas para o pH, ºbrix, glicose e pectina; a %
acidez titulável, sacarose, flavonoides totais e fibras solúveis foram maiores na
BMFH (1); a relação ratio, frutose e fibras insolúveis foram maiores na BMFH (2);
para ambas as bebidas, as maiores concentrações de mono- e dissacarídeos se
deram para a sacarose, e em ambas foram identificados fruto- e malto
oligossacarídeos, sendo que o primeiro foi encontrado em maior quantidade na
BMFH (1) e o último em maior concentração na BMFH (2). Na avaliação da cor,

xii
não houve diferenças em relação à luminosidade, mas a BMFH (1) apresentou
tonalidades mais tendentes ao verde e ao amarelo, pela maior concentração de
clorofilas e de β-caroteno. Antes da digestão in vitro, ambas as amostras
apresentaram 6 dos 17 flavonoides testados, mas diferiram com a presença de
outras duas na BMFH (1) e de outras 3 na BMFH (2). Foram obtidos maiores
resultados de Fenóis Totais para a couve fresca e hortelã liofilizada, no teste de
DPPH-trolox pelo extrato aquoso de couve fresca, na análise de TEAC e ORAC o
extrato aquoso de hortelã fresca. Entre as bebidas, a amostra digerida de BMFH
(1) obteve os maiores resultados de Fenóis Totais, DPPH-trolox e TEAC, e na
análise de ORAC, pela amostra digerida de BMFH (2). Sugere-se uma atividade
citostática muito fraca, sendo que as BMFHs são praticamente inativas para
atividade antiproliferativa. Na análise de CAA, o maior resultado foi encontrado na
amostra BMFH (2) antes da digestão. Comprovou-se que o processamento,
armazenamento e digestão in vitro afetam a composição de flavonoides dos
alimentos e os resultados de fenólicos totais e capacidade antioxidante, através da
perda ou produção de alguns compostos, além de demonstrar que a eficiência da
extração é dependente das condições do processo e da matriz testada.

Palavras-chave: bebidas funcionais, bebida mista de frutas e hortaliças,

antioxidante, citotoxicidade, atividade antiproliferativa.

xiii
 ABSTRACT

Considering the need for consumption of significant amounts of fruits and

vegetables to achieve the daily intake of nutrients and bioactive compounds, this
study aimed to develop and characterize two lyophilized fruit and vegetables
functional beverages (Green Smoothies). Proximate, vitamin and mineral
composition, MFVD (1) obtained higher values for most determinations, except for
the dietary fiber, sodium, Vitamin B2, Vitamin C and zinc. Both beverages
highlighted by the low calorific values and high value of dietary fiber, and because
they are sources of vitamin A and manganese and furthermore MFVD (1) to be a
source of magnesium. When evaluated in relation to the equivalent servings of
fruits and vegetables supplied in recommended daily value, MFVDs showed only
minor amounts for the contents of magnesium and vitamins B6 and C, and equal to
vitamin B2. Obtained amount equivalent to 3 portions of fruits and vegetables
relative to fiber, lipids, manganese, phosphorus and zinc, and 4 servings compared
to carbohydrates, calcium, iron, potassium and copper. When compared to similar
commercial beverages, the amount of 6 compositions of the two beverages were
higher than most commercial beverages analyzed, and lower in 4 content
determinations. Between the two formulated drinks, no significant differences were
found for pH, ºbrix, glucose and pectin; the titratable acidity %, sucrose, total
flavonoids and soluble fiber were higher in MFVD (1); the ratio relation, fructose
and insoluble fiber were higher in MFVD (2); for both drinks, the higher
concentrations of mono- and disaccharides are given for sucrose, and both fruit-
and maltooligosaccharides were identified, the first of which was found in greater
quantities in MFVD (1) and the latest in high concentration in the MFVD (2). In the
evaluation of color, there were no differences in relation to brightness, but the
MFVD (1) showed more conducive to green and yellow tones, caused by the
highest concentration of chlorophyll and β-carotene. Prior to in vitro digestion, both
samples showed 6 of 17 flavonoids tested, but differ in the presence other 2 in
MFVD (1) and other 3 in MFVD (2). Higher total phenolic results were obtained for

xiv
fresh kale and lyophilized mint, in the DPPH-trolox test by aqueous extract of fresh
kale, in the analysis of TEAC and ORAC by aqueous extract of fresh mint.
Between MFVDs, the digested sample of MFVD (1) obtained the highest results of
Total Phenols, DPPH-trolox and TEAC, and in ORAC analysis, by the digested
sample of MFVD (2). A very weak cytostatic activity is suggested, while the
samples of MFVD are practically inactive for antiproliferative activity, and in CAA
analysis the best result was found in the sample MFVD (2) before digestion. It was
shown that the processing, storage and in vitro digestion affect the composition of
flavonoids from food, total phenolic content and antioxidant capacity, through loss
or production of some compounds, and demonstrate that the extraction efficiency
is dependent on the process conditions and tested array.

Keywords: functional drinks, mixed fruits and vegetables drink, antioxidant,

cytotoxicity, antiproliferative activity.

xv
xvi
 SUMÁRIO

CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO .................................................................................. 1

CAPÍTULO 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................. 3
2.1 PANORAMA DO CONSUMO DE ALIMENTOS ............................................. 3
2.2 ALIMENTOS FUNCIONAIS E NUTRACÊUTICOS ....................................... 5
2.2.1 Alimentos com Propriedades Funcionais ............................................... 5
2.2.2 Compostos Nutracêuticos ...................................................................... 8
2.2.2.1 Fibras Dietéticas ........................................................................... 10
2.2.2.2 Antioxidantes ................................................................................ 15
2.2.3 Compostos Bioativos em Frutas e Hortaliças ...................................... 18
2.2.3.1 Frutas............................................................................................ 22
2.2.3.2 Hortaliças ...................................................................................... 30
2.2.3.3 Biodisponibilidade e Bioacessibilidade de Compostos Bioativos .. 35
2.3 BEBIDAS FUNCIONAIS.............................................................................. 38
2.3.1 Bebidas Mistas de Frutas e Hortaliças ................................................. 39
2.3.2 Sucos versus Smoothies...................................................................... 45
2.3.2.1 Mercado de Smoothies ................................................................. 47
2.3.2.2 Green Smoothie ............................................................................ 50
2.4 JUSTIFICATIVA........................................................................................... 51
2.5 OBJETIVOS ................................................................................................ 52
2.5.1 Objetivo Geral ...................................................................................... 52
2.5.2 Objetivos Específicos ........................................................................... 52
CAPÍTULO 3 METODOLOGIA .............................................................................. 54
3.1 PREPARO DAS BMFHS ............................................................................. 54
3.1.1 Sanitização e Processamento dos Vegetais ........................................ 54
3.1.2 Elaboração das Bebidas Mistas de Frutas e Hortaliças (BMFHs) ........ 56
3.2 CARACTERIZAÇÃO DAS BMFHS ............................................................. 57
3.2.1 Composição Centesimal ...................................................................... 57
3.2.1.1 Umidade e Voláteis ....................................................................... 57
3.2.1.2 Cinzas ........................................................................................... 57
3.2.1.3 Lipídios Totais ............................................................................... 58
3.2.1.4 Proteína ........................................................................................ 58
3.2.1.5 Carboidratos ................................................................................. 59
3.2.1.6 Calorias......................................................................................... 60
3.2.1.7 Teor de Fibra Alimentar Total ........................................................ 60
3.2.2 Composição Vitamínica ....................................................................... 60
3.2.2.1 Vitamina A ..................................................................................... 60
3.2.2.2 Vitaminas B1 (Tiamina), B2 (Riboflavina) e B6 (Piridoxina) ............ 61
3.2.2.3 Vitamina C (Ácido Ascórbico) ....................................................... 61
3.2.3 Composição Mineral ............................................................................ 62
3.2.4 Informações Nutricionais: Resultados Esperados versus Resultados
Obtidos ......................................................................................................... 64
3.2.5 BMFHs como Ingestão Diária de Frutas e Hortaliças .......................... 64

xvii
 3.2.6 Comparação entre as BMFHs e Similares Comerciais ........................ 65
3.2.7 Caracterização Físico-Química ............................................................ 72
3.2.7.1 Determinação do pH ..................................................................... 72
3.2.7.2 Determinação do ºBrix .................................................................. 72
3.2.7.3 Determinação de acidez ............................................................... 72
3.2.7.4 Ratio (Relação ºbrix/acidez) ......................................................... 73
3.2.7.5 Identificação e Quantificação dos Mono- e Dissacarídeos ........... 73
3.2.7.6 Extração e Quantificação de Clorofila ........................................... 74
3.2.7.7 Determinação Instrumental da Cor ............................................... 74
3.2.8 Caracterização dos Compostos Nutracêuticos .................................... 75
3.2.8.1 Extração e Quantificação de β-caroteno....................................... 76
3.2.8.2 Flavonoides Totais ........................................................................ 76
3.2.8.3 Teor de Fibras Solúveis e Insolúveis............................................. 77
3.2.8.4 Determinação de Pectina.............................................................. 77
3.2.8.5 Identificação e Quantificação dos Oligossacarídeos .................... 78
3.2.8.6 Identificação dos Compostos Fenólicos ....................................... 78
3.3 ENSAIOS IN VITRO .................................................................................... 79
3.3.1 Digestão in vitro ................................................................................... 79
3.3.2 Fenóis Totais ........................................................................................ 80
3.3.3 Preparo das Amostras.......................................................................... 81
3.3.3.1 DPPH-Trolox ................................................................................. 81
3.3.3.2 TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) ............................ 82
3.3.3.3 ORAC ........................................................................................... 83
3.3.4 Fenólicos Totais e Capacidade Antioxidante dos BMFHs: Resultados
Esperados versus Resultados Obtidos ......................................................... 84
3.3.5 Efeito da Liofilização no Teor de Compostos Bioativos ........................ 85
3.3.6 Influência do Solvente na Extração de Compostos Bioativos .............. 85
3.3.7 Efeito da Digestão in vitro na Biodisponibilidade de Compostos
Bioativos ....................................................................................................... 85
3.3.8 Atividade Antiproliferativa ..................................................................... 85
3.3.8.1 Ensaio 1 (Sulforrodamina B) ......................................................... 86
3.3.8.2 Ensaio 2 (HepG2) .......................................................................... 89
3.3.9 Citotoxicidade ...................................................................................... 90
3.3.10 CAA (Atividade Antioxidante Celular) ................................................. 90
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS ............................................ 92
CAPÍTULO 4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ..................................................... 93
4.1 CARACTERIZAÇÃO DAS BMFS ................................................................ 93
4.1.1 Composição Centesimal ...................................................................... 95
4.1.2 Composição Vitamínica ....................................................................... 96
4.1.3 Composição Mineral ............................................................................ 98
4.1.4 Informações Nutricionais: Resultados Esperados versus Resultados
Obtidos ....................................................................................................... 100
4.1.5 BMFHs como Ingestão Diária de Frutas e Hortaliças ........................ 102
4.1.6 Comparação entre as BMFHs e Similares Comerciais ...................... 105
4.1.7 Caracterização Físico-Química ...........................................................110

xviii
 4.1.8 Caracterização dos Compostos Nutracêuticos ...................................115
4.1.9 Identificação dos Compostos Fenólicos ..............................................119
4.1.10 Fenóis Totais e Atividade Antioxidante in vitro ................................. 125
4.1.11 Atividade Antiproliferativa (Sulforrodamina B) .................................. 154
4.1.12 Ensaios de Citotoxicidade e Antiproliferativo (HepG2) ..................... 158
4.1.13 CAA.................................................................................................. 160
4.2 RESUMO DOS RESULTADOS ................................................................. 164
CAPÍTULO 5 CONCLUSÕES ............................................................................ 169
SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS ................................................... 170
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 171
ANEXO ................................................................................................................ 204

xix
xx
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Composto ativo, efeitos fisiológicos e principais fontes de alimentos funcionais

(ANJO, 2004).......................................................................................................................7

Tabela 2: Exemplos de nutracêuticos agrupados por mecanismo de ação (WILDMAN &

KELLEY, 2007).....................................................................................................................9

Tabela 3: Área total produtora das principais frutas no Brasil, de acordo com o clima
(IBGE, 2007)......................................................................................................................22

Tabela 4: Área plantada das principais espécies frutíferas no Brasil, em hectares, no ano
de 2006 (Modificada de IBGE, 2007).................................................................................24

Tabela 5: Composições Centesimal, Mineral e Vitamínica dos vegetais estudados

(resultados em 100g amostra úmida) (Adaptada de TACO, 2011 e USDA, 2012)..........205

Tabela 6: Composições de Flavonoides dos vegetais estudados (resultados em mg/100g

amostra úmida) (Adaptada de USDA, 2011)....................................................................206

Tabela 7: Comparação da composição de nutrientes (por 100 g) entre uma média de

smoothies e um suco de laranja espremido na hora (RUXTON, 2008).............................46

Tabela 8: Formulação das bebidas....................................................................................56

Tabela 9: Condições cromatográficas utilizadas para quantificação das Vitaminas B1, B2 e

B6.........................................................................................................................................61

Tabela 10: Condições cromatográficas utilizadas para determinação de Vitamina C.......62

Tabela 11: Condições experimentais utilizadas no equipamento ICP OES para a

determinação de Cálcio, Cobre, Ferro, Fósforo, Magnésio, Sódio e Zinco em amostras de
bebidas liofilizadas.............................................................................................................63

Tabela 12: Condições experimentais utilizadas no equipamento ICP OES para

determinação de Manganês e Potássio em amostras de bebidas liofilizadas...................63

Tabela 13: Condições cromatográficas utilizadas para determinação de beta-

caroteno.............................................................................................................................76

Tabela 14: Linhagens celulares humanas empregadas na avaliação de atividade

antiproliferativa...................................................................................................................86

Tabela 15: Concentração das BMFHs para reconstituição...............................................94

Tabela 16: Composição Centesimal das formulações liofilizadas.....................................95

xxi
Tabela 17: Composição Vitamínica das formulações liofilizadas......................................97

Tabela 18: Composição Mineral das formulações liofilizadas...........................................99

Tabela 19: Caracterização Físico-Química das formulações liofilizadas.........................111

Tabela 20: Caracterização da composição de nutracêuticos das formulações...............115

Tabela 21: Resultados da Identificação de flavonoides dos BMFHs (1) e (2), antes e após
a digestão in vitro.............................................................................................................120

Tabela 22: Quantificação de ORAC para alguns padrões antioxidantes.........................127

Tabela 23: Quantificação de Fenóis Totais (mg GAE/g amostra úmida), DPPH-Trolox,
TEAC e ORAC (µmol Trolox equiv./g amostra úmida) das formulações frescas e
liofilizadas (digerida ou não)............................................................................................128

Tabela 24: Quantificação de Fenólicos Totais (extrato metanólico) e determinação de

DPPH-Trolox (extratos aquosos e etanólicos) de frutas e hortaliças nas formas fresca e
liofilizada..........................................................................................................................129

Tabela 25: Determinação de TEAC e ORAC de frutas e hortaliças (extratos aquosos e

etanólicos das formas frescas e liofilizadas)....................................................................130

Tabela 26: Resultados presumidos de Fenóis Totais (mg GAE/g amostra úmida), DPPH-
Trolox , TEAC e ORAC (µmol Trolox equiv./g amostra úmida) das formulações frescas e
liofilizadas.........................................................................................................................140

Tabela 27: Coeficiente de correlação (r) obtido entre Fenóis Totais e potencial
antioxidante (DPPH-Trolox, TEAC e ORAC) das amostras BMFHs (1) e (2), nas formas
fresca e liofilizada.............................................................................................................151

Tabela 28: Coeficiente de correlação (r) obtido entre Fenóis Totais e potencial
antioxidante (DPPH-Trolox, TEAC e ORAC) dos extratos aquosos e etanólicos, nas
formas fresca e liofilizada, das amostras de frutas e hortaliças estudadas.....................152

Tabela 29: Resultado de GI50 no ensaio Antiproliferativo para as amostras de bebida

analisadas........................................................................................................................157

Tabela 30: Resultados de IC50 para os ensaios de proliferação celular (HepG2)............160

Tabela 31: Resultados para os ensaios de CAA e da qualidade antioxidante celular.....163

xxii
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Ilustração do termo Nutracêutico (GULATI & OTTAWAY, 2006)..........................8

Figura 2: Estrutura molecular da Pectina (BRANDÃO & ANDRADE, 1999).....................12

Figura 3: Estrutura química dos principais fruto oligossacarídeos: 1-kestose (A), nistose
(B) e frutofuranosil nistose (C) (YUN, 1996)......................................................................14

Figura 4: Classificação dos fitoquímicos dietéticos (Adaptada de LIU, 2004)..................21

Figura 5: Banana Nanica (Musa aaa Cavendish cv Nanica).............................................25

Figura 6: Laranja ‘Pera’ (Citrus sinensis)..........................................................................26

Figura 7: Limão ‘Tahiti’ (Citrus latifolia Tanaka).................................................................27

Figura 8: Maçã ‘Fuji’ (Malus domestica Borkh).................................................................28

Figura 9: Manga ‘Palmer’ (Mangifera indica)....................................................................29

Figura 10: Pera ‘Williams’ (Pyrus communis)….………………………….………………...30

Figura 11: Couve Manteiga (Brassica oleracea var. acephala).........................................32

Figura 12: Couve-flor (Brassica oleracea var. botrytis).....................................................33

Figura 13: Hortelã (Mentha s.p.).......................................................................................34

Figura 14: Repolho Branco (Brassica oleracea var. capitata L.).......................................35

Figura 15: Análise global do lançamento do produto smoothie (NUNES, 2011)...............48

Figura 16: Principais atributos de consumo em smoothies (NUNES, 2011). Legenda:

SA/Com (sem aditivos e sem conservantes; S/Açucar (Sem açúcar adicionado);
100%Rec (suco 100% reconstituído); Alerg (Alergênicos); S/Glúten (Sem glúten);
BebSum (Bebidas de sumo – mais de 25% suco); Org (Orgânico); Nect (Néctar); Nat
(Natural); Et (Ético); SauInt (Saúde intestinal); 100%N/Com (100% não concentrado); Des
(Desidratado); Econ (Econômico); BaixoCal (Baixo valor calórico)...................................49

Figura 17: Fluxograma esquemático do processamento dos vegetais, elaboração das

BMFHs e análises das amostras.......................................................................................55

Figura 18: Algumas das bebidas mistas de frutas e hortaliças comerciais encontradas no
mercado brasileiro e estrangeiro, e utilizadas na comparação com as BMFHs formulados
neste estudo são os seguintes: (i) Smoothie Detox da Queensberry; (ii) Detox Monstro da
Do Bem; (iii) V+ Aruba da Greenday; (iv) V+ Bahamas da Greenday; (v) Detox Green da
Sanavita; (vi) Suco Verde da Do Vivo; (vii) Super Verde da Uuulalá; (viii) Suco Verde da

xxiii
Bisou; (ix) Kiwis, Apples and Limes da Innocent; (x) Antioxidant da Innocent; (xi) Life Juice
Greenpower da Emma & Tom’s; (xii) Orange Mango da Green Mustache; (xiii) Tropical
Twist da Green Mustache; (xiv) Essential Greens with Lime da Evolution Fresh; (xv)
Sweet Greens and Ginger da Evolution Fresh; (xvi) Super Green da Evolution Fresh; (xvi)
Sweet Greens and Lemon da Evolution Fresh..................................................................71

Figura 19: Representação da cor sólida para cor no espaço L*a*b* (Minolta, 1994).......75

Figura 20: Esquema da aplicação das amostras, em quatro concentrações distintas, na

placa teste (T1)..................................................................................................................87

Figura 21: Bebidas liofilizadas: (i) BMFH (1); (ii) BMFH (2)..............................................93

Figura 22: Bebidas reconstituídas: (i) BMFH (1); (ii) BMFH (2)........................................94

Figura 23: Gráfico comparativo entre as informações nutricionais preditas e as obtidas

experimentalmente das BMFHs (1) e (2).........................................................................101

Figura 24: Gráfico comparativo entre a Composição Centesimal das BMFHs (1) e (2) e
de porções de frutas e hortaliças.....................................................................................103

Figura 25: Gráfico comparativo entre a Composição Vitamínica das BMFHs (1) e (2) e de
porções de frutas e hortaliças..........................................................................................103

Figura 26: Gráfico comparativo entre a Composição Mineral das BMFHs (1) e (2) e de
porções de frutas e hortaliças..........................................................................................104

Figura 27: Gráfico comparativo entre as informações nutricionais das BMFHs (1) e (2) e
bebidas mistas de frutas e hortaliças comerciais encontradas no comércio
brasileiro...........................................................................................................................106

Figura 28: Gráfico comparativo entre as informações nutricionais das BMFHs (1) e (2) e
bebidas mistas de frutas e hortaliças comerciais encontradas no comércio
estrangeiro.......................................................................................................................107

Figura 29: Cromatogramas obtidos na identificação e quantificação de mono- e

dissacarídeos de: (i) padrões, (ii) BMFH (1) e (iii) BMFH (2)....................................112/113

Figura 30: Curva Padrão de Catequina para determinação de Flavonoides Totais........116

Figura 31: Cromatogramas obtidos na identificação e quantificação de Oligossacarídeos

de: (i) padrões, (ii) BMFH (1) e (iii) BMFH (2)............................................................117/118

Figura 32: Curva Padrão: (i) de Ácido Gálico para determinação de Fenóis Totais; (ii) de
Trolox para a análise DPPH-Trolox; (iii) de Trolox para a análise TEAC e (iv) de Trolox
para a análise de ORAC..................................................................................................126

Figura 33: Curva de decaimento de fluorescência do Trolox para o ensaio

ORAC...............................................................................................................................127

xxiv
Figura 34: Resultado para: (i) Doxorrubicina; (ii) BMFH (1); (iii) BMFH (2); (iv) BMFH (1)
digerida; (v) BMFH (2) digerida, no Teste Antiproliferativo. Legenda: U251 (glioma, SNC);
MCF-7 (mama); NCI-ADR/RES (ovário, com fenótipo de resistência a múltiplas drogas);
786-0 (rim); NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); OVCAR-3 (ovário); HT29
(cólon); HaCaT (queratinócito humano, célula normal imortalizada).................155/156/157

Figura 35: Resultado do ensaio de proliferação celular (HepG2) para a BMFH (1)........159

Figura 36: Curvas de diferentes concentrações do padrão Quercetina, no ensaio

antioxidante celular..........................................................................................................161

Figura 37: Curva padrão de Quercetina no ensaio antioxidante celular.........................161

Figura 38: Curvas de concentração (mg/mL) no ensaio antioxidante celular para as

amostras (i) BMFH (1); (ii) BMFH (2); (iii) BMFH (1) Digerida e (iv) BMFH (2)
Digerida............................................................................................................................162

xxv
xxvi
 CAPÍTULO 1
INTRODUÇÃO

Uma alimentação inadequada apresenta riscos significativos à saúde

humana. Os problemas gerados pela má alimentação podem ser observados em
todo o mundo como a desnutrição e o aumento das taxas de sobrepeso e
obesidade, responsáveis pelo aumento de Doenças Crônicas Não Transmissíveis
(DCNT), que podem levar indivíduos precocemente à morte (OMS, 2012).
Infelizmente a maioria das pessoas se alimenta mal; não por comerem
pouco, mas por consumirem alimentos que fornecem quantidade de nutrientes
inferior ou superior ao ideal, quantidade essa fundamental para uma boa saúde
(BLOCK & LANGSETH, 1994). Além da má alimentação, caracterizada pela queda
expressiva do consumo de frutas e hortaliças e elevado consumo de gorduras e
carboidratos simples, fatores comportamentais como sedentarismo, uso de álcool,
tabagismo, entre outros, também colaboram para o agravamento das DCNT
(WHO, 2004).
Uma boa recomendação é que todos devem ingerir, no mínimo, cinco frutas e
vegetais todos os dias (BLOCK & LANGSETH, 1994). Sabe-se que frutas e
verduras são fontes de vitaminas, minerais e fibras alimentares, bem como contêm
uma ampla variedade de compostos biologicamente ativos, os fitonutrientes
bioativos, sendo que as classes principais incluem carotenoides, polifenóis,
antocianinas, flavonoides, isotiocianatos, sulfetos e fitoesteróis (WISE, 2001). Mas
poucas pessoas consomem vegetais diariamente e em quantidades suficientes
para atender as necessidades nutricionais.
Uma forma de contornar os problemas acima descritos é incluir na dieta os
alimentos funcionais, ricos em compostos naturais como vitaminas, minerais,
fenóis, aminoácidos, fibras, carboidratos e outros (ICHIKAWA, 2000).
Uma bebida funcional como o Green Smoothie, mix de frutas e hortaliças,
pode ser convenientemente usada para fornecer as recomendações diárias de

1
vegetais. Por conter propriedades organolépticas melhoradas e maior
palatabilidade, esse suco torna-se uma forma de aumentar a aceitação e o
consequente consumo de vegetais e seus compostos bioativos.
Considerando o fato de que o setor de bebidas, especialmente as não
alcoólicas, vem ampliando seu mercado, introduzindo novos sabores e atendendo
à demanda crescente por novos produtos que reflitam uma melhor qualidade de
vida, o objetivo deste trabalho foi desenvolver e caracterizar duas bebidas mistas
liofilizadas a base de frutas e hortaliças (BMFHs), analisar suas propriedades
antioxidantes in vitro, sua citotoxicidade e atividade antiproliferativa.

2
 CAPÍTULO 2
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 PANORAMA DO CONSUMO DE ALIMENTOS

A estrutura socioeconômica tem determinado as escolhas alimentares

modernas, e estas têm sido caracterizadas pela falta de tempo para o preparo e
consumo de alimentos; presença de alimentos produzidos com novas técnicas de
conservação e de preparo; ampla oferta de itens alimentares; mudança do
consumo das refeições para estabelecimentos que comercializam alimentos;
aumento crescente da variedade de produtos e utensílios transportáveis; oferta de
produtos provenientes de várias partes do mundo; arsenal publicitário associado
aos alimentos; flexibilização nos horários das refeições, agregada à diversidade de
alimentos e; crescente individualização dos rituais alimentares (GARCIA, 2003).
O consumo inadequado de frutas, legumes, verduras, e consumo excessivo
de gorduras e açúcares são os causadores de aproximadamente 2,7 milhões de
mortes por ano em todo mundo, de acordo com estimativa realizada pela
Organização Mundial de Saúde (OMS), constituindo um dos dez fatores centrais
na determinação da carga global de doenças (CLARO, et al., 2007).
Segundo a Pesquisa de Orçamento Familiar (POF) de 2008-2009, o
consumo alimentar da população brasileira combina a tradicional dieta à base de
arroz e feijão com alimentos pobres em nutrientes e ricos em calorias. Para mais
de 90% da população, a ingestão diária de frutas, verduras e legumes está abaixo
dos níveis recomendados pelo Ministério da Saúde (400 g). Observou-se um
consumo excessivo de açúcar e gorduras em geral e consumo insuficiente de
frutas e hortaliças nas regiões economicamente mais desenvolvidas (Sul, Sudeste
e Centro-Oeste) e, de modo geral, no meio urbano e entre famílias com maior
renda (IBGE, 2011).

3
 Segundo dados de uma Pesquisa de Vigilância de Fatores de Risco e
Proteção para Doenças Crônicas por Inquérito Telefônico (Vigitel), apenas 18,9%
dos brasileiros consomem 5 ou mais porções de frutas e hortaliças diariamente
(BRASIL, 2010).
Apesar de serem necessárias mais pesquisas para a elucidação dos
mecanismos da relação entre componentes da dieta e desenvolvimento das
DCNT, especialistas em dieta, nutrição e prevenção de doenças crônicas
reconhecem que a atual evidência científica disponível oferece forte comprovação
do papel da dieta na prevenção e controle da morbidade atribuída a essas
doenças. Comportamentos alimentares podem influenciar o estado de saúde atual,
além de determinar se no futuro o indivíduo poderá desenvolver alguma DCNT
(WHO, 2006).
Uma dieta adequada, atividade física, controle do peso, e um estilo de vida
saudável, de um modo geral, podem evitar ou minimizar o desenvolvimento de
algumas DCNT, embora a genética desempenhe um papel importante. Além
disso, a suplementação e o consumo de alimentos que tenham sido formulados ou
fortificados, podem otimizar a capacidade de promoção de saúde da dieta do
indivíduo (WILDMAN & KELLEY, 2007).
Atualmente muitos alimentos com propriedades funcionais ou nutracêuticas
têm sido considerados como preventivos e também vêm sendo usados no controle
de doenças crônicas. Estes alimentos regulam processos vitais específicos, como
o aumento dos mecanismos biológicos de defesa do organismo contra influências
ambientais, prevenção de doenças, influência positiva nas condições físicas e
mentais, e redução do processo de envelhecimento (PERIBANEZ GONZALEZ,
2008).

4
2.2 ALIMENTOS FUNCIONAIS E NUTRACÊUTICOS

Os ingredientes funcionais são um grupo de compostos que apresentam

benefícios à saúde, tais como as alicinas presentes no alho, os carotenoides e
flavonoides encontrados em frutas e vegetais, os glucosinolatos encontrados nos
vegetais crucíferos, os ácidos graxos poli-insaturados presentes em óleos vegetais
e óleo de peixe. Estes ingredientes podem ser consumidos com os alimentos dos
quais são provenientes (alimentos funcionais), ou podem ser consumidos
individualmente, como nos nutracêuticos; neste caso, é necessário o
estabelecimento do perfil de segurança para o consumo humano, já que os
nutracêuticos não devem apresentar risco de toxicidade e/ou efeitos adversos nas
doses recomendadas para o efeito benéfico (MONTEIRO et al., 1995).

2.2.1 Alimentos com Propriedades Funcionais

A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) define alimentos

funcionais como: “todos os alimentos ou ingredientes que além das funções
nutricionais básicas, quando consumidos como parte da dieta usual, produzam
efeitos metabólicos e/ou fisiológicos e/ou efeitos benéficos à saúde, devendo ser
seguros para o consumo, sem supervisão médica” (BRASIL, 1999a).
Os alimentos funcionais devem ser compostos por componentes naturais
(em elevada concentração ou presentes em alimentos que normalmente não os
supririam); devem ter efeitos positivos além do valor básico nutritivo, aumento do
bem-estar e da saúde e/ou redução do risco de ocorrência de doenças,
juntamente com a promoção de benefícios à saúde além de aumentar a qualidade
de vida (desempenhos físico, psicológico e comportamental); a alegação da
propriedade funcional deve ter embasamento científico; pode ser um alimento
natural, ou alimento no qual um componente tenha sido removido, ou um alimento
modificado (MORAES & COLLA, 2006; ROBERFROID, 2002).
Os alimentos e ingredientes funcionais podem ser classificados de dois
modos: quanto à fonte (de origem vegetal ou animal), ou quanto aos benefícios

5
que oferecem, podendo atuar em seis áreas do organismo (nos sistemas
gastrointestinal, cardiovascular, no metabolismo de substratos, no crescimento, no
desenvolvimento e diferenciação celular, no comportamento das funções
fisiológicas e como antioxidantes) (SOUZA et al., 2003).
Inúmeros produtos têm sido caracterizados como alimentos funcionais,
compreendendo compostos que podem afetar diversas funções corpóreas,
significativas para o bem-estar e também para a saúde e redução do risco de
doenças. Na maioria dos casos, esta classe de compostos tem o principal papel
mais concentrado na redução dos riscos do que na prevenção de doenças
(MORAES & COLLA, 2006). Na Tabela 1 encontra-se um resumo dos compostos
ativos dos alimentos funcionais, suas fontes e efeitos no organismo.
Apesar de o Brasil necessitar de mais informação e aprofundamento em
relação aos alimentos funcionais, é um país emergente com grande potencial de
crescimento no consumo destes alimentos. Este fato reforça a necessidade de
pesquisa de consumo em território nacional, o que poderá servir de base para a
criação de estratégias por parte da indústria, de modo a garantir competitividade
através do conhecimento das necessidades do consumidor deste segmento
(EUROMONITOR, 2007; BARCELLOS, 2009).

6
Tabela 1: Composto ativo, efeitos fisiológicos e principais fontes de alimentos funcionais
(Modificado de ANJO, 2004).

COMPOSTO ATIVO EFEITO FONTE

TERPENÓIDES
Carotenoides Atividade antioxidante e Frutas (melancia, mamão, melão,
anticancerígena (útero, próstata, damasco, pêssego), verduras
mama, cólon, reto e pulmão). (cenoura, espinafre, abóbora,
brócolis, tomate, inhame, nabo).
Fitoesteróis Redução dos níveis de colesterol Óleos vegetais, sementes, nozes,
total e LDL colesterol. algumas frutas e vegetais.

Glucosinolatos Detoxificação do fígado, atividade Brócolis, couve-flor, repolho,

anticancerígena e antimutagênica. rabanete, palmito e alcaparra.

Fenólicos
Ácido fenólico Atividade antioxidante Frutas (uva, morango, frutas cítricas),
vegetais (brócolis, repolho, cenoura,
berinjela, salsa, pimenta, tomate,
agrião), chá.
Flavonoides Atividade antioxidante, redução do Frutas cítricas, brócolis, couve,
risco de câncer e de doença tomate, berinjela, soja, abóbora,
cardiovascular. salsa, nozes cereja.
Isoflavonas Inibição do acúmulo de estrogênio, Leguminosas (principalmente soja),
redução das enzimas legumes.
carcinogênicas.
Catequinas Atividade antioxidante, redução do Uva, vinho tinto, morango, chá verde,
risco de doença cardiovascular. chá preto, cacau.

Antocianinas Atividade antioxidante, proteção Frutas (amora, framboesa).

contra mutagênese.

Ácidos graxos ω3 e Redução do risco de câncer e de Peixes de água fria, óleo de canola,
ω6 doenças cardiovasculares, redução linhaça e nozes.
da pressão arterial.

Oligossacarídeos Redução dos riscos de câncer e dos Frutas, verduras leguminosas,

níveis de colesterol. cereais integrais.
Polissacarídeos

Prebióticos Regulação do trânsito intestinal e da Raiz de chicória, cebola, alho,

pressão arterial, redução do risco de tomate, aspargo, alcachofra, banana,
câncer e dos níveis de colesterol cevada, cerveja, centeio, aveia, trigo
total e triglicerídeos, redução da e mel.
intolerância a lactose.

7
 2.2.2 Compostos Nutracêuticos

Não existe legislação brasileira para compostos nutracêuticos, por este

motivo utilizaremos a seguinte definição: “o nutracêutico é o composto químico de
um alimento que proporciona benefícios médicos e de saúde, incluindo a
prevenção e/ou tratamento da doença”. Tais produtos podem abranger desde os
nutrientes isolados, suplementos dietéticos na forma de cápsulas e dietas até os
produtos beneficamente projetados, produtos herbais entre outros (MORAES &
COLLA, 2006; ROBERFROID, 2002). A Figura 1 representa o termo nutracêutico.

Medicamento Nutracêutico Alimento

Figura 1: Ilustração do termo Nutracêutico (GULATI & OTTAWAY, 2006).

Podem-se classificar os compostos nutracêuticos através dos mecanismos

de ação (antioxidantes, antibacterianos, anti-hipertensivos, anti-
hipercolesterolêmicos, antiinflamatórios, anticancerígenos, osteoprotetores, entre
outros). Esse sistema agrupa fatores nutracêuticos juntos, independentemente da
fonte de alimentação, com base em sua comprovada ou presumidas propriedades
fisiológicas (WILDMAN & KELLEY, 2007), e incluem fibras dietéticas, ácidos
graxos poli-insaturados, proteínas, peptídeos, aminoácidos ou cetoácidos,

8
minerais, vitaminas antioxidantes e outros antioxidantes (glutationa, selênio)
(ANDLAUER & FÜRST, 2002). Exemplos são apresentados na Tabela 2.

Tabela 2: Exemplos de ingredientes nutracêuticos agrupados por mecanismo de ação (WILDMAN

& KELLEY, 2007).

Influência Positiva no Atividade Osteogenética ou

Anticâncer Anti-inflamatória
Perfil Lipídico Sanguíneo Antioxidante Protetiva do osso

Capsaicina β-Glucana CLA Ácido Linolênico CLA

Genesteína γ-Tocotrienol Ácido Ascórbico EPA Proteína de soja
Daidzeína δ-Tocotrienol β-Caroteno DHA Genesteína
α-Tocotrienol MUFA Polifenóis Quercetina Daidzeína
γ-Tocotrienol Quercetina Tocoferóis Capsaicina Cálcio
GLA Fosfopeptídeos de
CLA ω-3 PUFAs Tocotrienóis
caseína
L. acidophilus Resveratrol Indol-3-carbonol Curcumina FOS
Esfingolipídios Taninos α-Tocoferol Inulina
Limoneno β-Sitosterol Ácido elágico
Dialil sulfeto Saponinas Licopeno
Ajoene Guar Luteína
α-Tocoferol Pectina Glutationa
Enterolactona Hidroxitirosol
Glicirrizina Luteolina
Equol Oleuropeína
Curcumina Catequinas
Ácido Elágico Gingerol
Luteína Ácido clorogênico
Carnosol Taninos
L. bulgaricus
Nota: As substâncias listadas nesta tabela incluem aquelas que estão aceitas e também propostas como
substâncias nutracêuticas.
Legenda: CLA – ácido linoleico conjugado; MUFA – ácido graxo monoinsaturado; PUFA – ácido graxo
poliinsaturado; EPA – ácido eicosapentaenoico; DHA – ácido decosa-hexaenoico; GLA – ácido gamalinolênico;
FOS – fruto oligossacarídeos.

9
2.2.2.1 Fibras Dietéticas

Várias famílias de polissacarídeos de plantas são resistentes às enzimas

digestivas secretadas e por este motivo não são fontes de energia disponíveis
para os seres humanos. Estes polissacarídeos são agrupados juntamente com
polímeros de lignina, de modo a formar uma das famílias de compostos
nutracêuticos mais reconhecíveis, as fibras. A celulose e hemicelulose são
polissacarídeos estruturais encontradas dentro das paredes das células vegetais,
demonstrando que, em grande parte, a função das fibras nas plantas é estrutural.
Além das características estruturais do tecido da planta, outra função interessante
de certas fibras é na reparação de traumas de tecidos vegetais, semelhante à
cicatrização de tecido em animais (WILDMAN & KELLEY, 2007).
De acordo com a American Association of Cereals Chemists Expert
Committee (AACC, 2001a), a definição de fibra dietética (FD) é “polissacarídeos
de parede celular, lignina e de substâncias associadas resistentes à hidrólise pelas
enzimas digestivas dos seres humanos”.
A maior parte das substâncias classificadas como fibras são polissacarídeos
não amiláceos, contêm alto peso molecular e podem ser encontradas nos vegetais
(em grãos, verduras, raízes e outras hortaliças) (PIMENTEL et al., 2005). Os
principais constituintes da FD de cereais são arabinoxilanas, β-glucanas mistas
ligadas e celulose (FUNK et al., 2007).
Os impactos fisiológicos do consumo insuficiente de fibras são constipação,
aumento do risco de doença coronária cardíaca e maior flutuação dos níveis
séricos de glicose e insulina (AACC, 2001b; JENKINS et al., 1998).
Podem-se diferenciar as fibras classificando-as como fibras solúveis (FDS) e
insolúveis (FDI). As fibras insolúveis permanecem intactas através de todo o trato
gastrointestinal (lignina, celulose e algumas hemiceluloses) (PIMENTEL et al.,
2005). Como atribuições funcionais da fibra insolúvel estão o incremento do bolo
fecal e o estímulo da motilidade intestinal; a maior necessidade de mastigação,
relevantes na sociedade moderna vítimas da ingestão compulsiva e da obesidade;

10
o aumento da excreção de ácidos biliares e propriedades antioxidantes e
hipocolesterolêmicas (RODRIGUEZ et al., 2003).
As FDI são geralmente mais resistentes à fermentação do cólon do que as
FDS. Carboidratos dietéticos, especificamente os amidos resistentes e fibra
dietética, são substratos para a fermentação que produz ácidos graxos de cadeia
curta (ácidos acético, butírico e propiônico). Esses ácidos agem baixando o pH do
cólon, reduzindo assim a população de potenciais agentes patogênicos, além
disso, o acetato é rapidamente absorvido e transportado para o fígado, enquanto o
propionato é um substrato para a gluconeogênese hepática e o butirato atua como
o combustível preferido dos colonócitos e também desempenha um papel
importante na regulação da proliferação e diferenciação celular (NAPOLITANO et
al., 2009).
As fibras solúveis compreendem as pectinas e hemiceluloses. Estas tendem
a formar géis em contato com água, aumentando a viscosidade dos alimentos
parcialmente digeridos no estômago (PIMENTEL et al., 2005). São responsáveis
por diminuírem a absorção de ácidos biliares, reduzindo os níveis séricos de
triglicerídeos, colesterol e insulina. Uma característica fundamental da fibra solúvel
é sua capacidade em ser metabolizada por bactérias, com a conseguinte produção
de gases (flatulência) (RODRÍGUEZ et al., 2003).

• Pectina

Pectina é um polissacarídeo solúvel em água, frequentemente utilizada como

agente espessante em alimentos por promover um aumento de viscosidade
quando submetida à hidratação. Geralmente é obtida a partir da casca e polpa de
frutas cítricas ou de maçã, de sementes de girassol e da polpa de beterraba
(THAKUR et al., 1997).
O termo geral pectina designa ácidos pectínicos solúveis em água, com grau
variável de grupos metil éster e um grau de neutralização capaz de formar gel com
açúcares e ácidos em condições adequadas (SAKAI et al., 1993). Quimicamente,

11
as pectinas são compostas por uma cadeia linear de ácido galacturônico ligado
por associação α(1,4) em uma cadeia polissacarídea (Figura 2). Além dos ácidos
galacturônicos apresentam outros açúcares neutros como ramnose, rucose,
ribose, arabinose, manose e galactose (BRANDÃO & ANDRADE, 1999). Muitas
das unidades do ácido galacturônico são esterificadas com metanol e o grupo
éster pode ser facilmente removido pela ação de enzimas (MAY, 1997).

Figura 2: Estrutura molecular da Pectina (BRANDÃO & ANDRADE, 1999).

“Pectinas com alto teor de metoxilas” (acima de 50%) são frequentemente

denominadas apenas como “pectinas” e têm poder de geleificação na presença de
açúcares e ácidos, enquanto que a geleificação de pectinas com baixo teor de
metoxilação é possível na ausência de açúcares e na presença de alguns íons
metálicos (SAKAI et al., 1993; FERNÁNDEZ-GONZÁLEZ et al., 2004).
É encontrada nas paredes celulares de vegetais, que auxiliam na adesão e
na resistência mecânica das células (WHISTLER & DANIEL, 1985; SIGUEMOTO,
1993). Além de seu papel importante no crescimento das células, elas estão
envolvidas em interações com agentes patogênicos e sua quantidade e natureza
são determinantes para a textura de frutos e vegetais, em geral, durante o seu

12
crescimento, amadurecimento, armazenamento e processamento (BRANDÃO &
ANDRADE, 1999).
O teor de pectina varia de 15 a 25 g/100g de acordo com o tipo de tecido das
plantas, sendo a maçã, beterraba e girassol, as principais fontes dessa fibra. A
quantidade de pectina em citros e outras frutas varia dependendo do clima, do
solo e outros fatores, como método de extração e maturidade do fruto
(FERNANDEZ, 2001).

• Fruto oligossacarídeos (FOS)

Oligossacarídeos de ocorrência natural, principalmente em produtos de

origem vegetal (presentes no alho, tomate, cebola, banana, alcachofra, centeio,
cevada, trigo, mel e cerveja), são chamados de açúcares não convencionais e
apresentam excelentes características funcionais em alimentos, além dos
aspectos fisiológicos e físicos. FOS é o nome comum dado apenas a oligômeros
de frutose que são compostos de 1-kestose (GF2), nistose (GF3) e frutofuranosil
nistose (GF4) (Figura 3), em que as unidades de frutosil (F) são ligadas na
posição â-2,1 da sacarose, o que os distingue de outros oligômeros (SPIEGEL et
al., 1994; YUN, 1996; HARTEMINK et al., 1997; BORGES, 2001).
Podem ser obtidos a partir da hidrólise da inulina pela enzima inulase,
através da sacarose. Essas substâncias têm características fisiológicas
semelhantes às fibras, mas diferem destas por não aumentarem a viscosidade da
solução, não alterarem a mistura dos componentes alimentares no intestino
delgado e, aparentemente, não se ligarem aos sais biliares. Tem como papel
principal o estímulo do crescimento no intestino das bifidobactérias do cólon,
atuando também no aumento do bolo fecal no intestino delgado (ANJO, 2004).

13
 Figura 3: Estrutura química dos principais fruto oligossacarídeos: 1-kestose
(A), nistose (B) e frutofuranosil nistose (C) (YUN, 1996).

Apresentam os seguintes efeitos: alteração do trânsito intestinal, reduzindo

metabólitos tóxicos; prevenção da diarréia ou da obstipação intestinal, por alterar a
microflora colônica; diminuição do risco de câncer; diminuição do nível de
colesterol e triglicerídeos; controle da pressão arterial; incremento na produção e
biodisponibilidade de alguns minerais; redução do risco de obesidade e diabetes
insulinodependente; redução da intolerância à lactose; e redução da
potencialidade de várias doenças humanas normalmente associadas com o alto
número de bactérias intestinais patógenas (como doenças autoimunes, câncer,
acne, cirrose hepática, constipação, intoxicação alimentar, entre outras) (YUN,
1996; FAGUNDES & COSTA, 2003).

14
2.2.2.2 Antioxidantes

Os antioxidantes podem ser definidos como “qualquer substância que,

quando presente em baixas concentrações em relação ao substrato oxidável,
significativamente retarda ou previne a oxidação desse substrato” (HALLIWELL &
GUTTERIDGE, 2001).
A ação antioxidante deve-se ao potencial de óxido-redução de determinadas
moléculas, à capacidade dessas moléculas em competir por sítios ativos e
receptores nas diversas estruturas celulares ou, ainda, à modulação da expressão
de genes que codificam proteínas envolvidas em mecanismos intracelulares de
defesa contra processos oxidativos degenerativos de estruturas celulares (DNA,
membranas) (BASTOS et al., 2009).
No meio biológico podem-se encontrar naturalmente diversas classes de
substâncias bioativas nos alimentos as quais atuam como antioxidantes, tanto na
forma hidrofílica (compostos fenólicos, vitamina C) como lipofílica (carotenoides,
Vitamina E) (VELIOGLU et al., 1998; TEOW et al., 2007).
Segundo Riccioni et al. (2008), alguns nutrientes e compostos bioativos
mostraram efeitos antioxidantes no organismo, como as vitaminas A, C, E e
polifenóis, reduzindo os marcadores de estresse oxidativo além do processo de
oxidação do mau colesterol (LDL). Estudos epidemiológicos e ensaios de
suplementação em humanos têm demonstrado que o licopeno, um carotenoide
também com propriedades antioxidantes, reduz o risco de doenças
cardiovasculares (RICCIONI et al., 2008).

• Vitaminas Antioxidantes

A vitamina E é a denominação dada a um grupo de compostos antioxidantes

lipossolúveis (sendo o á-tocoferol a forma mais ativa), pode ser encontrada em
lipoproteínas e membranas, bloqueando a reação em cadeia da peroxidação
lipídica, através do sequestro do radical peroxila (SOUSA et al., 2007).
Entre as diversas funções fisiológicas da vitamina C encontra-se o alto poder

15
antioxidante de reciclar a vitamina E no processo de peroxidação lipídica das
membranas e lipoproteínas; age como cofator de várias enzimas envolvidas na
hidroxilação pós-tradução do colágeno; é importante na absorção do ferro
dietético, devido a sua capacidade de reduzir a forma férrica (Fe3+) a ferrosa
(Fe2+), propiciando absorção do ferro não-heme no trato gastrointestinal; é um
potente agente redutor (Eo’= -170mV), capaz de reduzir a maioria das espécies
reativas de oxigênio e nitrogênio (ROS/RNS) fisiologicamente relevantes; tem a
habilidade em detoxicar substâncias carcinogênicas (STAHL & SIES, 1997;
SOUSA et al., 2007; CERQUEIRA et al., 2007).

• Polifenóis

Polifenóis são os antioxidantes mais abundantes da dieta, tendo a sua maior

concentração nas frutas, hortaliças e em seus derivados, e que seu consumo
diário pode atingir 1g, muito maior que o consumo de todos os outros fitoquímicos
classificados como antioxidantes. Os compostos fenólicos presentes nos vegetais
são os principais responsáveis pela atividade antioxidante (MATÉS et al., 1999;
SOUSA, 2011).
Os polifenóis são divididos em várias classes, de acordo com o número de
anéis de fenol e pelos elementos estruturais que ligam estes anéis uns aos outros,
compreendem uma ampla variedade de moléculas (vários grupos hidroxila em
anéis aromáticos), mas também moléculas com um anel de fenol (como os ácidos
e álcoois fenólicos). Os principais grupos de polifenóis são: flavonoides, ácidos
fenólicos, taninos (hidrolisável e condensado), estilbenos e lignanas (D'ARCHIVIO
et al., 2007).
Entre as centenas de compostos fenólicos e polifenólicos, os quais possuem
variadas estruturas e funções, que as plantas sintetizam, os mais estudados como
antioxidantes são os flavonoides (com a estrutura comum C6-C3-C6), consistindo
de dois anéis aromáticos ligados por um heterocíclico oxigenado, dentre os quais
as maiores classes são flavonóis, catequinas ou flavonas, antocianidinas e

16
isoflavonas. Existem grandes variações estruturais nestas classes, dependendo
do nível de hidrogenação, hidroxilação, metilação e sulfonação das moléculas.
Além disso, flavonoides formam complexos com açúcar, lipídios, aminas e ácidos
carboxílicos (SUN et al., 2002).
Pode-se encontrar o polifenol na forma livre (monômeros à decâmeros, que
inclui proantocianinas e taninos hidrolisáveis juntamente com flavonoides, ácidos
fenólicos, estilbenos e outros) ou associado à fibra dietética, polifenóis
poliméricos, incluindo proantocianidinas e os hidrolisáveis ou polifenóis de baixo
peso molecular ligados a constituintes da parede celular (polissacarídeos e
proteína) ou presos no interior das matrizes de fibras (SAURA-CALIXTO, 2010).
Os polifenóis associados à fibra dietética são uma parte importante dos
polifenóis da dieta, encontrados em todos os alimentos vegetais, com conteúdo
geralmente maior em frutas e verduras, ocorrendo em fibras insolúveis sob a
forma de taninos condensados (proantocianidinas) e fenóis hidrolisáveis, e nas
fibras solúveis incluindo uma pequena fração de flavonoides e ácidos fenólicos.
São compostos bioativos com propriedades de saúde potenciais geralmente
pouco estudados, tendo a maior parte das pesquisas em polifenóis de alimentos
abordando exclusivamente os de forma livre (SAURA-CALIXTO et al., 2007; GOÑI
et al., 2009).

• Carotenoides

Os carotenoides são pigmentos naturais responsáveis pela cor amarela,

laranja ou vermelha dos alimentos, com ampla distribuição na natureza,
encontrados nos vegetais (frutas e hortaliças), gema do ovo, crustáceos cozidos e
alguns peixes, sintetizados exclusivamente pelos vegetais, algas, fungos,
leveduras e bactérias e podem ser cumulativos através da dieta, intactos ou pouco
modificados (RODRIGUEZ-AMAYA, 1993).
Dos cerca de 600 carotenoides identificados, somente 20 são encontrado em
tecidos humanos e são provenientes da dieta. Entre estes, os principais incluem

17
os hidrocarbonetos licopeno e β-caroteno, e as xantofilas, astaxantina,
cantaxantina, luteína e zeaxantina (EL-AGAMEY et al., 2004).
A biodisponibilidade dos carotenoides é dependente da ingestão por meio da
dieta, digestão, liberação, absorção, distribuíção para os órgãos e tecidos, eles
devem atingir o sítio de atuação e ser excretados em seguida. Diversos fatores
interferem na biodisponibilidade dos carotenoides, tais como: a quantidade
ingerida, estrutura do carotenoide, competição entre carotenoides, estado
nutricional do indivíduo, ingestão de gordura, fibra, antioxidantes, processamento
de alimentos e tamanho da partícula (OSLON, 1999).
As estruturas dos carotenoides, principalmente o sistema de duplas ligações
conjugadas, são as bases de suas propriedades antioxidantes, tornando possível
a captação de radicais livres, principalmente o radical alquilperoxila (ROO•), além
de captar energia do oxigênio singlete, que volta ao estado fundamental (O2). O
carotenoide excitado resultante libera energia baixa e, portanto, inofensiva ao meio
celular (DI MASCIO et al., 1989; YOUNG & LOWE, 2001; TAPIERO et al., 2004).
Os carotenoides precursores da vitamina A, α- e β-carotenos e a β-
criptoxantina, são considerados antioxidantes e seus efeitos benéficos à saúde
estão relacionados a esta propriedade. A atividade antioxidante do β-caroteno
consiste na sua capacidade de reduzir significativamente os efeitos causados por
espécies reativas formadas normalmente no organismo, como aquelas de oxigênio
e nitrogênio, além da habilidade para exterminar o oxigênio singlete, que é
extremamente reativo nos radicais livres (IOM, 2000; AMANCIO, 2011).

2.2.3 Compostos Bioativos em Frutas e Hortaliças

Diversos estudos têm demonstrado que uma dieta saudável, que inclui
grandes quantidades de frutas frescas e vegetais, apresenta forte associação
entre fitonutrientes de frutas e verduras e a redução no risco de câncer e outras
doenças crônicas, associação essa que possivelmente é atribuída à atividade
biológica dos nutrientes que constituem a dieta (WISE, 2001).

18
 Estudo realizado por Gundgaard et al. (2003) relata que a ingestão média
diária de frutas e hortaliças entre 400 g e 500 g aumentou a expectativa de vida da
população dinamarquesa analisada em 0,8 e 1,3 anos, respectivamente ao
consumo. Além disso, o estudo estimou que 19% a 32% da incidência de câncer
pode ser evitada ao manter uma dieta rica em frutas e hortaliças.
Conforme descrito pelo programa “5 ao Dia” (2012), as frutas e hortaliças são
divididas em grupos de cores, cada qual, com seu conjunto de benefícios:
− Vermelhos: possuem fontes de carotenoides (precursores da vitamina A)
como o licopeno, que ajuda na prevenção do câncer de próstata. Esses alimentos
fazem bem ao coração, memória, previnem o câncer e fortalecem os olhos e pele.
− Laranjas: os alimentos dessa cor são fontes de carotenoides e também
são ricos em vitamina C, que é o antioxidante fundamental para a proteção das
células. Ajudam a manter a saúde do coração, da visão e do sistema imunológico.
− Roxos: contém niacina (vitamina do Complexo B), minerais, potássio e
também vitamina C. Mantém a saúde da pele, nervos, rins e aparelho digestivo e
retardam o envelhecimento.
− Verdes: são ricos em cálcio, fósforo e ferro. Promovem o crescimento e
ajudam na coagulação do sangue, evitam a fadiga mental, auxiliam na produção
de glóbulos vermelhos do sangue, além de fortalecer ossos e dentes.
− Brancos: possuem vitaminas do complexo B e os flavonoides, que atuam
na proteção das células. Auxiliam na produção de energia, no funcionamento do
sistema nervoso e inibem o aparecimento de coágulos na circulação (5 AO DIA,
2012).

Os compostos bioativos presentes em alimentos apresentam funções

fisiológicas importantes para promoção da saúde, mas não podem ser
metabolizados pelo organismo para gerar energia e, por este motivo, são
considerados substâncias não-nutritivas (MOSKAUG et al., 2005).
Compostos bioativos de vegetais (fitoquímicos) compreendem uma grande
variedade de classes de compostos químicos com diferentes propriedades físico-

19
químicas (polaridade, solubilidade, capacidade de formar pontes de hidrogênio,
potencial de oxidorredução) que irão determinar tanto o tipo como a eficiência de
atividade, assim como o meio e a estrutura celular em que podem atuar
(OLIVEIRA & BASTOS, 2011).
Os compostos bioativos são geralmente relacionados com os sistemas de
defesa das plantas contra a radiação ultravioleta ou as agressões de insetos ou
patógenos sendo, em sua maioria, metabólitos secundários (MANACH et al.,
2004).
Classificam-se os fitoquímicos como carotenoides, fenólicos, alcaloides,
compostos nitrogenados e compostos organossulfurados (Figura 4), sendo que os
fenólicos e carotenoides têm sido mais estudados. Estima-se que mais de 5000
fitoquímicos individuais tenham sido identificados em frutas, vegetais e grãos, mas
uma grande porcentagem ainda continua desconhecida e precisa ser identificada
antes que possamos compreender plenamente os benefícios de saúde por
fitoquímicos em alimentos integrais (LIU, 2003; LIU, 2004).
Essas substâncias exercem várias ações do ponto de vista biológico, como
atividade antioxidante, modulação de enzimas de destoxificação, estimulação do
sistema imune, redução da agregação plaquetária, modulação do metabolismo
hormonal, redução da pressão sanguínea, e atividade antibacteriana e antiviral
(CARRATU & SANZINI, 2005).
A existência de uma relação entre o consumo de frutas frescas e vegetais e a
menor incidência de cânceres originários em epitélios de revestimento (de
cavidade bucal, de esôfago, de estômago e de pulmão) vem sendo demonstrada
através de evidências epidemiológicas. Também tem sido comprovada a proteção
da vitamina A contra o câncer da cavidade bucal, faringe, laringe e pulmão, e a
possível diminuição do risco de desenvolver o câncer pela vitamina E. Mas não há
evidências de que a maior ingestão de vitamina C possa prevenir câncer intestinal,
apesar do bloqueio da formação endógena de nitrosaminas no trato
gastrointestinal (INCA, 2007).

20
 Fitoquímicos

Compostos Compostos
Carotenoides Fenólicos Alcaloides
Nitrogenados Organossufurados

á-Caroteno Isotiocianatos
Ácidos
â-Caroteno Flavonoides Estibenos Cumarinas Taninos Indóis
Fenólicos
â-Criptoxantina Compostos de
enxofre alílicos
Luteína
Zeaxantina
Astaxantina
Licopeno

Ácidos Ácidos
Flavanóis
Hidroxi- Hidroxi- Flavonóis Flavonas Flavanonas Antocianidinas Isoflavonoides
(Catequinas)
benzóicos cinâmicos

Catequina Genisteína
Quercetina Apigenina Eriodictiol Cianidina
Gálico p-Cumárico Epicatequina Daidzeína
Canferol Crisina Esperitina Pelargonidina
Protocatecúico Caféico Epigalocatequina Gliciteína
Miricetina Luteolina Naringenina Delfinidina
Vanílico Ferúlico Epicatequina Formononetina
Galangina galato Peonidina
Siríngico Sinápico
Fisetina Epigalocatequina Malvidina
galato

Figura 4: Classificação dos fitoquímicos dietéticos (Adaptada de LIU, 2004).

Vitamina C, carotenoides, pigmentos fenólicos, juntamente com a vitamina E

e o selênio, constituem o poder redutor natural dos alimentos. A mais importante
necessidade das células e dos tecidos é se proteger contra o estresse oxidativo.
Para essa tarefa o organismo dispõe, além de antioxidantes naturais dos
alimentos, e enzimas que combate ao estresse oxidativo como a superóxido
dismutase, a catalase, a glutationa peroxidase, selênio-dependente, além da
própria glutationa (MASCIO et al., 1991).
A atividade antioxidante de frutas, hortaliças e bebidas é muitas vezes
assumida como sendo de grande importância no combate de várias doenças
degenerativas. Ainda que não exista uma quantidade recomendada para as

21
substâncias bioativas, a recomendação de ingestão diária de frutas e hortaliças
representa um aumento na disponibilidade destes compostos, devido à relação
entre o consumo dos vegetais com a ingestão de compostos bioativos benéficos à
saúde (AMES, 1998; FALLER & FIALHO, 2009).

2.2.3.1 Frutas

O Brasil posiciona-se como o terceiro maior produtor mundial, atrás apenas

da China e Índia. A fruticultura está presente em todos os estados brasileiros e
envolve em torno de 5 milhões de pessoas, de forma direta ou indireta (ANUÁRIO
BRASILEIRO DE FRUTICULTURA, 2010).
Apesar da colheita de frutas no Brasil ficar em torno de 40 milhões de
toneladas ao ano, representa apenas 2% do comércio global do setor, o que
demonstra o forte consumo interno (57 kg habitante ano-1). Os principais mercados
compradores do produto brasileiro são a Europa, que absorve 70% das
exportações, e o MERCOSUL, que importa 11% (PLANETA ORGÂNICO, 2004;
ANUÁRIO BRASILEIRO DE FRUTICULTURA, 2010; FACHINELLO &
NACHTIGAL, 2013).
A Tabela 3 dá uma dimensão do que é a área cultivada com frutas no Brasil,
de acordo com o clima, onde se verifica que os maiores volumes de produção
ocorrem em climas tropicais e subtropicais (FACHINELLO & NACHTIGAL, 2013).

Tabela 3: Área total produtora das principais frutas no Brasil, de

acordo com o clima (IBGE, 2007).
FRUTAS ÁREA (ha)

Tropicais 1.034.708
Subtropicais 928.552
Temperadas 135.857
TOTAL 2.099.117

Legenda: ha – hectares.

22
 De acordo com dados da FAO (2012), as principais frutas tropicais são
abacaxi, manga, abacate e mamão. Os produtores de manga principais são: a
Índia, Tailândia e de abacaxi: México Filipinas, Tailândia e China. O abacate é
produzido no México, Indonésia e Estados Unidos, e o mamão na Índia, Brasil e
México, principalmente.
Em relação à produção de frutas tropicais consideradas secundárias está
concentrada nas Filipinas, Indonésia e Índia. Os maiores exportadores de manga
são o México, Índia e Brasil; de abacaxi: Costa Rica e Filipinas; exportadores de
abacate: Chile, México e Israel; e o mercado de mamão é dominado pelo México,
Malásia e Brasil. A importação de frutas frescas tropicais secundárias (lichia,
rambotã, goiaba, entre outras) concentra-se em três países: Hong Kong, Tailândia
e Malásia (FAO, 2012).
Na Tabela 4 observa-se a área plantada com as principais frutíferas
cultivadas no Brasil em 2006 (FACHINELLO & NACHTIGAL, 2013).
A fruticultura brasileira vem se expandindo nos últimos 15 anos, com saldos
positivos crescentes e com impacto amplamente favorável no desenvolvimento
econômico do País, apresentando um aumento no ano de 2008 de 4,5% na
produção de frutas frescas e de 11,5% das frutas processadas, em relação ao ano
anterior (ANUÁRIO BRASILEIRO DE FRUTICULTURA, 2009).
Existem diversas oportunidades para o lançamento de novos produtos à
base de frutas e hortaliças no mercado já que, além de serem consumidas in
natura, as frutas podem ser utilizadas como matéria-prima por indústrias
processadoras de alimentos, congeladas ou minimamente processadas
(TEIXEIRA et al., 2006).

23
 Tabela 4: Área plantada das principais espécies frutíferas
no Brasil no ano de 2006 (Modificada de IBGE, 2007).

FRUTA ÁREA (ha)

Laranja 813.354
Banana 511.181
Coco 294.161
Manga 78.484
Uva 75.385
Abacaxi 68.495
Tangerina 60.993
Limão 47.085
Maracujá 45.327
Mamão 37.060
Maçã 36.107
Pêssego 22.453
Goiaba 15.045
Abacate 10.515
Figo 3.020
Legenda: ha – hectares.

As Composições Centesimal, Mineral e Vitamínica (Tabela 5) e de

Flavonoides (Tabela 6) das frutas apresentadas a seguir são demonstradas no
ANEXO.

• Banana

As bananas pertencem à classe Monocotyledoneae, da ordem Scimitales. A

família Musaceae possui três subfamílias, a principal delas, Musoideae, apresenta
dois gêneros. O gênero Musa, onde se encontram os frutos comestíveis e de
interesse tecnológico, é representado por cerca de 30 espécies (CRUZ, 1995). É
um alimento altamente energético (cerca de 100 kcal por 100 g de polpa), cujos
carboidratos (cerca de 20%) são facilmente assimiláveis (ALVES, 1997).

24
 Diversos fatores contribuem para a boa aceitação da banana (Figura 5)
como seus aspectos sensoriais e valor nutricional, fonte energética devido à
presença de carboidratos além de minerais (potássio, cálcio, fósforo, ferro) e
vitaminas (A, B1, B2 e C), ausência de suco e de sementes duras na polpa,
disponibilidade durante todo o ano, além de possuir uma “embalagem” individual,
de fácil remoção, higiênica e, portanto, prática e conveniente (LICHTEMBERG,
1999).

Figura 5: Banana Nanica (Musa paradisiaca cv Nanica).

Seu valor nutritivo, baixo custo de produção, alta aceitação sensorial,

facilidade de consumo in natura, além de ser cultivada em mais de 80 países
tropicais, torna a banana um destaque entre as frutas. Por todos esses aspectos, a
cultura da bananeira assume importância econômica e social em todo o mundo,
principalmente entre os pequenos agricultores. Segundo a Organização de
Alimentos e Agricultura das Nações Unidas (Food and Agriculture Organization of
the United Nations - FAO), o Brasil é o quinto produtor mundial desta cultura,
tendo produzido 6,9 milhões de toneladas em 2012, em uma área aproximada de
481 mil hectares (FAO, 2009; FAO, 2014).

• Laranja

A laranjeira é a árvore frutífera mais conhecida, cultivada e estudada em todo

o mundo, sendo que, a qualidade do seu fruto, a laranja, está diretamente

25
relacionada com as condições climáticas e maturidade da fruta (KOROISHI, 2005).
A laranja ‘Pera’, Citrus sinensis (L.) Osbeck, (Figura 6) é a mais importante
variedade cítrica brasileira, sendo utilizada pela indústria e para os mercados
internos e externos de fruta fresca, tem um rendimento industrial muito bom para a
indústria, e as qualidades de seu suco a tornaram preferida tanto para a indústria
quanto para o mercado consumidor brasileiro de fruta fresca para o consumo
direto, extração e consumo local do suco (DONADIO, 1999).

Figura 6: Laranja ‘Pera’ (Citrus sinensis (L.) Osbeck).

As frutas e sucos cítricos vêm sendo reconhecidos por serem importantes

fontes de vitaminas e fibras e por conterem metabólitos secundários incluindo
antioxidantes (como ácido ascórbico, compostos fenólicos, flavonoides e
limonoides) importantes para a nutrição humana (JAYAPRAKASHA & PATIL,
2007). As laranjas também possuem consideráveis quantidades de pectina, de 3,5
a 5,5% na polpa e em pequenas quantidades no suco (WILSON, 1925;
TRESSLER et al., 1939).
Vários fatores influenciam a composição da laranja como a variedade, clima,
altitude, adubação, tipo de cavalo usado no enxerto, tratos culturais e estágio de
maturação (RODRIGUES & VIEGAS, 1980).

26
 • Limão

A lima ácida ‘Tahiti’ (Citrus latifolia Tanaka), conhecida e consagrada entre os

consumidores brasileiros como limão Tahiti (Figura 7), é uma espécie americana
de citro, tendo sua produção comercial apenas no continente americano. Sua
produção vem crescendo e ocupando lugar cada vez mais importante na
citricultura brasileira, com sua exportação em ascensão, além do consumo no
mercado interno (BARROS et al., 1991).

Figura 7: Limão ‘Tahiti’ (Citrus latifolia Tanaka).

A produção brasileira de limão no período de 1992 a 1999 passou de pouco

mais de 600 mil toneladas para mais de 700 mil toneladas em 46.554 ha, com
incremento de 4,5 mil ha no período. Em 2006, o estado de São Paulo era o
primeiro produtor deste fruto, tendo participação em 81,3% da produção, seguido
pelo Rio de Janeiro e Bahia, com 3,9% e 2,7%, respectivamente (TODA FRUTA,
2006).
Os principais constituintes solúveis são glicídios, ácidos orgânicos,
principalmente o cítrico, vitaminas, sais minerais e pequenas concentrações de
compostos nitrogenados e substâncias pécticas (TING & ATTAWAY, 1971).

• Maçã

A maçã (Figura 8) é uma das frutas mais conhecidas e provavelmente de

consumo mais difundido entre a população, é acessível e de boa disponibilidade.
É considerada uma das maiores fontes de polifenóis nas dietas ocidentais,

27
representando aproximadamente 22% do total de fenóis consumidos per capita
nos Estados Unidos (VINSON et al., 2001). De acordo com Liu et al. (2005),
apenas 100 g de maçã fresca possuem uma atividade antioxidante equivalente a
1700 mg de vitamina C e os estudos desenvolvidos vêm comprovando seus
inúmeros benefícios à saúde humana.

Figura 8: Maçã ‘Fuji’ (Malus domestica Borkh).

A maçã exerce funções como regulação do sistema nervoso, proteção de

pele e mucosas, proteção do aparelho digestivo e queda de cabelo, redução da
formação de coágulos sanguíneos, combate à obesidade, o reumatismo, a gota,
tem ação anti-inflamatória, é antioxidante, anticancerígena, cardioprotetora, reduz
os níveis de colesterol sanguíneo, funções estas que são devidas a presença de
fibras, vitamina C e compostos bioativos (quercetina, cianidina), mas, para a
obtenção de tais efeitos, recomenda-se o consumo de 1 maçã por dia (BRAGA &
BARLETA, 2012).

• Manga

A manga (Mangifera indica L.) pertence à família Anacardiaceae, é um fruto

nativo da região da Ásia, do sudeste do continente asiático e das ilhas
circunvizinhas, sendo considerada um dos melhores e mais aproveitados frutos de
origem tropical (PORTAL SÃO FRANCISCO, 2012).
Atualmente, o Brasil é o sétimo produtor mundial de manga (Figura 9) e,

28
dentre as cultivares de importância comercial, a Tommy Atkins é a mais plantada e
exportada pelo país (MARQUES et al., 2010).

Figura 9: Manga ‘Palmer’ (Mangifera indica).

De acordo com Siqueira et al. (1988), entre os micronutrientes, a manga

contém, principalmente, cálcio, fósforo e potássio e as vitaminas presentes são a A
(beta-caroteno), as do complexo B, variando entre as diferentes cultivares,
distintas condições climáticas e de solo existentes nas diferentes regiões de
cultivo. O grau de maturação dos frutos também influencia no aroma e no teor de
vitaminas C e A, pois, enquanto verdes são adstringentes, ácidos e ricos em
vitamina C, e quando maduros são doces, ricos em pró-vitamina A, moderados em
vitamina C e altamente aromáticos.
Embora haja um grande número de cultivares, apenas algumas apresentam
características comercializáveis, dentre elas, a Tommy Atkins, a mais cultivada e
exportada pelo país por apresentar maior produtividade, ser mais tolerante a
certas doenças e ainda, apresentar bons atributos de qualidade. Em seguida,
também consideradas de importância comercial estão as cultivares Haden, Keitt e
Palmer (BRASIL, 1999b; KAVATI & PIZA JR., 2000).

• Pera

A pera (Figura 10) é um dos frutos de maior aceitação e importância

econômica internacional, tendo como maiores produtores, em 2009, a China,

29
seguida pelos Estados Unidos, Itália, Espanha, Argentina. O Brasil ocupa a 46°
posição no ranking mundial, com produção de apenas 0,08% da produção mundial
(FAO, 2012).

Figura 10: Pera ‘Williams’ (Pyrus communis).

É um fruto de clima temperado a subtropical, e tem seus principais estados

produtores situados na região sul e sudeste do Brasil. Dentre os estados
brasileiros produtores, o Rio Grande do Sul é responsável por 49,77% da
produção nacional, seguido pelos Estados do Paraná com 16,28%, Santa Catarina
e São Paulo com 15,81 e 5,14%, respectivamente (FAO, 2012).

2.2.3.2 Hortaliças

A olericultura (cultura de hortaliças) é o ramo da horticultura que tem o maior

número de cultivares explorados, no geral possui ciclo curto, alta produtividade, e
está inserida em um contexto de mercado dinâmico (CAMARGO FILHO &
MAZZEI, 1994).
As hortaliças são plantas de consistência herbácea, com tratos culturais
intensivos, fornecem folhas, hastes, flores, frutos, raízes cujas partes comestíveis
são diretamente utilizadas na alimentação humana, ou seja, in natura ou com
pouco processamento (AMARO et al., 2005).
De acordo com Amaro et al. (2005), as hortaliças compreendem mais de 70
espécies e podem ser agrupadas de acordo com a parte comestível em:

30
 − Hortaliças-folhosas: alface, almeirão, agrião, espinafre, couve, cebolinha,
salsa, rúcula;
− Hortaliças-flores: couve-flor, couve brócolos;
− Hortaliças-frutos: berinjela, jiló, abóbora, quiabo, chuchu, tomate,
pimentão, pepino;
− Hortaliças-tubérculos: batata; cará;
− Hortaliças-raízes: cenoura, beterraba, rabanete, nabo, batata-doce;
− Hortaliças-bulbos: cebola, alho;
− Hortaliças-rizomas: inhame;
− Hortaliças-hastes: aspargo, aipo ou salsão;
− Hortaliças-condimentos: cebolinha, coentro, pimenta, salsa, manjericão,
hortelã.

Segundo a Tabela Brasileira de Composição de Alimentos (TACO, 2006),

elaborada pela Universidade Estadual de Campinas (NEPA-UNICAMP), hortaliças
como alface, acelga e agrião possuem mais de 90% de umidade, poucas calorias,
gorduras e proteínas, e quantidades significativas de fibras e minerais. Dentre os
minerais, são encontrados cálcio, magnésio, fósforo, ferro e potássio. Dentre as
vitaminas, em maior quantidade estão a vitamina C e a tiamina (LEONE, 2009). As
Composições Centesimal, Mineral e Vitamínica (Tabela 5) e de Flavonoides
(Tabela 6) das hortaliças apresentadas a seguir são demonstradas no ANEXO.
Dados do IBGE estimam que, em 2012, a produção de hortaliças no Brasil
tenha sido maior que 18 milhões de toneladas em uma área de 800 mil hectares
(VILELA, 2013).

• Couve

A couve folha (Brassica oleracea var. acephala) pertence à família das

Brassicaceae, é uma planta herbácea de porte ereto, com caule sublenhoso, emite
folhas continuamente e perene (COSTA et al., 2011).

31
 É popularmente conhecida no Brasil como couve manteiga (Figura 11) ou
couve de folhas. Apresenta um cultivo típico de outono e inverno, mas com
tolerância ao calor, podendo ser plantada durante o ano todo em diferentes
regiões do Brasil (CATÁLOGO BRASILEIRO DE HORTALIÇAS, 2011). De acordo
com Camargo et al. (2008), em 2006, a área plantada de couve no estado de São
Paulo era de 1200 ha, aumentando para 1424 ha em 2007, com produtividades de
26,7 e 28,8 toneladas por hectare, respectivamente.

Figura 11: Couve Manteiga (Brassica oleracea var. acephala).

A couve manteiga tem destaque pela sua importância econômica, facilidade

de cultivo e pela riqueza em sais minerais, vitaminas e por comportar-se como
uma fonte de antioxidantes (fonte de carotenoides e outros flavonoides na
alimentação humana). É extensamente utilizada na medicina tradicional brasileira,
principalmente exercendo funções de alivio aos sintomas de úlcera gástrica
(CATÁLOGO BRASILEIRO DE HORTALIÇAS, 2011; FAGUNDES, 2012).
Segundo Lorenz & Maynard (1988), comparativamente a outras hortaliças
folhosas, a couve manteiga se destaca por seu maior conteúdo de proteínas,
carboidratos, fibras, cálcio, ferro, vitamina A, niacina e vitamina C, além de ser
excelente fonte de carotenoides apresentando, entre as hortaliças, maiores
concentrações de luteína e beta caroteno (LORENZ & MAYNARD, 1988;
LEFSRUD et al., 2007).

32
 • Couve-flor

A couve-flor (Brassica oleracea var. botrytis), Figura 12, pertencente à

família Brassicaceae, com a comestível composta por uma inflorescência imatura
inserida sobre um caule curto, podendo ter coloração branca, creme, amarela,
roxa e verde. Pode ser produzida durante o ano inteiro devido aos programas de
melhoramento genético, que produziram cultivares e híbridos adaptados à alta
temperatura (MAY et al., 2007; KANO et al., 2010).

Figura 12: Couve-flor (Brassica oleracea var. botrytis).

De acordo com o Anuário Brasileiro de Hortaliças (2013), em 2012 o estado

de São Paulo produziu aproximadamente 43 mil toneladas de couve-flor, com uma
área plantada de 2 mil hectares.
A couve-flor possui alto valor nutritivo, contendo vitaminas A, B1, B2, B5, C,
cálcio, ferro e fósforo. Também, a espécie apresenta algumas propriedades
medicinais, como favorecimento da neutralização gástrica e auxílio na
manutenção óssea, além de excelente mineralizante (TAKEISHI et al., 2009).

• Hortelã

Existem mais espécies de menta (Figura 13) do que se consegue identificar,

pois a polinização das várias espécies ocorre de forma cruzada, dando origem a
novos híbridos. O gênero Mentha compreende cerca de 25 espécies diferentes de
hortelãs e correlatos que pertencem à família Labiatae (MAIA, 1958).

33
 Figura 13: Hortelã (Mentha s.p.).

Várias espécies de Mentha têm sido investigadas, tanto por suas atividades
biológicas como também pelos óleos essenciais produzidos por suas folhas, o
qual é rico em mentol (50 - 70%), de larga aplicação na indústria de alimentos,
farmacêutica e de higiene, além de mentofurona, pineno, limoneno e cânfora,
tanino, ácidos orgânicos, flavonoides e heterosídios (MARTINS et al., 1994;
MARTINS et al., 2002).
Destacam-se pelo uso em chás com efeito medicinal, conhecidos
principalmente pelo seu sabor característico e aroma refrescante, por
apresentarem indicação digestiva, estimulante e tônica em geral. É carminativa,
antiespasmódica, estomáquica, expectorante, antisséptica, colerética, colagoga e
vermífuga. Usada também na alimentação como condimento, e industrialmente é
extraída uma essência, geralmente empregada na perfumaria e na fabricação de
bebidas e doces (MAIA, 1958; MARTINS et al., 2002).
As espécies mais cultivadas no Brasil são a Mentha arvensis e a Mentha
spicata, pois ambas são bem adaptadas ao clima subtropical (temperaturas entre
18 e 24ºC), apesar de suportarem temperaturas de até 40ºC na máxima e 5ºC na
mínima (CORRÊA JUNIOR, 1994).

• Repolho

Entre as hortaliças, as Brássicas são umas das principais fontes de alimento

consumidas nos países desenvolvidos, ficando atrás das Solanáceas (batata e

34
tomate). Na Europa, Portugal e Espanha apresentam os maiores consumos por
habitante, e no Brasil o repolho (Brassica oleracea var. capitata L.) é a brássica
mais consumida. A cultura do repolho (Figura 14) tem importância em grande
parte do território nacional, com maiores concentrações de cultivos em cinturões
verdes próximos de capitais e nas regiões serranas (DE ARAGÃO et al., 2013).

Figura 14: Repolho Branco (Brassica oleracea var. capitata L.).

Os seus efeitos benéficos são conhecidos na prevenção do câncer e

doenças cardíacas, na redução de inflamações e no estímulo do sistema
imunológico. Uma porção de repolho (150 gramas) é suficiente para suprir 92% da
necessidade diária de vitamina K de um adulto, 50% das necessidades de
vitamina C, 15% da necessidade de manganês e de vitamina B6, além de outros
minerais e vitaminas (GUTIERREZ, 2013).

2.2.3.3 Biodisponibilidade e Bioacessibilidade de Compostos Bioativos

Ainda que sejam apresentadas evidências dos benefícios proporcionados

pelo consumo de alimentos ricos em vitaminas e compostos bioativos, é essencial
o conhecimento da biodisponibilidade destas substâncias na avaliação da sua
função na promoção da saúde (GRANADO et al., 2006).
Para que um composto tenha elevada atividade antioxidante ou outras
atividades biológicas in vitro, uma quantidade suficiente deste composto deve
chegar aos tecidos-alvo para que exista atividade biológica in vivo. Por este
motivo, além do conhecimento da quantidade de um nutriente presente em um

35
alimento específico ou suplemento dietético, deve-se conhecer ainda mais a sua
disponibilidade. Exemplo deste fato são os polifenóis, os quais são os mais
abundantes em nossa dieta, mas não são necessariamente aqueles que têm o
melhor perfil de biodisponibilidade (D'ARCHIVIO et al., 2010).
Além de não ser biodisponível in vivo, um bioativo também pode ser
rapidamente metabolizado e excretado, tornando-se ineficaz. Uma abordagem
completa sobre a atividade biológica dessas substâncias deve abranger o estudo
da sua biodisponibilidade, englobando a absorção, distribuição, o metabolismo, o
tempo de meia vida efetiva, os mecanismos de ativação e inativação e a excreção
do composto em questão. Certamente, poucos compostos bioativos foram
adequadamente estudados sob este ponto de vista (HORST & LAJOLO, 2012).
No caso da Nutrição, a biodisponibilidade pode ser definida como a fração do
nutriente, ou composto bioativo, que está disponível para ser utilizado em funções
fisiológicas ou ser armazenado, ou seja, fração do alimento que nosso organismo
é capaz de utilizar efetivamente. Dessa forma, o termo “biodisponibilidade”
engloba aspectos relacionados à ingestão, absorção, metabolismo, distribuição
aos tecidos e bioatividade (PARADA & AGUILERA, 2007).
Bioatividade aborda eventos ligados à forma como os compostos bioativos
são transportados e atingem os tecidos-alvos, ou seja, como eles interagem com
as biomoléculas, o metabolismo ou biotransformação que podem sofrer, e a
geração de um marcador biológico e a resposta fisiológica que provocam
(FERNANDEZ-GARCIA et al., 2009).
Diversos fatores, quando avaliados em conjunto, respondem pelas variações
intra e interindividuais na biodisponibilidade de um determinado composto bioativo
de alimentos: a complexidade da matriz alimentícia, a forma química do composto
de interesse, estrutura e quantidade de outros compostos ingeridos
concomitantemente (fatores exógenos) e ainda o tempo de trânsito intestinal,
esvaziamento gástrico, metabolismo do composto e grau de conjugação, possíveis
interações com proteínas na circulação sanguínea e tecidos, composição da
microflora intestinal e o perfil genético do indivíduo (fatores endógenos). (;

36
SCHOLZ & WILLIAMSON, 2007; HOLST & WILLIAMSON, 2008; CROZIER et al.,
2009).
Alguns compostos bioativos apresentam baixa biodisponibilidade,
especialmente quando comparada à de macronutrientes, devido ao fato de o
organismo reconhecer esses compostos como xenobióticos. Este fato ocorre pela
incapacidade do organismo distinguir compostos com potencial benéfico, tóxico ou
neutro, diferenciando apenas se os compostos são ou não nutrientes.
Similarmente ao que ocorre com os micronutrientes, somente parte dos
compostos bioativos não nutrientes é absorvido/metabolizado, a exemplo da
absorção dos polifenóis estimada entre 1% e 60% do total ingerido (BASTOS et
al., 2009).
Manach et al. (2005) compilaram dados a partir de estudos de maior
relevância, e publicaram uma revisão na qual foram avaliados 97 estudos de
várias classes de polifenóis, nomeadamente, antocianinas, flavonóis, flavanonas,
monômeros flavonol, proantocianidinas, isoflavonas, ácidos hidroxicinâmicos e
hidroxibenzóicos. Concluiram que a biodisponibilidade varia amplamente entre os
polifenóis e, para alguns destes compostos, entre as fontes alimentares,
dependendo das formas que contêm.
A biodisponibilidade pode ser avaliada por métodos in vivo ou in vitro, sendo
este último baseado em modelos experimentais que simulam a fisiologia humana.
Quando comparados a estudos in vivo, os modelos in vitro têm como vantagem a
facilidade, baixo custo e reprodutibilidade, a possibilidade da avaliação do grau de
liberação destes compostos a partir da matriz alimentar, estabilidade frente ao
processo digestório, além de poder estimar a quantidade realmente disponível
para possível absorção pelo epitélio gastrointestinal (GRANADO-LORENCIO et
al., 2007).
Define-se bioacessibilidade como a fração do composto liberada da matriz
alimentar no trato gastrointestinal a qual se torna disponível para absorção, ou
seja, a bioacessibilidade considera toda a sequência de eventos que ocorre
durante a transformação do alimento em função da ação do processo digestório

37
(PARADA & AGUILERA, 2007).
Muitas vezes os termos biodisponibilidade e bioacessibilidade são utilizados
indistintamente, mas é importante salientar que a biodisponibilidade inclui os
conceitos de bioatividade, bem como bioacessibilidade. A determinação da
bioacessibilidade fornece informações importantes na seleção da quantidade
apropriada e as matrizes de alimentos adequadas para assegurar a qualidade
nutricional dos produtos alimentares e também pode ser utilizada como ferramenta
de apoio na estimativa de medições de bioatividade e compostos potencialmente
bioativos, na investigação de seus possíveis benefícios à saúde (GIORI, 2010).
Pelo fato de existirem efeitos sinérgicos nas misturas de polifenóis contidos
na matriz de cada alimento testado, são difíceis de obter conclusões definitivas
sobre a biodisponibilidade e bioatividade de um único composto fenólico
(D'ARCHIVIO et al., 2010).

2.3 BEBIDAS FUNCIONAIS

A indústria de alimentos aderiu a relação dieta/saúde, o que levou ao

desenvolvimento de novos produtos cujas funções almejam ultrapassar o
fornecimento de nutrientes básicos e a satisfação do paladar do consumidor.
Produtos estes, conhecidos como “alimentos funcionais”, têm como principal
função a redução do risco de doenças crônico-degenerativas e representam uma
nova fatia do mercado de alimentos, como principais apelos de venda os
benefícios à saúde (GOMES & BONNAS, 2010).
As escolhas para bebidas se tornaram tão específicas que têm representado
o estilo de vida dos consumidores. Consumidores estes que podem escolher entre
bebidas que aumentam a energia, ou que ajudam no controle de peso, no
desenvolvimento cognitivo, na saúde dos ossos e articulações, ou bebidas que
são específicas para cada idade e gênero, com um foco crescente em produtos
destinados a crianças, mulheres e idosos (FORTITECH, 2011).
De acordo com relatório de 2009 da Associação Brasileira as Indústrias de

38
Refrigerantes e Bebidas Não Alcoólicas (ABIR), o mercado brasileiro foi
influenciado por muitas das tendências de consumo globais onipresentes como: a
consciência saudável; aumento do poder aquisitivo; consumo de conveniência
(“on-the-go”); bebidas funcionais; explosão das vendas de bebidas de baixa
caloria. Todos estes fatores estão encabeçando o crescimento do mercado de
bebidas funcionais no Brasil (ABIR, 2009).
Na última década, o mercado de bebidas funcionais cresceu
consistentemente, com um maior aumento nos últimos anos. De acordo com o
Datamonitor, o mercado global de bebidas não alcoólicas está avaliado em quase
US$ 500 bilhões, sendo que a Europa corresponde a US$ 189 bilhões, e com
rápido crescimento do mercado chinês com uma taxa geral de 77% ao longo da
última década (FORTITECH, 2011).
Acima de 83% dos britânicos consome suco de frutas, bebidas de sucos e
smoothies, e uma alta proporção de consumidores bebe pelo menos uma vez por
semana. Dada a maturidade do mercado, há uma grande inovação de produtos a
qual tem tornado o mercado dinâmico e altamente competitivo (MINTEL, 2013).

2.3.1 Bebidas Mistas de Frutas e Hortaliças

Apesar de serem uma excelente fonte de vitaminas, enzimas e minerais,

algumas frutas e hortaliças apresentam um off flavor e amargor que dificultam o
seu consumo. Como uma alternativa conveniente e econômica para aumentar a
ingestão destes alimentos, sugere-se a mistura de dois ou mais sucos de frutas e
hortaliças com extratos de temperos para a preparação de bebidas nutritivas. No
campo da indústria de alimentos pode-se pensar no desenvolvimento de bebidas
naturais e saudáveis através da mistura de frutas e hortaliças, que também podem
servir como aperitivo (BHARDWAJ & PANDEY, 2011).
O consumo de sucos de hortaliças pode dar-se por meio de blends ou
néctares, principalmente com a inclusão de suco de frutas, pois, apesar de ser um
eficiente meio de preservar a saúde e de serem excepcionalmente nutritivos,

39
esses sucos apresentam preferência limitada ou sabor pouco palatável. Essas
misturas são formuladas buscando a criação de bebidas funcionais, refrescantes,
agradáveis e naturais; proporcionando um novo tipo de sabor e/ou sensação e
sensações especiais “texturalmente modificadas”; garantir a existência desses
alimentos durante o ano todo, sendo uma boa maneira de utilização do excesso
de produção desses componentes (KOON, 2000; PSZCZOLA, 1995).
O órgão responsável pela regulamentação de produtos de origem vegetal no
Brasil é o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). A Lei nº
8918 do MAPA define suco misto como o suco obtido pela mistura de duas ou
mais frutas e das partes comestíveis de dois ou mais vegetais, ou dos seus
respectivos sucos, sendo a denominação constituída da palavra suco, seguida da
relação de frutas e vegetais utilizados, em ordem decrescente das quantidades
presentes na mistura (BRASIL, 1994).
Bebidas temperadas também estão ganhando importância no mercado na
forma de drinks de frutas/polpas/aperitivos/bebidas saudáveis, entre outros
produtos. Estudos relatam que a qualidade organoléptica de bebidas prontas para
servir poderia ser aumentada pela adição de extratos de especiarias como, por
exemplo, gengibre, pimenta preta, hortelã, cardamomo e cominho. Estas
especiarias, além de serem saborosas, possuem propriedades medicinais e
terapêuticas, que tem um efeito profundo sobre a saúde humana, já que afetam
muitos processos funcionais (JOSHI et al., 1993; GOWDA & JALALI, 1995;
BHARDWAJ & PANDEY, 2011).
Diversos motivos têm motivado e aumentado o consumo de sucos mistos de
frutas e hortaliças industrializados, como a falta de tempo para preparar suco das
frutas in natura, a praticidade oferecida pelos produtos processados, preocupação
com o consumo de alimentos mais saudáveis e, por este motivo, a substituição
das bebidas carbonatadas por sucos nutritivos. Suco mistos naturais também
podem se tornar um novo hábito devido às diversas combinações de cores,
sabores e aromas, além das possíveis propriedades funcionais que apresentam
(MATSUURA & ROLIM, 2002; LIERMANN, 2012).

40
 Quase 60% dos adultos do Reino Unido consomem sucos puros de frutas e
hortaliças, e as vendas destes aumentaram em 15%, entre 1999 e 2004. A NDNS
(National Diet and Nutrition Survey) do Reino Unido informou em 2002 que o
consumo médio de sucos puros de frutas e hortaliças foi de 106 g/dia, sendo que
os homens consumiram um pouco mais do que as mulheres. O pico de ingestão
encontra-se entre aqueles com idade entre 25-34 anos e, posteriormente,
diminuindo com a idade (HENDERSON & GREGORY, 2002; MINTEL, 2004).
Há inúmeros relatos na literatura sobre o benefício de sucos verdes
comerciais, contendo couve, assim como outros vegetais folhosos verdes escuros
em associação (FAGUNDES, 2012). Diversos estudos investigaram os efeitos do
processamento em diferentes sucos puros de frutas e hortaliças, avaliando, entre
outros fatores, o impacto sobre a atividade antioxidante e os níveis de compostos
fenólicos, além da estabilidade durante o armazenamento, avaliação sensorial e
biodisponibilidade in vivo.
Quinteros (1995) investigou a estabilidade de duas formulações de néctares
acerola-cenoura, processadas a escala piloto e armazenadas sob condições
ambientais durante um período de seis meses. Algumas características dos
néctares tais como pH, ºBrix, acidez titulável, açúcares redutores e não redutores
permaneceram inalterados durante o período do estudo, não foi detectada a
presença de microrganismos e a análise sensorial realizada pelos provadores não
detectou mudanças significativas dos atributos sensoriais no decorrer do
armazenamento.
Koon (2000) formulou um néctar misto de frutas e hortaliças composto pelos
sucos de beterraba, cenoura e carambola e polpa de morango, na proporção final
de 2:2:1:2, respectivamente, com brix final de 13º, fonte de potássio e ferro. O
néctar foi enlatado e um estudo da vida de prateleira foi realizado durante 6
meses, onde foram analisadas sensorial, microbiológica, física e fisico-
quimicamente. Na análise sensorial, o produto final obteve médias consideradas
boas para aparência e aceitação global, sendo um produto palatável, o qual teve
uma indicação de vida de prateleira de três meses, período em que as

41
características físicas, químicas, microbiológicas e sensoriais apresentaram boa
estabilidade à temperatura ambiente.
Dhaliwal & Hira (2001) relataram que formulações de sucos e bebidas
através de misturas de frutas e hortaliças (cenoura, beterraba, cenoura preta,
limão e gengibre) são possíveis para satisfazer o gosto e preferência dos
consumidores. Estes sucos podem ser armazenados de forma eficaz durante um
período de 3 meses sem qualquer mudança no pH, acidez, sólidos totais,
densidade, viscosidade, contagem total de bactérias, açúcares, taninos e minerais.
Kang et al.(2004) mostraram resultados referentes à uma ação protetora do
suco verde comercial de vegetais contra o câncer. Eles observaram uma
diminuição de dano oxidativo ao DNA humano após avaliar vinte indivíduos
fumantes tratados com suco verde durante oito semanas.
Bradi et al. (2005) demonstraram uma ação quimiopreventiva do suco verde
em linhagens celulares de câncer de mama humano, observando uma supressão
da proliferação celular.
Branco et al. (2007) elaboraram um blend de suco de laranja e cenoura (com
diferentes teores, 5 e 25%) e concentrado a diferentes teores de sólidos solúveis
(15 e 30 ºbrix), selecionando através de análise sensorial a formulação com 5% de
cenoura e 15 ºbrix. Concluiu-se que o processo de concentração e o
armazenamento, pelo período de 60 dias, acarretaram na redução significativa dos
conteúdos de ácido ascórbico e carotenoides totais.
Sousa et al. (2010) desenvolveram formulações de néctares mistos de frutas
tropicais (caju, manga e acerola), acrescidos de diferentes concentrações de
extratos de Ginkgo biloba, Panax ginseng e misturas de Ginkgo biloba e Panax
ginseng, avaliaram características sensoriais, físico-químicas e químicas dos
néctares selecionados. Como resultados, observaram que a adição dos extratos
não afetou a composição química dos néctares, os quais apresentaram
quantidades elevadas de vitamina C, carotenoides, fenólicos totais e antocianinas.
Borges et al. (2010) desenvolveram uma bebida rica em polifenóis, como um
meio conveniente de fornecimento de polifenóis adicionais à dieta, e investigaram

42
a biodisponibilidade do seu vasto espetro de constituintes através da realização de
um estudo in vivo, com coleta de plasma e urina durante 24 horas e análise por
HPLC-PDA-MS. Observou-se que a combinação de compostos polifenólicos na
bebida são absorvidos e excretados a uma extensão similar, quer ingeridos
individualmente ou em conjunto, em uma única bebida. Concluindo-se que a
bebida rica em polifenóis pode fornecer a mistura pretendida de polifenóis
biodisponíveis, sem que, para isso, seja necessário o consumo de vários
alimentos diferentes.
Leone et al. (2011) desenvolveram um suco misto de frutas e hortaliças,
composto por 21,8% de polpa de uva, 14% de polpa de azedinha e 4,2% de polpa
de acerola. Este suco foi avaliado quanto à atividade antioxidante e aos valores de
luteína, compostos fenólicos e vitamina C, durante 100 dias de armazenamento.
Após 100 dias de armazenamento, o suco misto possuía boa atividade
antioxidante, mantendo suas propriedades bioativas de auxílio na prevenção de
doenças causadas pelos radicais livres.
Liermann et al. (2012) analisaram algumas características físico-químicas de
duas formulações de uma bebida mista de couve e limão, comparando o método
de cultivo orgânico com o convencional. Os resultados apresentados
demonstraram que a união da couve e do limão contribui para o aumento do pH
melhorando a palatabilidade do suco, em relação ao suco puro de limão; as
formulações feitas a partir de produtos orgânicos apresentaram maiores valores de
pH, menores de acidez titulável, sugerindo maior susceptibilidade a
microrganismos deterioradores; e o tratamento “orgânico sem casca” apresentou
maior relação ratio entre os demais.
George et al. (2012) investigaram os efeitos do consumo diário de frutas e
hortaliças, através de bebidas baseadas em purês, na vasodilatação,
biodisponibilidade fitoquímica, status antioxidante e outros fatores de risco de
doenças cardiovasculares. Realizou-se um estudo in vivo onde sangue e urina
foram coletados antes e após cada intervenção e a vasodilatação avaliada. No
geral, os resultados obtidos no estudo mostraram que as bebidas baseadas em

43
purês de frutas e hortaliças são um veículo útil para aumentar a ingestão de frutas
e hortaliças, aumentando significativamente as concentrações de fitoquímica
dietéticos e plasmáticos, com uma tendência para o aumento da vasodilatação
endotélio-dependente.
De acordo com Houchins et al. (2012), os efeitos de frutas e hortaliças nas
formas bebidas versus sólida sobre o apetite humano e ingestão de alimentos,
aguda e cronicamente, não são claras. Foi realizado um estudo in vivo que avaliou
classificações apetitivas após a inclusão de frutas e hortaliças, em formas sólidas
e bebidas, na dieta habitual de adultos magros saudáveis e com
sobrepeso/obesos, com baixo consumo habitual. Na forma aguda, os participantes
com sobrepeso/obesidade relataram menores reduções de fome após o consumo
da pré-carga de fruta em bebida comparada com a forma sólida. Os participantes
também consumiram significativamente menos da dieta de teste (tanto grama
quanto energia) após a ingestão da pré-carga de fruta sólida. No entanto, a
latência da refeição subsequente não foi significativamente diferente entre as pré-
cargas de frutas sólidas ou bebida. A ingestão total de energia diária foi
significativamente maior quando os participantes obesos consumiam a pré-carga
de bebida de frutas em comparação com a sólida. A ingestão diária de energia foi
marcada, mas não significativamente maior entre os magros entre as formas
bebida versus alimento sólido. As classificações de fome e saciedade
permaneceram estáveis quando os participantes consumiram frutas e hortaliças
em forma sólida ou bebida durante 8 semanas cada. As respostas apetitivas
agudas pós-ingestivas foram mais fracas após o consumo de frutas em formas de
bebidas versus alimento sólido. Consumo de cargas de frutas e hortaliças nas
formas sólida ou bebida durante 8 semanas não altera cronicamente as respostas
apetitivas.
Bhardwaj & Pandey (2011) apresentaram uma revisão com foco na mistura
de frutas, frutas subutilizadas, hortaliças, plantas medicinais e especiarias na
preparação de bebidas nutritivas à base de frutas e hortaliças naturais. Com base
nos dados analisados, concluíram que a formulação de bebidas pela mistura de

44
frutas, hortaliças e sumos de especiarias é extremamente útil para satisfazer os
gostos e preferências dos consumidores. Estas bebidas tem uma vida de
prateleira mais longa (3-6 meses), sem ter quaisquer infestações microbianas de
sucos. Portanto, há um grande potencial para a utilização e comercialização de
bebidas mistas de frutas, hortaliças e sumos de especiarias como bebida natural e
saudável de frutas muito ou pouco exploradas, não só no mercado interno como
na frente de exportação.

2.3.2 Sucos versus Smoothies

Para aumentar a ingestão de fitoquímicos, a indústria de alimentos oferece

smoothies como uma alternativa e/ou adição ao consumo de frutas e hortaliças
frescas. Os smoothies foram introduzidos pela primeira vez em 1960 nos Estados
Unidos e Reino Unido e reemergiu em 2000, recentemente também na Alemanha,
pertencem aos sucos de frutas, e são originalmente compostos apenas por frutas
e vegetais frescos (QIAN, 2006; TITUS, 2008).
Para a produção dos smoothies utilizam-se frutas integrais, as quais são
processadas até polpa ou purê, parcialmente com pedaços, mas sementes e
cascas (não comestíveis) são removidas. Na maioria dos casos, as misturas de
frutas e hortaliças são selecionadas baseadas em cores, sabor, textura potável e,
principalmente, por garantir a alta concentração de nutrientes com baixo teor
energético (QIAN, 2006; WATZL, 2008).
De acordo com Ruxton (2008), a Tabela 7 mostra que os smoothies contêm
mais calorias, carboidrato, açúcares, fibra e vitamina C por 100 g do que o suco de
laranja. Como um resultado da inclusão da fruta integral homogeneizada, os
smoothies contêm 1,7 g de fibras por 100 g, em comparação com 0,1 g por 100 g
de suco. Ambas as bebidas são ricas em vitamina C e podem ser rotuladas com a
alegação de '’fonte’’ sob os Regulamentos de Alegações Nutricionais e de Saúde
(Nutrition and Health Claims Regulations - CE 1924/2006). No entanto, apenas os
smoothies seriam permitidos ter alegação de "fonte" de fibra. Ao contrário de

45
sucos, a composição de macronutrientes dos smoothies é similar ao encontrado
em duas porções de fruta, notando-se a similaridade no conteúdo de açúcar (todos
por volta de 30 g). Pôde-se sugerir que a escolha de um smoothie pelo
consumidor como parte do consumo recomendado de 5 porções de frutas e
hortaliças ao dia, teria uma ingestão total de açúcar que não foi significativamente
mais elevada do que se o consumidor escolhesse consumir uma banana e uma
porção de manga ou cereja.

Tabela 7: Comparação da composição de nutrientes (por 100 g) entre uma

média de smoothies e um suco de laranja espremido na hora (RUXTON, 2008).

*
COMPOSIÇÃO SMOOTHIE SUCO DE LARANJA

Calorias (kcal) 56 43
Proteína (g) 0,6 0,7
Carboidratos (g) 14,4 9,0
Açúcares (g) 12,1 9,0
Gordura (g) 0,3 0,0
Fibra (AOAC) (g) 1,7 0,1
Vitamina C (mg) 41 30
Antioxidantes ORAC (mmol TE)** 1566 900

*Baseado em uma composição média de 8 amostras de smoothies Innocent (líderes de

Mercado com 74% do market share; IRI 2008).
Legenda – ORAC: método baseado na Capacidade de Absorção do Radical Oxigênio
(**TE – equivalente de vitamina E).
AOAC: Association of Analytical Chemists (Associação de Química Analítica)

Müller et al. (2010) analisaram smoothies, purês de frutas, concentrados e

sucos utilizados pela indústria de alimentos para a produção destas novas
bebidas. Foram analisados Fenólicos Totais (Folin Ciocalteu), teor de vitamina C e
capacidade antioxidante (CAO) (métodos FRAP, TEAC e ORAC) usando métodos
de alto rendimento em um leitor de microplacas (NOVOstar BMG LABTECH). O
teor de vitamina C variou entre 31 ± 3 mg/100 g de concentrado de romã para
1375 ± 125 mg/100 g de purê de acerola, o conteúdo de compostos fenólicos
totais foi quantificado entre 51 ± 1 mg equiv. de ácido gálico (GAE)/100 g do

46
smoothie manga-pêssego e 1152 ± 62 mg/100 g de purê de acerola rico em ácido
ascórbico. A CAO diferiu dependendo do tipo de fruta e ensaio de antioxidante
usado. Na maioria dos produtos de fruta, a maior parte de CAO foi gerada por
compostos polifenólicos, exceto o purê de acerola e suco de laranja.
Comparando-se smoothies e sucos comerciais, de processamento mais
moderado, as características nutricionais e organolépticas dos vegetais são
melhor preservadas nos smoothies. Considerando-se que é um produto livre de
aditivos e sem adição de açúcar, pode-se estabelecer o smoothie como um
produto de elevado interesse nutricional e conveniência para o consumidor. Os
smoothies ocupam um lugar de destaque em um mercado onde os consumidores
procuram produtos de elevada qualidade organoléptica e nutricional,
convenientes, minimamente processados e de composição simples (KEENAN et
al. 2012a).

2.3.2.1 Mercado de Smoothies

De acordo com o Instituto Brasileiro de Frutas (IBRAF), as tendências

internacionais apontam demanda crescente por uma alimentação mais saudável à
base de frutas e vegetais e por produtos com alto teor nutritivo, que promovam
bem-estar. Um desses produtos é o smoothie, bebida com combinações variadas,
que traz uma grande porção, acima de 50%, ou é integralmente à base da fruta
natural, tendo como diferencial o alto valor nutricional da fruta, pura ou
concentrada, e o valor calórico entre 45 e 88 calorias (em 100 mL) (IBRAF, 2009).
Os smoothies são uma das mais recentes apresentações no mercado para o
consumo de fruta. Ao nível do mercado europeu tem havido um crescente
posicionamento dos smoothies, sendo que o Reino Unido foi o país europeu com
maior atividade relativa a lançamento de produtos, no período compreendido entre
janeiro e setembro de 2011, de acordo com a base de dados INNOVA, Figura 15
(NUNES, 2011).

47
 Figura 15: Análise global do lançamento do produto smoothie (NUNES, 2011).

De acordo com Vivianne Ihekweazu, analista de mercado sênior da Mintel,

“os smoothies têm sido a verdadeira história de sucesso das bebidas do século 21
e, claramente, não são mais um nicho de mercado. Alimentação saudável, e em
particular a campanha '5 frutas e vegetais ao dia', têm sido a força motriz por trás
das taxas contínuas do crescimento excepcional. Com consumidores do Reino
Unido tornando-se cada vez mais conscientes da saúde e à luz das preocupações
crescentes sobre a obesidade em adultos e crianças, o mercado de smoothie está
para ver um crescimento futuro significativo” (MINTEL, 2011).
Segundo dados da Mintel (2011), no Reino Unido, os smoothies de fruta são
o centro do mercado, contando com 86% das vendas em 2006, mas também faz
parte deste mercado emergente o desenvolvimento de smoothies funcionais (por
exemplo, com ginseng, equinácea e outros ingredientes).
A indústria dos smoothies na Europa e Estados Unidos tem acompanhado as
preferências do consumidor, com o adequamento do processamento e tecnologia
associada, além de estar inovando o produto em relação à sua funcionalidade. A

48
Figura 16 demonstra os principais atributos que têm sido desenvolvidos nos
smoothies em ambos os mercados (NUNES, 2011).

Figura 16: Principais atributos de consumo em smoothies (NUNES, 2011). Legenda: SA/Com
(sem aditivos e sem conservantes; S/Açucar (Sem açúcar adicionado); 100%Rec (suco 100%
reconstituído); Alerg (Alergênicos); S/Glúten (Sem glúten); BebSum (Bebidas de sumo – mais de
25% suco); Org (Orgânico); Nect (Néctar); Nat (Natural); Et (Ético); SauInt (Saúde intestinal);
100%N/Com (100% não concentrado); Des (Desidratado); Econ (Econômico); BaixoCal (Baixo
valor calórico).

Ainda que tenha ocorrido um grande crescimento no mercado dos smoothies

no Reino Unido, apenas 31% dos adultos consome este produto, sendo a faixa
etária entre 15-19 e 25-34 anos, nas regiões de Londres e do sul do Reino Unido,
que mais consomem smoothies (NUNES, 2011).
Em países como a Alemanha, por exemplo, o smoothie tornou-se um boom
de consumo: só em setembro de 2006 foram consumidos 4 milhões de litros. Em
outros países, como a República da Irlanda, tem havido uma tendência no
desenvolvimento do mercado desta bebida, sendo que neste país, houve um
crescimento de 214%, no período compreendido entre 2002 e 2006 (IBRAF, 2009;

49
MINTEL, 2011; KEENAN et al., 2012a).
Pesquisas mais recentes da Mintel (2011) mostram que, ao longo dos anos
de 2006-2011, o mercado de smoothies tem desfrutado de uma explosão real de
energia, com as vendas crescendo por nada menos do que 523%, atingindo 134
milhões de euros em 2006.
Desde 2007, as vendas do smoothie pronto pra beber sofreram um
crescimento extremamente forte, com um aumento de 124% no período de 2007 a
2012, arrecadando por volta 608 milhões de dólares. O crescimento da categoria
foi impulsionado pelo desejo dos consumidores por produtos inovadores,
convenientes e nutritivos que abordassem a nutrição e a saúde (MINTEL, 2012).
Como existe uma baixa saturação do mercado e uma grande concorrência
entre os smoothies feitos por encomenda, os fabricantes dos smoothies prontos
para beber devem difundir seu produto entre todos os segmentos de
consumidores e continuar a desenvolver smoothies inovadores em uma variedade
de formatos que incentive novos usuários e aumente a compra entre
consumidores ocasionais. Esforços também devem ser concentrados para facilitar
a portabilidade e consumo em movimento destas bebidas, pois apenas 41% dos
consumidores ingerem smoothies fora de casa (LLOYD, 2011; MINTEL, 2012).

2.3.2.2 Green Smoothie

De acordo com Assis (2009), o Green Smoothie é um suco preparado
apenas com frutas, folhas verdes e algum líquido (água ou água de coco, por
exemplo), com proporções referenciais de 60% de frutas, 40% de folhas verdes e
líquido. As folhas mais populares são a couve, a acelga, o espinafre, a folha de
rama de beterraba, a hortelã, a menta, as alfaces lisa, crespa e americana, e as
menos populares, e que devem ser usadas em pequena quantidade, são o agrião,
a mostarda, a grama de trigo, a folha de cenoura e as alfaces roxa e romana.
Devem ser usadas frutas que possam ser liquidificadas e que adquiram uma
consistência cremosa e sem fibras, sendo as mais populares: banana, maçã, pera,

50
morango, mamão, manga, mirtilo, abacaxi, pêssego, ameixa, laranja (sem casca e
sem semente), açaí, entre outros. Como líquido, usa-se água comum, água de
coco, sucos ou chás.
Di Cagno et al. (2011) criaram um protocolo para processamento e
armazenamento de Red e Green Smoothies (RS e GS), que incluiu fermentação
por bactérias starter ácido lácticas selecionadas e cepas produtoras de exo-
polissacarídeos. Compostos polifenólicos e, especialmente, ácido ascórbico foram
melhor preservados nos RS e GS iniciados em comparação com amostras não
iniciadas. Isso refletiu na atividade captadora de radicais livres, sendo que a
correlação estatística foi encontrada apenas entre o nível de ácido ascórbico e a
atividade captadora de radicais livres. A fermentação por bactérias lácticas
melhorou claramente os atributos sensoriais do RS e GS.

2.4 JUSTIFICATIVA
Considerando a necessidade do consumo de frutas e hortaliças para garantir
a ingestão diária recomendada de nutrientes e as dificuldades no consumo de
vegetais, e no preparo e transporte diário de bebidas frescas nutritivas, o setor de
bebidas, especialmente as não alcoólicas, vem ampliando seu mercado e
introduzindo novos sabores e atendendo à demanda crescente por novos produtos
que reflitam uma melhor qualidade de vida.

51
2.5 OBJETIVOS

2.5.1 Objetivo Geral

Desenvolver e caracterizar duas bebidas mistas liofilizadas a base de frutas e

hortaliças (BMFHs), analisar suas propriedades antioxidantes, citotoxicidade e
atividade antiproliferativa, in vitro.

2.5.2 Objetivos Específicos

• Caracterizar as bebidas liofilizadas:

− Determinação de suas composições centesimal, mineral e vitamínica e

comparação entre estes resultados experimentais e os valores preditos através de
cálculos;

− Caracterização físico-química;

− Avaliação das bebidas como ingestão diária de frutas e hortaliças;

− Caracterização dos compostos nutracêuticos através da quantificação de

β-caroteno, teor de fibras solúveis e insolúveis, teor de pectina, identificação e
quantificação de oligossacarídeos;

− Quantificação dos compostos fenólicos através dos métodos Fenóis

Totais e Flavonoides Totais e,

− Identificação dos flavonoides, utilizando-se Espectrometria de Massa de

Alta Resolução (HR-ESI-MS).

• Comparar as BMFHs formuladas neste estudo com bebidas semelhantes,

mix de frutas e hortaliças, encontradas no mercado nacional e internacional.

• Avaliar, nas bebidas e em seus componentes individuais (frutas e

hortaliças), o efeito do processo de liofilização e do tipo de solvente utilizado na
extração, através da composição fenólica (Fenóis Totais) e da capacidade

52
antioxidante in vitro pelos métodos ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity),
TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) e DPPH-Trolox (método baseado
no uso do radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl).

• Avaliar as BMFHs e o efeito da digestão in vitro:

− Identificação dos flavonoides utilizando-se de Espectrometria de Massa

de Alta Resolução (HR-ESI-MS);

− Determinação dos Fenólicos Totais e dos potenciais antioxidantes in vitro

pelos métodos ORAC, TEAC, DPPH-Trolox e CAA (Cellular Antioxidant Activity) e,

− Avaliar por técnicas in vitro a Atividade Antiproliferativa e Citotoxicidade.

53
 CAPÍTULO 3
METODOLOGIA

3.1 PREPARO DAS BMFHS

As frutas maduras e as hortaliças foram obtidas em comércio local na cidade

de Campinas-SP. Os vegetais foram mantidos sob refrigeração até o momento do
preparo, por no máximo 24 horas.
Foram utilizados os seguintes vegetais na formulação das bebidas:

Frutas: Banana Nanica (Musa aaa Cavendish cv Nanica), Laranja Pera

(Citrus sinensis), Limão Tahiti (Citrus latifolia Tanaka), Maçã Fuji (Malus domestica
Borkh), Manga Palmer (Mangifera indica) e Pera Williams (Pyrus communis L.);
Hortaliças: Couve Manteiga (Brassica oleracea var. acephala), Couve-flor
(Brassica oleracea var. botrytis), Hortelã (Mentha s.p.) e Repolho branco (Brassica
oleracea L. var. capitata L.);

O fluxograma esquemático do processamento, elaboração e análise das

amostras está descrita na Figura 17.

3.1.1 Sanitização e Processamento dos Vegetais

Os vegetais foram higienizados e sanitizados (durante 15 minutos em 200

ppm de cloro ativo) antes de serem processados.
Para a análise individual de cada vegetal, os mesmos foram triturados em
processador comum, congelados em freezer (-20°C por 48 horas) e,
posteriormente, liofilizados (liofilizador da marca TERRONI, modelo LS3000).
Análises de capacidade antioxidante in vitro e caracterização dos compostos
fenólicos consistiram em avaliar os vegetais, individualmente e em duas
formulações, BMFHs (1) e (2), nas condições frescas e liofilizadas. Para as
análises de caracterização das bebidas, utilizaram-se as BMFHs liofilizadas.

54
 BMFHs
Homogeneização

Frutas e
Hortaliças
ANÁLISES
- Fenóis Totais
- Capacidade Antioxidante
(DPPH-Trolox, TEAC, ORAC)
Liofilização

ANÁLISES
- Composição Centesimal
- Composição Vitamínica
- Composição Mineral
- Caracterização Físico-Química
- Caract. de Compostos Fenólicos
- Caract. de Carboidratos
- Digestão in vitro
- Identif. de flavonoides (HR-ESI-MS)
- Atividade Antioxidante (DPPH-
Trolox, TEAC, ORAC e CAA)
- Ensaio de Citotoxicidade
Higienização - Atividade Antiproliferativa
e Sanitização
Processamento
Figura 17: Fluxograma esquemático do processamento dos vegetais, elaboração das BMFHs e análises das amostras.

55
 3.1.2 Elaboração das Bebidas Mistas de Frutas e Hortaliças (BMFHs)

Duas formulações foram preparadas homogeneizando-se, em liquidificador

comum, apenas frutas e hortaliças, sem a adição de água ou qualquer aditivo
como conservante, edulcorante, corante, etc.
Utilizaram-se as polpas de manga e banana; os sucos e endocarpo do limão
e da laranja; e as cascas e polpas da maçã e da pera. Os talos da couve manteiga
e do repolho e as folhas da couve-flor foram retirados, e apenas a parte
remanescente foi utilizada nos passos seguintes.
As formulações das bebidas selecionadas encontram-se na Tabela 8. Após o
preparo das formulações, as bebidas foram congeladas e liofilizadas e seguiram
para as análises posteriores. As BMFHs liofilizadas foram armazenadas em
freezer comum (-20°C), devidamente vedadas para que não ho uvesse absorção
de água, até que pudessem ser analisadas, e as BMFHs frescas foram
imediatamente analisadas.

Tabela 8: Formulação das bebidas.

COMPONENTE BMFH (1) BMFH (2)

FRUTAS

Banana Nanica 18,52% 9,95%

Laranja Pera 27,78% 14,22%
Limão Tahiti 1,85% -
Maçã Fuji - 16,11%
Manga Palmer 41,67% 21,33%
Pera Williams - 23,70%

HORTALIÇAS

Couve-flor - 4,74%
Couve Manteiga 9,26% 4,74%
Hortelã 0,92% 0,47%
Repolho Branco - 4,74%

56
3.2 CARACTERIZAÇÃO DAS BMFHS

Com o objetivo de caracterizar as bebidas funcionais formuladas, foram

determinadas as composições centesimal, vitamínica e mineral e realizou-se a
caracterização físico-química e dos compostos nutracêuticos.
Todas as análises foram realizadas em triplicata e os resultados foram
calculados em base úmida, exceto para umidade e voláteis, para facilitar a
comparação com os dados da literatura.

3.2.1 Composição Centesimal

3.2.1.1 Umidade e Voláteis

O método baseou-se na determinação indireta da água presente no alimento

por gravimetria, através de metodologia descrita por Horwitz (2005).
A água da amostra foi eliminada por aquecimento em estufa, até obtenção de
peso constante, e a massa do resíduo seco foi determinada através de pesagem,
após resfriamento da amostra em dessecador. A umidade foi calculada pela
diferença da massa do alimento antes e após a secagem.

3.2.1.2 Cinzas

O método consistiu na incineração da amostra em mufla a 550˚C,

promovendo a evaporação da água e de substâncias voláteis e a oxidação da
matéria orgânica, de acordo com metodologia descrita por Horwitz (2005). O
resíduo da incineração é denominado cinzas ou resíduo mineral fixo e sua
quantificação é feita por gravimetria, após do resfriamento do cadinho em
dessecador.

57
3.2.1.3 Lipídios Totais

A quantificação de lipídios totais foi determinada através de metodologia

descrita por Zenebon & Pascuet (2005).
Determinação do teor de substâncias solúveis em éter de petróleo, após
destruição de proteínas, carboidratos e outros componentes, com ácido clorídrico
em ebulição. A extração foi feita em aparelho extrator de Soxhlet e a quantificação
por gravimetria.

(Eq. 1)

Onde:
N = nº de gramas de lipídios
P = nº de gramas da amostra

3.2.1.4 Proteína

A determinação de proteína foi realizada de acordo com Horwitz (2005), com

fatores proteicos (Nx5,75). Este método também é conhecido como método de
Kjeldahl e fundamenta-se na digestão ácida da amostra em presença de
catalisadores, formação de amônia, destilação deste meio básico e titulação com
solução-padrão de ácido.
Em um balão de Kjeldahl, adicionaram-se 10 g de amostra, 18 g de sulfato
de potássio, 1 g de sulfato de cobre pentaidratado e 25 mL de ácido sulfúrico
concentrado. Digeriu-se a matéria orgânica, sob aquecimento, até sua completa
destruição. Retirou-se o balão do aquecimento e este foi deixado em temperatura
ambiente para seu resfriamento. Adicionou-se 150 mL de água e 90 mL de solução
de hidróxido de sódio (50% p/v), conectando imediatamente o balão ao
condensador, destilando-o com aquecimento máximo. Recolheu-se cerca de 100
ml do destilado em erlenmeyer contendo 30 mL de solução de ácido bórico com
indicadores (20% de ácido bórico, 6% de solução alcoólica de vermelho de metila

58
a 0,1%, 15% de solução alcoólica de verde de bromocresol a 0,1%, 59% de água).
Retirou-se o erlenmeyer e titulou-se com solução de ácido clorídrico (0,1N) até
mudança da coloração verde para rosada.
Utilizaram-se as equações 2 e 3 para o cálculo do teor de proteínas e o
resultado foi expresso em g de proteína/100 g de amostra úmida.

(Eq. 2)

(Eq. 3)

Onde:
N = normalidade.

3.2.1.5 Carboidratos

A quantificação de carboidratos totais foi calculada por diferença (Eq. 4):

(Eq.4)

Onde:
U = Umidade
C = Cinzas
P = Proteína
LT = Lipídios Totais

59
3.2.1.6 Calorias

O valor calórico foi calculado de acordo com Kalil (1975), Passmore et al.
(1975) e USDA (1963), pela equação 5.

(Eq. 5)

Onde:
P = Proteínas
C = Carboidratos
LT = Lipídios Totais

3.2.1.7 Teor de Fibra Alimentar Total

A determinação do teor de fibras totais foi realizada de acordo com

metodologia descrita por Horwitz (2006) no Instituto de Tecnologia de Alimentos
(ITAL) em Campinas-SP.

3.2.2 Composição Vitamínica

Para a composição vitamínica, foram analisadas as vitaminas A, B1

(Tiamina), B2 (Riboflavina), B6 (Piridoxina) e C (Ácido Ascórbico), de acordo com
as metodologias descritas a seguir. As determinações da composição vitamínica
foram realizadas no Instituto de Tecnologia de Alimentos (ITAL) em Campinas-SP.

3.2.2.1 Vitamina A

O analito analisado foi o β-caroteno, conforme descrito, posteriormente, no

item 3.2.7.1 da metodologia. O resultado de vitamina A foi obtido através do fator
de conversão: 1UI de vitamina A corresponde a 1,8 µg de β-caroteno, logo, dividiu-
se o valor de β-caroteno obtido pelo fator 1,8.

60
3.2.2.2 Vitaminas B1 (Tiamina), B2 (Riboflavina) e B6 (Piridoxina)

As análises das vitaminas B1 e B2 foram realizadas de acordo com

metodologias descritas por Horwitz (2010) e Van de Weerdhof et al. (1973), e para
a vitamina B6, utilizaram-se os métodos descritos por Horwitz (2005) e Gregory &
Kirk (1978).
Realizou-se uma extração com hidrólise ácida em autoclave, seguida de
hidrólise enzimática. A quantificação e detecção das vitaminas foram realizadas
utilizando-se HPLC.
As condições cromatográficas estão descritas na Tabela 9.

Tabela 9: Condições cromatográficas utilizadas para quantificação das Vitaminas B1, B2 e B6.

HPLC CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS

Vitamina B1 Vitamina B2 Vitamina B6

Coluna C18 (125x4 mm, 5 µm) C18 (125x4 mm, 5 µm) C18 (125x4 mm, 5 µm)
Fase Móvel KCl 37,3 M, metanol 15% KCl 37,3 M, metanol KH2PO4 0,033 M
e água bidestilada 85% 30% e água bidestilada pH 2,2
70%.
Fluxo da Fase Móvel 0,5 mL/min 0,7 mL/min 0,7 mL/min
Detector Fluorescencia Fluorescência Fluorescência
Comprimento de onda
Excitação 362 nm 432 nm 295 nm
Emissão 464 nm 545 nm 405 nm
Reação Pós-coluna NaOH 20% : ferricianeto - -
de potássio 1% : água
(24:3:73)

3.2.2.3 Vitamina C (Ácido Ascórbico)

Extração com água acidificada, quantificação e detecção com uso de HPLC,

de acordo com Arakawa et al. (1981). As condições cromatográficas estão
descritas na Tabela 10.

61
 Tabela 10: Condições cromatográficas utilizadas para determinação de Vitamina C.

HPLC CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS

Coluna NH2 (150x4,6 mm, 5 µm)

Fase Móvel KH2PO4 (50 mM, pH 5,5): Acetonitrila (25:75, v/v)
Fluxo da Fase Móvel 1,0 mL/min
Detector Arranjo de Diodos
Comprimento de onda 260 nm

3.2.3 Composição Mineral

As determinações da composição mineral foram realizadas no Instituto de

Tecnologia de Alimentos (ITAL) em Campinas-SP e os resultados foram calculados
em base úmida para facilitar a comparação com os dados da literatura.
Para a quantificação dos elementos Cálcio, Cobre, Ferro, Fósforo, Magnésio,
Manganês, Potássio, Sódio e Zinco, utilizou-se espectrômetros de emissão
atômica com plasma de argônio com acoplamento indutivo (ICP OES), de acordo
com Horwitz (2005).
Para os elementos Cálcio, Cobre, Ferro, Fósforo, Magnésio, Sódio e Zinco
empregaram-se as condições experimentais de operação do equipamento
encontram-se descritas na Tabela 11, e as análises de Manganês e Potássio
foram realizadas como descrito na Tabela 12.

62
Tabela 11: Condições experimentais utilizadas no equipamento ICP OES para a determinação de
Cálcio, Cobre, Ferro, Fósforo, Magnésio, Sódio e Zinco em amostras de bebidas liofilizadas.

ICP OES CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS

Potência de RF (W) 900

-1
Vazão de argônio auxiliar (L min ) 15,0
-1
Vazão de argônio principal (L min ) 1,5
-1
Vazão da amostras (mL min ) 2,55
Pressão do nebulizador 3 bar
Tempo de integração(s) e de leitura(s) 3
Número de replicatas 3
Configuração da tocha Radial
Comprimento de onda (nm) Ca: 317,93 Cu: 324,75
Fe: 259,94 P: 178,28
Mg: 279,08 Na: 589,59
Zn: 213,86

Tabela 12: Condições experimentais utilizadas no equipamento ICP OES para determinação de
Manganês e Potássio em amostras de bebidas liofilizadas.

ICP OES CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS

Potência de RF (W) 1000

Pressão do nebulizador (kPa) 200
-1
Vazão de argônio auxiliar (L min ) 1,5
-1
Vazão de argônio principal (L min ) 15
Correção de fundo 2 pontos
Tempo de integração (s) e de leitura (s) 10
Número de replicatas 3
Configuração da tocha Axial
Comprimento de onda (nm) Mn 257,610 K 766,491

63
 3.2.4 Informações Nutricionais: Resultados Esperados versus
Resultados Obtidos

Após obter as informações nutricionais das BMFHs obtidas

laboratorialmente, foram realizados cálculos das composições esperadas, com o
objetivo de presumir os resultados das informações nutricionais das amostras de
BMFHs (1) e (2). Os resultados esperados, presumidos através dos cálculos, e
avaliados em relação aos resultados obtidos experimentalmente foram
comparados através de gráficos.

3.2.5 BMFHs como Ingestão Diária de Frutas e Hortaliças

Sugere-se a escolha de uma BMFH como parte do consumo recomendado

de 5 porções de frutas e hortaliças ao dia, tendo em vista o baixo consumo diário
de frutas e hortalilças. Para avaliar quantas porções de frutas e hortaliças seriam
supridas pelas formulações de BMFHs, foram plotadas em gráficos as
Composições Centesimal, Vitamínica e Mineral dos resultados obtidos para as
BMFHs (respectivamente, itens 3.2.1, 3.2.2 e 3.2.3 da metodologia) e os valores
obtidos por algumas porções de frutas e hortaliças na Tabela Brasileira de
Composição de Alimentos (TACO, 2011).
As porções de vegetais utilizadas para fazer esta comparação foram
sugeridas pela facilidade de encontrar esses alimentos durante todo o ano, por
serem comuns no dia-a-dia dos consumidores brasileiros e por fazerem parte das
formulações das BMFHs.
As porções foram consideradas como a seguir:

- 1 porção: banana;
- 2 porções: 1 porção de banana e 1 porção de repolho;
- 3 porções: 1 porção de maçã, 1 porção de pera e 1 porção de couve;
- 4 porções: 1 porção de maçã, 1 porção de pera, 1 porção de couve e uma
porção de repolho;

64
 - BMFH (1): 300 mL da bebida reconstituída e,
- BMFH (2): 300 mL da bebida reconstituída.

3.2.6 Comparação entre as BMFHs e Similares Comerciais

Não foram encontradas, no mercado de bebidas, bebidas liofilizadas

compostas por frutas e hortaliças ou que pudessem se equiparar as composições
ou aos processos utilizados na produção das BMFHs (1) e (2) deste trabalho. Por
este motivo, as BMFHs foram comparadas a algumas das bebidas similares,
também compostas por um mix de frutas e hortaliças, disponíveis nos mercados
nacional e internacional de sucos.
Os dados de composição e informações nutricionais dos similares comerciais
foram obtidos através dos sites ou SAC (Serviço de Atendimento ao Consumidor)
dos fabricantes destes produtos.
Foram selecionadas 17 bebidas, de tipos diversos, desde frescas ou
industrializadas, disponíveis no comércio ou entregues diariamente, em diferentes
tipos de embalagem, na forma líquida ou em pó, prontos para o consumo ou não,
encontrados no mercado nacional ou internacional. O nome, a marca, a
composição, a imagem e outras informações a respeito dos produtos utilizados
nesta comparação serão descritos a seguir.

- Smoothie Detox 100% (marca Queensberry):

Suco industrializado, na forma líquida, acondicionado em garrafa de vidro,

pronto para o consumo, encontrado no Brasil e vendido em diversos tipos de
comércio (Figura 18, item i). Ingredientes: kiwi, abacaxi, suco concentrado (maçã,
limão), extrato de chá verde, hortelã, clorofila, estabilizante pectina de fruta
(QUEENSBERRY, 2014).

65
 - Suco Verde Detox Monstro (marca Do Bem):

Suco industrializado, na forma líquida, acondicionado em embalagem Tetra

Pak, pronto para o consumo, encontrado apenas no Brasil e vendido em diversos
tipos de comércio (Figura 18, item ii). Ingredientes: suco de maçã integral, suco
de pepino integral, suco de couve integral, suco de limão integral, polpa de
gengibre e hortelã (DO BEM, 2014).

- V+ Aruba (marca Greenday):

Suco industrializado, na forma líquida, acondicionado em embalagem Tetra

Pak, pronto para o consumo, encontrado no Brasil e vendido em diversos tipos de
comércio (Figura 18, item iii). Ingredientes: suco integral de maçã, suco integral
de laranja, polpa de manga, polpa de cenoura, polpa de pepino, polpa de abacaxi,
aroma natural de aloe vera, aroma natural de abacaxi, aroma natural de hortelã e
antioxidante: ácido ascórbico (GREENDAY, 2014).

- V+ Bahamas (marca Greenday):

Suco industrializado, na forma líquida, acondicionado em embalagem Tetra

Pak, pronto para o consumo, encontrado no Brasil e vendido em diversos tipos de
comércio (Figura 18, item iv). Ingredientes: suco integral de maçã, suco integral
de laranja, polpa de tomate, polpa de cenoura, polpa de beterraba, melancia
desidratada, extrato de couve, extrato de agrião, extrato de espinafre, aroma
natural de laranja, aroma natural de melancia e antioxidante: ácido ascórbico
(GREENDAY, 2014).

- Detox Green (marca Sanavita):

Suco industrializado em pó, enlatado, deve ser dissolvido antes do consumo,

encontrado no Brasil e vendido em diversos tipos de comércio (Figura 18, item v).
Ingredientes: maltodextrina, polpa de laranja em pó, espinafre desidratado em pó,

66
couve liofilizada em pó, polidextrose, polpa de blueberry em pó, maçã desidratada
em pó, salsa desidratada em pó, gengibre desidratado em pó, antiumectante
dióxido de silício, acidulante ácido cítrico, espessante goma guar, edulcorante
sucralose, aromatizante idêntico ao natural de laranja e corante natural de clorofila
(SANAVITA, 2014).

- Suco Verde (marca Do Vivo):

Suco fresco coado em voil, na forma líquida, acondicionado em embalagem

plástica, pronto para o consumo, encontrado apenas no Brasil e entregue através
de entregas diárias, de acordo com o pacote comprado (Figura 18, item vi).
Ingredientes: maçã, chuchu ou pepino, algum grão germinado, uma raiz (inhame,
batata-doce, batata yacon, abóbora ou cenoura), folhas de couve, acelga, alface,
hortelã, erva-doce, erva-cidreira, gengibre e grama de trigo (DO VIVO, 2014).

- Super Verde (marca Uuulalá):

Suco fresco, na forma líquida, acondicionado em embalagem plástica, pronto

para o consumo, encontrado apenas no Brasil e entregue através entregas diárias,
de acordo com o pacote comprado (Figura 18, item vii). Ingredientes: pepino,
maçã verde, salsão, couve, espinafre, limão, salsa e gengibre (UUULALÁ, 2014).

- Suco Verde (marca Bisou):

Suco fresco, na forma líquida, acondicionado em embalagem de vidro, pronto

para o consumo, encontrado apenas no Brasil e entregue através de entregas
diárias, de acordo com o pacote comprado (Figura 18, item viii). Ingredientes:
maçã, pepino, couve-manteiga, limão, espinafre, salsinha e gengibre (BISOU,
2014).

67
 - Kiwis, Apples and Limes (marca Innocent Drinks):

Suco industrializado, na forma líquida, acondicionado em embalagem

plástica, pronto para o consumo, encontrado no exterior e vendido em diversos
tipos de comércio (Figura 18, item ix). Ingredientes: 2 e ½ maçãs prensadas, 16
uvas brancas prensadas, 1 kiwi esmagado, uma pitada de espinafre, extrato de
urtiga, limão fresco, suco de ¼ de um abacaxi prensado (INNOCENT DRINKS,
2014).

- Antioxidant (marca Innocent Drinks):

Suco industrializado, na forma líquida, acondicionado em embalagem

plástica, pronto para o consumo, encontrado no exterior e vendido em diversos
tipos de comércio (Figura 18, item x). Ingredientes: 1 e 1/2 maçãs prensadas,
purê de 1/2 banana, 1/2 kiwi esmagado (12%), 7 uvas brancas, 1/4 de manga
esmagada, pepino espremido, semente de linhaça moída (0,6%), suco de lima
(0,2%), espinafre e extrato de urtiga, grama de trigo moída (0,02%) e algumas
vitaminas e minerais (vitamina E, C e selênio) (INNOCENT DRINKS, 2014).

- Greenpower (marca Emma & Tom’s):

Suco industrializado, na forma líquida, acondicionado em embalagem

plástica, pronto para o consumo, encontrado no exterior e vendido em diversos
tipos de comércio (Figura 18, item xi). Ingredientes: suco de maçã, purê de
banana, polpa de maracujá, purê de ameixa, suco de limão, spirulina, clorela,
alfafa, kelp, espinafre, alga dulse (EMMA E TOM'S, 2014).

- Orange Mango (marca Green Mustache):

Suco industrializado, na forma líquida, acondicionado em embalagem

plástica, pronto para o consumo, encontrado no exterior e vendido em diversos
tipos de comércio (Figura 18, item xii). Ingredientes: suco de laranja orgânico,

68
purê de manga orgânica, mix de folhas verdes orgânicas (purê de espinafre
orgânico, purê de couve orgânica), água de coco orgânica a partir de concentrado
(água filtrada, água de coco orgânico concentrada), suco de limão orgânico, base
de Salba® orgânica (semente de chia) (GREEN MUSTACHE, 2014).

- Tropical Twist (marca Green Mustache):

Suco industrializado, na forma líquida, acondicionado em embalagem

plástica, pronto para o consumo, encontrado no exterior e vendido em diversos
tipos de comércio (Figura 18, item xiii). Ingredientes: purê de manga orgânica, mix
de folhas verdes orgânicas (purê de espinafre orgânico, purê de couve orgânica),
suco de laranja orgânica, purê de goiaba orgânica, água de coco orgânica a partir
de concentrado (água filtrada, água de coco orgânico concentrada), suco de
abacaxi orgânico, purê de banana orgânica, purê de maracujá orgânico, base de
Salba® orgânica (semente de chia) (GREEN MUSTACHE, 2014).

- Essential Greens with Lime (marca Evolution Fresh):

Suco industrializado prensado a frio, na forma líquida, acondicionado em

embalagem plástica, pronto para o consumo, encontrado no exterior e vendido em
diversos tipos de comércio (Figura 18, item xiv). Ingredientes: sucos (aipo, pepino,
espinafre, alface, couve, lima, salsa, grama de trigo, broto de trevo) (EVOLUTION
FRESH, 2014).

- Sweet Greens and Ginger (marca Evolution Fresh):

Suco industrializado prensado a frio, na forma líquida, acondicionado em

embalagem plástica, pronto para o consumo, encontrado no exterior e vendido em
diversos tipos de comércio (Figura 18, item xv). Ingredientes: sucos orgânicos
(aipo, maçã, pepino, espinafre, salsa, couve, alface, gengibre, lima, limão, grama
de trigo, broto de trevo) (EVOLUTION FRESH, 2014).

69
 - Super Green (marca Evolution Fresh):

Suco industrializado prensado a frio, na forma líquida, acondicionado em

embalagem plástica, pronto para o consumo, encontrado no exterior e vendido em
diversos tipos de comércio (Figura 18, item xvi). Ingredientes: suco de laranja,
purê de manga, suco de maçã, suco de abacaxi, purê de framboesa, spirulina,
clorela, grama de trigo, grama de cevada, dulse (EVOLUTION FRESH, 2014).

- Sweet Greens and Lemon (marca Evolution Fresh):

Suco industrializado prensado a frio, na forma líquida, acondicionado em

embalagem plástica, pronto para o consumo, encontrado no exterior e vendido em
diversos tipos de comércio (Figura 18, item xvii). Ingredientes: sucos (aipo, maçã,
pepino, espinafre, alface, couve, lima, limão, salsa, grama do trigo, broto de trevo)
(EVOLUTION FRESH, 2014).

As informações nutricionais, vitamínicas e minerais destas bebidas foram

plotadas em gráficos para obter uma melhor visualização e comparação dos
dados.

70
 (i) (ii) (iii) (iv)

(v) (vi) (vii) (viii)

(ix) (x) (xi) (xii)

(xiii) (xiv) (xv) (xvi) (xvii)

Figura 18: Algumas das bebidas mistas de frutas e hortaliças comerciais encontradas no mercado brasileiro e
estrangeiro, e utilizadas na comparação com as BMFHs formulados neste estudo são os seguintes: (i)
Smoothie Detox da Queensberry; (ii) Detox Monstro da Do Bem; (iii) V+ Aruba da Greenday; (iv) V+ Bahamas
da Greenday; (v) Detox Green da Sanavita; (vi) Suco Verde da Do Vivo; (vii) Super Verde da Uuulalá; (viii)
Suco Verde da Bisou; (ix) Kiwis, Apples and Limes da Innocent; (x) Antioxidant da Innocent; (xi) Life Juice
Greenpower da Emma & Tom’s; (xii) Orange Mango da Green Mustache; (xiii) Tropical Twist da Green
Mustache; (xiv) Essential Greens with Lime da Evolution Fresh; (xv) Sweet Greens and Ginger da Evolution
Fresh; (xvi) Super Green da Evolution Fresh; (xvi) Sweet Greens and Lemon da Evolution Fresh.

71
 3.2.7 Caracterização Físico-Química

Para a Caracterização Físico-Química das BMFHs, realizaram-se as

determinações de pH, ºbrix, acidez, ratio (relação ºbrix/acidez), clorofila,
identificação e quantificação de mono- e dissacarídeos e determinação
instrumental da cor.
Os resultados foram calculados em base úmida para facilitar a comparação
com os dados da literatura.

3.2.7.1 Determinação do pH

Leituras diretas em pHmetro (modelo Micronal B374) calibrado com

soluções-tampão nos pHs 4 e 7 a 20°C, de acordo com Zenebon & Pascuet
(2005).
Pesaram-se 10 g da amostra em um béquer e diluiu-se com auxílio de 100
mL de água destilada.
Determinou-se o pH, com o aparelho previamente calibrado, operando-o de
acordo com as instruções do manual do fabricante.

3.2.7.2 Determinação do ºBrix

Determinação baseada na leitura direta dos graus Brix das amostras

reconstituídas a 20°C, em refratômetro digital da m arca LEICA, modelo AR200.

3.2.7.3 Determinação de acidez

Realizou-se a determinação da acidez das bebidas segundo método descrito

por Zenebon & Pascuet (2005). A acidez foi expressa em percentagem de ácido
cítrico, sendo este o ácido predominante.
Pesou-se de 1 g de amostra, transferiu-se para um frasco Erlenmeyer e
adicionaram-se 50 mL de água. Titulou-se com solução de hidróxido de sódio (0,1
M), determinando-se o ponto de viragem (pH 9) com o auxílio de pHmetro.

72
 A equação 6 foi utilizada para calcular a % acidez da amostra.

(Eq. 6)

Onde:
V = volume (mL) da solução de hidróxido de sódio 0,1 M gasto na titulação
f = fator da solução de hidróxido de sódio (0,1 M)
P = peso (g) da amostra usado na titulação
c = correção para solução de NaOH 1 M (10 para solução NaOH 0,1 M)

3.2.7.4 Ratio (Relação ºbrix/acidez)

Cálculo do ratio segundo Reed et al. (1986), onde foi utilizada uma razão
ºbrix/acidez.

3.2.7.5 Identificação e Quantificação dos Mono- e Dissacarídeos

A identificação e quantificação dos oligossacarídeos, resultantes do

tratamento da hidrólise, foram realizadas através de cromatografia de íons
acoplada ao detector amperiométrico pulsado (HPAEC-PAD), em cromatógrafo
Dionex ICS-5000, de acordo com metodologia modificada de L’homme et al.
(2001).
Utilizou-se a coluna Carbopac PA-1 a 22 - 24 ºC, bomba Single Grad Degas
e o software de Automação Cromatográfica Chromeleon 7.0 CHM-1, da Dionex
(USA). Os açúcares foram eluídos com 100 mM (5%) de hidróxido de sódio com
gradiente de acetato de sódio 500 mM (5% de 0 a 8,75 min, 100% de 8,75 a 13,75
min e depois 5% até o final da corrida). Utilizou-se um fluxo de 1 mL/min, fator de
diluição para a amostra de 500 vezes e com volume de injeção de 15 µL.
Para esta determinação foram utilizados padrões de glicose, frutose e
sacarose.

73
3.2.7.6 Extração e Quantificação de Clorofila

A extração e a quantificação de clorofila foram realizadas de acordo com

metodologia descrita por Lichtenthaler (1987).
Pesou-se 1g das bebidas liofilizados, maceraram-se em almofariz após
adição de 5 mL de acetona/água (8:2). O material foi filtrado a vácuo e transferido
para um balão volumétrico de 25 mL, sendo o volume completado com
acetona/água (8:2).
A absorbância da solução foi lida em espectrofotômetro a 647 e 663 nm.
Os teores de clorofilas totais, a e b foram calculados de acordos com as
Equações 7, 8 e 9 propostas por Lichtenthaler (1987):

(Eq. 7)

(Eq. 8)

(Eq. 9)

Onde:
Abs663 = absorbâncias a 663 nm
Abs647 = absorbância a 647 nm

As concentrações de clorofila obtidas através da absorbância foram

calculadas em mg de clorofila/100 g amostra úmida.

3.2.7.7 Determinação Instrumental da Cor

Realizaram-se as leituras de cor das BMFHs liofilizadas através de leitura

direta em espectrofotômetro (Colorquest Hunterlab), usando um sistema de leitura
CIELAB, para refletância especular incluída. As amostras foram colocadas em
cubeta de quartzo opticamente limpa com 10 mm de caminho óptico.

74
 Em 1976, a CIE recomendou o uso da escala de cor CIE L*a*b*, ou CIELAB
(Figura 19). O máximo valor de L* (luminosidade) é 100, enquanto o valor mínimo
é zero e constitui o preto. Os eixos a* e b* não apresentam limites numéricos
específicos. A coordenada a* varia do vermelho (+a*) ao verde (-a*), e a
coordenada b* do amarelo (+b*) ao azul (-b*) (HUNTERLAB, 1996).

Figura 19: Representação da cor sólida para cor no espaço L*a*b* (Minolta, 1994).

3.2.8 Caracterização dos Compostos Nutracêuticos

A composição de nutracêuticos foi determinada através da quantificação de

β-caroteno, flavonoides totais, teor de fibras solúveis e insolúveis e de pectina,
além da identificação e quantificação de compostos fenólicos e oligossacarídeos,
conforme descritos a seguir.

75
3.2.8.1 Extração e Quantificação de β-caroteno

A extração e quantificação de β-caroteno foram realizadas de acordo com

metodologia descrita por Carvalho et al. (1992), realizadas no Instituto de
Tecnologia de Alimentos (ITAL) em Campinas-SP.
Realizou-se a extração dos pigmentos com acetona, a saponificação com
uso de hidróxido de potássio, partição em éter de petróleo, quantificação e
detecção com uso de HPLC.
As condições cromatográficas estão descritas na Tabela 13.

Tabela 13: Condições cromatográficas utilizadas para determinação de beta-caroteno.

HPLC CONDIÇÕES EXPERIMENTAIS

Coluna C18 (125x4 mm, 5 µm)

Fase Móvel metanol : clorofórmio (95:05)
Fluxo da Fase Móvel 1,0 mL/min
Detector Arranjo de Diodos
Comprimento de onda 450 nm

3.2.8.2 Flavonoides Totais

O conteúdo total de flavonoides foi determinado pelo método colorimétrico

descrito por He et al. (2008), com algumas adaptações.
A extração de flavonoides foi realizada com a adição de acetona gelada
(80%) a amostra na proporção de 1:3 (amostra:acetona), homogeneização em
ultrassom (UltraSonic-Cleaner Thornton) por 10 minutos e posterior centrifugação
(centrífuga ROTANTA 460R) durante 10 minutos a 5 ºC e 10.000 rpm. Evaporou-
se o sobrenadante em rota-evaporador a vácuo (Rotavapor RII Buchi), a 45ºC.
Reconstituiu-se o extrato com adição de Tetrahidrofurano (THF):etanol (1:1).
A reação constituiu da adição de 0,5mL de boroidrato de sódio:etanol (50
mM) e 0,5mL de cloreto de alumínio:etanol (74,56 mM) em 1mL de extrato

76
reconstituído. Agitou-se em shaker por 30 minutos a 120 rpm em temperatura
ambiente. Adicionaram-se mais 0,5 mL de boroidrato de sódio:etanol (50 mM),
seguido de agitação e shaker nas mesmas condições anteriores. Adicionaram-se 2
mL de ácido acético gelado (0,8 M), homogeneizou-se a mistura e deixou-se na
ausência de luz durante 15 min. Adicionou-se 1 mL de cloranil:THF (20 mM) e
agitou-se em shaker por 1 h a 100 ºC. A mistura foi resfriada e o volume final
ajustado para 4 mL com metanol. 1 mL de vanilina:metanol (1052 mM) foi
adicionado, homogeneizou-se e adicionaram-se 2 mL de ácido clorídrico (37%). A
mistura foi agitada e deixada na ausência de luz durante 15 min.
A leitura foi realizada em espectrofotômetro (Beckman DU 640) a 490 nm e a
quantificação foi baseada no estabelecimento de uma curva padrão de catequina
(0,1 a 8 mM). Os resultados foram expressos em mg Catequina Equiv./100 g
amostra úmida.

3.2.8.3 Teor de Fibras Solúveis e Insolúveis

Os teores de fibras Solúveis e Insolúveis foram realizados de acordo com

metodologia descrita por Prosky et al. (1992), realizados no Instituto de Tecnologia
de Alimentos (ITAL) em Campinas-SP.
Os métodos utilizados nas determinações de fibra alimentar total, fibras
solúvel e insolúvel quantificam parcialmente compostos tais como maltodextrina,
amido resistente, amido modificado, polidextrose, inulina e polissacarídeos.

3.2.8.4 Determinação de Pectina

A pectina foi quantificada segundo metodologia descrita por Pearson (1976),

realizada no Instituto de Tecnologia de Alimentos (ITAL) em Campinas-SP. O
resultado final expresso em mg de pectato de cálcio/100 g amostra úmida.

77
3.2.8.5 Identificação e Quantificação dos Oligossacarídeos

A identificação e quantificação dos oligossacarídeos, resultantes do

tratamento da hidrólise, foram realizadas através de cromatografia líquida de íons
acoplada ao detector amperiométrico pulsado (HPAEC-PAD), em cromatógrafo
Dionex ICS-5000, de acordo com metodologia modificada de L’homme et al.
(2001).
Utilizou-se a coluna Carbopac PA-100 a 22 - 24ºC, bomba Single Grad
Degas e o software de Automação Cromatográfica Chromeleon 7.0 CHM-1, da
Dionex (USA). Os açúcares foram eluídos com 100 mM (5,2%) de hidróxido de
sódio com gradiente linear de acetato de sódio 500 mM (0 a 33%), a um fluxo de 1
mL/min, utilizando um fator de diluição para a amostra de 100 vezes, com volume
de injeção de 25µL.
Foram utilizados padrões de fruto oligossacarídeos,1-kestose (GF2), 1-
nistose (GF3) e 1-frutofuranosil nistose (GF4), e de malto oligossacarídeos:
maltose (G2), maltotriose (G3), maltotetrose (G4), maltopentaose (G5),
maltohexose (G6) e maltoheptaose (G7).

3.2.8.6 Identificação dos Compostos Fenólicos

A identificação de flavonoides das formulações obtidas, BMFHs (1) e (2), e

destas bebidas após a digestão in vitro (item 3.3.1 da metodologia), foi realizada
através de análise por Espectrometria de Massa de Alta Resolução (HR-ESI-MS).
Diluíram-se 5 mg das bebidas liofilizadas, BMFHs (1) e (2), em solução de
MeOH:H2O (50:50) até um volume final de 1 mL. Para as bebidas digeridas, 10 µL
do volume das amostras foram diluídas em 990 µL de MeOH:H2O (50:50). As
soluções obtidas foram então filtradas separadamente através de um microfiltro de
nylon com tamanhos de poros de 0,22 µm. Os filtrados foram divididos em duas
porções (~500 µL cada) e 0,1% de ácido fórmico foi adicionada para ionização
positiva e 0,1% de hidróxido de amônio foi adicionado para ionização negativa.
Dados de espectrometria de massa foram adquiridos por ESI-LTQ-XL

78
Orbitrap Discovery (Thermo Scientific, Bremen, Alemanha). As condições de
operação foram: gás de bainha (nitrogênio) fixado em 10 unidades arbitrárias,
temperatura capilar de 285°C, voltagem de pulveriza ção de 4,5 kV e uma taxa de
fluxo de 10 µL/min. Os espectros foram registrados na faixa de m/z de 50-500,
tanto no sentido positivo (para antocianidinas e flavanóis) e modos de íons
negativos (para flavanonas, flavonas e flavonóis).
Os compostos foram identificados através dos espectros de massas de alta
resolução como parâmetro principal. Comparação entre massas teóricas e
experimentais foi realizada, com o erro da massa expressas em ppm. Somente os
resultados com desvio de menos de 5 ppm foram considerados correspondentes a
estrutura proposta .

3.3 ENSAIOS IN VITRO

Realizou-se a digestão in vitro das BMFHs e para caracterizar o conteúdo

fenólico e a capacidade antioxidante das amostras frescas e liofilizadas de
bebidas (digeridas ou não) e dos vegetais utilizados nas formulações, realizaram-
se determinações de Fenóis Totais e das atividades antioxidantes in vitro, através
das análises de DPPH-Trolox, TEAC e ORAC.
Realizaram-se também os ensaios de Citotoxicidade, Atividade
Antiproliferativa e Atividade Antioxidante Celular (CAA), com o intuito de avaliar as
BMFHs (digeridas ou não) em relação aos seus efeitos em células humanas,
como uma forma de aproximação das condições fisiológicas reais e de obter
informações mais completas.

3.3.1 Digestão in vitro

A digestão das BMFHs foi realizada de acordo com Faller et al. (2012). Para
a simulação de digestão gástrica, amostras liofilizadas das bebidas foram
adicionadas a solução salina (NaCl 140 mM, KCl 5 mM, e BHT 150 µM) na razão
de 1:4 p/p (amostra/salina) a fim de obter volume final de 18 mL. As misturas

79
foram colocadas em shaker com agitação, em temperatura ambiente, por 10
minutos. Posteriormente, as misturas foram acidificadas a pH 2,0 com HCl
(utilizando soluções de 0,1M e 1M). Adicionaram-se 0,5 mL de solução de pepsina
(0,2 g de em 5 mL de HCl 0,1 M) e as amostras foram incubadas em shaker, com
agitação, a 37°C durante 1 hora. Após a digestão gá strica, o pH das amostras foi
elevado até 6,9 pela adição de NaHCO3 (1 M).
Para simular a digestão intestinal, adicionaram-se 2,5 mL de solução de
pancreatina e bile (0,45 g de extrato biliar e 0,075 g de pancreatina em 37,5 mL de
NaHCO3 0,1 M) às amostras resultantes da digestão gástrica, incubando-se as
misturas em shaker, com agitação, a 37 °C por 2 hor as. Posteriormente,
ajustaram-se os pesos das amostras digeridas para 28 g pela adição de solução
salina, centrifugaram-se a 10000 rpm por 10 minutos para separação de das duas
fases: sobrenadante (fração bioacessível), e o resíduo (fração não bioacessível).
Ambas as frações foram armazenadas a -70 °C até o m omento das análises.

3.3.2 Fenóis Totais

A determinação de Fenóis Totais foi realizada de acordo com o método Folin

Ciocalteau, descrito por Roesler et al. (2007).
O extrato foi preparado em metanol (0,5 mg/mL) e ultrassonificado por duas
horas (UltraSonic-Cleaner Thornton). O extrato foi centrifugado por 10 minutos,
10000 rpm, e o sobrenadante separado e utilizado nas etapas seguintes.
A reação ocorreu pela mistura de 0,5 mL de extrato, 2,5 mL da solução de
Folin Ciocalteau (10%) e 2,0 mL de Carbonato de Sódio (7,5%), nesta ordem.
Agitou-se o tubo e o mesmo ficou incubado por cinco minutos em banho maria a
50 ºC. Após a incubação fez-se a leitura no espectrofotômetro (Beckman DU 640)
a 760 nm, sendo o metanol utilizado como branco da reação.
Fez-se uma curva de ácido gálico utilizando-se diferentes concentrações
deste padrão antioxidante.
O resultado final foi expresso em mg GAE/g amostra úmida.

80
 3.3.3 Preparo das Amostras

Para as amostras de BMFHs utilizou-se água destilada como solvente e para

as amostras de vegetais (frutas e hortaliças utilizadas nas formulações das
BMFHs), tanto in natura quanto liofilizados, realizaram-se extrações aquosas e
etanólicas, com o objetivo de avaliar o efeito do solvente na extração de
compostos com atividade antioxidante.
Os extratos foram preparados nas concentrações requeridas para cada
método e posteriormente ultrassonificados por 30 minutos (UltraSonic-Cleaner
Thornton). Os mesmos foram centrifugados por 10 minutos a 10.000 rpm e 5ºC e o
sobrenadante foi separado e utilizado nas análises seguintes.

3.3.3.1 DPPH-Trolox

A análise de DPPH-Trolox é um método baseado no uso do radical DPPH

(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) e que utiliza o padrão Trolox ((S)-(-)-6-hydroxy-
2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) na determinação da atividade
antioxidante, realizada de acordo com metodologia descrita por Thaipong et al.
(2006).
A reação foi realizada em placas de Elisa, transparentes, com 96 poços,
fundo reto e a leitura realizada em fluorímetro (Novo Star BMG Labtechnologies).
Misturou-se 50 ìL de amostra (1 mg/mL), ou padrão Trolox ((S)-(-)-6-hydroxy-
2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid) (0,83-166,67 ìM em etanol), com
250 ìL de DPPH (radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) (0,004% em metanol). No
poço do DPPH foram adicionados 250 ìL do radical mais 50 ìL de etanol. O
equipamento foi zerado com etanol. Fez-se uma única leitura em
espectrofotômetro (517 nm) após 30 minutos de reação em local protegido de luz
e à temperatura ambiente.
Para o cálculo da atividade antioxidante, primeiramente foi transformada
cada absorbância da amostra em Redução (%), através da equação 10.

81
 (Eq. 10)

Onde:
AbsBranco = Absorbância da reação do radical com o solvente utilizado na
extração
AbsExtrato = Absorbância da reação do radical com o extrato

Com os dados obtidos para o Trolox, construiu-se uma curva padrão

correlacionando a concentração de (ìM) e a redução (%) da concentração de
radicais DPPH.
A partir das reduções encontradas para cada amostra, as quais deveriam
estar entre 20 e 80% de redução, encontrou-se a concentração de Trolox
equivalente a partir da curva padrão. Os resultados foram então expressos em
ìmol Trolox Equiv./g amostra úmida ou ìmol TE/g amostra úmida.

3.3.3.2 TEAC (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity)

A determinação da Capacidade Antioxidante em Equivalente Trolox (TEAC)

foi baseada no método descrito por Le et al. (2007).
O radical cátion ABTS´ (2,2´-azinobis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) foi
preparado de 12 a 16 horas antes do ensaio. A produção do radical deu-se pela
mistura de uma solução aquosa de 7 mM de ABTS´ com 140mM de persulfato de
potássio. Este radical foi diluído com água até que a absorbância atingisse valor
de 0,7000 ± 0,02 a 734 nm.
A leitura foi realizada em espectrofotômetro (Beckman DU 640), a 734 nm,
após 6 minutos de reação entre 50 ìL de amostra (1 mg/mL) e 250ìL de radical
ABTS´. Realizou-se o mesmo ensaio com diferentes concentrações de Trolox (5-
1000 µM) com a finalidade de construir uma curva padrão.
Para o cálculo da atividade antioxidante, primeiramente foi transformada

82
cada absorbância da amostra em redução (%) da concentração de radicais
ABTS´, através da equação 8, descrita anteriormente.
Construíu-se uma curva correlacionando-se a concentração de Trolox (ìM) vs
redução (%) da concentração de ABTS´. O resultado das amostras foi então
expresso em ìmol Trolox Equiv./g amostra úmida ou ìmol TE/g amostra úmida.

3.3.3.3 ORAC

O ensaio ORAC hidrofílico foi realizado segundo procedimento descrito por

Dávalos et al. (2004) com algumas modificações.
A reação ocorreu após adição nos poços de uma placa de 96 poços para
fluorescência dos reagentes na seguinte ordem: 20 ìL de cada uma das 5
concentrações de cada um dos extratos previamente preparados, 120 ìL de
Fluoresceína (0,378 ìg/mL de Tampão Fosfato de Potássio 75 mM pH 7,4 ), 60 ìL
de AAPH (108 mg/mL). Para o branco foram adicionados 20 ìL Tampão Fosfato de
Potássio (75 mM pH 7,4) e para o padrão, 20 ìL de amostra (ou Trolox).
Após a adição de todos reagentes na placa, fez-se à leitura da fluorescência
em Fluorímetro (Novo Star BMG Labtechnologies) a cada 1 minuto, durante 80
minutos. Foram utilizados filtros de emissão de 520 nm e de excitação de 485 nm.
A temperatura no equipamento era de 37 ºC.
Todos os extratos foram preparados em triplicata e lidos em triplicata.
As leituras da fluorescência a cada minuto foram utilizadas no cálculo da
AUC, que é a área abaixo da curva, formada pela construção do gráfico
correlacionando o tempo em função do decaimento da fluorescência. A fórmula
utilizada para o cálculo da AUC foi a seguinte:

(Eq. 11)

83
 Onde:
f1 = leitura da fluorescência no tempo 1 minuto
f2 = leitura da fluorescência no tempo 2 minutos
fn = leitura da fluorescência no tempo 80 minutos

Calculou-se o AUC para todas as amostras, diferentes concentrações do

Trolox e para o Branco. Foi subtraído do AUC do padrão e das amostras, o AUC
do branco.
Fez-se um gráfico do padrão Trolox (0,5 a 100 ìM) correlacionando a AUC em
função da concentração (ìM) do padrão. Pela equação da reta dessa correlação
obteve-se a concentração de Trolox equivalente à AUC obtida para cada amostra.
O resultado final foi expresso em ìmol Trolox Equiv./g amostra úmida ou ìmol
TE/g amostra úmida. Para os demais padrões lidos, o resultado final foi expresso
em ìM Trolox Equiv./ìM padrão ou ìM TE/ìM padrão, pois o mesmo foi preparado
na concentração de 1 ìM (concentração final).

3.3.4 Fenólicos Totais e Capacidade Antioxidante dos BMFHs:

Resultados Esperados versus Resultados Obtidos

A partir dos dados experimentais das análises de Fenóis Totais e Atividade

Antioxidante (DPPH-Trolox, TEAC e ORAC), obtidos para as formas frescas e
liofilizadas de cada vegetal, foram realizados cálculos com o objetivo de presumir
os resultados das mesmas análises nas amostras de BMFHs (1) e (2). Para este
cálculo, utilizaram-se os extratos metanólicos e aquosos e foi considerada a
proporção de cada fruta e hortaliça nas BMFHs.
Os resultados esperados, presumidos através dos cálculos, foram
comparados e avaliados em relação aos resultados experimentais pela análise das
amostras de BMFHs (1) e (2) frescas e liofilizadas.

84
 3.3.5 Efeito da Liofilização no Teor de Compostos Bioativos

Amostras frescas e liofilizadas das bebidas (extratos aquosos) e dos vegetais

(extratos aquosos e etanólicos) foram analisadas em relação ao efeito da
liofilização na capacidade antioxidante e conteúdo fenólico das mesmas.
Utilizaram-se os ensaios de Fenóis Totais, DPPH-Trolox, TEAC e ORAC para a
realização dessa avaliação.

3.3.6 Influência do Solvente na Extração de Compostos Bioativos

A influência do tipo de solvente (água e etanol) utilizado na extração dos

compostos bioativos foi avaliada através da comparação entre os resultados
obtidos para os extratos aquosos e etanólicos das amostras frescas e liofilizadas
dos vegetais, através das determinações da capacidade antioxidante (DPPH-
Trolox, TEAC e ORAC).

3.3.7 Efeito da Digestão in vitro na Biodisponibilidade de Compostos

Bioativos

As amostras das bebidas digeridas foram analisadas em relação ao efeito

digestão in vitro sobre a capacidade antioxidante (métodos DPPH-Trolox, TEAC e
ORAC) e do conteúdo fenólico (método Fenóis Totais) das mesmas. Também
foram avaliadas a Citotoxicidade, Atividade Antiproliferativa e Capacidade
Antioxidante Celular (CAA) (respectivamente itens 3.3.8, 3.3.9 e 3.3.10 da
metodologia).

3.3.8 Atividade Antiproliferativa

Realizaram-se dois ensaios de Atividade Antiproliferativa, sendo o primeiro

em sete linhagens tumorais e 1 não tumoral, todas humanas, utilizando o ensaio
da sulforrodamina B e o segundo em linhagem tumoral humana de hepatócitos
(HepG2).

85
3.3.8.1 Ensaio 1 (Sulforrodamina B)

As BMFH (1) e (2), antes e após digestão, foram avaliadas quanto a sua
atividade antiproliferativa em células tumorais humanas utilizando-se o ensaio da
sulforrodamina B (SBR) para avaliação do crescimento celular (Monks et al.,
1991).
Empregaram-se 7 linhagens de células tumorais e 1 linhagem não tumoral,
todas humanas (Tabela 14). As linhagens tumorais foram doadas gentilmente pelo
Frederick Cancer Research & Development Center, National Cancer Institute (NCI,
EUA), enquanto a linhagem HaCat foi doada pelo Prof. Dr. Ricardo Della Coletta
(FOP/UNICAMP). Todas as linhagens foram mantidas no laboratório de cultura de
células em frascos de 25 cm3, com 5 mL de meio RPMI suplementado com 5% de
soro fetal bovino (SFB) e incubadas a 37°C, em atmo sfera úmida com 5% de CO2.

Tabela 14: Linhagens celulares humanas empregadas na avaliação de atividade antiproliferativa.

DENSIDADE DE
ORIGEM
LINHAGEM ÓRGÃO/DOENÇA INOCULAÇÃO
EMBRIONÁRIA
(104 cel/mL)

U251 SNC; glioma Ectoderme 4,0

MCF-7 Mama; adecarcinoma Ectoderme 6,0
NCI-ADR/RES* Ovário; adenocarinoma Ectoderme 5,0
786-O Rim; adenocarcinoma Mesoderme 5,0
NCI-H460 Pulmão; carcinoma tipo não Endoderme 4,0
pequenas células
OVCAR-3 Ovário; adenocarcinoma Mesoderme 7,0
HT-29 Cólon; adenocarcinoma Endoderme 5,0
HaCaT Pele (queratinócito)/ Ectoderme 5,0
Não tumoral

* esta linhagem apresenta resistência a múltiplos fármacos

Foram inoculados 100µL/compartimento, em placas de 96 compartimentos,

de cada suspensão celular, na densidade de inoculação descrita na Tabela 14, em
meio RPMI/5% SFB, acrescido de penicilina:estreptomicina (1000 U/mL:1000
µg/mL, 1 mL/L RPMI). Após 24 h de incubação, a 37 ºC em atmosfera úmida com
5% de CO2, foram adicionados 100 µL/compartimento da amostra, testada em

86
quatro concentrações distintas (0,25; 2,5; 25 e 250 µg/mL) (Figura 20).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B
C
D
E
F
G
H

Branco do meio de cultura (sem células)

Branco da suspensão celular

Branco das amostras teste

Suspensão celular na presença da amostra 1 em quatro concentrações distintas

Suspensão celular na presença da amostra 2 em quatro concentrações distintas

Suspensão celular na presença da amostra 3 em quatro concentrações distintas

Suspensão celular na presença da amostra 4 em quatro concentrações distintas

Suspensão celular na presença da amostra 5 em quatro concentrações distintas

Figura 20: Esquema da aplicação das amostras, em quatro concentrações distintas, na placa teste
(T1).

Para preparação das amostras, uma alíquota de 10 mg de cada amostra foi

dissolvida em 100 µL de dimetilsulfóxido (DMSO). Em seguida, 50 µL dessa
solução-mãe foram dispersos em 950 µL de meio RPMI/5% SFB, para preparação
da solução de trabalho. Esta foi diluída sucessivamente, em meio de cultura, para
preparação das concentrações finais de 0,25; 2,5; 25 e 250 µg/mL. A concentração
final de DMSO não interferiu no crescimento celular.
Como controle positivo utilizou-se o quimioterápico Doxorrubicina, nas
concentrações de 0,025; 0,25; 2,5 e 25 µg/mL. No momento da adição das

87
amostras, realizou-se a fixação, com ácido tricloroacético (TCA) a 50%, da placa
controle chamada T0, o que permitiu determinar qual a quantidade de células no
momento da adição das amostras.
Ao final de 48h de incubação, as células foram fixadas com 50
µL/compartimento de TCA a 50% e as placas incubadas por 1h a 4ºC; em seguida,
as placas foram lavadas quatro vezes consecutivas com água destilada para
remoção de resíduos de TCA, meio, SFB e metabólitos secundários. Depois de
secas completamente, à temperatura ambiente, as células foram coradas com 50
µL/compartimento de SRB 0,4% (p/v), dissolvido em ácido acético 1%, e mantidas
por 20 min, a temperatura ambiente; em seguida, foram lavadas, quatro vezes,
com ácido acético 1% e secas à temperatura ambiente. Finalmente o corante
ligado às proteínas celulares será solubilizado com Trizma Base, 10 µM e pH 10,5.
A leitura espectrofotométrica da absorbância foi realizada em 540nm em leitor de
microplacas.
Com os valores médios de absorbância para cada concentração de cada
amostra, o crescimento celular, expresso em porcentagem, foi calculado segundo
as seguintes fórmulas:

Se T > T1 → estímulo de crescimento celular

Se T1 > T ≥ T0 → atividade citostática:

(Eq. 12)

Se T< T0 → atividade citocida:

(Eq. 13)

Onde:
T = média da absorbância da célula tratada – absorbância amostra sem
célula.

88
 T1 = absorbância do branco de células.
T0 = absorbância do controle de células na placa T0.

Foram gerados gráficos de porcentagem de crescimento em função da

concentração da amostra testada, para cada uma das linhagens testadas. A
concentração efetiva denominada GI50 (Growth Inhibition, concentração
necessária para interromper em 50% o crescimento celular) foi calculada por
regressão não linear, tipo sigmoidal, utilizando-se software Origin, versão 8.0
(EUA).

3.3.8.2 Ensaio 2 (HepG2)

O ensaio antiproliferativo com linhagem tumoral humana de hepatócitos

(HepG2) foi realizado de acordo com metodologia descrita por Liu et al. (2002).
O teste antiproliferativo foi realizado apenas para as concentrações de
amostra que não apresentaram níveis de citotoxicidade contra as células HepG2.
Células HepG2 foram mantidas em meio de cultura (DMEM calibrado até o
pH 7,0, adicionado de 5% de soro fetal bovino, inativado a 56ºC por 30 minutos,
1% de antibiótico/antimicótico) em uma estufa a 37ºC contendo 5% de CO2. Uma
suspensão celular em meio, de 100 µL na densidade de 2,5 x 104 células/mL, foi
plaqueada em cada poço da placa transparente de 96 poços. Após 4 horas, o
meio foi removido e um meio contendo diversas concentrações (entre 0,005-1
mg/mL) das amostras de BMFH (digeridas ou não) foram adicionadas às células.
Após 72 horas de incubação, as células foram lavadas com PBS (pH 7,4 a
0,1%). Realizou-se o protocolo de coloração por azul de metileno (98% de Hanks,
1,25% de solução de glutaraldeído 5,5% e 0,6% de azul de metileno), descrito no
ensaio de Citotoxicidade, item 3.3.9 da metodologia.
Foram gerados gráficos de porcentagem de crescimento (%) vs
concentração da amostra testada (mg/mL), e as concentrações necessárias para
interromper em 50% o crescimento celular IC50.

89
 3.3.9 Citotoxicidade

O ensaio de citotoxicidade com linhagem tumoral humana de hepatócitos

(HepG2) foi realizado de acordo com metodologia descrita por Wolfe & Liu (2007).
Os hepatócitos (HepG2) cresceram em meio de cultura (DMEM calibrado até
o pH 7,0, adicionado de 5% de soro fetal bovino, inativado a 56ºC por 30 minutos,
1% de antibiótico/antimicótico) e foram mantidas a 37 °C e 5% CO 2.
Plaquearam-se 100 µL de células HepG2 em meio de cultura, na densidade
de 4×104 células/mL, em placa de 96 compartimentos e incubadas por 24 horas a
37 °C. Removeu-se o meio e lavaram-se as células co m 100 µL de tampão PBS
estéril (pH 7,4 a 0,1%). Adicionaram-se 100 µL das amostras diluídas em meio
(entre 0,005-1 mg/mL) e incubou-se a placa a 37 °C por 24 horas.
Posteriormente, as células foram lavadas com PBS, seguida de coloração
com Azul de metileno, na qual 50µL de solução de corante azul de metileno (98%
de Hanks, 1,25% de solução de glutaraldeído 5,5% e 0,6% de azul de metileno) foi
adicionado aos compartimentos e a placa incubada a 37 °C por 1 hora. Removeu-
se o corante e a placa foi imersa em água destilada, repetindo-se o procedimento
6 vezes ou até que a água estivesse limpa. Retirou-se totalmente a água dos
poços e acrescentaram-se 100 µL de tampão de eluição (50% etanol, 49% PBS e
1% ácido acético) nos compartimentos.
Agitou-se a placa por 20 minutos e absorbância foi lida a 570nm, subtraindo-
se o valor do branco.
Considerou-se citotóxica a concentração de amostra que apresentou
decaimento no valor da absorbância acima de 10% quando comparada com o
controle.

3.3.10 CAA (Atividade Antioxidante Celular)

O ensaio da atividade antioxidante celular (Cellular Antioxidant Activity) com

linhagem tumoral humana de hepatócitos (HepG2) foi realizado seguindo-se
metodologia descrita por Wolfe & Liu (2008), após realização do ensaio de

90
citotoxicidade descrito anteriormente.
Incubou-se um volume de 100ìL de células em meio de cultura (DMEM
calibrado até o pH 7,0, adicionado de 5% de soro fetal bovino, inativado a 56ºC
por 30 minutos, 1% de antibiótico/antimicótico), densidade de 6×104 células/mL,
em microplaca estéril preta de 96 poços. Incubou-se a placa por 24 horas a 37 °C
e 5% CO2 e o crescimento de células excessivo foi removido através da lavagem
com PBS estéril (pH 7,4 a 0,1%).
As células foram tratadas em triplicata, por 1 hora, com 100 ìL de meio
contendo a amostra e 25 ìM de DCFH-DA (2′,7′-dichlorofluorescein diacetate,
Sigma). Os poços foram lavados com 100 ìL de PBS (pH 7,4 a 0,1%).
Adicionaram-se 600 ìM de ABAP (2,2′-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride)
às células em 100 ìL de HBSS (Hanks’ Balanced Salt Solution, + 10 mM Hepes).
A leitura foi realizada a cada 5 minutos por 1 hora em leitor de fluorescência
(Fluorímetro Novo Star BMG Labtechnologies) a 37 °C , com filtros de emissão a
538 nm e excitação a 485 nm.
Após a subtração do branco e subtração inicial dos valores da fluorescência,
a área abaixo da curva de fluorescência em função do tempo foi integrada para o
cálculo do valor do CAA.

(Eq. 14)

Onde:
∫SA representou a área integrada da amostra em função do tempo e
∫CA a área integrada da curva controle.

O resultado final foi expresso em ìmol Quercetina Equivalente/100 g amostra

úmida ou ìmol QE/100 g amostra úmida.

91
3.4 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS

Todos os resultados foram descritos como média ± desvio padrão da

triplicata analisada. Os dados foram analisados pelo programa estatístico SAS 9.2
Service Pack e a diferença entre os grupos determinada pelo “one-way ANOVA”
usando o teste de Tukey, onde p < 0,05 foi considerado significante.

92
 CAPÍTULO 4
RESULTADOS E DISCUSSÕES

4.1 CARACTERIZAÇÃO DAS BMFS

A caracterização das bebidas liofilizadas, BMFH (1) e BMFH (2) (Figura 21),
foi realizada através das determinações das Composições Centesimal, Vitamínica,
Mineral e de Mono- e Dissacarídeos, além da Caracterização Físico-Química.

(i)

(ii)

Figura 21: Bebidas liofilizadas: (i) BMFH (1); (ii) BMFH (2).

93
 Para a obtenção das BMFHs prontas para o consumo (Figura 22), as
porções liofilizadas devem ser reconstituídas após diluição em água mineral fria e
homogeneização em liquidificador, nas seguintes concentrações (Tabela 15).

(i)

(ii)

Figura 22: Bebidas reconstituídas: (i) BMFH (1); (ii) BMFH (2).

Tabela 15: Concentração das BMFHs para reconstituição.

AMOSTRA CONCENTRAÇÃO (g/L)

BMFH (1) 151,1

BMFH (2) 143,1

94
 4.1.1 Composição Centesimal

A Composição Centesimal foi determinada através dos ensaios de Umidade

e Voláteis, Calorias, Proteínas, Lipídios Totais, Carboidratos Totais, Fibra Alimentar
Total e Cinzas. Os resultados estão descritos na Tabela 16.

Tabela 16: Composição Centesimal das formulações liofilizadas.

AMOSTRA
ANÁLISE
BMFH (1) %VD BMFH (2) %VD

Umidade e Voláteis a b
4,03±0,07 - 3,26±0,02 -
(g/100 g amostra seca)

Calorias a b
56,84±0 9 54,38±0 8
(kcal/100 g amostra úmida)

Proteína a b
0,614±0,002 2 0,584±0,001 2
(g/100 g amostra úmida)

Lipídios Totais a b
0,141±0 1 0,132±0,001 1
(g/100 g amostra úmida)

Carboidratos Totais a b
13,28±0 13 12,73±0 13
(g/100 g amostra úmida)

Fibra Alimentar Total b a

1,750±0,001 21 2,077±0,027 25
(g/100 g de amostra úmida)

Cinzas a b
0,51±0 - 0,40±0 -
(g/100 g amostra úmida)

Os valores referem-se à média de três determinações ± desvio padrão. Análise estatística pelo método Tukey, com
p<0,05. Letras minúsculas foram usadas na comparação horizontal (entre as amostras). Legenda: %VD - Valores
diários de referência foram calculados para uma porção de 300mL de BMFH, de acordo com a resolução 360 de
23/12/2003 da ANVISA

Analisando-se a Composição Centesimal, observou-se que a BMFH (1)

obteve os maiores valores, estatisticamente significativos (p>0,05), para todas as
análises realizadas, exceto para o conteúdo de Fibra Alimentar Total, onde o maior
valor foi obtido pela amostra BMFH (2).
O conteúdo de calorias analisado nas BMFHs variou entre 54,38±0,00 e

95
56,84 ± 0,00 kcal/100 g amostra úmida, sendo a amostra BMFH (1)
estatisticamente mais calórica (p > 0,05) que a BMFH (2). Foram obtidos valores
de Fibras Alimentares Totais entre 1,750 ± 0,001 (BMFH (1)) e 2,077 ± 0,027 g/100
g amostra úmida para o BMFH (2).
Deve ser dado destaque aos baixos valores calóricos, com 9% e 8% da
porcentagem de VD, respectivamente para a BMFH (1) e BMFH (2) e também ao
alto conteúdo de Fibra Alimentar Total das duas amostras, pois suprem 21% e
25% do Valor Diário recomendado em uma porção de 300 mL de BMFH (1) e
BMFH (2), respectivamente.
Obteve-se uma variação de Umidade e Voláteis entre 3,26 ± 0,02 e 4,03 ±
0,07 g/100 g amostra seca e para o conteúdo de Cinzas, a variação ficou entre
0,40 e 0,51 g/100 g amostra úmida.
Avaliando os resultados das BMFHs analisadas, observa-se uma variação de
conteúdo de proteína entre 0,584 ± 0,001 e 0,614 ± 0,002 g/100 g amostra úmida,
para o ensaio de lipídios totais variaram entre 0,132 ± 0,001 e 0,141 ± 0,000 g/100
g amostra úmida, já o conteúdo de carboidratos variou entre 12,73 ± 0,00 e 13,28
± 0,00 g/100 g amostra úmida.

4.1.2 Composição Vitamínica

A Composição Vitamínica foi determinada através da quantificação das

vitaminas A, B1 (Tiamina), B2 (Riboflavina), B6 (Piridoxina) e Vitamina C (Ácido
Ascórbico). A Composição Vitamínica das amostras BMFH (1) e (2) estão descritas
na Tabela 17.

96
Tabela 17: Composição Vitamínica das formulações liofilizadas.

AMOSTRA
COMPOSTO BMFH (1) BMFH (2)
%VD %VD
(mg/100 g amostra úmida) (mg/100 g amostra úmida)
a,A b,A
Vitamina A* 261,940±0,000 39 95,021±0,000 14
Vitamina B1 a,B b,C
0,014±0,001 3 0,007±0,000 2
(Tiamina)
Vitamina B2 b,C a,B
(Riboflavina) 0,009±0,000 2 0,013±0,001 3

Vitamina B6 a,C b,D

(Piridoxina) 0,008±0,001 2 0,003±0,000 1

Vitamina C
(Ácido ascórbico) nd - nd -

Os valores referem-se à média de três determinações ± desvio padrão. Análise estatística pelo método Tukey,
com p<0,05. Letras minúsculas foram usadas na comparação horizontal (entre as amostras) e letras
maiúsculas na comparação vertical (entre as vitaminas analisadas).
Legenda: %VD - Valores diários de referência foram calculados para uma porção de 300mL de BMFH, de
acordo com a resolução 360 de 23/12/2003 da ANVISA; nd - Não detectado pelo método utilizado.
* UI/100 g amostra úmida

Na comparação vertical, entre os compostos analisados na BMFH (1), os

maiores valores foram encontrados para a Vitamina A (261,94 ± 0,00 mg/100 g
amostra úmida), seguido da Vitamina B1 (0,014 ± 0,001) e posteriormente pelas
Vitaminas B2 e B6, as quais não diferiram estatisticamente entre si. Para a BMFH
(2), os maiores valores obtidos para as vitaminas analisadas foram encontrados
para a Vitamina A (95,02 ± 0,00), Vitamina B2 (0,013 ± 0,001), seguidos de
menores quantidades de Vitamina B1 e posteriormente pela Vitamina B6.
Entre as vitaminas analisadas, exceto pela vitamina B2, a qual foi obtida em
maior quantidade pelo BMFH (2), e Vitamina C que não foi detectada, todas as
vitaminas apresentaram maiores valores, estatisticamente significativo (p < 0,05),
na amostra BMFH (1). Levando-se em consideração a diferença de formulação
das BMFHs, pode-se atribuir o maior teor de vitamina B2 da BMFH (2) a presença
de couve-flor (contém 0,09 mg vitamina B2 em 100 g de amostra úmida).
De acordo com Pereira & Baldwin (2001), a degradação do ácido ascórbico

97
pode ocorrer em condições aeróbicas ou anaeróbicas, ambas levando à formação
de pigmentos escuros e também pela ação da luz. Sua estabilidade aumenta com
a diminuição da temperatura. Mas, apesar de todos os cuidados tomados durante
o processamento dos vegetais no preparo das BMFHs, como baixas temperaturas
e iluminação no ambiente, pouco tempo de exposição antes do congelamento,
escurecimento da campânula do liofilizador, entre outros cuidados tomados, a
vitamina C não foi detectada em nenhumas das BMFHs avaliadas.
A perda de nutrientes poderia ser diminuída modificando-se algumas etapas
de processamento como, por exemplo, o congelamento rápido das amostras em
freezers mais potentes (com temperaturas mais baixas do que os freezers
domésticos) ou em nitrogênio líquido ou realizar a homogeneização somente após
a liofilização individual dos vegetais, pois ambas as modificações diminuiriam a
superfície de contato que oxida com o oxigênio do ar e com a luz do ambiente.
Deve ser dado destaque à porcentagem do Valor Diário (%VD) de Vitamina A
suprida por uma porção de 300 mL tanto da amostra BMFH (1), com 39% do valor
diário, quanto pela BMFH (2), com 14%. A amostra BMFH (1) pode ser
considerada fonte de Vitamina A, pois contém mais que 15% da %VD de
referência.

4.1.3 Composição Mineral

A composição Mineral quantificou Cálcio, Cobre, Fósforo, Ferro, Magnésio,

Manganês, Potássio, Sódio e Zinco nas amostras de BMFHs. Os resultados
obtidos para os analitos avaliados e seus valores diários de referência (%VD),
para cada bebida analisada, estão descritas na Tabela 18.

98
Tabela 18: Composição Mineral das formulações liofilizadas.

AMOSTRA
ANALITOS
BMFH (1) BMFH (2)
%VD %VD
(mg/100 g amostra úmida) (mg/100 g amostra úmida)

a,B b,B
Cálcio 40,21±0,03 12 26,62±0,29 8
a,F b,F
Cobre 0,12±0,01 0 0,11±0,00 0
a,E,F b,F
Ferro 0,23±0,00 5 0,18±0,00 4
a,C b,C
Fósforo 17,89±0,67 8 16,74±0,29 7
a,D b,D
Magnésio 14,23±0,06 16 10,06±0,01 12
a,E,F b,F
Manganês 0,19±0,01 24 0,13±0,00 17
a,A b,A
Potássio 233,90±1,06 - 194,19±1,29 -
b,E a,E
Sódio 1,31±0,09 0 1,49±0,06 0
a,F a,F
Zinco 0,13±0,01 5 0,13±0,01 6

Os valores referem-se à média de três determinações ± desvio padrão. Análise estatística pelo método Tukey, com
p<0,05. Letras minúsculas foram usadas na comparação horizontal (entre as amostras) e letras maiúsculas na
comparação vertical (entre os minerais analisados). Legenda: %VD - Valores diários de referência foram calculados
para uma porção de 300 mL de BMFH, de acordo com a resolução 360 de 23/12/2003 da ANVISA

Ao compararmos verticalmente os minerais presentes em cada amostra,

tanto para o BMFH (1) quanto para o BMFH (2), foi possível observar que os
principais minerais foram o Potássio (respectivamente, 233,90 ± 1,06 e 194,19 ±
1,29 mg/100 g amostra úmida), Cálcio (40,21 ± 0,03 e 26,62 ± 0,29), Fósforo
(17,89 ± 0,67 e 16,74 ± 0,29) e Magnésio (14,23 ± 0,06 e 10,06 ± 0,01), seguidos
por quantidades menores dos outros minerais.
Os maiores conteúdos de Cálcio, Magnésio e Manganês da BMFH (1) podem
ser atribuídos às presenças de limão Tahiti e hortelã, e à maior concentração de
couve manteiga, vegetais estes que contêm quantidades consideráveis desses
minerais.
Todos os minerais analisados foram obtidos estatisticamente em maior
quantidade pela amostra BMFH (1), exceto pelos minerais sódio, o qual
apresenta-se em maior teor no BMFH (2), e zinco, que não apresentou diferença

99
estatística entre as BMFHs estudadas.
Maiores destaques devem ser dados ao Magnésio e ao Manganês que,
apesar de não apresentarem as maiores quantidades quando comparados com os
minerais analisados, são os que apresentam maiores porcentagens de Valor Diário
(%VD) suprindo uma grande quantidade deste valor em uma porção de 300 mL,
tanto da amostra BMFH (1) quanto pela BMFH (2). O conteúdo de Manganês
contido nas BMFHs supre 24% e 17% do valor diário recomendado e o Magnésio
16% e 12%, respectivamente para as amostras BMFH (1) e BMFH (2). Sendo
assim, pode-se considerar que a BMFH (1) é fonte de Manganês e Magnésio e a
BMFH (2), fonte de Manganês.

4.1.4 Informações Nutricionais: Resultados Esperados versus

Resultados Obtidos

As informações nutricionais das BMFHs obtidas experimentalmente foram

comparadas, através de um gráfico (Figura 23), às composições esperadas,
preditas através do cálculo das informações obtidas na literatura para cada vegetal
(Tabela 5, ANEXO). As concentrações de cada ingrediente foram consideradas no
cálculo das informações nutricionais preditas para cada bebida.

100
Figura 23: Gráfico comparativo entre as informações nutricionais preditas e as obtidas experimentalmente das BMFHs (1) e (2).

101
 Através da análise da Figura 23, pode-se observar o seguinte:

- Ambas as BMFHs (1) e (2) apresentaram menores conteúdos de proteínas,

carboidratos, fósforo, magnésio, manganês, vitaminas A, B1, B2, B6 e C e maiores
valores de fibras, cálcio, cobre, ferro e potássio do que os resultados preditos;
- Quando comparados aos valores preditos, a BMFH (1) apresenta menores
conteúdos de calorias, lipídios e sódio e maiores de cinzas e BMFH (2) apresenta
menores teores de cinzas e maiores valores de sódio e zinco;
- Resultados equivalentes entre os dados obtidos experimentalmente e os
preditos através de cálculos foram observados apenas para os conteúdos de zinco
da BMFH (1) e de calorias e lipídios da BMFH (2).

Essas variações, encontradas entre os valores preditos e os obtidos

experimentalmente, podem ser causadas por vários fatores como: o tipo de solo,
fertilizantes utilizados, época e local de plantio, estocagem, comercialização das
frutas e hortaliças ou pela perda durante etapas do processamento das bebidas,
como homogeneização, oxidação pelo contato com ar ou exposição à luz,
armazenamento, entre outros.

4.1.5 BMFHs como Ingestão Diária de Frutas e Hortaliças

As Composições Centesimal, Vitamínica e Mineral preditas através da soma

dos resultados apresentados na TACO (2006) (ANEXO) de algumas porções de
frutas e hortaliças foram plotadas em 3 gráficos (Figuras 24, 25, e 26), juntamente
com as composições obtidas pelas BMFHs.
Por este motivo, estes gráficos foram utilizados para sugerir o equivalente de
porções de frutas e hortaliças supridas por uma porção de 300 mL das BMFHs.

102
Figura 24: Gráfico comparativo entre a Composição Centesimal das BMFHs (1) e (2) e de porções
de frutas e hortaliças.

Figura 25: Gráfico comparativo entre a Composição Vitamínica das BMFHs (1) e (2) e de porções
de frutas e hortaliças.

103
Figura 26: Gráfico comparativo entre a Composição Mineral das BMFHs (1) e (2) e de porções de
frutas e hortaliças.

Avaliando os gráficos (Figuras 24, 25 e 26), pode-se observar que:

- Quando comparadas a uma porção de banana, as BMFHs (1) e (2)

apresentam menores quantidades apenas para o conteúdo de magnésio,
Vitaminas B6 e C, e têm conteúdo equivalente de Vitamina B2;
- Em relação à quantidade de fibras, as BMFHs (1) e (2) são equivalentes a 3
porções de vegetais (maçã, pera e couve), mas apresentam quantidades maiores
que 2 porções (banana e repolho);
- As BMFHs (1) e (2) são equivalentes a 2 porções (banana e repolho) e 3
porções (maçã, pera e couve) em relação aos conteúdos estimados de lipídios,
manganês, fósforo e zinco;
- Também são equivalentes a 2 porções (banana e repolho), 3 porções
(maçã, pera e couve) e 4 porções (maçã, pêra, couve e repolho) no conteúdo
predito de carboidratos, cinzas, cálcio, ferro, potássio e cobre, e

104
 - A condição teórica do consumo de 4 porções (maçã, pêra, couve e repolho)
é melhor que as BMFHs em relação a caloria e carboidratos, em menores
quantidades, e contêm maiores teores de proteínas, fibras, cinzas, todas as
vitaminas e quase todos os minerais analisados.

Como foi demonstrado anteriormente, segundo a POF de 2008-2009, para

mais de 90% da população brasileira, a ingestão diária de frutas, verduras e
legumes está abaixo dos níveis recomendados pelo Ministério da Saúde (400 g).
Por este motivo, pode-se sugerir que o consumo de uma bebida mista de frutas e
hortaliças, como as BMFHs (1) e (2), supriria parte da deficiência de nutrientes na
dieta, justificando a ingestão destas bebidas como parte do consumo
recomendado de frutas e hortaliças.
Ruxton (2008) realizou uma estimativa sugerindo que a ingestão de 250mL
de smoothies (baseados na composição média de 8 amostras de smoothie da
marca Innocent) faria uma modesta contribuição para o consumo de energia, mas
uma contribuição potencialmente importante para recomendações de fibras (18%
de %VD) e vitamina C (>100% de %VD). Cerca de 29% da porcentagem do Valor
Diário de Referência para açúcares totais seriam fornecidos por uma porção de
smoothie, embora nada tenha sido "acrescentado" de açúcar (ou seja,
provenientes do fruto, que constitui o produto). Quando comparamos os resultados
obtidos por este autor aos obtidos para as BMFHs, podemos observar que as
bebidas avaliadas neste estudo obtiveram maiores %VD de fibras totais, mas
menor quantidade de carboidratos e vitamina C.

4.1.6 Comparação entre as BMFHs e Similares Comerciais

Com o objetivo facilitar a visualização dos dados a serem avaliados, o

primeiro gráfico (Figura 27) compara as BMFHs formuladas com oito (8) marcas
encontradas no Brasil e o segundo gráfico (Figura 28) comparando os dados
deste trabalho com informações nutricionais de nove (9) marcas vendidas no
mercado internacional.

105
Figura 27: Gráfico comparativo entre as informações nutricionais das BMFHs (1) e (2) e bebidas mistas de frutas e hortaliças comerciais
encontradas no comércio brasileiro.

106
Figura 28: Gráfico comparativo entre as informações nutricionais das BMFHs (1) e (2) e bebidas mistas de frutas e hortaliças comerciais
encontradas no comércio estrangeiro.

107
 Analisando-se os gráficos comparativos entre as informações nutricionais
das BMFHs (1) e (2) e das bebidas mistas de frutas e hortaliças, de coloração
verde, comercializadas no Brasil (Figura 27) e no exterior (Figura 28) pôde-se
observar que:

- O valor energético de BMFH (1) e (2) foi um pouco maior do que quase
todas as bebidas avaliadas neste estudo à exceção da bebida Suco Verde-Do
Vivo.
- As concentrações de carboidratos das BMFHs são maiores que as de todas
as bebidas avaliadas, exceto do Suco Verde da marca Do Vivo e do Sweet Greens
and Ginger, as quais apresentaram maiores concentrações entre 1,51 e 1,57
vezes e entre 3,4 e 3,6 vezes, respectivamente.
- As quantidades de proteínas das BMFHs (1) e (2) se apresentaram maiores
do que as bebidas Smoothie Detox, Detox Monstro, Detox Green, Kiwis, Apples
and Limes, Sweet Greens and Ginger e Sweet Greens and Lemon, e menores que
as concentrações de nove bebidas comerciais. Os sucos V+ Aruba e V+ Bahamas,
ambas da marca Greenday, não apresentaram quantidades significativas de
proteínas.
- Entre as 17 bebidas avaliadas, ambas as BMFHs contêm concentrações de
gorduras totais menores do que sete bebidas e têm concentrações similares à
contida no Super Verde. Sendo que, dentre as nove bebidas restantes, seis
apresentaram valores de gorduras totais iguais a zero e as outras três não
apresentaram quantidades significativas.
- Ambas as quantidades de fibras das BMFHs (1) e (2) são maiores dos que
as encontradas em 14 bebidas avaliadas, sendo que, dentre estas, quatro não
contém fibras, duas contêm quantidades não significativas e uma contêm apenas
traços. O Suco Verde da marca Do Vivo tem concentração de fibras maiores do
que as das duas BMFHs formuladas; ambos Smoothie Detox e Super Verde têm
mais fibras do que a BMFH (1), mas têm menos que a BMFH (2).
- Ambas as BMFHs (1) e (2) contêm concentrações menores de sódio

108
quando comparadas a 12 bebidas comerciais e maiores do que cinco, sendo que,
dentre estas, duas não apresentaram quantidades significativas e uma contêm
apenas traços.
- Entre as tabelas nutricionais das 17 bebidas avaliadas, dez não continham
as concentrações de cálcio. Entre as outras sete, ambas as BMFHs contêm
maiores concentrações que as apresentadas pelo Orange Mango, Tropical Twist,
Sweet Greens and Ginger e Super Green; o Suco Verde da Do Vivo contém
concentrações similares a da BMFH (2) e menores do que a da BMFH (1).
- Entre as dezessete bebidas, apenas oito continham os valores das
concentrações de ferro nas tabelas nutricionais. O Suco Verde da marca Do Vivo,
o Life Juice Greenpower e o Super Green apresentaram concentrações de ferro
maiores do que as BMFHs (1) e (2). Já o Essencial Greens with Lime e o Sweet
Greens and Lemon contêm a mesma concentração de ferro que a BMFH (2),
sendo também menores do que a encontrada na BMFH (1). O Orange Mango e o
Tropical Twist contêm maiores concentrações de ferro do que a BMFH (1), mas
contêm mais ferro do que a BMFH (2).
- Apenas três das dezessete bebidas avaliadas continham o valor de
magnésio na tabela nutricional, sendo que, o Orange Mango não contém
magnésio, o Suco Verde da marca Do Vivo apresentou valores maiores do que
ambas as BMFHs e o Tropical Twist contém menor concentração de magnésio
quando comparado as duas BMFHs formuladas neste trabalho.
- Sete entre as dezessete bebidas comerciais continham, em suas tabelas
nutricionais, as concentrações de potássio. Três destas bebidas (Life Juice
Greenpower, Orange Mango e Super Green) apresentam valores menores do que
os contidos em ambas as BMFHs; Essencial Greens with Lime e Sweet Greens
and Ginger contêm quantidades maiores do que as encontradas nas BMFHs (1) e
(2); Tropical Twist e Sweet Greens and Lemon contêm mais potássio do que a
BMFH (2) e menos do que a BMFH (1).
- Onze bebidas não apresentaram as concentrações de vitamina A em suas
tabelas nutricionais, sendo que, dentre as seis restantes, apenas o Sweet Greens

109
and Ginger contém menos vitamina A do que as duas BMFHs; três bebidas
(Orange Mango, Tropical Twist e Super Green) contém maiores conteúdos do que
ambas as BMFHs, e o Essencial Greens with Lime e o Super Green somente
contêm maiores concentrações do que a BMFH (2).
- A concentração de vitamina C não foi detectada nas BMFHs (1) e (2), pelo
método utilizado, e, por este motivo, não pode ser feita a comparação com as
bebidas comerciais. O fato das bebidas comerciais apresentarem altas
concentrações de vitamina C pode ser justificado pela adição deste composto nos
produtos ou pelo processamento utilizado na produção das bebidas.

Holland et al. (2008) avaliaram as frutas pera, maçã e kiwi juntamente com o
smoothie comercial correspondente (v/v, 45% de pera, 29,6% de maçã e 25% de
kiwi). Os frutos foram analisados individualmente e estes valores utilizados para
calcular a composição nutricional esperada no smoothie final. Além disso, as frutas
também foram usadas para fazer uma bebida caseira à base de frutas seguindo a
receita de smoothie comercial, sem a adição de ácido ascórbico. A composição
nutricional do smoothie caseiro foi em seguida comparada ao equivalente
comercial. Os níveis de açúcares e de β-caroteno para ambos os smoothies
obtiveram as concentrações esperadas. A bebida caseira continha o conteúdo
esperado de vitamina C, enquanto que a da bebida comercial apresentou um teor
muito mais elevado, refletindo a adição de 4 g de ácido ascórbico por litro. O
conteúdo fenólico do smoothie comercial foi muito maior do que o esperado (p <
0,001), o qual também continha a maior capacidade antioxidante. Assim,
smoothies, tanto o caseiro quanto o comercial, parecem ser benéficos no auxílio
do cumprimento da recomendação de 5 porções de frutas e hortaliças por dia.

4.1.7 Caracterização Físico-Química

Os resultados obtidos na Caracterização Físico-Química das bebidas
liofilizadas estão descritas na Tabela 19, através das determinações de pH, ºbrix,
%acidez titulável, ratio, mono- e dissacarídeos, clorofila e cor.

110
 Tabela 19: Caracterização Físico-Química das formulações liofilizadas.

AMOSTRA
ANÁLISE
BMFH (1) BMFH (2)

a a
pH 4,24±0,05 4,30±0,01
a b
%Acidez Titulável 0,254±0,004 0,175±0,004
a a
ºBrix 7,85±0,07 7,90±0,14
b a
Ratio 30,92±0,30 45,17±1,19

MONO- E DISSACARÍDEOS
(mg/100 g amostra úmida)
a,C a,C
Glicose 1832±141 1835±157
a,A b,A
Sacarose 4937±403 4096±301
b,B a,B
Frutose 2506±183 3591±235

COR
a a
L* 60,68±0,41 62,31±0,80
a b
a* -3,90±0,05 -0,42±0,11
a b
b* 43,87±0,44 37,93±0,33

CLOROFILA
(mg/g amostra úmida)
a b
Totais 3,96±0,31 2,01±0,12
a b
a 2,68±0,08 1,31±0,05
a b
b 1,02±0,14 0,70±0,07

Os valores referem-se à média de três determinações ± desvio padrão. Análise estatística pelo
método Tukey, com p<0,05. Letras minúsculas foram usadas na comparação horizontal (entre
as amostras). Para o conteúdo de mono- e dissacarídeos, utilizaram-se letras maiúsculas na
comparação vertical, entre os analitos avaliados.
Legenda: L* = luminosidade; a* = coordenada que varia do vermelho (+a*) e verde (-a*); b* =
coordenada que varia do amarelo (+b*) ao azul (-b*)

• Determinações de pH, %Acidez Titulável, ºBrix e da relação Ratio

Não houve diferenças estatisticamente significativas para o ensaio de pH,

entre as BMFHs estudadas, variando entre 4,24±0,05 e 4,3±0,01. O baixo pH
contribui para uma melhor conservação do produto. Os resultados de %Acidez

111
Titulável variaram entre 0,254±0,004 e 0,175±0,004%, sendo os maiores valores
para este ensaio observados na BMFH (1).
Comparando-se os resultados horizontalmente, entre as amostras, pode-se
observar que não houve diferenças estatisticamente significativas para os valores
de %Brix, os quais variaram entre 7,85±0,07 e 7,9±0,14.
O ratio é a relação entre o teor de sólidos solúveis (°Brix ) e o teor de ácidos
tituláveis. Ele é o indicador utilizado para determinar o balanço do sabor
doce:ácido (COUTO & CANNIATTI-BRAZACA, 2010). Os resultados obtidos para
esta relação variaram entre 30,92±0,30 e 45,17±1,19, sendo o maior valor
estatisticamente significativo obtido pela amostra BMFH (2).

• Mono- e Dissacarídeos

Os cromatogramas obtidos na identificação e quantificação de mono- e

dissacarídeos das BMFHs estudadas podem ser observados na Figura 29.

(i)

112
 (ii)

(iii)

Figura 29: Cromatogramas obtidos na identificação e quantificação de mono- e dissacarídeos de:

(i) padrões, (ii) BMFH (1) e (iii) BMFH (2).

113
 Os resultados obtidos para glicose variaram entre 1,83±0,14 e 1,84±0,16
g/100 g amostra úmida, para sacarose entre 4,10±0,30 e 4,94±0,40, e frutose
entre 2,51±0,18 e 3,59±0,24 g/100 g amostra úmida. Avaliando a quantidade de
monossacarídeos em relação ao conteúdo de Carboidratos Totais obtêm-se
valores de 13,78 e 14,45% de glicose, 37,20 e 32,20% de sacarose e 18,90 e
28,27% de frutose, respectivamente para BMFH (1) e (2), sendo que os valores
restantes podem ser compostos por oligo- ou polissacarídeos.
Comparando-se os resultados horizontalmente, entre as BMFHs, pode-se
observar que não houve diferenças estatisticamente significativas para os valores
de conteúdo de glicose, os maiores valores para o ensaio sacarose foram obtidos
na BMFH (1) e para frutose pela BMFH (2). Na comparação vertical, entre os
ensaios de cada amostra, o mesmo comportamento foi observado para as duas
BMFHs analisadas, onde o maior conteúdo de mono- e dissacarídeos se deu pela
sacarose, seguida de frutose e posteriormente pela glicose.

• Cor

Na análise dos resultados para Cor, não houve diferença estatisticamente

significativa para o valor de L* (luminosidade) entre as BMFHs. A amostra BMFH
(1) obteve os maiores valores para as coordenadas a* (-3,9±0,05) e b*
(43,87±0,44), demonstrando tonalidades mais tendentes ao verde e ao amarelo do
que a amostra BMFH (2).
A cor é um atributo de importância fundamental no julgamento da qualidade
de um alimento, uma vez que a apreciação visual é o primeiro dos sentidos a ser
usado, sendo, portanto, uma característica decisiva na escolha e aceitação do
produto (LIMA et al., 2007). O impacto visual gerado pela cor muitas vezes, se
sobrepõe ao causado por outros atributos de aparência e odor. Pode ainda,
apresentar efeito na própria intensidade com que é percebido o sabor (CARDOSO
et al., 1997).

114
 • Clorofilas

Houve uma variação nos resultados de Clorofilas Totais entre 2,01±0,12 e

3,96±0,31 mg/100 g amostra úmida, Clorofila a entre 1,31±0,05 e 2,68±0,08 e
Clorofila b entre 0,70±0,07 e 1,02±0,14 mg/100 g amostra úmida. Os maiores
valores significativos foram obtidos na BMFH (1) para os três resultados
analisados, o que pode justificar a maior tendência para a cor verde desta
amostra, em relação a BMFH (2).

4.1.8 Caracterização dos Compostos Nutracêuticos

Os resultados obtidos para os ensaios de caracterização dos compostos

nutracêuticos (β-Caroteno, Flavonoides Totais, Fibras Solúveis e Insolúveis,
Pectina e Oligossacarídeos) são descritas na Tabela 20.

Tabela 20: Caracterização da composição de nutracêuticos das formulações.

AMOSTRA
ANÁLISE
BMFH (1) BMFH (2)

CAROTENÓIDES:
â-Caroteno a b
471,43±23,80 171,15±8,16
(ìg/100 g amostra úmida)

COMPOSTOS FENÓLICOS:
Flavonoides Totais a b
37,9±3,7 30,8±0,3
(mg Catequina Equiv./100 g amostra úmida)

FIBRAS DIETÉTICAS:
Insolúveis b a
901,9±4,6 1273,0±20,0
(mg/100 g amostra úmida)
Solúveis: a b
827,7±4,6 799,9±7,2
(mg/100 g amostra úmida)
Pectina a a
571,5±9,1 559,5±10,0
(mg/100 g amostra úmida)
Fruto oligossacarídeo a b
17,3±0,3 9,2±0,2
(mg/100 g amostra úmida)
Mato oligossacarídeo b a
1,45±0,03 1,93±0,01
(mg/100 g amostra úmida)
Os valores referem-se à média de três determinações ± desvio padrão. Análise estatística pelo método Tukey,
com p<0,05. Letras minúsculas foram usadas na comparação horizontal (entre as amostras).

115
 • Carotenoides

No ensaio de â-caroteno, houve uma variação dos resultados entre

171,15±8,16 e 471,43±23,80 µg/100 g amostra úmida. Comparando-se os
resultados obtidos para as BMFHs, pode-se observar que o maior conteúdo de β-
caroteno foi obtido pela BMFH (1), podendo justificar uma maior tendência para a
cor amarela desta amostra quando comparada com a BMFH (2).

• Flavonoides Totais

Para a determinação de Flavonoides Totais, utilizou-se uma curva padrão de

Catequina com equação y = 0,3035x + 0,0292 e R² = 0,9995 (Figura 30).

Figura 30: Curva Padrão de Catequina para determinação de Flavonoides Totais.

Nas bebidas mistas de frutas e hortaliças estudadas, BMFHs (1) e (2), houve
uma variação entre 30,5 e 41,6 mg Catequina Equiv./100 g amostra úmida para o
ensaio de Flavonoides Totais, onde os maiores valores foram encontrados para a
amostra BMFH (1).

116
 • Fibras Dietéticas

Os resultados para Fibras Solúveis e Insolúveis variaram, respectivamente,

entre 799,9±7,2 e 827,7±4,6, e 901,9±4,6 e 1273,0±20,0 mg/100 g amostra úmida,
para as bebidas analisadas. O conteúdo de Fibras Solúveis foi significativamente
maior para a BMFH (1) enquanto o maior valor encontrado para Fibras Insolúveis
foi obtido pela amostra BMFH (2).
Foi obtida uma variação para o conteúdo de Pectina entre 559,5±10,0 e
571,5±9,1 mg/100 g amostra úmida. Para o conteúdo de Pectina, não houve
diferença estatisticamente significativa entre as BMFHs estudadas. Comparando-
se com o conteúdo de Fibras Solúveis, a pectina foi responsável por 69% na
BMFH (1) e 70% na BMFH (2), e em relação ao Conteúdo de Carboidratos Totais,
foi responsável por 4,3% e 4,4%, respectivamente para BMFH (1) e (2).
Na Identificação e quantificação dos oligossacarídeos, obtiveram-se os
seguintes cromatogramas dos padrões e das BMFHs analisadas (Figura 31).

(i)

117
 (ii)

(iii)

Figura 31: Cromatogramas obtidos na identificação e quantificação de Oligossacarídeos de: (i)

padrões, (ii) BMFH (1) e (iii) BMFH (2).

118
 Foram identificados fruto- e malto oligossacarídeos nas BMFHs estudadas
(respectivamente variando entre 9,2 ± 0,2 e 17,3 ± 0,3, e entre 1,45 ± 0,03 e 1,93
± 0,01 mg/100 g amostra úmida), sendo o primeiro em quantidade
significativamente maior na BMFH (1), e este último em maior quantidade na
BMFH (2).
Em relação ao conteúdo total de fibras solúveis, o fruto oligossacarídeo foi
responsável por 2,09% na BMFH (1), e 1,15% na BMFH (2), e o malto
oligossacarídeo por 0,18 e 0,24%, respectivamente na BMFH (1) e (2).
Avaliando a quantidade de oligossacarídeos quantificados em relação ao
conteúdo de Carboidratos Totais, obtiveram-se valores de 0,13 e 0,07% de fruto
oligossacarídeos e 0,01 e 0,02% de malto oligossacarídeos, respectivamente para
BMFH (1) e (2).

4.1.9 Identificação dos Compostos Fenólicos

A identificação dos flavonoides das BMFHs (1) e (2) liofilizadas, antes e após
a digestão in vitro, foi realizada através de análise por Espectrometria de Massa
de Alta Resolução (HR-ESI-MS) e os resultados estão apresentados na Tabela 21.

119
Tabela 21: Resultados da Identificação de flavonoides dos BMFHs (1) e (2), antes e após a
digestão in vitro.

BMFH (1) BMFH (2)

FLAVONOIDE SD AD SD AD

ANTOCIANIDINAS
Cianidina x x x x
Delfinidina nd nd nd nd
MODO POSITIVO

Pelargonidina x x nd nd

FLAVANÓIS
(+) Catequina x nd x x
(-) Epicatequina x nd x x
(-) Epicatequina-3-galato x nd nd nd
(-) Epigalocatequina nd nd nd nd
(-) Epigalocatequina-3-galato nd nd nd nd

FLAVANONAS
Eriodictiol x nd x nd
Hesperetina x x x nd
Naringenina x nd x nd
MODO NEGATIVO

FLAVONAS

Apigenina nd nd nd nd
Luteolina nd nd nd nd

FLAVONÓIS

Canferol nd nd nd nd
Isoramnetina nd nd x nd
Miricetina nd nd nd nd
Quercetina nd nd x nd

Legenda: SD = Sem Digestão; AD = Após Digestão;

x = presente na amostra; nd = não detectado pelo método utilizado.

Analisando-se a Tabela 21 e comparando os flavonoides encontrados em

cada formulação liofilizada, pode-se demonstrar que ambas as bebidas, BMFHs
(1) e (2), apresentaram cianidina, (+) catequina, (-) epicatequina, eriodictiol,
esperetina e naringenina.

120
 As diferenças de composição de flavonoides entre os BMFHs (1) e (2) são:

- BMFH (1): presença de pelargonidina e (-) epicatequina-3-galato e,

- BMFH (2): presença de (-) epigalocatequina, isoramnetina e quercetina.

Os resultados obtidos na identificação dos flavonoides das formulações

avaliadas (Tabela 21) foram analisados juntamente com os dados de composição
de flavonoides dos vegetais estudados, Tabela 5 (ANEXO) disponibilizada pela
USDA em 2011, podendo-se supor que a cianidina e a pelargonidina identificadas
na BMFH (1) foram obtidas da manga, e a cianidina da BMFH (2) através da
maçã, manga e pera; a banana e a manga contidas nas BMFHs (1) e (2) e a maçã
e pera da BMFH (2) são as fontes de (+) catequina destas amostras; a banana das
BMFHs (1) e (2) seria responsável pela (-) epicatequina das amostras, e a maçã e
a pera da BMFH (2) responsáveis tanto pela (-) epicatequina quanto pela (-)
epigalocatequina; o eriodictiol e hesperetina são obtidas da laranja e hortelã nas
duas amostras, BMFHs (1) e (2), e também do limão na BMFH (2); os cítricos,
limão e laranja, são as fontes de naringenina na BMFH (1), e apenas este último
na BMFH (2); a isoramnetina encontrada na BMFH (2) tem como fontes a pera e a
couve utilizadas na sua formulação e, todos os vegetais, exceto a hortelã, são as
fontes de quercetina da BMFH (2).

• Efeito do Processamento na Composição de Flavonoides

Observou-se a perda de alguns flavonoides que estão presentes nos

vegetais frescos, em sua forma individual, os quais não foram encontrados após
processamento nas formulações de BMFH (1) e (2):

- Isoramnetina e quercetina da BMFH (1);

- Pelargonidina, (-) epicatequina-3-galato e (-) epigalocatequina-3-galato da
BMFH (2) e,
- Delfinidina, apigenina, luteolina, canferol e miricetina das BMFHs (1) e (2).

121
 Comportamento contrário, biodisponibilidade de flavonoides após
processamento dos vegetais, foi observado na BMFH (1) através do composto (-)
epicatequina-3-galato. Pode-se observar que os vegetais que compõem a sua
formulação (banana, laranja, limão, manga, couve e hortelã) não apresentam (-)
epicatequina-3-galato, de acordo com a Tabela 5 (ANEXO) disponibilizada pela
USDA.
De acordo com Pereira (2010), o processamento afeta o conteúdo, a
atividade e a biodisponibilidade dos componentes bioativos dos alimentos.
O armazenamento também afeta o conteúdo de polifenóis. O
armazenamento de sucos de maçã por 11 meses resultou num decréscimo em
ácidos fenólicos de 5% a 21%. A diminuição do teor de ácido p-cumárico livre
também foi observada em framboesas vermelhas congeladas. Após o
armazenamento a frio, brócolis perdeu cerca de 75% de seus derivados cafeoil-
quínico e 40-50% dos seus ácidos sinápicos e derivados feruloil. Teor de polifenóis
foi estudado em vinhos tintos durante o armazenamento ao longo de sete meses
no escuro: o teor de antocianinas diminuiu 88%, enquanto não ocorreram
variações significativas nos conteúdos de flavonóis totais. Por outro lado, foi
observado em maçãs (variedade Annurca) que ocorreu um aumento importante no
teor de ácido clorogênico após quatro meses de armazenamento (de 101 a 144
mg/kg de peso fresco); e também o teor de ácidos fenólicos aumentado quando
cenouras foram armazenadas sob condições aeróbicas (D’ARCHIVIO et al., 2010).
Processos tecnológicos tais como a homogeneização dos vegetais, podem
aumentar a biodisponibilidade dos polifenóis pela alteração da matriz dos
alimentos, tal como foi demonstrado por diversos pesquisadores para o licopeno e
para â-caroteno, dois dos carotenoides mais importantes. Na verdade, tem sido
demonstrado que o purê e pasta de tomate são fontes de licopeno mais
biodisponível do que o tomate cru (PORRINI et al., 1998).
De acordo com Dekker et al. (1999), a maior perda de fenólicos em suco de
maçã ocorre na prensagem. A concentração de ácido clorogênico em suco

122
industrializado representa somente 50% da encontrada no suco fresco (VAN DER
SLUIS et al., 2002).
Chang et al. (2006) observou que, após os diferentes processos de secagem
de tomate estudados, liofilização ou secagem por ar quente, ocorre elevação do
teor de flavonoides, fenólicos e licopeno, acarretando aumento da atividade
antioxidante. A secagem pode acelerar a liberação dos fenólicos a partir da quebra
dos constituintes celulares, embora o rompimento das paredes celulares possa
liberar enzimas oxidativas e hidrolíticas que poderiam destruir os antioxidantes das
amostras.
De acordo com Shofian et al. (2011) e estudos anteriores, perdas de
vitaminas e valor nutricional dos alimentos são relatados devido à liofilização de
alimentos. É também evidente que a composição de alguns antioxidantes e a
atividade antioxidante de vegetais são significativamente afetadas pela liofilização.

• Efeito da Digestão in vitro na Composição de Flavonoides

A avaliação in vitro das atividades antioxidantes, citotoxicidade e proliferação

celular das amostras de BMFH juntamente com a digestão in vitro, proverá
informações mais completas e próximas às condições fisiológicas reais.
Comparando-se as amostras digeridas das BMFHs (1) e (2), Tabela 21,
pode-se observar a presença de cianidina em ambas as BMFHs, pelargonidina e
hesperetina apenas na BMFH (1) e (+) catequina e (-) epicatequina na BMFH (2).
Podem-se perceber diferenças entre as amostras antes e após a digestão in
vitro, nas quais observa-se a perda de alguns compostos após o processo de
digestão, como segue:

- Presença de (+) catequina e (-) epicatequina na BMFH (1) e ausência nesta

amostra digerida;
- A BMFH (2) apresenta os compostos hesperetina, isoramnetina e
quercetina, apenas antes da digestão in vitro e,

123
 - (-) Epicatequina-3-galato, eriodictiol e naringenina estão presentes nas
amostras BMFH (1) e (2) antes da digestão, mas estão ausentes nas amostras
digeridas.

Akillioglu & Karakaya (2010) justificam, através das análises dos resultados
obtidos em seus estudos com feijões, que a menor quantidade de Fenóis Totais
antes da digestão in vitro pode ser explicada pela capacidade limitada dos
métodos de extração usados para a determinação de polifenóis, pois alguns
polifenóis, especialmente polifenóis associados com compostos de elevado peso
molecular tais como proteínas e carboidratos, podem escapar dos métodos
normais de extração aplicados. No entanto, esta fração pode ser libertada a partir
da matriz de alimentos através da ação de enzimas da digestão. Explicação
semelhante para polifenóis alimentares com um elevado grau de polimerização e
relacionados com componentes de alto peso molecular foram relatados por Saura-
Calixto et al. (2007).
Siracusa et al. (2011), em ensaios utilizando infusões de alcaparra (Capparis
spinosa L.) e erva-doce do mar (Crithmum maritimum L.), verificaram que o teor
em compostos fenólicos totais e a atividade antioxidante dos extratos diminuíam
significativamente nas infusões digeridas. Estes autores sugem que os compostos
fenólicos dominantes presentes antes da digestão não são estáveis nas condições
gastrointestinais aplicadas, sendo que esta instabilidade poderia estar relacionada
com o pH do meio, que conduziria alterações estruturais que comprometem a sua
atividade antioxidante. Também existe a possibilidade de, durante a incubação
pancreática poderem ocorrer reações de isomerização do ácido clorogénico, que
levassem à diminuição da atividade antioxidante total dos extratos (Siracusa et al.,
2011).
Em estudo realizado com extratos de amoras, Liang et al. (2012) verificaram
que, o teor de antocianidinas diminuiu consideravelmente após a digestão
intestinal, mas a atividade antioxidante manteve-se elevada. Estes autores
sugerem que os compostos fenólicos gerados a partir da degradação das

124
antocianidinas em ambiente intestinal possuam, igualmente, atividade antioxidante
(Liang et al., 2012).
Ensaios realizados em sucos de vegetais por Wootton-Beard et al. (2011)
mostraram resultados contraditórios. Pôde-se observar estabilidade relativa na
atividade antioxidante de alguns sucos ao longo do processo digestivo, mas
também observou-se que outros sucos obtiveram decréscimos na atividade
antioxidante total após a digestão (Wootton-Beard et al., 2011).

4.1.10 Fenóis Totais e Atividade Antioxidante in vitro

A análise de fenóis totais é importante por ser o primeiro indicativo quanto ao

possível potencial antioxidante de um extrato, pois, a funcionalidade de frutas está
intimamente relacionada com a presença dos compostos fenólicos. Logo, uma alta
concentração de fenóis aumentará as chances de um maior potencial antioxidante
(MALTA, 2011).
A medida de capacidade antioxidante reflete a ação cumulativa de todos os
antioxidantes presentes em um extrato ou amostra biológica proporcionando,
desta forma, uma análise de parâmetros integrados. A capacidade antioxidante
pode ser considerada um marcador sensível e confiável para detectar mudanças
no estresse oxidativo in vivo, fornecendo ajuda na elucidação de fatores
fisiológicos e nutricionais importantes, e ainda, suprindo informações sobre
absorção e biodisponibilidade de compostos antioxidantes (GHISELLI et al., 2000)
Para este estudo, utilizaram-se curvas padrões de Ácido Gálico (y =
0,0023x + 0,0208 e R2 = 0,9952) na determinação de Fenóis Totais (Figura 32,
item i), de Trolox na determinação de DPPH-Trolox, com equação y = 2,8295x -
1,9601 e R² = 0,9986 (Figura 32, item ii), para a determinação de TEAC, utilizou-
se uma curva padrão de Trolox com equação y = 0,5388x + 1,2175 e R² = 0,9965
(Figura 32, item iii) e na determinação de ORAC, uma curva padrão de Trolox com
equação y = 0,346x + 12,796 e R² = 0,9944 (Figura 32, item iv). A curva de

125
decaimento de fluorescência do Trolox, do método ORAC, encontra-se
demonstrada na Figura 33.

(i) (ii)

(iii) (iv)

Figura 32: Curva Padrão: (i) de Ácido Gálico para determinação de Fenóis Totais; (ii) de Trolox
para a análise DPPH-Trolox; (iii) de Trolox para a análise TEAC e (iv) de Trolox para a análise de
ORAC.

126
 Figura 33: Curva de decaimento de fluorescência do Trolox para o ensaio ORAC.

Determinaram-se também os potenciais antioxidantes, no ensaio ORAC,

para alguns padrões antioxidantes (Tabela 22).

Tabela 22: Quantificação de ORAC para alguns padrões antioxidantes.

PADRÃO µM TE/µM de padrão

Catequina 6,12±0,51

Quercetina 4,52±0,60

Ác. Clorogênico 8,69±0,01

Os valores referem-se à média de três determinações ± desvio padrão.

Os resultados obtidos para a quantificação de Fenóis Totais e Atividade

Antioxidante (métodos DPPH-Trolox, TEAC e ORAC) dos extratos aquosos das
bebidas frescas e liofilizadas (antes e após digestão in vitro) das BMFHs (1) e (2),
estão na Tabela 23 e das frutas e hortaliças (extratos aquosos e etanólicos das
bebidas frescas e liofilizadas) utilizadas nas BMFHs (1) e (2), estão na Tabela 24
(Fenóis Totais e DPPH-Trolox) e na Tabela 25 (TEAC e ORAC).

127
Tabela 23: Quantificação de Fenóis Totais (mg GAE/g amostra úmida), DPPH-Trolox , TEAC e
ORAC (µmol Trolox equiv./g amostra úmida) das formulações frescas e liofilizadas (digerida ou
não).

AMOSTRA

BMFH (1) BMFH (2)

ANÁLISE
Liofilizada Liofilizada
Fresca Fresca
SD AD SD AD
a,A a,B,β A,á b,B a,A,β A,á
Fenóis Totais 2,29±0,40 2,58±0,05 57,81±2,02 1,27±0,03 2,73±0,07 55,29±1,84

b,A a,A,á A,â b,B a,A,á A,â

DPPH-Trolox 0,86±0,05 1,14±0,09 0,05±0,01 0,71±0,06 1,07±0,13 0,05±0,01

b,A a,A,β A,á b,B a,B,β B,á

TEAC 0,43±0,02 0,85±0,03 1,38±0,08 0,24±0,03 0,71±0,01 0,01±0,00

b,B a,A,β A,á a,A b,B,β A,á

ORAC 6,55±0,32 10,39±1,62 17,37±1,71 10,53±0,99 6,04±0,66 19,73±5,29

Os valores referem-se à média de três determinações ± desvio padrão. Análise estatística pelo método Tukey, com
p<0,05. Letras minúsculas foram usadas para avaliar o efeito da liofilização para cada amostra, através da
comparação horizontal entre sua forma fresca e liofilizada (SD). Letras maiúsculas utilizadas na comparação das
amostras BMFH (1) e (2): entre as formas frescas ou entre formas liofilizadas (SD) ou entre as formas liofilizadas
(AD). Letras gregas foram utilizadas avaliação do efeito da digestão através da comparação entre as amostras
liofilizadas (SD) e (AD).
Legenda: SD = Sem Digestão e AD = Após Digestão

128
Tabela 24: Quantificação de Fenólicos Totais (extrato metanólico) e determinação de DPPH-Trolox (extratos aquosos e etanólicos) de frutas
e hortaliças nas formas fresca e liofilizada.

FENÓIS TOTAIS DPPH-TROLOX

(mg GAE/g amostra úmida) (ìmol Trolox Equiv./g amostra úmida)
AMOSTRA
EXTRATO METANÓLICO EXTRATO AQUOSO EXTRATO ETANÓLICO

Fresca Liofilizada Fresca Liofilizada Fresca Liofilizada

FRUTAS
b,F a,D a,D,E,á b,F,á a,E,â b,G,â
Banana Nanica 0,69±0,17 11,76±0,78 0,35±0,05 0,07±0,00 0,15±0,01 0,02±0,00
b,C a,D a,C,á b,A,á a,D,â a,A,â
Laranja Pera 2,35±0,14 12,69±0,87 1,06±0,09 0,52±0,01 0,35±0,06 0,34±0,03
b,G a,F a,C,á b,D,á a,C,á b,D,E,â
Limão Tahiti 0,08±0,01 0,77±0,18 1,01±0,06 0,11±0,01 1,21±0,10 0,08±0,01
b,C,D a,E a,D,á b,E,â a,D,á b,B,á
Maçã Fuji 1,99±0,55 4,49±0,04 0,57±0,03 0,08±0,01 0,37±0,14 0,16±0,01
b,D.E a,C a,C,á b,G,á a,B,á b,E,F,á
Manga Palmer 1,52±0,21 19,27±1,44 1,16±0,12 0,05±0,00 1,39±0,07 0,07±0,01
b,E,F a,E,F a,E,â b,I,á a,D,á b,F,G,â
Pera Wilians 1,12±0,34 3,03±0,23 0,06±0,00 0,03±0,00 0,31±0,03 0,04±0,00

HORTALIÇAS
a,C.D a,E,F a,D,E,á b,H,â a,D,E,á b,G,á
Couve-flor 1,86±0,34 2,06±0,12 0,30±0,01 0,02±0,00 0,29±0,12 0,03±0,00
b,A a,B a.A,á b,C,á a,A,â b,F,G,â
Couve Manteiga 8,06±0,02 51,76±2,65 3,07±0,12 0,12±0,01 1,87±0,16 0,04±0,00
b,B a,A a,B,á b,B,á a,D,â b,C,â
Hortelã 3,82±0,42 105,42±1,62 2,53±0,48 0,15±0,01 0,40±0,06 0,12±0,01
a,E a,F a,D,E,á b,H,â a,E,á b,C,D,á
Repolho branco 1,25±0,08 1,34±0,05 0,15±0,00 0,02±0,00 0,14±0,01 0,10±0,01

Os valores referem-se à média de três determinações ± desvio padrão. Análise estatística pelo método Tukey, com p<0,05. As análises dos resultados foram feitas
para cada método, onde as letras minúsculas foram usadas na avaliação do efeito da liofilização de cada amostra na comparação horizontal dos extratos aquosos
ou etanólicos entre suas formas fresca e liofilizada. Letras maiúsculas foram usadas na avaliação do potencial entre as amostras, em cada método e solvente de
extração, através da comparação vertical dos extratos, metanólico, aquoso ou etanólico (para sua forma fresca ou para a forma liofilizada). As letras gregas foram
utilizadas na avaliação da influência do solvente utilizado na extração através da comparação horizontal entre as formas frescas ou entre as liofilizadas, apenas para
o ensaio de DPPH-Trolox, pois a extração utilizada na determinação de Fenóis Totais é metanólica, de acordo com metodologia descrita anteriormente.

129
Tabela 25: Determinação de TEAC e ORAC de frutas e hortaliças (extratos aquosos e etanólicos das formas frescas e liofilizadas).

TEAC ORAC
(ìmol TE/g amostra úmida) (ìmol TE/g amostra úmida)
AMOSTRA
EXTRATO AQUOSO EXTRATO ETANÓLICO EXTRATO AQUOSO EXTRATO ETANÓLICO
Fresca Liofilizada Fresca Liofilizada Fresca Liofilizada Fresca Liofilizada

FRUTAS
Banana Nanica 0,42±0,02b,E,F,α 0,70±0,05a,B,α 0,37±0,01a,D,β 0,21±0,01b,E,β 3,49±0,43b,D,β 5,32±0,23a,C,α 4,78±0,16a,G,H,α 1,34±0,03b,D,β

Laranja Pera 0,94±0,07a,D,α 0,47±0,03b,D,α 0,90±0,08a,D,α 0,49±0,01b,D,α 11,48±0,24a,C,β 2,71±0,15b,C,D,β 24,15±0,32b,C,α 28,42±2,30a,A,α

Limão Tahiti 0,38±0,02b,E,F,β 0,47±0,01a,D,β 0,53±0,01b,D,α 0,78±0,02a,B,C,α 1,58±0,19a,D,α 1,68±0,09a,D,α 1,32±0,18a,H,β 1,04±0,10a,D,β

Maçã Fuji 0,39±0,03b,E,F,β 0,62±0,04a,C,α 0,68±0,03a,D,α 0,43±0,05b,D,β 2,20±0,20a,D,β 2,66±0,31a,C,D,β 12,70±1,44a,D,α 4,86±0,31b,C,α

Manga Palmer 1,45±0,15a,C,β 0,45±0,03b,D,E, 3,63±0,11a,C,α 0,71±0,01b,C,α 3,18±0,39a,D,α 1,37±0,09b,D,α 3,54±0,16a,G,H,α 1,35±0,01a,D,α
β

Pera Wilians 0,17±0,01b,F,β 0,41±0,02a,E,α 0,30±0,03a,D,α 0,19±0,01b,E,β 1,63±0,07a,D,β 1,42±0,02b,D,β 8,64±1,02a,E,F,α 7,24±0,12b,C,α

HORTALIÇAS
Couve-flor 0,98±0,10a,D,β 0,30±0,01b,F,α 1,44±0,07a,D,α 0,21±0,01b,E,β 5,24±0,14a,C,D,β 5,32±0,58a,C,α 5,42±0,12a,F,G,α 2,29±0,08b,D,β

Couve Manteiga 4,71±0,28a,A,β 0,96±0,01b,A,α 8,76±0,27a,B,α 0,86±0,05b,B,β 26,79±7,22b,B,β 54,52±2,99a,A,α 46,29±4,30a,A,α 6,55±0,12b,C,β

Hortelã 2,12±0,04a,B,β 0,47±0,01b,D,β 12,42±1,51a,A,α 3,62±0,16b,A,α 55,28±3,98a,A,β 16,06±1,70b,B,β 42,18±1,93a,B,α 20,49±1,79b,B,α

b,D,E,α a,D,β
Repolho branco 0,59±0,03a,E,α 0,45±0,06 0,31±0,01 0,15±0,01b,E,β 4,12±0,33a,D,β 1,67±0,01b,D,β 10,28±0,68a,D,E,α 2,03±0,22b,D,α

Os valores referem-se à média de três determinações ± desvio padrão. Análise estatística pelo método Tukey, com p<0,05. As análises dos resultados foram feitas
para cada método, onde as letras minúsculas foram usadas na avaliação do efeito da liofilização de cada amostra na comparação horizontal dos extratos aquosos
ou etanólicos entre suas formas fresca e liofilizada. Letras maiúsculas foram usadas na avaliação do potencial entre as amostras através da comparação vertical dos
extratos aquoso ou etanólico (para sua forma fresca ou para a forma liofilizada). As letras gregas foram utilizadas na avaliação da influência do solvente utilizado na
extração através da comparação horizontal entre as formas frescas ou entre as liofilizadas.

130
 • Fenóis Totais

Para o métodos Fenóis Totais, os valores variaram entre 1,27 ± 0,03 e 57,81
± 2,02 mg GAE/g amostra úmida, sendo o primeiro encontrado para a amostra
fresca da BMFH (2) e este último para a amostra digerida da BMFH (1).
Resultados de Fenóis Totais semelhantes aos obtidos pelas BMFHs não
digeridas (amostras frescas e liofilizadas) foram encontradas por Müller et al.
(2010) e Agbenorhevi & Marshall (2012). Ao quantificarem os teores de fenólicos
totais de amostras de smoothies, Müller et al. (2010) obtiveram valores entre 0,51
± 0,01 e 2,13 ± 0,02 mg GAE/g amostra, tanto para um smoothie composto
apenas de frutas ou por frutas e hortaliças. Já Agbenorhevi & Marshall (2012)
obtiveram valores entre 1,94 ± 0,07 e 2,69 ± 0,02 mg GAE/mL quando avaliaram 3
diferentes smoothies de frutas.
Os resultados para Fenóis Totais das amostras de frutas e hortaliças
variaram entre 0,08 ± 0,01 (limão fresco) e 105,42 ± 1,62 mg GAE/g (hortelã
liofilizada). Avaliando o potencial entre as amostras para a forma fresca, observa-
se os maiores valores de Fenóis Totais para a amostra couve (8,06 ± 0,02 mg
GAE/g), seguido de hortelã (3,82 ± 0,42) e laranja (2,35 ± 0,14 mg GAE/g). Já para
as amostras liofilizadas, maiores valores nas amostras de hortelã (105,42 ± 1,62
mg GAE/g), couve (51,76 ± 2,65 mg GAE/g) e manga (19,27 ± 1,44 mg GAE/g).
Entre as frutas, os maiores valores foram obtidos pelas amostras liofilizadas
de manga, laranja e banana, e entre as hortaliças, destacam-se a hortelã liofilizada
e as amostras fresca e liofilizada de couve.
Embora este método seja o mais utilizado para quantificação de compostos
fenólicos em alimentos, o reagente Folin-Ciocalteau é capaz de interagir com
outros compostos não fenólicos, o que pode resultar em valores superestimados
de fenólicos totais (VINSON et al., 2001).
De acordo com USDA (2010), para as mesmas amostras estudadas,
observou-se uma variação dos valores de Fenóis Totais entre 0,93 (couve-flor) e
7,26 mg GAE/g amostra (suco de laranja fresco). Os resultados apresentados pela
USDA foram os seguintes para as amostras: banana fresca (1,55 mg GAE/g),

131
sucos in natura de laranja (7,26 mg GAE/g) e limão (1,17 mg GAE/g), maçã Fuji
fresca e com casca (2,1 mg GAE/g), manga fresca (1,01 mg GAE/g), cultivares
verdes de pera fresca e com casca (1,78 mg GAE/g), couve-flor (0,93 mg GAE/g),
hortelã fresca (6,9 mg GAE/g) e repolho fresco (2,02 mg GAE/g). Com exceção do
limão, manga, couve-flor e repolho, os resultados anteriormente apresentaram
teores de Fenóis Totais dentro dos valores obtidos pelas amostras estudadas
neste trabalho.
Wu et al. (2004) obtiveram em sua pesquisa os seguintes valores de Fenóis
Totais para as amostras frescas de banana (2,31 ± 0,60 mg GAE/g), laranja (3,37
± 0,39 mg GAE/g), maçã (2,11 ± 0,32 mg GAE/g), manga (2,66 mg GAE/g), pera
(2,20±0,18 mg GAE/g), couve-flor (2,74 mg GAE/g) e repolho (2,03±0,31 mg
GAE/g). Exceto para as amostras de couve-flor e repolho, pois apresentaram
valores maiores do que os observados, todas as outras amostras estudadas por
Wu et al. apresentam resultados de fenólicos totais dentro da variação obtida por
este estudo.
Os resultados de Fenóis Totais de frutas tropicais obtidos no estudo de
Mahattanatawee et al. (2006), variaram entre 0,21 e 2,32 mg GAE/g de purê,
sendo que estes valores estão dentro dos resultados encontrados neste estudo
para as frutas avaliadas.
Dentre outras amostras estudadas, Ciéslik et al. (2006) obtiveram valores de
Fenóis Totais de laranja (2,17 mg GAE/g) e repolho (1,08 mg GAE/g) semelhantes
aos obtidos para as mesmas amostras neste estudo.
Brat et al., também em 2006, avaliaram diversas frutas e vegetais, entre eles,
os de interesse para esse estudo foram banana (0,52 mg GAE/g), laranja (entre
0,27 e 0,37 mg GAE/g), maçã (entre 0,90 e 3,00 mg GAE/g), pera (entre 0,41 e
1,48 mg GAE/g), manga (0,68 mg GAE/g), limão (entre 0,35 e 0,55 mg GAE/g) e
couve-flor (0,13 mg GAE/g). Resultados semelhantes entre este estudo e os
apresentados por Brat et al. (2006) foram obtidos para as amostras de banana,
limão, maçã e pera, mas as amostras laranja, manga e couve-flor têm menores
valores de fenólicos totais do que os obtidos neste estudo.

132
 Amorim et al. (2007) obteve média de 0,47 mg GAE/g de amostra para
amostras de banana, variando de 0,22 mg GAE/g (triploide Ambei) a 1,21 mg
GAE/g (diploide Khai). Cohen et al. (2009) obtiveram uma média de 0,37 mg
GAE/g, para os teores de polifenóis totais entre os 26 acessos de bananeira, com
variação de 0,13 mg GAE/g (Mambee thu) a 1,21 mg GAE/g (Khai). Em 2011,
Amorim et al. obtiveram média para os teores de polifenóis totais entre os 61
acessos de banana foi de 0,38 mg GAE/g, com variação de 0,12 mg GAE/g
(triploide Torp) a 2,58 mg GAE/g (tetraploide Teparod). Os resultados de fenólicos
totais obtidos neste estudo para as amostras frescas e liofilizadas de banana
ficaram acima das médias observadas para as cultivares de banana demonstradas
anteriormente.
Dragoviæ-Uzelac et al. (2009), obtiveram em seu estudo com frutas e
vegetais, comumente consumidos na dieta croata, os seguintes resultados de
fenóis totais para as amostras frescas de laranja (1,28 ± 0,02 mg GAE/g), maçã
(0,57 ± 0,02 mg GAE/g), pera (0,41 ± 0,03 mg GAE/g), couve (1,04 ± 0,12 mg
GAE/g) e couve-flor (0,65 ± 0,05 mg GAE/g). Comparando os resultados com os
obtidos nesse estudo, pode-se observar que todas as amostras apresentaram
quantificação de fenólicos totais superiores aos encontrados por Dragoviæ-Uzelac
et al. (2009).
Dentre as análises realizadas por Faller & Fialho (2009), estimou-se o teor de
Fenóis Totais de 12 alimentos de maior consumo no Brasil (seis frutas e seis
hortaliças), entre os quais, os de maior interesse neste estudo, e seus respectivos
teores de Fenóis Totais, são: banana (2,15 ± 0,04 mg GAE/g), laranja (1,15 ± 0,01
mg GAE/g), manga (1,12 ± 0,10 mg GAE/g) e repolho (0,67 ± 0,17 mg GAE/g),
sendo que, apenas a banana obteve resultados similares e as outras 3 amostras
se apresentaram abaixo dos resultados obtidos neste estudo.
Mélo et al. (2006) também avaliaram diversas frutas e hortaliças em relação
ao conteúdo de polifenóis totais, entre elas: bananas ‘Comprida’ (0,45 mg
Catequina Equiv./g) e ‘Pacovan' (0,52 mg Catequina Equiv./g), couve-flor (0,88 mg
Catequina Equiv./g), repolho verde (0,47 mg Catequina Equiv./g), mangas rosa

133
(0,72 mg Catequina Equiv./g) e espada (0,61 mg Catequina Equiv./g) e laranja
(0,92 mg Catequina Equiv./g). Melo et al. (2008) estudaram o teor de fenólicos
totais em diversas frutas, entre elas laranja (0,67 ± 0,02 mg Catequina equiv./mL
extrato), mangas espada (0,26 ± 0,01 mg Catequina Equiv./mL extrato) e rosa
(0,26 ± 0,01 mg Catequina Equiv./mL extrato). Apesar de ambos os autores, Mélo
et al. (2006) e Melo et al. (2008), terem estudado frutas e hortaliças avaliadas
neste estudo, seus resultados não podem ser comparados pois estão baseados
em uma curva padrão de Catequina, diferentemente da curva utilizada neste
trabalho (padrão Ác. Gálico) para a determinação de Fenóis Totais.
Há grande variação no conteúdo de fenólicos encontrado em diferentes
frutas ou vegetais, ou até para as mesmas frutas ou em vegetais avaliados em
diferentes estudos (BALASUNDRAM et al., 2006). O conteúdo de fenólicos de
plantas depende de fatores intrínsecos (gênero, espécie, cultivar, maturação,
estágio de crescimento) e extrínsecos (origem geográfica, condições ambientais e
de cultivo, condições de colheita, manejo e processo de armazenamento)
(TOMÁS-BARBERAN & ESPÍN, 2001; SOARES, 2008).

• DPPH-Trolox

Para o ensaio de DPPH-Trolox, houve uma variação entre 0,05 ± 0,01 (para
as duas BMFHs digeridas) e 1,14 ± 0,09 ìmol TE/g amostra úmida (BMFH (1)
liofilizado antes da digestão).
Os resultados das amostras de frutas e hortaliças analisadas no ensaio de
DPPH-Trolox variaram entre 0,02 ± 0,00 (extrato aquoso do repolho branco
liofilizado) e 3,07 ± 0,12 ìmol TE/g amostra úmida (extrato aquoso de couve
manteiga fresca). Deve ser dado destaque, entre as frutas, para os extratos
etanólico (1,39 ± 0,07 ìmol TE/g) e aquoso (1,16 ± 0,12 ìmol TE/g) da manga
fresca, e extrato etanólico de limão fresco (1,21 ± 0,10 ìmol TE/g), e entre as
hortaliças para os extratos aquoso (3,07 ± 0,12 ìmol TE/g) e etanólico (1,87 ± 0,16
ìmol TE/g) da couve fresca, e extrato aquoso da hortelã fresca (2,53 ± 0,48 ìmol

134
TE/g).
Avaliando o potencial entre as amostras através da comparação vertical,
obtiveram-se os maiores valores, quando avaliados os extratos aquosos das
amostras frescas, para couve (3,07 ± 0,12 ìmol TE/g), seguido de hortelã (2,53 ±
0,48 ìmol TE/g), para as amostras liofilizadas, laranja (0,52 ± 0,01 ìmol TE/g),
hortelã (0,15 ± 0,01 ìmol TE/g) e couve (0,12 ± 0,01 ìmol TE/g). Já para os extratos
etanólicos, maiores valores das amostras frescas obtidas pela couve (1,87 ± 0,16
ìmol TE/g), manga (1,39 ± 0,07 ìmol TE/g) e limão (1,21 ± 0,10 ìmol TE/g), e para
as amostras liofilizadas laranja (0,34 ± 0,03 ìmol TE/g) e maçã (0,16 ± 0,01 ìmol
TE/g).
Apenas como base de comparação, pois apresentam diferentes variedades e
solventes extratores, os dados obtidos neste estudo foram comparados
observados por Kevers et al. (2007) e por Dragoviæ-Uzelac et al. (2009). Menores
valores do que os obtidos por Kevers et al. (2007) foram encontrados para
amostras frescas de banana (5,23 ± 0,84 ìmol TE/g), limão (3,04 ± 0,40 ìmol TE/g),
maçã var. ‘Jonagold’ (0,92 ± 0,24 ìmol TE/g), laranja (2,24 ± 0,08 ìmol TE/g) e pera
var. ‘Conference’ (1,40 ± 0,04 ìmol TE/g), e valores aproximados aos obtidos por
Dragoviæ-Uzelac et al. (2009), para amostras frescas de laranja (9 ìmol TE/g),
maçã var. ‘Idared’ (9 ìmol TE/g), couve-flor var. ‘Favola’ (8,2 ìmol TE/g) e couve
var. ‘Melissa’ (7,2 ìmol TE/g).

• TEAC

O TEAC apresentou uma variação dos resultados entre 0,01 ± 0,00 (BMFH
(2) digerida) e 1,38 ± 0,08 ìmol TE/g amostra úmida (BMFH (1) digerida).
Dentre os smoothies analisados por Müller et al. (2010), os maiores valores
TEAC foram medidos nos smoothies contendo morangos com quase ou acima de
10 ìmol TE/g. Os outros smoothies compostos de frutas e hortaliças mostraram
capacidades antioxidantes inferiores a 6-8 ìmol TE/g sem qualquer correlação com
os frutos utilizados. Os resultados obtidos para as amostras avaliadas neste

135
estudo, BMFHs (1) e (2), apresentaram valores de TEAC abaixo dos obtidos por
Müller, o que pode ser explicado pelo alto conteúdo de vitamina C apresentado
nas amostras avaliadas por este autor.
Os resultados de TEAC para as frutas e hortaliças analisadas variaram entre
0,15 ± 0,01 (extrato etanólico do repolho liofilizado) e 12,42 ± 1,51 ìmol TE/g
amostra úmida (extrato etanólico de hortelã fresco). Entre as frutas, estão em
destaque os extratos etanólico (3,63 ± 0,11 ìmol TE/g) e aquoso (1,45 ± 0,15 ìmol
TE/g) de manga fresca, e extratos aquoso (0,94 ± 0,07 ìmol TE/g) e etanólico (0,90
± 0,08 ìmol TE/g) da laranja fresca, já entre as hortaliças, os extratos etanólico da
hortelã fresca (12,42 ± 1,51 ìmol TE/g) e os etanólicos (8,76 ± 0,27 ìmol TE/g) e
aquosos (4,71 ± 0,28 ìmol TE/g) da couve fresca, detêm os maiores valores.
Na avaliação do potencial entre as amostras, maiores valores,
estatisticamente significativos, foram encontrados para os extratos aquosos nas
amostras frescas de couve (4,71 ± 0,28 ìmol TE/g), hortelã (2,12 ± 0,04 ìmol TE/g)
e manga (1,45 ± 0,15 ìmol TE/g) e nas amostras liofilizadas de couve (0,96 ±
0,01), banana (0,70 ± 0,05 ìmol TE/g) e maçã (0,62 ± 0,04 ìmol TE/g). Para os
extratos etanólicos, maiores valores foram obtidos para as amostras frescas e
liofilizadas de hortelã (respectivamente 12,42 ± 1,51 e 3,62 ± 0,16 ìmol TE/g) e
couve (8,76 ± 0,27 e 0,86 ± 0,05 ìmol TE/g).
Pellegrini et al. (2003) realizaram a análise da capacidade antioxidante in
vitro de diversas frutas, hortaliças, bebidas e óleos consumidos na Itália. As
amostras de interesse neste estudo e seus respectivos resultados para o método
TEAC são os seguintes: couve-flor (1,10 ìmol TE/g), maçã var. ‘Golden’ (1,59 ìmol
TE/g), banana (0,64 ìmol TE/g), laranja (8,64 ìmol TE/g) e pera (2,19 ìmol TE/g).
Resultados similares foram encontrados neste estudo para as amostras de banana
e couve-flor, sendo que todas as outras amostras apresentaram-se abaixo do
encontrado por Pellegrini et al. (2003).

136
 • ORAC

Para o ORAC, os resultados estão entre 6,04 ± 0,66 (BMFH (2) liofilizada) e
19,73 ± 5,29 ìmol TE/g amostra úmida (BMFH (2) digerida).
Resultados semelhantes foram encontrados para as amostras avaliadas por
Müller et. al (2010), com resultados de ORAC variando entre 7,9 ± 0,5 e 38,6 ± 1,0
ìmol TE/g para amostras de smoothies compostos por frutas e hortaliças.
Os resultados de ORAC para as frutas e hortaliças analisadas variaram entre
1,04 ± 0,10 (extrato etanólico de limão liofilizado) e 55,28 ± 3,98 ìmol TE/g amostra
úmida (extrato aquoso de hortelã fresca). Entre as amostras de frutas, destacam-
se os extratos etanólicos de laranja liofilizada (28,42 ± 2,30 ìmol TE/g amostra
úmida) e fresca (24,15 ± 0,32 ìmol TE/g amostra úmida), de maçã fresca (12,70 ±
1,44 ìmol TE/g amostra úmida) e extrato aquoso de laranja fresca (11,48 ± 0,24
ìmol TE/g amostra úmida). Entre as hortaliças, encontraram-se os maiores valores
para o método ORAC, com destaque para os extratos aquosos (55,28 ± 3,98 ìmol
TE/g amostra úmida) e etanólicos (42,18 ± 1,93 ìmol TE/g amostra úmida) de
hortelã fresca e extratos aquoso (54,52 ± 2,99 ìmol TE/g amostra úmida) e
etanólico (46,29 ± 4,30 ìmol TE/g amostra úmida) de couve liofilizada e fresca,
respectivamente.
Avaliando-se o potencial entre os extratos, através da comparação vertical
entre as formas frescas ou liofilizadas das amostras, podem-se observar maiores
valores significativos para os extratos aquosos das amostras frescas de hortelã
(55,28 ± 3,98 ìmol TE/g amostra úmida), couve (26,79 ± 7,22 ìmol TE/g amostra
úmida) e laranja (11,48 ± 0,24 ìmol TE/g amostra úmida) e das amostras
liofilizadas de couve (54,52 ± 2,99 ìmol TE/g amostra úmida) e hortelã (16,06 ±
1,70 ìmol TE/g amostra úmida). Entre os extratos etanólicos, maiores valores
também foram encontrados para as amostras frescas de couve (46,29 ± 4,30 ìmol
TE/g amostra úmida), hortelã (42,18 ± 1,93 ìmol TE/g amostra úmida) e laranja
(24,15 ± 0,32 ìmol TE/g amostra úmida) e para as amostras liofilizadas de laranja
(28,42 ± 2,30 ìmol TE/g amostra úmida) e hortelã (20,49 ± 1,79 ìmol TE/g amostra
úmida).

137
 Wang et al. (1996) analisaram a atividade antioxidante total pelo método
ORAC de 12 frutas e 5 sucos de frutas comerciais. Os resultados obtidos por este
autor para as amostras laranja (7,50 ± 1,01 ìmol TE/g), banana (2,21 ± 0,19 ìmol
TE/g), maçã (2,18 ± 0,35 ìmol TE/g) e pera (1,34 ± 0,15 ìmol TE/g), se mostraram
similares aos obtidos neste estudo.
Wu et al. (2004) avaliaram a determinação da capacidade antioxidante de
diversas frutas e hortaliças através do método ORAC. As amostras de interesse
para este estudo e seu valor de ORAC são os seguintes: maçã ‘Fuji’ (25,93 ìmol
TE/g), bananas (8,79 ìmol TE/g), manga (10,02 ìmol TE/g), laranja (18,14 ìmol
TE/g), cultivar verde de pera (19,11 ìmol TE/g), couve-flor (6,47 ìmol TE/g) e
repolho (13,59 ìmol TE/g). Comparando-se estes resultados com os obtidos neste
trabalho, pode-se observar que, entre as amostras estudadas, apenas o resultado
de ORAC da laranja está entre os valores encontrados neste estudo, sendo que
para todas as outras amostras, os resultados apresentaram valores superiores.
Os resultados de ORAC de frutas tropicais crescidas na Florida CA-USA,
obtidos no estudo de Mahattanatawee et al. (2006), variaram entre valores
menores que 0,1 a 16,7 ìmol TE/g de purê, estando dentro do obtido para as
amostras de frutas avaliadas neste estudo.
Kevers et al. (2007) determinaram a atividade antioxidante de diversas frutas
e hortaliças. As amostras de interesse neste estudo e seus respectivos resultados
de ORAC são: amostras frescas de banana (7,83 ± 2,56 ìmol TE/g), limão (8,43 ±
1,96 ìmol TE/g), maçã var. ‘Jonagold’ (11,39 ± 1,04 ìmol TE/g), laranja (13,18 ±
2,92 ìmol TE/g) e pera var. ‘Conference’ (5,19 ± 1,32 ìmol TE/g). Resultados
similares aos encontrados neste estudo foram obtidos para as amostras de
laranja, maçã e pera, já para as amostras de banana e limão demonstraram-se
abaixo dos valores obtidos por este autor.
A USDA (2010) apresenta, no Release 2, alguns dos resultados encontrados
na literatura para o conteúdo de ORAC obtidos para as amostras de frutas e
hortaliças estudadas. Comparando-se os valores ORAC, pode-se observar que os
valores obtidos por outros autores foram maiores que os resultados obtidos neste

138
estudo para 78% das amostras avaliadas. Estes resultados foram até 4,7 vezes
maiores, quando avaliadas as amostras de banana fresca (1,6 vezes), maçã fresca
e com casca (4,7 vezes), manga fresca (3,5 vezes), cultivares verdes de pera
fresca com casca (2,3 vezes), couve-flor (1,6 vezes) e hortelã fresca (2,4 vezes).
Já as amostras restantes obtiveram comportamento diferente, no qual o suco de
laranja fresca apresentou resultados de ORAC até 1,6 vezes menores, e o repolho
fresco, obteve valores dentro do encontrado neste estudo.
Estas diferenças podem ser devido à complexidade dos grupos de
compostos antioxidantes e/ou aos métodos de extração empregados, além disso,
o conteúdo destes compostos na planta varia entre o gênero, espécie, cultivar,
maturação, origem, condições ambientais, de cultivo, colheita, manejo,
armazenamento, entre outros.

• Fenólicos Totais e Capacidade Antioxidante das BMFHs: Resultados

Esperados versus Resultados Obtidos

A partir dos dados experimentais obtidos pelas amostras frescas e liofilizadas

de cada vegetal e da proporção de cada um nas BMFHs, calcularam-se os
resultados presumidos dos teores de Fenóis Totais e Atividade Antioxidante
(métodos DPPH-Trolox, TEAC e ORAC), demonstrado na Tabela 26. Para o
cálculo dos resultados esperados e as comparações destes com os dados
experimentais, foram utilizados os extratos metanólicos, para a análise de
fenólicos totais, e os extratos aquosos, para os métodos de atividade antioxidante.

139
 Tabela 26: Resultados presumidos de Fenóis Totais (mg GAE/g amostra úmida),
DPPH-Trolox , TEAC e ORAC (µmol TE/g amostra úmida) das formulações frescas e
liofilizadas.

BMFH (1) BMFH (2)

ANÁLISE
Fresca Liofilizada Fresca Liofilizada

Fenóis Totais 2,20 19,52 1,86 11,64

DPPH-Trolox 1,17 0,19 0,72 0,12
TEAC 1,41 0,55 0,90 0,51
ORAC 8,18 7,54 5,37 4,96

Comparando-se as Tabelas 23 e 24 (quantificação de Fenóis Totais, DPPH-

Trolox, TEAC e ORAC das formulações frescas e liofilizadas) e a Tabela 25
(resultados presumidos de Fenóis Totais, DPPH-Trolox, TEAC e ORAC das
formulações frescas e liofilizadas), pode-se observar que resultados
estatisticamente iguais foram obtidos para as amostras frescas de BMFH (1)
(Fenóis Totais) e BMFH (2) (DPPH-Trolox). Resultados estatisticamente menores
do que os presumidos foram obtidos para as amostras de BMFH (1) frescas, nos
métodos DPPH-Trolox, TEAC e ORAC, e liofilizadas, para Fenóis Totais, e também
para a BMFH (2) fresca e liofilizada, nos métodos de Fenóis Totais e TEAC.
Comportamento contrário, resultados estatisticamente maiores, foi observado para
a amostra liofilizada de BMFH (1) (métodos DPPH-Trolox, TEAC e ORAC) e
BMFH (2) fresco (ORAC) e liofilizado (DPPH-Trolox e ORAC).
Pode-se supor que as diferenças encontradas neste estudo entre os valores
experimentais e os preditos são resultado do processamento e dos procedimentos
para a preservação das BMFHs, pois estes fatores podem ser responsáveis tanto
pelo aumento quanto pelo decréscimo da ação antioxidante. Estas mudanças
dependem de muitos fatores, tais como: estrutura química dos compostos
bioativos, potencial de oxirredução, sua localização na matriz e possíveis
interações com outros componentes do alimento (NICOLI et al., 1999).

140
 • Efeito da Liofilização no Teor de Compostos Bioativos

A liofilização é usada como uma alternativa para preservar a amostra, no

entanto, pode influenciar as propriedades antioxidantes das amostras processadas
(SHOFIAN et al., 2011). É também evidente que a composição de alguns
antioxidantes e a atividade antioxidante das amostras são afetadas pela liofilização
(CHANG et al., 2006).
Um segundo aspecto relacionado ao problema, diz respeito à influência da
água sobre a oxidação lipídica. Assim, a eliminação da água para evitar o
desenvolvimento de microrganismos pode acelerar a oxidação, tornando-se,
portanto, um problema para produtos desidratados. Esta influência depende não
só do teor de umidade, mas, principalmente da atividade da água presente. Os
efeitos da Aw sobre a oxidação dos lipídios, segundo Heildelbaugh & Karel (1970)
e Hurtado (1971), são irregulares: favorecendo-a ou reduzindo-a. Estes efeitos
anômalos, segundo Labuza et al. (1972) parecem também ter importância em
termos de ação antioxidante.
Na comparação horizontal dos resultados de fenóis totais de cada amostra
entre suas formas frescas e liofilizadas (antes da digestão in vitro), não foi
observado efeito da liofilização para a amostra de BMFH (1), diferentemente do
que foi obtido para a amostra de BMFH (2), onde maior valor significativo foi
encontrado após a liofilização (2,73 ± 0,07 mg GAE/g amostra úmida). Avaliando-
se as frutas e hortaliças, pode-se observar que para todas as amostras houve um
aumento significativo do conteúdo de fenóis totais após a liofilização, entre 1,07 e
27,6 vezes, exceto para a couve-flor onde não houve diferença estatisticamente
significativa entre a amostra fresca e liofilizada.
Para ambas as BMFHs, observa-se um aumento significativo do valor de
DPPH-Trolox após a liofilização (1,14 ± 0,09 e 1,07±0,13 ìmol TE/g amostra
úmida, respectivamente para as BMFHs (1) e (2)). Já para os extratos das
amostras de frutas e hortaliças testadas houve diminuição significativa no
conteúdo de DPPH-Trolox após o processo de liofilização, exceto para os extratos
etanólicos de laranja, os quais não apresentaram diferença estatística entre as

141
amostras fresca e liofilizada.
Avaliando-se os resultados para o método TEAC após a liofilização,
observou-se um aumento em relação às amostras frescas, com resultados de 0,85
± 0,03 e 0,71 ± 0,01 ìmol TE/g amostra úmida, respectivamente para as BMFHs
(1) e (2). O mesmo comportamento foi observado nos extratos aquosos de
banana, limão, maçã, pera e para o extrato etanólico de limão. Comportamento
contrário, com uma diminuição significativa do valor de TEAC foi obtido em 75%
das amostras testadas, para extratos aquosos e etanólicos das amostras laranja,
manga, couve, couve-flor, hortelã e repolho e nos extratos etanólicos de banana,
maçã, pera.
Nora (2012) obteve maiores valores nos métodos antioxidantes para
amostras liofilizadas de Araçá Vermelho (TEAC e DPPH) e Guabiju (DPPH)
quando comparadas às amostras frescas e não houve diferença para o método
TEAC entre as amostras de Guabiju fresca e liofilizada. Sugeriu, assim, que este
aumento após a liofilização esteja relacionado à facilidade do contato com o
solvente durante a extração.
Guiné et al. (2011) obteve, em seu trabalho com liofilização de pepino, ligeira
redução dos resultados obtidos para o método TEAC, e a atribuiu a outros
compostos com atividade antioxidante que não os compostos fenólicos, já que não
observou variação nas concentrações de Fenóis Totais, quando comparadas as
amostras frescas e liofilizadas.
Avaliando o efeito da liofilização nos resultados de ORAC, são obtidos
comportamentos diferentes entre as amostras estudadas. Na BMFH (1) a
liofilização aumentou significativamente o valor de ORAC (10,39 ± 1,62 ìmol TE/g
amostra úmida), quando comparada com a sua forma fresca (6,55 ± 0,32 ìmol
TE/g amostra úmida). Um aumento do potencial, entre 1,17 e 2,04 vezes, também
foi observado nos extratos aquosos de banana, maçã e couve e dos extratos
etanólicos de laranja. Para a mostra BMFH (2) observou-se um comportamento
contrário, onde o maior valor foi obtido na sua forma fresca (10,53 ± 0,99 ìmol
TE/g amostra úmida), o que também ocorreu para 60% das amostras de frutas e

142
hortaliças testadas. Não houve diferenças significativas para os extratos aquosos
de limão e couve-flor e para os extratos etanólicos de manga e pera.
Os resultados obtidos neste estudo para o efeito da liofilização nos teores de
fenólicos totais e atividade antioxidante de frutas, hortaliças e das BMFHs
formulados, estão de acordo com as conclusões obtidas por Shofian et al. (2011).
A partir do seu estudo, Shofian afirma que a liofilização afeta significativamente a
composição de alguns outros componentes antioxidantes e atividade antioxidante
das frutas tropicais estudadas, apesar de ter obtido retenção da quantidade
máxima da ocorrência natural de ácido ascórbico.

• Influência do Solvente na Extração de Compostos Bioativos

A extração é um passo muito importante no isolamento, identificação e

utilização de compostos fenólicos e não existe nenhum método único e padrão de
extração (IGNAT et al., 2011). Os compostos fenólicos têm sido extraídos por
moagem, secagem ou liofilização de frutas, legumes e ervas ou apenas por
imersão de plantas frescas com subsequente extração por solvente (MERKEN &
BEECHER, 2000). Estas metodologias implicam a co-extração de substâncias
não-fenólicas, tais como açúcares, ácidos orgânicos e proteínas, o que requer
processos de purificação subsequentes (por exemplo, a extração em fase sólida, a
SPE) (CASTAÑEDA-OVANDO et al., 2009).
A eficiência da extração é conhecida por ser uma função das condições do
processo. Vários fatores afetam a concentração dos componentes desejados no
extrato: a temperatura, proporção líquido-sólido, a taxa de fluxo e o tamanho das
partículas. Entre extrações com etanol e metanol, uma multiplicidade de outros
solventes de extração tem sido utilizada na literatura (IGNAT et al., 2011).
Em particular, o metanol tem sido geralmente encontrado como mais eficaz
na extração de polifenóis com pesos moleculares inferiores, enquanto os
flavonóides de maior peso molecular são mais bem extraídos com solução aquosa

143
de acetona. O etanol é outro bom solvente para extração de polifenóis e é seguro
para consumo humano (METIVIER et al., 1980; SHI et al., 2005).
Pérez-Jimenez et al. (2008) ressaltam que, para a eficiência do processo de
extração, deve-se utilizar uma extração exaustiva, utilizando-se soluções de
solventes aquosos, com diferentes polaridades, de modo a extrair compostos com
diferentes estruturas químicas.
Normalmente, o procedimento de extração é sequencial e sistematicamente
liberta os compostos fenólicos de suas respectivas formas. Quando falamos de
ácidos fenólicos (ácidos livres ou ligados), o primeiro passo do processo envolve
tipicamente a utilização de um solvente orgânico aquoso, para extrair os ácidos
fenólicos solúveis/extraíveis (livres, ésteres solúveis, solúveis e glicosídeos)
(ESCARPA et al. , 2002; MATTILA & KUMPULAINEN, 2002; RUSSELL et al.,
2009).
Entre estes, a extração assistida por ultrassom é uma alternativa de baixo
custo, simples e eficiente entre as técnicas de extração convencionais (JING et al.,
2008). Este método descreve um procedimento para extração de compostos
orgânicos não-voláteis e semivoláteis, garantindo um contato íntimo da matriz da
amostra com o solvente de extração. Ultrassom é frequentemente usado para
melhorar a extração de lípidos, proteínas e compostos fenólicos de plantas (IGNAT
et al., 2011).
A variabilidade no teor total de fenólicos em diferentes extratos poderia ser o
resultado da solubilidade variável dos compostos fenólicos; esta variação na
solubilidade pode ser acionada pela polaridade do solvente (MARINOVA &
YANISHLIEVA, 1997). Materiais de plantas podem conter compostos fenólicos
variando de substâncias simples (por exemplo, ácidos fenólicos, antocianinas) à
altamente polimerizadas (por exemplo, taninos) em diferentes quantidades. Além
disso, compostos fenólicos também podem ser associados com outros
componentes da planta, tais como carboidratos e proteínas. Portanto, não há
nenhum procedimento de extração universal adequado para extração de todos os
compostos fenólicos de plantas. Os solventes, tais como metanol, etanol, acetona,

144
acetato de etila, e suas combinações têm sido utilizados para a extração de fenóis
a partir de materiais vegetais, frequentemente com diferentes proporções de água
(DAI & MUMPER, 2010).
Outro fator a ser considerado segundo Madsen et al. (1997) é o substrato
utilizado: antioxidantes polares são mais ativos em lipídios puros enquanto os
apolares em substratos polares. É o chamado “paradoxo polar” que confirma os
achados para tocoferóis e ácido ascórbico como antioxidante.
Na avaliação da influência do solvente utilizado na extração em relação ao
resultado de DPPH-Trolox, pode-se observar que não houve diferença significativa
entre os extratos aquosos e etanólicos das amostras frescas de Limão Tahiti,
maçã, Manga Palmer, Couve-flor e Repolho branco e das amostras liofilizadas de
manga Palmer. Maiores valores significativos foram encontrados para os extratos
aquosos das amostras frescas e liofilizadas de banana (respectivamente 0,346 ±
0,045 e 0,067 ± 0,001 ìmol TE/g amostra úmida), laranja (1,060 ± 0,091 e 0,521 ±
0,010), couve (3,072 ± 0,120 e 0,122 ± 0,010) e hortelã (2,534 ± 0,484 e 0,145 ±
0,010) e para o extrato etanólico da pera fresca (0,307 ± 0,029), e entre as
amostras liofilizadas foram encontrados os maiores valores para os extratos
aquosos de limão (0,107 ± 0,007) e pera (0,026 ± 0,001) e para os etanólicos de
maçã (0,160 ± 0,011), couve-flor (0,022 ± 0,002) e repolho (0,018 ± 0,000).
Anwar et al. (2013), tabém obteve resultados da atividade sequestradora de
radicais DPPH variando consideravelmente em relação os solventes de extração
estudados para a amostra de couve-flor.
Koksal & Gulcin (2008) e Llorach et al. (2003), compararam os solventes
etanol e água na extração de antioxidantes de couve-flor. Nos dois casos, o etanol
foi superior à água na extração do conteúdo de compostos fenólicos totais. Jaiwal
et al. (2012) também obtiveram melhores resultados na extração etanólica,
quando comparada à aquosa, ao quantificar compostos fenólicos e atividade
antioxidante (DPPH) presentes na casca de Diospyros melanoxylon Roxb.
Resultados diferentes foram obtidos por Jardini & Mancini Filho (2007) ao
avaliarem a atividade antioxidante dos extratos etéreo, alcoólico e aquoso obtidos

145
da polpa e das sementes da romã (Punica granatum, L.), obtendo os melhores
resultados para os extratos aquosos.
Para avaliar a influência do tipo de solvente na extração dos compostos
bioativos em relação ao ensaio de TEAC, compararam-se as formas frescas e as
formas liofilizadas entre cada solvente. A extração aquosa foi mais efetiva para as
amostras frescas e liofilizadas de banana e repolho e amostras liofilizadas de
maçã, pera, couve e couve-flor. Para as amostras frescas e liofilizadas de limão,
manga e hortelã, e para as amostras frescas de maçã, pera e couve-flor, a
extração etanólica obteve melhores resultados. Não houve diferença
estatisticamente significativa entre as extrações para as amostras frescas ou
liofilizadas de laranja Pera.
Diferentemente do que foi observado para algumas amostras deste estudo,
Vizzotto & Pereira (2011) relataram que a água pura como solvente extrator de
amora-preta não foi tão eficiente quando os demais solventes testados. De acordo
com Chirinos et al. (2007), o uso de água pura resulta em extratos com alta
impureza (ácidos orgânicos, açúcares, proteínas solúveis), podendo interferir na
quantificação destes compostos.
Avaliando os resultados obtidos por Chipault et al. (1956), pode-se observar
que também foi obtida uma variação da eficácia em função do solvente usado para
preparar os extratos antioxidantes.
A água, considerada o solvente universal, em combinação com outros
solventes orgânicos contribui para criar um meio moderadamente polar, o que
favorece a extração de polifenóis (LAPORNIK et al., 2005; LIYANA-PATHIRANA &
SHAHIDI, 2005b).
Anwar et al. (2013), com base nas tendências de seu estudo, sugeriram que
solventes orgânicos de base aquosa são superiores na recuperação de um
rendimento mais elevado de extração de componentes antioxidantes de couve-flor
e, portanto, pode ser considerado em estudos futuros de extração. No entanto, é
importante salientar que o rendimento de extração ótimo não pode traduzir a maior
atividade antioxidante; os solventes de base aquosa podem apenas solubilizar

146
uma maior gama de compostos, alguns dos quais podem ter pouca ou nenhuma
atividade antioxidante.
Analisando a influência do tipo de solvente na extração dos compostos
bioativos para a análise de ORAC, observa-se que 65% das amostras estudadas
obtiveram maiores valores (p<0,05) nos extratos etanólicos. Apenas para as
amostras frescas e liofilizadas de manga, não houve diferenças significativas entre
os solventes utilizados na extração. Já para as amostras frescas e liofilizadas de
limão e as amostras liofilizadas de couve e couve-flor, os maiores resultados foram
encontrados para os extratos aquosos.
Gonçalves et al. (2011) concluíram, através da avaliação dos resultados
obtidos no seu estudo, que a atividade antioxidante detectada por sistemas
complexos, tais como materiais vegetais, pode ser causada por várias classes de
componentes, pois existem outras famílias de substâncias presentes nos extratos
de interesse além dos compostos fenólicos (polares) que contribuem para a
eliminação de radicais livres (tais como terpenoides, carotenoides, tocoferóis,
entre outros) que estão influenciando na atividade antioxidante; e também pelo
sinergismo e interações entre eles a partir da mistura complexa, resultando em
uma atividade antioxidante dependente da composição do extrato.
Alguns estudos mostraram que o metanol e etanol foram os melhores
solventes de extração de compostos fenólicos a partir de materiais de plantas do
que solventes menos polares como acetona e hexano (ZARENA & SANKAR,
2009; MOHSEN & AMMAR, 2009).
De acordo com outro estudo, um solvente menos polar, tal como a acetona,
pode extrair mais compostos fenólicos das flores do que solventes mais polares,
como o metanol e água. Estas diferenças podem dever-se aos tipos de compostos
fenólicos em materiais vegetais. Em geral, um bom equilíbrio da polaridade, é
necessário na extração de compostos fenólicos de origem vegetal (LIU et al.,
2009; HORAX et al., 2010).
De acordo com os resultados obtidos em seu estudo, Stankovic et al. (2012)
afirmam que os compostos fenólicos de extratos dependem da parte da planta

147
utilizada na experiência e os solventes utilizados para a extração, e não apenas na
concentração de compostos fenólicos, mas também as propriedades destes
compostos contribuem para as atividades de diferentes extratos.

• Efeito da Digestão in vitro na Biodisponibilidade de Compostos

Bioativos

Um dos principais fatores que influenciam a biodisponibilidade é a estrutura

química do composto. Nos alimentos, a maioria dos polifenóis existe como
polímeros ou em formas glicosiladas: o grupo açúcar é conhecido como o glicona
e o grupo sem açúcar (o polifenol) é conhecida como a aglicona. Nestas formas
nativas os polifenóis não podem ser absorvidos e têm de ser hidrolisados pelas
enzimas intestinais ou pela microflora do cólon antes da absorção. A estrutura
química específica dos polifenóis, bem como o tipo de açúcar no glicosídio
determina a sua taxa e extensão de absorção intestinal (D'ARCHIVIO et al., 2010).
Outro fator que afeta a biodisponibilidade é representado pela interação com
outros compostos. A capacidade dos polifenóis e seus metabólitos ligarem-se às
proteínas deve ser considerada ao determinar a bioatividade geral. Além disso, as
interações com outros compostos fenólicos com mecanismos semelhantes de
absorção podem influenciar a biodisponibilidade dos polifenóis (D'ARCHIVIO et al.,
2010).
Comparando-se apenas as amostras digeridas, entre as BMFHs (1) e (2),
observou-se para o método TEAC, que os maiores valores foram obtidos pela
amostra BMFH (1) (1,38 ± 0,08 ìmol TE/g amostra úmida). Não houve diferença
estatisticamente significativa entre as amostras nos ensaios de Fenóis Totais,
DPPH-Trolox e ORAC.
O aumento da biodisponibilidade dos compostos antioxidantes, após a
digestão in vitro, pode ser observado para as BMFHs (1) e (2) nos métodos Fenóis
Totais (aumento entre 20 e 23 vezes) e ORAC (entre 1,3 e 4,7 vezes), e para a
amostra BMFH (1) no método TEAC (em média 1,5 vezes). Comportamento

148
diferenciado, com a redução nos valores após a digestão, ocorreu para as duas
amostras no método DPPH-Trolox (redução entre 15 e 30 vezes) e na amostra
BMFH (2) no método TEAC (em média 70 vezes).
Akillioglu & Karakaya (2010) também concluíram, através de seus resultados,
que a digestão faz fenólicos ligados serem transformados em formas livres. Seus
dados foram semelhantes aos encontrados neste estudo para o método TEAC,
onde foram obtidas atividades antioxidantes de frações dialisáveis contra radical
ABTS´ monstrando-se entre 2,84 e 6,19 vezes maiores do que as de BMFHs
antes da digestão. Atividades antioxidantes dos extratos aquosos de frações não
dialisáveis (retidas) contra radical ABTS´ também foram encontradas como sendo
maiores do que aquelas das BMFHs antes da digestão (p<0,05). Extratos
metanólicos das frações não-dialisáveis das amostras apresentaram efeito
inibitório sobre radicais ABTS´ variando entre 24,97 e 86,05%.
Reduções significativas dos valores de DPPH (1,61-2,09 vezes), após o
processo de digestão in vitro, também foram obtidos por Akillioglu & Karakaya
(2010). Saura-Calixto et al. (2007) relataram que cerca de 66% dos polifenóis em
leguminosas pertencem à fração insolúvel não-digerível. Eles propuseram que,
polifenóis associados à fração solúvel não digerível não passam através da
barreira intestinal. No entanto, eles podem ter algum efeito antioxidante do
intestino delgado porque eles são solúveis no meio digestivo. Além disso, os
polifenóis associados com a fração insolúvel não digerível não podem passar
através da barreira intestinal e eles podem atingir o cólon, onde podem ser
fermentados pela microflora colônica, exercendo assim sua atividade antioxidante
após a fermentação colônica.
Liyana-Pathirana & Shahidi (2005a) avaliaram o efeito de condições
simuladas de pH gástricos no conteúdo de fenóis totais e atividade antioxidante de
trigo mole e duro. O conteúdo de fenóis totais foi aumentado em 3,5-5,3 vezes
para o trigo mole e entre 2,4-5,1 vezes para o trigo duro. Uma das explicações foi
relacionada com condições gástricas que podem influenciar a composições
fenólicas desde que fenólicos são comumente esterificados a açúcares ou ácidos.

149
A condição gástrica simulada resultou em um aumento dramático na capacidade
antioxidante em equivalente Trolox do trigo, que foi de 2,5 e 4 vezes maior para o
trigo mole e duro, respectivamente.
Comparando-se os maiores valores encontrados para a quantificação de
fenólicos totais e antioxidante obtidos por Müller et al. (2010) em amostras de
smoothies, observa-se que as amostras digeridas de BMFH (1) e (2)
apresentaram resultados até 11 vezes maiores no método TEAC, 26 vezes para
Fenóis Totais e até 63 vezes maiores do que os encontrados para o método
ORAC, demonstrando assim o aumento da biodisponibilidade dos compostos
fenólicos e antioxidantes.
Digestão parece ser um fator importante para potencializar a atividade
antioxidante. Isto pode ser devido ao aumento na solubilidade de polifenóis e
digestão de proteínas e de amido, que podem levar à libertação de polifenóis,
devido às condições ácidas do estômago e da hidrólise enzimática no duodeno
(AKILLIOGLU & KARAKAYA, 2010). Explicação semelhante foi relatada noutro
local, indicando que a digestão gastrointestinal in vitro causou o aumento da
capacidade antioxidante de alimentos à base de grãos de cereais integrais devido
a possível libertação de polifenóis após a digestão de proteínas e de amido
(PEREZ-JIMENEZ & SAURA-CALIXTO, 2005).
Comparações das atividades antioxidantes antes e depois dos processos de
digestão in vitro revelaram que a digestão pareceu ser um fator importante para
potencializar a atividade antioxidante das amostras estudadas. A atividade
antioxidante dos retidos, que representa a fração não dialisável, mostra que a
digestão no estômago causou o aumento na atividade antioxidante em relação às
amostras não digeridas (AKILLIOGLU & KARAKAYA, 2010).

• Correlação entre os Ensaios

Atualmente, não existe um método oficial para determinação da atividade

antioxidante em alimentos de origem vegetal e seus subprodutos, tendo em vista

150
os vários mecanismos antioxidantes que podem ocorrer, bem como a diversidade
de compostos bioativos. A literatura descreve vários métodos antioxidantes, cada
um com um princípio distinto que utilizam radicais livres e/ou padrões diversos.
Dessa forma, os estudos que visam avaliar propriedades antioxidantes de extratos
vegetais utilizam mais de uma metodologia para inferir, com maior segurança, se
os extratos analisados poderão apresentar também alguma atividade em combater
os radicais livres formados no interior do organismo humano. Entre as
metodologias que têm sido utilizadas, destacam-se as que utilizam os radicais
livres sintéticos DPPH e ABTS´, pela facilidade de execução e pela boa correlação
com as demais metodologias antioxidantes (SOUSA et al., 2011).
Vários autores têm demonstrado de forma conclusiva que existe uma forte
relação positiva entre o teor de fenólicos totais e a capacidade antioxidante de
frutas e hortaliças, enquanto que outros autores não têm evidenciado esta
correlação (MELO et al., 2008).
As relações entre Fenóis Totais e Potencial Antioxidante (DPPH-Trolox,
TEAC e ORAC) das BMFHs (1) e (2), nas formas fresca e liofilizada, encontram-se
na Tabela 27 e dos extratos aquosos e etanólicos, nas formas fresca e liofilizada,
das frutas e hortaliças estudadas, na Tabela 28.

Tabela 275: Coeficiente de correlação (r) obtido entre Fenóis Totais e

potencial antioxidante (DPPH-Trolox, TEAC e ORAC) das amostras BMFHs
(1) e (2), nas formas fresca e liofilizada.

AMOSTRAS
COEFICIENTE DE CORRELAÇÃO (r)
Frescas Liofilizadas

Fenóis Totais x DPPH-Trolox 0,9271 0,2088

Fenóis Totais x TEAC 0,9439 0,6940
Fenóis Totais x ORAC 0,9168 0,9528
DPPH-Trolox x TEAC 0,9521 0,5429
DPPH-Trolox x ORAC 0,9644 0,0020
TEAC x ORAC 0,9947 0,7716

151
Tabela 28: Coeficiente de correlação (r) obtido entre Fenóis Totais e potencial antioxidante (DPPH-
Trolox, TEAC e ORAC) dos extratos aquosos e etanólicos, nas formas fresca e liofilizada, das
amostras de frutas e hortaliças estudadas.

AMOSTRAS

COEFICIENTE DE CORRELAÇÃO (r) Extrato Aquoso Extrato Etanólico

Fresca Liofilizada Fresca Liofilizada

Fenóis Totais x DPPH-Trolox 0,8395 0,1367 0,0141 0,5301

Fenóis Totais x TEAC 0,9530 0,2681 0,9315 0,7250
Fenóis Totais x ORAC 0,8770 0,5428 0,4766 0,6162
DPPH-Trolox x TEAC 0,8876 0,1158 0,0866 0,3955
DPPH-Trolox x ORAC 0,7746 0,1562 0,7803 0,3017
TEAC x ORAC 0,6022 0,7727 0,4781 0,8376

Ao analisar os resultados da Tabela 27, pode-se observar que houve uma

correlação significativa entre os valores de Fenóis Totais e as capacidades
antioxidantes (DPPH-Trolox, TEAC e ORAC) das amostras frescas, e para as
amostras liofilizadas dos BMFHs quando comparados Fenóis Totais versus ORAC
e TEAC versus ORAC.
Resultados semelhantes foram obtidos por Müller et al. (2010), onde foram
encontradas correlações muito boas entre o teor de fenólicos totais e capacidade
antioxidante nos produtos de uma única fruta, no entanto, não foi observado o
mesmo comportamento nos smoothies de frutas.
Gonçalves (2008) obteve uma correlação positiva entre a capacidade
antioxidante determinada através do método de ORAC e os teores fenólicos (r =
0,93). Afirma também ter obtido, de um modo geral, uma correlação significativa
entre os valores de Fenóis Totais, DPPH e ORAC.
A alta correlação entre Fenóis Totais e DPPH se deve principalmente ao fato
dos dois serem baseados em mecanismos de ação semelhantes, ou seja, na
transferência de elétrons. Já o método ORAC se baseia na transferência de
átomos de hidrogênio do antioxidante para o radical AAPH (PRIOR et al., 2005).

152
 Analisando a Tabela 28, observa-se uma boa correlação para os extratos
aquosos das amostras frescas, e também para as relações TEAC versus ORAC
dos extratos aquoso e etanólico das amostras liofilizadas, extratos etanólicos na
relação Fenóis Totais versus TEAC e extrato etanólico da amostra fresca na
DPPH-Trolox versus ORAC.
Alguns estudos têm demonstrado uma correlação linear entre o teor de
fenólicos totais e a atividade antioxidante por ORAC em frutas e vegetais (WANG
et al., 1996; CAO et al., 1996; PRIOR et al., 1998; WANG & LIN, 2000; WU et al.,
2004), mas Fenóis Totais e atividade antioxidante não estão correlacionados em
todos os tipos de alimentos (WU et al., 2004).
Anwar et al. (2013), obtiveram uma forte correlação quando relacionaram o
conteúdo de Fenóis Totais e a percentagem de inibição do ácido linoleico, para
todos os 12 extratos de couve-flor (variando o método de secagem e solvente de
extração), indicando que o conteúdo de Fenóis Totais também é, neste caso, um
indicador útil da atividade antioxidante. Llorach et al. (2003) relataram resultados
semelhantes para o seu estudo com extração de couve-flor a base de etanol e de
água. Curiosamente, Koksal & Gulcin (2008) relataram que o conteúdo de Fenóis
Totais e atividade antioxidante (ensaio de DPPH) dos extratos etanólicos de
couve-flor não se correlacionou fortemente.
Mahattanatawee et al. (2006), afirma em seu estudo com frutas tropicais, que
houve correlação significativa (r = 0,96) para ambos (ORAC e DPPH) entre a
atividade antioxidante e Fenóis Totais, sugerindo que os compostos fenólicos
provavelmente contribuíram de forma significativa para a atividade antioxidante em
extratos de frutas.
Vedana et al. (2008) encontraram uma correlação positiva para a atividade
antioxidante de extratos aquosos e hidroalcoólicos de uvas, da cultivar Isabel,
quando avaliados pelos métodos do DPPH e TEAC. Entretanto, essa regra não é
geral para todos os antioxidantes, pois Villaño et al. (2006), constataram que os
ácidos fenólicos siríngico, vanílico e p-cumárico, e a procianidina B3 não reagem
com o radical ABTS´, entretanto, apresentam elevada atividade antioxidante pelo

153
método DPPH.
Floegel et al. (2011), ao avaliarem o potencial antioxidante de 18 frutas, 13
legumes e 19 bebidas consumidas nos Estados Unidos, constataram que a
capacidade antioxidante detectada pelo ABTS´ foi significativamente maior para os
frutos, legumes e bebidas em comparação com o ensaio DPPH. Segundo os
autores, os antioxidantes hidrofílicos e de alta pigmentação foram melhor refletidos
pelo ensaio TEAC, sugerindo que este método pode ser mais útil do que o método
de DPPH para a detecção da capacidade antioxidante em uma variedade de
alimentos.
Leong e Shui (2002), ao correlacionarem a capacidade antioxidante de frutas
comercializadas em Singapura pelos ensaios TEAC e DPPH, reportaram uma boa
correlação (r = 0.9045) entre a atividade antirradical livre em apenas 11 das 27
frutas analisadas.
Já Thaipong et al. (2006), ao analisarem a atividade antioxidante de extratos
metanólicos de goiaba pelos ensaios TEAC e DPPH, encontraram correlação
significativa (r = 0,85) entre estes dois métodos.

4.1.11 Atividade Antiproliferativa (Sulforrodamina B)

Para mensurar o efeito citostático, calculou-se uma concentração efetiva

Growth Inhibition 50 (GI50), que é a concentração necessária para que ocorra 50%
de crescimento celular.
Os resultados obtidos para o padrão doxorrubicina (Figura 34, item i) e para
a BMFH (1) (Figura 34, item ii), BMFH (2) (Figura 34, item iii), BMFH (1) digerida
(Figura 34, item iv) e BMFH (2) digerida (Figura 34, item v) e os resultado de GI50
(Tabela 29), são demonstrados a seguir.

154
(i)

(ii)

155
(iii)

(iv)

156
 (v)
Figura 34: Resultado para: (i) Doxorrubicina; (ii) BMFH (1); (iii) BMFH (2); (iv) BMFH (1) digerida;
(v) BMFH (2) digerida, no Teste Antiproliferativo.
Legenda: U251 (glioma, SNC); MCF-7 (mama); NCI-ADR/RES (ovário, com fenótipo de resistência
a múltiplas drogas); 786-0 (rim); NCI-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); OVCAR-3
(ovário); HT29 (cólon); HaCaT (queratinócito humano, célula normal imortalizada).

Tabela 29: Resultado de GI50 no ensaio Antiproliferativo para as amostras de bebida analisadas.

GI50 (µg/mL)
Amostra
2 M a 7 4 o h Q

Doxorrubicina 0,05 0,08 9,2 0,08 0,19 0,1 0,25 0,23

BMFH (1) >250 >250 >250 >250 >250 >250 44,6 >250
BMFH (2) >250 >250 42 >250 >250 >250 >250 44,6
BMFH (1) Digerida >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250
BMFH (2) Digerida >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250 >250

Legenda: Linhagens celulares humanas - 2 = U251 (glioma, SNC); m = MCF-7 (mama); a = NCI-ADR/RES
(ovário, com fenótipo de resistência a múltiplas drogas); 7 = 786-0 (rim); 4 = NCI-H460 (pulmão, tipo não
pequenas células); o = OVCAR-3 (ovário); h = HT29 (cólon); q = HaCaT (queratinócito humano, célula normal
imortalizada).

157
 As amostras foram consideradas ativas, com potencial Antiproliferativo,
quando a Inibição do crescimento foi maior que 50% e de forma dose dependente,
preferencialmente com seletividade para os tipos celulares. Este comportamento
foi observado para a Doxorrubicina, a qual apresentou efeito citostático e citocida,
como pode ser visto na Figura 34. Além da inibição de crescimento acima de 50%
de todas as linhagens avaliadas, esta inibição ocorreu de forma dose dependente,
ou seja, apresentou diferentes comportamentos em relação à variação das
concentrações de amostra.
As BMFHs (1) e (2), digeridas ou não, foram avaliadas quanto ao potencial
anticâncer em culturas de células tumorais humanas. Como pode ser observado
na Tabela 29, a BMFH (1) apresentou efeito citostático apenas para a linhagem de
cólon (HT29), com valor de GI50 de 44,6 µg/mL, e o BMFH (2) para as linhagens
de ovário (NCI-ADR/RES), com resultados de GI50 de 42 µg/mL.
Os resultados obtidos sugerem uma atividade citostática muito fraca, sendo
que as amostras são praticamente inativas para atividade antiproliferativa. O fato
das amostras não terem apresentado resultados tão promissores como
quimioterápicos não impede que eles possam ter um maior potencial na
quimioprevenção do câncer, atuando nas etapas de iniciação e promoção,
avaliando essas bebidas através de modelos de carcinogênese.

4.1.12 Ensaios de Citotoxicidade e Antiproliferativo (HepG2)

As BMFHs (1) e (2), antes e após a digestão in vitro, foram testadas quanto à
capacidade antiproliferativa e antioxidante celular (CAA) frente às células de
hepatócitos humanos (HepG2).
Inicialmente foi realizado o teste de citotoxicidade para diferentes
concentrações de amostra, entre 5 e 100 µg/mL para as BMFHs (1) e (2) antes da
digestão, entre 8 e 1511 µg/mL para a BMFH (1) após a digestão e entre 7 e 1431
µg/mL BMFH (2) após a digestão, e as concentrações não citotóxicas foram
utilizadas nos ensaios Antiproliferativo e CAA.

158
 Para as amostras testadas, concentrações acima de 250 e de 130 µg/mL se
mostraram citotóxicas, respectivamente para as amostras não digeridas das
BMFHs (1) e (2), ou seja, houve diminuição da absorção acima de 10% quando
comparado ao controle. Entre as concentrações testadas da amostra digerida de
BMFH (1), não foi observada citotoxicidade, já para a amostra digerida da BMFH
(2), foram citotóxicas as concentrações acima de 358 µg/mL. Portanto, o teste
antiproliferativo e a atividade antioxidante celular (CAA) foram realizados
utilizando-se as concentrações das amostras nas quais não foram observadas a
citotoxidade.
As atividades antiproliferativas da BMFH (1) digerida, BMFH (2) e BMFH (2)
digerida não foram determinadas, pois a inibição do crescimento foi menor que
50% nas doses avaliadas, e por este motivo, não foi possível calcular o IC50
destas amostras. O gráfico de Crescimento Celular vs Concentração da BMFH (1)
(Figura 35) e os resultados de IC50 (Tabela 30), obtidos através dos resultados
das análises de proliferação celular (HepG2), são apresentados a seguir.

Figura 35: Resultado do ensaio de proliferação celular (HepG2) para a BMFH (1).

159
 Tabela 30: Resultados de IC50 para os ensaios de proliferação celular (HepG2).

IC50
AMOSTRA
(µg/mL amostra úmida)

BMFH (1) 11±1

BMFH (1) Digerida nd
BMFH (2) nd
BMFH (2) Digerida nd

Os valores referem-se à média de três determinações ± desvio padrão.

Legenda: nd - não determinado

Os resultados obtidos para a BMFH (1) sugerem uma atividade citostática

muito fraca, sendo praticamente inativas para atividade antiproliferativa.

4.1.13 CAA

O ensaio CAA foi realizado para concentrações das amostras que não
apresentaram citotoxicidade, como descrito no item 4.2.10.2 da metodologia.
Assim, para as amostras não digeridas de BMFH (1) e (2), o ensaio de CAA foi
realizado para concentrações menores que 0,25 e 0,13 mg/mL, respectivamente.
Já para as BMFHs (1) e (2) após a digestão in vitro, realizou-se o ensaio de CAA,
respectivamente para as concentrações abaixo de 1,511 e 0,358 mg/mL.
Para os cálculos da fluorescência no ensaio CAA, construiu-se um gráfico
relacionando o decaimento da fluorescência versus tempo, para cada
concentração do padrão Quercetina (Figura 36).

160
 Figura 36: Curvas de diferentes concentrações do padrão Quercetina, no ensaio
antioxidante celular.

Calculou-se a área abaixo da curva (AUC), obtendo-se um gráfico de CAA

versus concentração de Quercetina, com equação y = 11,047x – 8,9244 e
R2=0,9251 (Figura 37).

Figura 37: Curva padrão de Quercetina no ensaio antioxidante celular.

A curva padrão de Quercetina foi utilizada na quantificação do potencial

antioxidante celular das amostras (Figura 38). Os resultados do ensaio CAA das
BMFHs liofilizadas (digeridas ou não) foram expressos em µmol de QE/100g de

161
amostra úmida (Tabela 31).
Para comparar a qualidade antioxidante em relação aos compostos fenólicos
das BMFHs, digeridas ou não, os valores de CAA foram expressos como µmol
QE/µmol GAE e demonstrados na Tabela 31.

(i) (ii)

(iii) (iv)

Figura 38: Curvas de concentração (mg/mL) no ensaio antioxidante celular para as amostras (i)
BMFH (1); (ii) BMFH (2); (iii) BMFH (1) Digerida e (iv) BMFH (2) Digerida.

162
 Tabela 31: Resultados para os ensaios de CAA e da qualidade antioxidante celular.

CAA Qualidade de CAA

AMOSTRA
(µmol QE/100g amostra úmida) (µmol QE/µmol GAE)
a
BMFH (1) 464,76 ± 60,33 1,80
b
BMFH (1) Digerida 296,51 ± 33,63 0,05
d
BMFH (2) 7,03 ± 0,46 0,03
c
BMFH (2) Digerida 83,14 ± 0,43 0,02

Os valores referem-se à média de três determinações ± desvio padrão. Análise estatística pelo método Tukey,
com p<0,05. Letras minúsculas foram usadas comparação vertical dos resultados das amostras estudadas.

Os resultados de CAA variaram entre 7,03±0,46 e 464,76±60,33 µmol

QE/100g amostra úmida. Dentre as amostras estudadas, maiores resultados
foram obtidos pela BMFH (1) (464,76 ± 60,33 µmol QE/100g amostra úmida),
seguido pela sua forma digerida (296,51 ± 33,63), posteriormente pela BMFH (2)
digerida (83,14 ± 0,43) e por último pela BMFH (2) (7,03 ± 0,46).
Até o presente momento não foram encontrados dados na literatura de
ensaios de CAA realizados em bebidas mistas compostas por frutas e hortaliças,
por este motivo, os resultados obtidos para as BMFHs foram comparadas as
determinações de CAA de alguns vegetais frescos.
Pesquisadores estudaram o efeito da etapa de lavagem das células com
tampão PBS na capacidade antioxidante celular (CAA) de diversas frutas e
vegetais (Wolfe & Liu, 2007; Wolfe et al., 2008; Song et al., 2010). Ao comparar os
resultados das BMFHs com os obtidos pelos extratos de frutas estudados por
estes autores, pode-se concluir que ambas as BMFHs (1), digerida ou não,
possuem potencial antioxidante celular melhor do que todas as frutas e hortaliças
avaliadas, com ou sem lavagem com PBS. Já a amostra digerida de BMFH (2) é
maior do que todas as hortaliças avaliadas, com ou sem lavagem, é similar ao
mirtilo selvagem após lavagem com PBS, tem valor menor que as amostras sem
lavagem de romã e berries, exceto oxicoco, e as amostras lavadas de romã e
amora silvestre. A amostra não digerida da BMFH (2) apresenta potencial similar à

163
nectarina e rabanete sem lavagem, e cereja e pera após lavagem com PBS, mas
é maior que apenas 8 frutas sem lavagem, 11 hortaliças sem lavagem com PBS e
todas as hortaliças com lavagem.
A qualidade antioxidante da BMFH (1) apresentou-se muito maior (1,80 µmol
QE/µmol GAE) do que da sua forma digerida (0,05 µmol QE/µmol GAE) e do que
a BMFH (2) digerida ou não, respectivamente 0,02 e 0,03 µmol QE/µmol GAE.
É interessante apontar que, apesar de os maiores valores terem sido obtidos
por ambas BMFHs digeridas nos conteúdos de fenóis totais e ORAC, e pela
BMFH (1) digerida na análise de TEAC, os resultados de CAA e qualidade de CAA
foram significativamente maiores na amostra não digerida de BMFH (1), quando
comparada à amostra digerida e às amostras de BMFH (2) digerida ou não. Estes
resultados são parcialmente similares apenas aos obtidos no resultado de DPPH-
Trolox, no qual a BMFH (1) não digerida obteve maiores valores que as BMFHs
digeridas.
A análise de atividade antioxidante celular (CAA) vem sendo considerada
como a análise biologicamente mais relevante na medida de atividade antioxidante
de alimentos quando comparada a ensaios químicos comuns de atividade
antioxidante, pois é responsável por alguns aspectos da absorção, metabolismo e
localização dos compostos antioxidantes nas células. A digestão in vitro
combinada com a CAA pode ser usada para obter mais informações fisiológicas
nos efeitos dos compostos bioativos de alimentos na saúde (WOLFE & LIU, 2007;
FALLER et al., 2012).

4.2 RESUMO DOS RESULTADOS

Foram desenvolvidas duas bebidas mistas liofilizadas a base de frutas e

hortaliças, BMFH (1) (composta por banana, laranja, limão, manga, couve e
hortelã) e BMFH (2) (contendo banana, laranja, maçã, pera, manga, couve, couve-
flor, repolho e hortelã), suas composições centesimal, mineral e vitamínica e as
caracterizações físico-químicas e de compostos nutracêuticos foram

164
determinadas; avaliaram-se as bebidas formuladas como ingestão diária de frutas
e hortaliças, que também foram comparadas a bebidas semelhantes encontradas
no mercado nacional e internacional; realizou-se a quantificação dos compostos
fenólicos e a identificação dos flavonoides; avaliaram-se as bebidas e seus
componentes individuais (frutas e hortaliças) quanto aos efeitos da liofilização, do
tipo de solvente utilizado na extração dos compostos antioxidantes, e da digestão
in vitro; determinaram-se os índices da capacidade antioxidante in vitro e também
foram avaliadas a citotoxicidade e suas atividades antiproliferativas em células
humanas.
Na determinação da composição centesimal, a BMFH (1) obteve os maiores
valores para todas as análises, exceto para o teor de fibra alimentar, em relação a
BMFH (2). Destacam-se os baixos valores calóricos das BMFHs, 8 e 9% do valor
diário recomendado, respectivamente para as BMFHs (1) e (2), e pelo alto
conteúdo de fibra alimentar pois suprem 21 e 25%, respectivamente para as
BMFHs (1) e (2), do valor diário em uma porção de 300 mL.
Na composição vitamínica, observou-se que, exceto pela vitamina B2 e pela
vitamina C, que não foi detectada, todas as vitaminas analisadas apresentaram
valores maiores na amostra para a BMFH (1). Deve ser dado destaque à
concentração de vitamina A nas duas BMFHs, suprindo 39 e 14% do valor diário
recomendado, respectivamente para as BMFHs (1) e (2).
Pode-se observar também que, na composição mineral, exceto para o sódio
e zinco, todos os minerais analisados foram obtidos em maior quantidade pela
BMFH (1). O zinco não apresentou diferenças estatisticamente significativas entre
as BMFHs (1) e (2). Deve ser dado ainda destaque para o manganês com
concentrações de 24 e 17% do valor diário recomendado, respectivamente para
as BMFHs (1) e (2), e para o magnésio com 16 e 12% do valor diário,
respectivamente para as BMFHs (1) e (2), tornando a BMFH (1) em fonte de
magnésio e manganês e a BMFH (2) em fonte de manganês.
As BMFHs (1) e (2) foram avaliadas em relação ao equivalente de porções
de frutas e hortaliças supridas no valor diário recomendado de nutrientes, através

165
da comparação das informações nutricionais de uma porção de 300 mL destas
bebidas com as informações nutricionais de 1 a 4 porções de frutas e hortaliças.
As BMFHs apresentaram menores quantidades apenas para os conteúdos de
magnésio e de vitaminas B6 e C, e não foram diferentes significativamente na
quantidade de vitamina B2, quando comparadas a uma porção de banana.
Obtiveram quantidade de fibras equivalentes a 3 porções de vegetais (maçã, pera
e couve), e maior do que 2 porções (banana e repolho). Em relação aos lipídios,
manganês, fósforo e zinco, são equivalentes de 2 a 3 porções, e em relação a
carboidratos, cálcio, ferro, potássio e cobre, equivalentes de 2 a 4 porções de
vegetais.
As informações nutricionais das BMFHs (1) e (2) também foram comparadas
a 17 bebidas mistas de frutas e hortaliças, de coloração verde, comercializadas no
Brasil e/ou no exterior. O valor energético, conteúdo de carboidratos, gorduras,
fibras, cálcio e potássio das BMFHs (1) e (2) são maiores do que a maioria das
bebidas comerciais analisadas, e menores em conteúdo de sódio, proteínas e
vitaminas A e C.
Na caracterização físico-química não houve diferenças significativas para o
pH, lembrando que o baixo pH contribui para uma melhor conservação das
BMFHs. A % de acidez titulável e sacarose foram maiores na BMFH (1), o ratio e
frutose foram maiores na BMFH (2) e não houve diferenças estatisticamente
significativas para ºBrix e glicose. Para ambas, BMFH (1) e (2), as maiores
concentrações de mono- e dissacarídeos se deram para a sacarose, frutose e por
último a glicose.
Na avaliação da cor, não houve diferenças estatisticamente significativas em
relação à luminosidade, mas a BMFH (1) apresentou tonalidades mais tendentes
ao verde e ao amarelo. A coloração mais tendente ao verde da BMFH (1) pode ser
justificada por uma maior concentração de clorofilas total, a e b.
Para a caracterização dos nutracêuticos, a maior concentração de β-
caroteno, obtida pelo BMFH (1), pode justificar a maior tonalidade tendente ao
amarelo, quando comparado com a BMFH (2). Os teores de flavonoides totais e

166
fibras solúveis também foram maiores na BMFH (1), enquanto que para o teor de
fibras insolúveis foi maior para a BMFH (2). Não houve diferenças estatisticamente
significativas entre o conteúdo de pectina das duas bebidas, BMFHs (1) e (2).
Foram identificados fruto- e malto oligossacarídeos nas duas BMFHs, sendo que o
primeiro foi obtido em maior quantidade na BMFH (1) e o último na BMFH (2).
A identificação dos flavonoides não glicosilados foi realizada antes e após a
digestão in vitro das BMFHs (1) e (2). Ambas as BMFHs, antes da digestão,
apresentam 6 dos 17 padrões de flavonoides empregados, mas se diferem com a
presença de pelargonidina e (-) epicatequina-3-galato na BMFH (1) e de (-)
epigalocatequina, isoramnetina e quercetina, pela BMFH (2).
O processamento e armazenamento podem ter afetado a composição de
flavonoides de frutas e hortaliças frescas, comprovadas pela perda de compostos
após o processamento (tais como homogeneização, congelamento e liofilização)
das BMFHs (1) e (2), como ocorreu para 7 flavonoides na BMFH (1) e 8 na BMFH
(2), e pela produção de outros compostos, como ocorreu com o (-) epicatequina-3-
galato na BMFH (1). O efeito da digestão in vitro também pôde ser avaliado
através da composição de flavonoides das BMFHs (1) e (2) antes e após a
digestão, onde observou-se a perda de 5 compostos na BMFH (1) e de 6 na
BMFH (2) após a digestão in vitro.
Foram quantificados os Fenóis Totais e a capacidade antioxidante (DPPH-
Trolox, TEAC e ORAC) das BMFHs (1) e (2), antes e após a digestão in vitro, e de
seus componentes individuais (frutas e hortaliças), além do efeito da liofilização e
do solvente usado na extração.
Observou-se que, no geral, alguns dos resultados obtidos nas análises de
quantificação de fenólicos totais e determinação da capacidade antioxidante
diferiram dos obtidos na literatura. Essas variações encontradas podem ser
causadas por vários fatores como o tipo de solo, fertilizantes utilizados, época e
local de plantio, estocagem, comercialização, variedade da espécie vegetal em
estudo, dentre outros.
Através da análise de Fenóis Totais para as amostras de frutas e hortaliças

167
demonstraram-se os maiores valores, entre as amostras frescas, para couve e,
entre as amostras liofilizadas, para a hortelã. Entre as BMFHs, obteve-se maior
teor de fenóis totais para a amostra digerida de BMFH (1), quando comparadas às
amostras frescas ou liofilizadas, digeridas ou não.
Para o DPPH-trolox, entre as BMFHs os maiores resultados foram obtidos
pela amostra digerida de BMFH (1), e entre as frutas e hortaliças, pelo extrato
aquoso de couve fresca. Na análise de TEAC, a amostra com o resultado de maior
valor foi a BMFH (1) digerida, entre as BMFHs, e o extrato aquoso de hortelã
fresco, entre os vegetais. Já na análise de ORAC, os maiores resultados foram
obtidos pela BMFH (2) digerida e extrato aquoso de hortelã fresco,
respectivamente para as comparações entre as BMFHs e entre as frutas e
hortaliças.
Foi comprovado que o processamento, o método de conservação e a
liofilização podem ser responsáveis pelo aumento ou diminuição do conteúdo de
fenólicos totais e da atividade antioxidante e que a eficiência da extração é
dependente das condições do processo e da matriz testada.
Através dos resultados obtidos pelas análises de capacidade antioxidante in
vitro e na identificação dos flavonoides, observa-se a perda e produção de novos
compostos durante a digestão in vitro, aumentando ou diminuindo os resultados
das análises realizadas. O aumento da atividade antioxidante e do conteúdo de
fenólicos totais após a digestão pode ser justificado pela potencialização destes
devido ao aumento da solubilidade de polifenóis e digestão de proteínas e de
amido, que podem levar a liberação de polifenóis.
Através da avaliação da atividade antiproliferativa pelos métodos de
sulforrodamina B e com a HepG2, sugere-se uma atividade citostática muito fraca,
sendo que as BMFHs são praticamente inativas para atividade antiproliferativa. Na
análise da Atividade Antioxidante Celular (CAA), com a célula tumoral HepG2, o
maior resultado foi encontrado na amostra BMFH (2) antes da digestão, como foi
observado apenas na análise de ORAC.

168
 CAPÍTULO 5
CONCLUSÕES

Como conclusão da comparação entre as bebidas formuladas, observa-se

que a BMFH (1) obteve melhores resultados em praticamente todas as análises
realizadas. Nas análises laboratoriais, BMFH (1) apresentou baixos valores
calóricos e concentração de sódio e alto teor de fibras alimentares, mostrou-se
fonte de vitamina A, manganês e magnésio. Além disso, uma porção de 300 mL
supre os nutrientes equivalentes a 1 a 4 porções de vegetais, com a grande parte
dos nutrientes avaliados em maior concentração do que os encontrados em 17
BMFHs comerciais comparadas neste estudo. Assim, a BMFH (1) pode ser
considerada uma bebida funcional por conter compostos nutracêuticos como fibras
solúveis e insolúveis, pectina, β-caroteno e flavonoides, além de apresentar
valores consideráveis de fenólicos totais e atividade antioxidante in vitro.
Nenhum trabalho foi encontrado na literatura relacionado a um estudo de
bebidas funcionais mistas de frutas e hortaliças liofilizadas, tornando este trabalho
bem aprofundado no que diz respeito aos estudos de desenvolvimento e análises
in vitro de bebida funcional. Podendo ser considerado pioneiro no
desenvolvimento de bebidas naturais liofilizadas em pó, compostas por frutas e
hortaliças, sem adição de açúcar ou quaisquer outros aditivos, e que apresentam
formulações nutricionais com propriedades funcionais naturais, de preparo rápido
e fácil, com manutenção da sua forma original após reconstituição, sem separação
de fases, e de pequeno volume que facilita o seu transporte.
Estas bebidas podem vir a apresentar boas perspectivas na indústria e no
mercado de alimentos e bebidas já que facilita a aceitação e ingestão de frutas e
hortaliças, incrementando o alcance de grande parte do valor diário recomendado
de nutrientes.

169
 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS

Sugere-se o uso das BMFHs formuladas em trabalhos futuros, em estudos

como:

- Avaliação sensorial com diferentes grupos de julgadores: crianças e idosos;

- Desenvolvimento de embalagem para porções individuais;
- Estudo do acondicionamento e vida de prateleira;
- Estudo da viscosidade das bebidas frescas e após reconstituição da bebida
liofilizada para avaliar o efeito da liofilização;
- Estudo de viabilidade econômica e custo de produção;
- Avaliar a presença de compostos antinutricionais;
- Identificação de flavonoides glicosilados antes e após a digestão in vitro;
- Avaliação dos efeitos in vivo em humanos saudáveis ou com doença
crônica não-degenerativa;
- Avaliação da detoxicação hepática in vivo (glutationa e citocromos);
- Avaliação da atividade e enzimas antioxidantes in vivo (α-glicosidade e α-
amilase);
- Aumento de escala para produção industrial.

170
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203
ANEXO

204
Tabela 5: Composições Centesimal, Mineral e Vitamínica dos vegetais estudados (resultados em 100g amostra úmida) (Adaptada de
TACO, 2011 e USDA, 2012).
FRUTAS HORTALIÇAS
ENSAIOS
Banana Laranja Limão Maçã Manga Pera Couve- Couve Repolho
Hortelã
Nanica Pera Tahiti Fuji Palmer Williams flor Manteiga branco

Umidade e Voláteis (g) 73,8 91,3 87,4 84,3 79,7 85 92,8 90,9 78,7* 94,7
COMPOSIÇÃO
CENTESIMAL

Calorias (kcal) 92 33 32 56 72,5 53 23 27 70* 17

Proteína (g) 1,4 0,7 0,9 0,3 0,4 0,6 1,9 2,9 3,8* 0,9
Lipídios Totais (g) 0,1 0,1 0,1 Tr 0,2 0,1 0,2 0,5 0,9* 0,1
Carboidratos Totais (g) 23,8 7,6 11,1 15,2 19,4 14 4,5 4,3 14,9* 3,9
Fibra Alimentar (g) 1,9 Tr 1,2 1,3 1,6 3 2,4 3,1 8,0* 1,9
Cinzas (g) 0,8 0,3 0,4 0,2 0,3 0,3 0,6 1,3 1,76* 0,4

Cálcio (mg) 3 7 51 2 11,6 8 18 131 243* 35

Magnésio (mg) 28 8 10 2 8,7 6 12 35 80* 9
COMPOSIÇÃO

Manganês (mg) 0,14 0,03 0,07 0,03 0,1 0,04 0,16 1,02 1176* 0,13
MINERAL

Fósforo (mg) 27 14 24 9 14 12 57 41 73* 14

Ferro (mg) 0,3 Tr 0,2 0,1 0,1 0,1 0,5 0,5 5,1* 0,2
Sódio (mg) Tr Tr 1 Tr 1,9 Tr 3 6 31* 4
Potássio (mg) 376 149 128 75 156,5 116 256 403 569* 150
Cobre (mg) 0,1 0,01 0,06 0,06 0,1 0,07 0,03 0,06 0,33* 0,02
Zinco (mg) 0,2 Tr 0,2 Tr 0,1 0,1 0,3 0,4 1,1* 0,2
COMPOSIÇÃO

Vitamina A (UI) 64* 200* Tr 54* 1082* 25* 0* 9990* 4248* 98*
VITAMÍNICA

Vitamina B1-Tiamina (mg) Tr Tr 0,3 Tr 0,1 Tr 0,03 0,2 0,08* Tr

Vitamina B2-Riboflavina (mg) 0,02 Tr 0,04 Tr 0,03 Tr 0,09 0,31 0,27* 0,03
Vitamina B6-Piridoxina (mg) 0,14 Tr Tr 0,03 0 Tr 0,1 0,06 0,13* 0,06
Ácido ascórbico (mg) 5,9 73,3 38,2 2,4 65,5 2,8 36,1 96,7 31,8* 18,7

*Valores retirados da base de dados da USDA (2012), por estarem em falta na Tabela Brasileira de Composição de Alimentos (TACO). Legenda: Tr =
Traços

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Tabela 6: Composições de Flavonoides dos vegetais estudados (resultados em mg/100g amostra úmida) (Adaptada de USDA, 2011).
FRUTAS HORTALIÇAS
FLAVONOIDES
Bananas Laranja* Limão* Maçã Fuji** Mangas Pera Couve-flor Couve Hortelã Repolho

Antocianidinas
Cianidina - - - 0,65 0,1 12,18 - - - -
Delfinidina 7,39 - - 0,01 0,02 - - - - -
Pelargonidina - - - 0,01 0,02 - - - - -

Flavanóis
(+) Catequina 6,1 - - 0,75 1,72 0,27 - - - -
(-) Epicatequina 0,02 - - 5,55 - 3,76 - - - -
(-) Epicatequina-3-galato - - - - - 0,02 - - - -
(-) Epigalocatequina - - - 1,14 - 0,59 - - - -
(-) Epigalocatequina-3-galato - - - 1,93 - 0,17 - - - -

Flavanonas
Eriodictiol - 0,17 4,88 - - - - - 30,92 -
Hesperetina - 20,39 14,47 - - - - - 9,52 -
Naringenina - 3,27 1,38 - - - - - - -

Flavonas
Apigenina - - - - 0,01 - 0,08 - 8,71 0,08
Luteolina - - - 0,01 0,02 - 0,1 - 11,33 0,1

Flavonóis
Canferol 0,11 - - - 0,05 - 0,18 46,8 - 0,18
Isoramnetina - - - - - 0,3 - 23,6 - -
Miricetina 0,01 0,05 0,37 0,01 0,06 - - - - -
Quercetina 0,06 0,25 2,19 2,35 - 4,24 0,28 22,58 - 0,28
*Suco das frutas **Frutas com casca

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