FUNDAÇÃO EDSON QUEIROZ

UNIVERSIDADE DE FORTALEZA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
MESTRADO EM CIÊNCIAS MÉDICAS

NOME DO ALUNO

ANTÔNIO ELISIÁRIO DOS SANTOS NETO

TÍTULO

Análise proteômica em modelo experimental em ratas.

FORTALEZA–CE
UNIFOR-2021
 NOME DO AUTOR

ANTÔNIO ELISIÁRIO DOS SANTOS NETO

TÍTULO

Análise proteômica em modelo experimental em ratas.

Projeto apresentado ao Curso de Mestrado em

Ciências Médicas da Universidade de Fortaleza
como requisito de qualificação e andamento ao
estudo.

Orientador(a): Prof(a). Dr(a). ANA CRISTINA DE

OLIVEIRA MONTEIRO MOREIRA
FORTALEZA–CE
ANO/2021
 ANTÔNIO ELISIÁRIO DOS SANTOS NETO

Análise proteômica em modelo experimental em ratas.

Área de concentração: ESTUDOS TRANSLACIONAIS EM CIÊNCIAS MÉDICAS

Linha de Pesquisa:

BANCA EXAMINADORA

Prof(a). Dr(a). ANA CRISTINA DE OLIVEIRA MONTEIRO MOREIRA

Orientador(a) – Universidade – UNIFOR/CE

Prof. Dr MARCELO BORGES CAVALCANTE

Membro Efetivo – Universidade UNIFOR/CE

________________________________
Prof(a). Dr(a). xxxxxxxxxxxxxxxxxx
Membro Efetivo – Universidade xxxxxxxxxx
 RESUMO

O PRESENTE TRABALHO TEM O OBJETIVO DE CONSTRUIR UM

PAINEL PROTEICOS EM RATAS DA LINHAGEM WISTAR
COMPARANDO A UM GRUPO CONTROLE. OS ACHADOS
QUALITATIVOS E PREVALÊNCIA SERÃO CONFRONTADOS AOS
DA LITERATURA AFIM DE PREDIZER SEUS POTÊNCIAS
BIOMARCADORES.
SABE-SE QUE A ENDOMETRIOSE É UMA PATOLOGIA DE
EVOLUÇÃO BENIGNA, DE NATUREZA CRÔNICA ACOMETENDO
MULHERES PRINCIPALMENTE NA SUA FASE REPRODUTIVA COM
TAXA DE PREVALÊNCIA EM TORNO DE 3% NA POPULAÇÃO
GERAL E 30 a 40% DAS MULHERES SUB-INFÉRTEIS. TENDO SUAS
PRINCIPAIS CARACTERÍSTICAS: DOR PÉLVICA CRÔNICA,
INFERTILIDADE (OU BAIXA FERTILIDADE) FEMININA, E
DISPAREUNIA (DOR NA RELAÇÃO SEXUAL), ASSIM COMO OS
SINTOMAS RELACIONADOS A ÓRGÃOS ACOMETIDOS PELA
DOENÇA: DISÚRIA, DISQUESIA E DISMENORREIA. AINDA QUE
ALGUMAS PACIENTES POSSAM APRESENTA-SE
ASSINTOMÁTICAS. DE CAUSA DESCONHECIDA ALGUMAS
TEORIAS TENTAM EXPLICAR SUA ORIGEM COMO: A TEORIA DA
MENSTRUAÇÃO RETRÓGRADA, ONDE TECIDO ENDOMETRIAL
CHEGA NA CAVIDADE ABDOMINAL ATRAVÉS DAS TROMPAS DE
FALÓPIOS, AS TEORIA DA DISSEMINAÇÃO LINFÁTICA E A
IMUNOLÓGICA EXPLICAM TECIDO ENDOMETRIAL ECTÓPICO
FORA DA CAVIDADE PERITONEAL E POR FIM A TEORIA DA
METAPLASIA CELÔMICA EXPLICA ENDOMETRIOSE NOS
EXTREMOS DA VIDA REPRODUTIVA. GRANDES ESFORÇOS TEM
SIDO REALIZADO EM PROPOR TRATAMENTOS CADA VEZ MAIS
PRECOCE OBJETIVANDO MELHORAR A QUALIDADE E O
POTENCIAL REPRODUTIVO DESTAS PACIENTES. SABEMOS QUE
O TECIDO ECTÓPICO NECESSITA DE AMBIENTE FAVORÁVEL À
SUA IMPLANTAÇÃO PARA TORNA-SE BIOLOGICAMENTE ATIVO.
FATORES IMUNES TEM PAPEL FUNDAMENTAL NA MANUTENÇÃO
DESTE TECIDO COMO AS INTERLEUCINAS, VGEF, ÓXIDO NÍTRICO
DENTRE OUTROS.
BASEADO NESTES ASPECTOS FISIOGÊNICOS, ESTUDOS
PROTEICOS SÃO CADA VEZ MAIS RELEVANTES PARA ELUCIDAR
ESTA PATOLOGIA.
PROTEOMA É UM CONJUNTO DE PROTEÍNAS E VARIANTES DE
PROTEÍNAS QUE PODEM SER ENCONTRADAS NUMA CÉLULA
ESPECÍFICA QUANDO SUJEITA A UM CERTO ESTÍMULO, SERIA O
EQUIVALENTE PROTEICO DO GENOMA. A ANALISE DE
PROTEÍNAS EXPRESSAS DIFERENCIALMENTE, ENVOLVIDAS NAS
VIAS DE RESPOSTA IMUNE HUMORAL E OUTRAS VIAS DE
REPARAÇÃO TECIDUAL COMO INFLAMAÇÃO, ADESÃO,
MIGRAÇÃO CELULAR E COAGULAÇÃO SANGUÍNEA SÃO
PROMISSORES PARA PREDIZER A OCORRÊNCIA DA
ENDOMETRIOSE, HAJA VISTO QUE SUA CONFIRMAÇÃO É
ANATOMOPATOLÓGICA PROVENIENTE DE CIRURGIA VÍDEO-
LAPAROSCÓPICA. DIANTE DESTE CENÁRIO PROPOMOS
INVESTIR EM UM ESTUDO EXPERIMENTAL ANALISANDO
PROTEOMAS NO SORO E TECIDO ECTÓPICO DOS ANIMAIS A FIM
DE COMPARÁ-LOS E SUGERIR POSTERIORMENTE
BIOMARCADORES PARA O DIAGNÓSTICO DESTA ENFERMIDADE.

Palavras-chave: PROTEOMAS. BIOMARCADORES, ENDOMETRIOSE.

SUMÁRIO
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1 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
ENDOMETRIOSE É UMA PATOLOGIA BENIGNA, CRÔNICA DE
NATUREZA INFLAMATÓRIA QUE SE CARACTERIZA POR
TECIDO ENDOMETRIAL BIOLOGICAMENTE ATIVO, FORA DA
CAVIDADE UTERINA. DE ACORDO COM DADOS
EPIDEMIOLÓGICOS PUBLICADOS NO
REALIZAMOS UMA REVISÃO NA LITERATURA MAIS ATUAL
COM OS DESCRITORES: ENDOMETRIOSE, TRATAMENTO DE
ENDOMETRIOSE, PROTEOMAS, USO DE ESPECTROMETRIA
DE MASSA EM ENDOMETRIOSE, PROTEOMAS NA
ENDOMETRIOSE, BIOMARCADORES PARA ENDOMETRIOSE E
BIOMARCADORES. ESSE LEVANTAMENTO LEVOU EM
CONSIDERAÇÃO OS ARTIGOS CIENTÍFICOS MAIS RECENTE
NOS ÚLTIMOS 5 ANOS. PRIORIZAMOS PUBLICAÇÕES DE
FORTE IMPACTO CIENTÍFICO; NAS PUBLICAÇÕES NACIONAIS
BUSCAMOS NOS PERIÓDICOS CAPES, PUBMED, SCIELO E
EBSCHOST. ALGUNS LIVROS TEXTOS FORAM UTILIZADOS
COMO: MANUAL FEBRASGO SOBRE ENDOMETRIOSE (EDIÇÃO
ATUALIZADA), GINECOLOGIA DO WILLIAMS E TRATADO DE
GINECOLOGIA FEBRASGO 2019.
O QUE BUSCAMOS FOI LEVANTAR DADOS SOBRE O USO DE
PROTEOMAS PARA DIAGNÓSTICO, ACOMPANHAMENTO /
FOLLOW UP E CRITÉRIOS PARA RECIDIVA APÓS
TRATAMENTO. A ENDOMETRIOSE POR SER UMA DOENÇA EM
QUE SUA CURA NÃO PODE SER 100% COMPROVADA,
PENDENTE DO MELHOR TRATAMENTO OU MELHORA
CLÍNICA, ELA CARECE DE BIOMARCADORES QUE
EXPRESSEM AGUDIZAÇÃO DO QUADRO OU MESMO
PREDIZER COM RAZOÁVEL CHANCE DE CERTEZA SOBRE
 14

SUA OCORRÊNCIA. BASEADO NESTE ASPECTO

COMPORTAMENTAL DA HISTÓRIA NATURAL DA DOENÇA, É
MISTER TER UMA ARSENAL DE EXAMES QUE POSSIBILITEM
CARACTERIZAR SUA EXISTÊNCIA COM BOA SENSIBILIDADE E
ESPECIFICIDADE. ATUALMENTE O DIAGNÓSTICO PASSA
PELA CIRURGIA ENDOSCÓPICA, ONDE OS IMPLANTES SÃO
VISUALIZADOS E BIOPSIADOS. VALE RESSALTAR QUE OS
SINTOMAS PARECEM NÃO REPRESENTAR NA INTEGRA O
GRAU DE ACOMETIMENTO OU INFILTRAÇÃO DAS LESÕES.
PODEMOS TER CASOS COM ENDOMETRIOSE CLASSIFICADA
EM SUPERFICIAL EM QUE A PACIENTE É BASTANTE
SINTOMÁTICA E PACIENTE COM TUMORES OVARIANOS –
ENDOMETRIOSE, POUCOS SINTOMÁTICAS. NÃO ESTÁ MUITO
CLARO, MÁS PARECE EXISTIR UM AMBIENTE IMUNOLÓGICO
FAVORÁVEL A PRESENÇA DA LESÃO ENDOMETRÍOTICA.
CÉLULAS LEUCOCITÁRIAS T-KILLER E LINFÓCITOS ATRAVÉS
DE UM INTRICADO BALANÇO MUTAGÊNICO RESPONDENDO A
UM COMPLEXO E BEM DOCUMENTADO FLUXOS DE
PROTEÍNAS SÃO RESPONSÁVEIS PELA ORIGEM,
DESENVOLVIMENTO, PERSISTÊNCIA E MANUTENÇÃO DA
ENDOMETRIOSE. OS MEDIADORES INFLAMATÓRIOS COMO
ÓXIDO NÍTRICO E INTERLEUCINAS IL6, PARECEM
DESEMPENHAR UMA FORTE LIGAÇÃO COM OS IMPLANTES
ASSIM COMO DISPARAM MEDIADORES DE DOR, POR VIAS JÁ
CONHECIDAS E CONSAGRADAS. DIANTE DESTE CENÁRIO
“CAÓTICO” BUSCAMOS PROVAS DE TRAÇOS DE PROTEÍNAS
QUE POSSAM ESTAR DIRETAMENTE ENVOLVIDAS COM A
ENDOMETRIOSE E QUE SUA EXPRESSÃO CONSIGA AFIRMAR
COM RAZOÁVEL SEGURANÇA ESTATÍSTICAS A PRESENÇA DA
 15

DOENÇA. REVISÃO SISTEMÁTICAS REALIZADAS APONTAM

PAINÉIS DE PROTEOMAS QUE PARECEM SURGIR COMO
POTÊNCIAS BIOMARCADORES. ALGUNS ESTUDOS,
INCLUSIVE COM ENSAIOS CLÍNICOS, PESQUISARAM
PROTEOMAS EM SORO E TECIDO TÓPICO EM MULHERES
COM E SEM ENDOMETRIOSE. VÁRIAS PROTEÍNAS FORAM
LISTADAS POR MOSTRAREM EXPRESSIVIDADE NAS
AMOSTRAS. BUSCAMOS NESTE ESTUDO ANALISAR
PROTEOMAS NO SORO E EM TECIDO ENDOMETRIÓTICO EM
RATAS WISTAR, ESTIMULADAS COM ESTROGÊNIOS E
TRATADAS COM ACETATO DE MEDROXIPROGESTERONA E
DESCREVER SUAS RELAÇÕES.
16
 17

3 OBJETIVOS E METAS

OBJETIVO PRINCIPAL:

 AVALIAR O CONJUNTO DE SUAS PROTEÍNAS E SUAS

ISOFORMAS EM UM MODELO EXPERIMENTAL DE
ENDOMETRIOSE EM RATAS.

OBJETIVO SECUNDÁRIO:

 AVALIAR O CONJUNTO DE PROTEÍNAS E SUAS

ISOFORMAS NO TECIDO ENDOMETRIÓTICO EM UM
MODELO EXPERIMENTAL DE ENDOMETRIOSE EM RATAS.

 AVALIAR O CONJUNTO DE PROTEÍNAS E SUAS

ISOFORMAS NO SANGUE EM UM MODELO DE
ENDOMETRIOSE EM RATAS.

 AVALIAR O CONJUNTO DE PROTEÍNAS E SUAS

ISOFORMAS NO ENDOMÉTRIO DE ÚTERO EM UM MODELO
EXPERIMENTAL DE ENDOMETRIOSE EM RATAS.
 18

METAS:

 LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO DOS PRINCIPAIS

PRESCRITORES PARA ESTUDO DA ARTE E ASSEGURAR
AS ESTRATÉGIAS DE METODOLOGIA E OS ESTUDOS MAIS
RELEVANTES DO ASSUNTO, BUSCANDO AS PRINCIPAIS
PUBLICAÇÕES E PRIORIZAR TRABALHOS DE PUBLICAÇÃO
CIENTÍFICA RECONHECIDA, PRIORIZAMOS ESTUDOS:
CASO-CONTROLE, ENSAIOS CLÍNICOS, REVISÃO
SISTEMÁTICA.

 UTILIZAR E CONFIRMAR O MODELO PARA ENDOMETRIOSE

SUBCUTÂNEA EM RATAS, MODELO VALIDADO PARA
TESTE DE FÁRMACOS.
 DESCREVER O PRIMEIRO PAINEL PROTEICO DE
ENDOMETRIOSE EM UM ESTUDO EXPERIMENTAL EM
RATAS.
 19

4 METODOLOGIA E ESTRATÉGIA DE AÇÃO

PROPOMOS REALIZAR UM ESTUDO EXPERIMENTAL, COM RATAS

ALBINAS JOVENS DA LINHAGEM WISTAR, COM POTENCIAL
REPRODUTIVO, PESANDO ENTRE: 150 A 250 G. REALIZAREMOS O
ESTUDO NO NUBEX ( NÚCLEO DE BIOLOGIA EXPERIMENTAL DA
UNIFOR/CE), ONDE OS REFERIDOS ANIMAIS FICARAM CONFINADOS
COM CONTROLE DA TEMPERATURA, UMIDADE, LUMINOSIDADE,
POLUIÇÃO ACÚSTICA E CONTROLE DA QUANTIDADE E QUALIDADE
ALIMENTAR. A ALIMENTAÇÃO DEVERÁ SER LIVRE DE DERIVADO
FLAVONOIDES OU QUALQUER ALIMENTO QUE POSSAM SER FONTES
DE ESTEROIDES. ESTES ANIMAIS APÓS SELECIONADOS SERÃO
AVALIADOS SOB SUAS INTEGRIDADES FÍSICAS E SEPARADAS POR
SEXO (APENAS ANIMAIS FÊMEAS) SERÃO UTILIZADAS. USAREMOS 4
GRUPOS: (CADA GRUPO COM 6 ANIMAIS), NA SEGUINTE DISTRIBUIÇÃO:

SEM ENDOMETRIOSE ESTROGENIO PROGESTERONA

ENDOMETRIOSE
GRUPO
1 SIM ------------ ----------- -----------
(SHAM)
GRUPO
2 -------- SIM ----------- ----------
GRUPO
3 --------- SIM SIM ----------
GRUPO
4 --------- SIM SIM SIM

 REALIZAREMOS IMPLANTES DE ENDOMETRIOSE

SUBCUTÂNEA USANDO MODELO VALIDADO:
 20

“DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE UM
MODELO DE ENDOMETRIOSE SUBCUTÂNEA EM
RATAS PARA ESTUDO DE PROVÁVEIS
MECANISMOS FISIOPATOLÓGICOS E DO
EFEITO DE DROGAS- DISSERTAÇÃO DE
MESTRADO -UFC/2013 AUTOR: DR FRANCISCO
EDSON XIMENES GOMES PEREIRA”

 A DOSAGEM DE ESTROGÊNIO UTILIZADO SERÁ 10 MG/KG,

DOSAGEM MAIS EFETIVA PARA MANUTENÇÃO DOS
IMPLANTES DE ENDOMETRIOSE CONFORME

DESCRIÇÃO ...” O peso úmido dos focos de

endometrioses do grupo tratado com estrogênio (β-
estradiol, 10 mg/kg) tiveram diferença significante
em relação ao controle e às demais
doses(p=0,0064).” DE ACORDO COM EDSON...
 A DOSAGEM DE ACETATO DE MEDROXIPROGESTERONA

UTILIZADA SERÁ DE 0,5 MG/KG. ” Os pesos úmidos dos

focos de endometrioses tratados com acetato de
medroxiprogesterona nas doses de 0,5 mg/kg, 2
mg/kg e 5 mg/kg tiveram uma diminuição nos seus
pesos em relação ao controle(p=0,0069), mas, entre
as doses não houve diferença significativa.”
 AS MEDICAÇÕES SERÃO REALIZADAS POR VIA
SUBCUTÂNEA.
 O TRATAMENTO SERÁ REALIZADO APÓS 0 5 DIA, TEMPO
QUE JÁ EXISTE ADESÃO E VASCULARIZAÇÃO DOS
IMPLANTES.
 21

 OS IMPLANTES ENDOMETRIAIS SERÁ REALIZADO COMO

DESCRITO, DE ACORDO COM EDSON... “MODELO DE
ENDOMETRIOSE SUBCUTÂNEA”: ANESTESIA REALIZADO
POR VIA INTRAPERITONEAL COM HIDRATO DE CLORAL A
10% (0,1 ml/30g de rata), APÓS TRICOTOMIA COM ASSEPSIA
COM IODOPOVIDONA A 10% SERÁ REALIZADO INCISÃO
LONGITUDINAL SUPRA PÚBICA DE 2,5 CM, FAZ-SE UM
TÚNEL ENTRE A PAREDE ABDOMINAL E A INCISÃO EM
ÂNGULO DE 45 graus, IDENTIFICA O ÚTERO E REALIZA A
HEMI-SECÇÃO DO HEMI-ÚTERO ESQUERDO EM SEGUIDA
RETIRA-SE UM FRAGMENTO DE 4 X 4 MM DA PEÇA COM
AJUDA DE MICROSCÓPICO IDENTIFICA-SE O ENDOMÉTRIO.
EM SEGUIDA FAZ-SE A FIXAÇÃO DO IMPLANTE COM FIO
MONONYLON 4.0 NO SUBCUTÂNEO NA REGIÃO INGUINAL
DIREITA. EM SEGUIDA FAZ A SUTURA DOS PLANOS
FECHANDO A INCISÃO.
 A AVALIAÇÃO DO ESTADO DE ESTRO DAS RATAS SERÁ
REALIZADO COM ESTUDO DA CITOLOGIA VAGINAL
ATRAVÉS DA DETECÇÃO DE CÉLULAS .... CONFIRMANDO
SEU ESTADO DE CICLO REPRODUTIVO.
 A ANÁLISE PROTEICA será OBTIDA DO TECIDO
ENDOMETRIAL, SANGUE E ENDOMÉTRIO TÓPICO DAS
RATAS E SERÃO COLHIDAS NOS SEGUINTES MOMENTOS:
---------
 A ANALISE PROTEICA será REALIZADO COM
ESPECTROMETRIA DE MASSA DO NUBEX, APARELHO DE
MODELO??????????
 UTILIZAREMOS OS TESTES ESTÁTICOS....
 O ESTUDO DEVERÁ SER APROVADO PELO COMITÉ DE
ÉTICA EM ESTUDOS COM ANIMAIS DA UNIFOR.
22
23
 24

6 PLANO DE ATIVIDADES

1. LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO
2. DEFINIÇÃO DO TEMA E PROJETO DE PESQUISA
3. DEFINIÇÃO DA METODOLOGIA
4. CONCLUIR PROJETO PARA SUBMETER A QUALIFICAÇÃO.
5. SUBMETER PROJETO AO COMITÉ DE ÉTICA EM PESQUISA
COM ANIMAIS
6. REALIZAR PESQUISA E TRABALHO EM ANIMAIS
7. LEVANTAMENTO DOS DADOS DA PESQUISA
8. ANÁLISE ESTATÍSTICA
9. DISCURSÃO E ESTUDOS DOS DADOS OBTIDOS E
ASSEGURAR A VIABILIDADE PARA A PESQUISA
10. APRESENTAÇÃO DA DISSERTAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO
TÍTULO DE MESTRADO.
 25

7 ORÇAMENTO PREVISTO

O ORÇAMENTO SERÁ AVALIADO DE ACORDO COM O NÚMERO DE

ANIMAIS UTILIZADOS NO EXPERIMENTO E EM REGRA GERAL AS
DESPESAS PREVISTAS SEGUEM O SEGUINTE:
 RATAS, VARIEDADE ALBINA E LINHAGEM WISTAR. NÚMERO
ESTIMADOS EM 60 ANIMAIS. (CONTAGEM CONSIDERANDO
A AMOSTRAGEM PARA TESTE E PERDAS DOR MOTIVOS
DIVERSOS: MORTES NA INDUÇÃO ANESTÉSICA, MORTES
DURANTE O PROCEDIMENTO, MORTE APÓS O
PROCEDIMENTO SEM TEMPO PARA ENTRAR NO ESTUDO...)
 AS MEDICAÇÕES: B-ESTRADIOL, ACETATO DE
MEDROXIPROGESTERONA SERÁ ADQUIRIDAS POR MEIOS
PRÓPRIOS E MANTIDAS DE ACORDO O FABRICANTE PARA
SEU USO.
 USO DE KIT PARA O ESPECTRÔMETRO DE MASSAS....
 SOFTWARE PARA ANALISE DOS DADOS, será UTILIZADO
PELA UNIFOR.
 MATERIAL PARA REALIZAÇÃO DAS CIRURGIAS:
ANESTÉSICO, LUVAS, PVPI, FIOS, MATERIAL (PINÇAS) PARA
CIRURGIA NAS RATAS SERÃO EM PARTE FORNECIDOS
PELA UNIFOR E EM PARTE POR MEIOS PRÓPRIOS.
 AVALIAÇÃO ANATOMOPATOLÓGICA E CITOLOGIA
ONCÓTICA DO LAVADO VAGINAL....
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8 RESULTADOS ESPERADOS

1. DEMONSTRAR ATRAVÉS DOS RESULTADOS QUE PODEMOS

PROPOR UM PAINEL DE PROTEÍNAS PARA O, MODELO DE
ENDOMETRIOSE SUBCUTÂNEA EM RATAS, ENVOLVIDAS NO
PROCESSO DE IMPLANTAÇÃO, ADESÃO, INFILTRAÇÃO,
ANGIOGÊNESE E IMUNÓGENOS DOS IMPLANTES.
2. APRIMORAR AS TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO COM
BIOMARCADORES, HAJA VISTO QUE ATUALMENTE NENHUM
BIOMARCADOR É ESPECÍFICO PARA ENDOMETRIOSE
SENDO QUE OS TRABALHOS MAIS RECENTE APONTAM O
CA125 (câncer antigen 125), COM DISCUTÍVEL SENSIBILIDADE
E ESPECIFICIDADE.
3. TESTAR E ASSEGURAR A VALIDAÇÃO DO MODELO DE
ENDOMETRIOSE SUBCUTÂNEA EM RATAS UTILIZADO EM
NOSSO ESTUDO.
 27

REFERÊNCIAS

AS REFERÊNCIAS SERÃO ACRESCIDAS A CADA TRECHO APOS A APRECIAÇÃO DOS SENHORES.

AGUARDO AINDA O LEVANTAMENTO BIBLIOGRÁFICO DA UNIFOR.

 28

ANEXOS