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Os pontos quânticos do infravermelho próximo biocompatíveis

fornecidos à pele por adesivos de microagulha registram a
vacinação

Financiamento:

Este trabalho foi financiado pela bolsa OPP 1150646 da Fundação Bill & Melinda Gates. O
apoio da bolsa de estudos para KJM foi fornecido pelo Prêmio Nacional de Serviço de Pesquisa
NIH Ruth L. Kirschstein (F32EB022416). LJ agradece a Associação de Promoção de Inovação
Juvenil CAS (2018042), a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81671755) e o
Conselho de Bolsas de Estudo da China (201604910444) pelo apoio financeiro. Este trabalho foi
apoiado em parte pelo Koch Institute Support (core) Grant P30-CA14051 do National Cancer
Institute. Este trabalho foi realizado em parte no Centro da Universidade de Harvard para
Sistemas em nanoescala (CNS), um membro da Rede Nacional de Infraestrutura Coordenada de
Nanotecnologia (NNCI), que é apoiado pela National Science Foundation sob o prêmio NSF
no. 1541959.

Science Translational Medicine, 18 de dezembro de 2019:

Vol. 11, Edição 523, eaay7162
DOI: 10.1126 / scitranslmed.aay7162

No registro
As vacinas previnem doenças e salvam vidas; no entanto, a falta de manutenção de registros de
imunização padronizados torna difícil rastrear a cobertura de vacinas em todo o
mundo. McHugh et al.desenvolveu microagulhas solúveis que distribuem padrões de
micropartículas emissoras de luz no infravermelho próximo à pele. Os padrões de partículas são
invisíveis a olho nu, mas podem ser visualizados usando smartphones modificados. Ao
administrar uma vacina em conjunto, o padrão de partículas na pele pode servir como um
registro de vacinação pessoal. Os padrões foram detectados 9 meses após a entrega
intradérmica de micropartículas em ratos, e a co-entrega de poliovírus inativado levou à
produção de anticorpos protetores. Padrões de micropartículas distribuídas por microagulhas
discretas em pele humana pigmentada e porcina foram identificáveis usando aprendizado de
máquina semiautomático. Estes resultados demonstram prova de conceito para manutenção de
registros de vacinação intradérmica em pessoa.

Resumo
A manutenção de registros médicos precisos é um grande desafio em muitos locais de poucos
recursos, onde não existem bancos de dados centralizados e bem mantidos, contribuindo para
1,5 milhão de mortes evitáveis por vacinas anualmente. Aqui, apresentamos uma abordagem
para codificar o histórico médico de um paciente usando a distribuição espacial de pontos
quânticos biocompatíveis no infravermelho próximo (NIR QDs) na derme. Os QDs são invisíveis
a olho nu, mas detectáveis quando expostos à luz NIR. QDs com um núcleo de seleneto de
cobre e índio e concha de sulfeto de zinco dopado com alumínio foram ajustados para emitir no
espectro NIR por meio do controle da estequiometria e do tempo de conchagem. A formulação
que apresentou maior resistência ao fotobranqueamento após exposição solar simulada
(equivalência de 5 anos) através de pele humana pigmentada foi encapsulada em
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micropartículas para uso in vivo. Em paralelo, A geometria da microagulha foi otimizada in silico
e validada ex vivo usando pele humana sintética e suína. Micropartículas contendo QD foram
então incorporadas em microagulhas solúveis e administradas a ratos com ou sem
vacina. Imagens longitudinais in vivo usando um smartphone adaptado para detectar luz NIR
demonstraram que os padrões de QD fornecidos por microagulhas permaneceram brilhantes e
puderam ser identificados com precisão usando um algoritmo de aprendizado de máquina 9
meses após a aplicação. Além disso, a co-entrega com a vacina de poliovírus inativada produziu
títulos de anticorpos neutralizantes acima do limite considerado protetor. Essas descobertas
sugerem que QDs intradérmicos podem ser usados para codificar informações de forma
confiável e podem ser entregues com uma vacina,

INTRODUÇÃO
As vacinas são excepcionalmente seguras e eficazes, salvando cerca de 2 milhões a 3 milhões
de vidas anualmente ( 1 ). No entanto, a cada ano, 1,5 milhão de mortes evitáveis por vacinas
ocorrem devido à sub vacinação - principalmente em áreas do mundo em desenvolvimento com
infraestrutura precária de saúde ( 2 ). Uma barreira importante para melhorar a cobertura vacinal
nessas regiões é a incapacidade de identificar com precisão o status de imunização de bebês
devido a restrições de recursos, o que pode afetar a qualidade do atendimento prestado
( 3 , 4 ). Essas áreas muitas vezes carecem de sistemas precisos de registros médicos e
dependem de campanhas de vacinação para distribuir as vacinas. No entanto, as investigações
em resposta a surtos recentes de sarampo e caxumba nos Estados Unidos ( 5), Austrália ( 6 ) e
Itália ( 7 ) destacaram que a manutenção inadequada de registros de imunização não é exclusiva
das nações em desenvolvimento.

Cartões ou certificados de vacinação em papel são os registros mais amplamente usados no

mundo em desenvolvimento, mas estão sujeitos a erros ( 8 ) e são possuídos por apenas 60%
de todas as famílias em países de baixa e média renda ( 9 ). Sem registros de vacinação
precisos, os profissionais de saúde não têm os dados necessários para tomar decisões
informadas sobre a administração de vacinas, muitas vezes contando com a memória dos pais
( 10 ). Isso pode resultar na aplicação de doses adicionais desnecessárias de vacina e, portanto,
em custos indevidos ou, mais problemático, em oportunidades perdidas de vacinação, o que
deixa a criança em risco de contrair doenças infecciosas ( 8 , 10 ). Até dois terços das
oportunidades de vacinação podem ser perdidas em algumas áreas (11 ), levando a uma
potencial queda de 30% na cobertura vacinal ( 3 ). Várias soluções foram propostas, incluindo
aplicativos de banco de dados baseados em smartphone ( 12 ), impressão digital ( 13 ) e chips
de comunicação de campo próximo ( 14 ); no entanto, esses métodos mais avançados
tecnologicamente ainda não alcançaram uma adoção generalizada devido à dificuldade de
implementação.

Portanto, nosso objetivo foi desenvolver uma plataforma que seja robusta, barata e fácil de usar
para superar os principais obstáculos à implementação no mundo em desenvolvimento. Nossa
hipótese é que as informações, como o histórico de vacinação, podem ser codificados
invisivelmente na pele, aplicando um padrão distinto de micropartículas fluorescentes no
infravermelho próximo (NIR) usando um patch de microagulha. Ao fornecer todas as informações
necessárias sobre os próprios pacientes e entregar micropartículas nas mesmas microagulhas
que a vacina, esta plataforma oferece várias vantagens principais em comparação com papel
tradicional ou prontuários eletrônicos, incluindo o seguinte: (i) a eliminação da dependência de
amplamente acessíveis , banco de dados seguro de informações do paciente; (ii) falta de
confiança na identificação precisa do paciente e na entrada de dados por profissionais
médicos; (iii) capacidade de fazer determinações rápidas do estado de vacinação; (iv) eliminação
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da fraude de vacinação; (v) capacidade de avaliação da cobertura vacinal em nível

populacional; e (vi) custo mínimo viável de implementar em ambientes com poucos
recursos. Usando um fator de forma de microagulha, esta plataforma deve ser facilmente
assimilada no futuro cenário de vacinação porque microagulhas estão atualmente em
desenvolvimento para várias vacinas (15 ) e têm mostrado vantagens como economia de dose
de antígeno, estabilidade melhorada do antígeno e facilidade de (auto-) administração em
comparação com as injeções solúveis tradicionais ( 16 - 18 ). Os adesivos de microagulha para
manutenção de registros de vacinação podem não exigir o armazenamento da cadeia de frio e
podem ter uma vida útil longa, o que pode aumentar muito a viabilidade de implementação em
locais com poucos recursos.

RESULTADOS

Corante comercial e caracterização de pontos quânticos personalizados

Para criar uma plataforma de microagulha que pudesse ser aplicada à pele, dissolver
rapidamente e deixar para trás as partículas que posteriormente podem ser visualizadas para
determinar o estado de vacinação ( Fig. 1, A a C ), primeiro precisamos identificar um candidato
adequado para detecção de termos. Começamos investigando o uso de fluoróforos comerciais
com emissão no espectro NIR (fig. S1). Para examinar a resistência ao fotodegradação, um
critério-chave para uso em nossa aplicação, os corantes fluorescentes foram cobertos com pele
humana cadavérica pigmentada e expostos à luz que simula o espectro solar em uma
intensidade sete vezes maior. Apesar de ser fortemente protegido da luz pela pele humana
sobreposta, os fluoróforos orgânicos fotobranqueamento dentro de algumas semanas de
exposição solar simulada ( Fig. 1D) Alternativamente, os corantes comerciais inorgânicos
demonstraram resistência considerável ao fotobranqueamento, mas exibiram baixa intensidade
de fluorescência por massa e eram difíceis de processar devido à sua insolubilidade tanto em
água quanto em solventes orgânicos. Em seguida, buscamos o uso de pontos quânticos
coloidais (QDs), também conhecidos como nanocristais semicondutores, como sondas
fluorescentes potenciais devido ao seu brilho favorável e fotoestabilidade. Sintetizamos e
caracterizamos mais de 60 combinações distintas de núcleos de seleneto de cobre e índio e
cascas de ZnS: Al (tabela S1). Alterando a estequiometria do núcleo e a espessura da casca,
pudemos controlar o comprimento de onda de emissão de pico ( Fig. 1E ), aumentar o
rendimento quântico de fotoluminescência (PL QY) ( Fig. 1F), e afetam outras propriedades
ópticas (figs. S2 e S3 e tabela S2). Por exemplo, em uma formulação QD, realizar o processo de
descascamento por 5 horas resultou em um aumento de PL QY de 16,2 para 43,6% e um desvio
para o azul no pico de emissão de 964 para 891 nm.
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Fig. 1 Esquemática da plataforma e caracterização da sonda fluorescente.

( A ) As micropartículas fluorescentes são distribuídas através de uma matriz de microagulhas

solúveis em um padrão espacial distinto. ( B ) As microagulhas são então aplicadas na pele por 2
a 5 min, resultando na dissolução da matriz da microagulha e retenção das micropartículas
fluorescentes. ( C ) Um LED NIR e um smartphone adaptado são usados para padrões de
imagem de micropartículas fluorescentes retidas na pele. Ao incorporar seletivamente
micropartículas dentro de microagulhas usadas para administrar uma vacina, o padrão resultante
de fluorescência detectado na pele pode ser usado como um registro do paciente da história de
vacinação de um indivíduo. ( D ) Fotobranqueamento rápido de corantes orgânicos cobertos com
pele humana pigmentada sob luz solar simulada. ( E) Os perfis de emissão de QDs (linhas
sólidas) mostram uma mudança para o azul com o aumento do tempo de bombeamento. A linha
tracejada representa a absorção pela amostra de descascamento de 5 horas. As setas indicam
o eixo y relevante para absorção (esquerda) e emissão (direita). au, unidades arbitrárias. ( F ) PL
QY em função do tempo de casca sob diferentes comprimentos de onda de excitação. ( G )
Comparação da intensidade de fotoluminescência relativa de QDs com os corantes inorgânicos
comerciais IRDC2 e IRDC3 (barras azuis) e picos de emissão correspondentes (círculos roxos
vazios e quadrados). ( H ) Fotoestabilidade de QDs cobertos com pele humana pigmentada sob
luz solar simulada. ( Eu) Microscopia eletrônica de transmissão (TEM) e TEM de alta resolução
(inserção) mostrando o tamanho e a estrutura cristalina de ZnS: Al-revestido
CuInSe 2 QDs. Barras de escala, 20 e 5 nm, respectivamente. n = 3 para todos os gráficos
contendo barras de erro. Barras de erro indicam SD.

Em seguida, selecionamos cinco formulações QD com picos de emissão variando de 828 a 891
nm para otimizar a transmissão e detecção de luz in vivo ( Fig. 1G ). Esses QDs foram expostos
à luz solar simulada através da pele pigmentada de cadáveres a sete vezes a intensidade do sol
por um período que simulou 5 anos de exposição dia / noite. Uma formulação QD, S10C5H,
demonstrou resistência substancialmente maior ao fotobranqueamento do que outras
formulações ( P <0,05), retendo 13 ± 3% do sinal após cinco anos simulados em comparação
com o próximo melhor candidato, que reteve apenas 4 ± 2% de seu sinal inicial ( Fig. 1H) Isso
representou uma melhoria de cerca de 50 vezes na resistência ao fotobranqueamento em
comparação com os corantes orgânicos de alto desempenho testados. Como resultado, S10C5H
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foi escolhido para experimentos subsequentes. Esses QDs tinham 3,7 ± 0,6 nm de diâmetro e
exibiam a estrutura da fase calcopirita característica do CuInSe 2 bruto ( Fig. 1I e Fig. S4).

Encapsulamento QD
Após a síntese, um subconjunto de S10C5H QDs foi encapsulado em microesferas de poli
(metacrilato de metila) (PMMA) usando uma emulsão espontânea / técnica de evaporação de
solvente ( Fig. 2, A a D ). Os parâmetros de emulsão, como concentração de surfactante e
velocidade de homogeneização, foram refinados para produzir partículas que continham 60% de
QDs em massa com um tamanho médio de 15,7 ± 5,3 μm ( Fig. 2E ). Os QDs encapsulados
exibiram um pico de emissão semelhante, mas ligeiramente desviado para o vermelho, devido à
transferência de energia de ressonância de Förster em QDs compactados ( Fig. 2F ). Apesar da
perda de cerca de 40% do sinal por massa devido à presença de PMMA, essas partículas ainda
exibiam fluorescência brilhante ( Fig. 2G ), que era estável por meses em solução salina
tamponada com fosfato (PBS) a 37 ° C (Fig. 2H ). QDs embutidos em PMMA também
demonstraram intensidade de fluorescência consistente em uma faixa de pH que seria
fisiologicamente relevante no fagolisossomo (fig. S5).

Fig. 2 Encapsulação e caracterização de QDs em microesferas de PMMA.

Imagens de microscopia de luz de microesferas de PMMA carregadas com ( A ) 0% (p / p) QDs,

( B ) 37,5% (p / p) QDs e ( C ) 60% (p / p) QDs. ( D ) Imagem SEM de micropartículas de PMMA
contendo S10C5H QDs. ( E ) Histograma de distribuição de partículas volumétricas suavizado
usando uma função de suavização de janela móvel de 11 quadros para maior clareza, n =
10 4 partículas analisadas. ( F ) Perfis de fotoluminescência de S10C5H QDs antes e depois do
encapsulamento de PMMA mostrando uma mudança mínima no comprimento de onda de
emissão de fluorescência. ( G ) Intensidades de fotoluminescência relativa (barras azuis) usando
um filtro passa-longa de 850 nm ( n= 2) e picos de emissão (círculos roxos vazios). ( H )
Manutenção da intensidade da fotoluminescência em PBS a 37 ° C ao longo dos meses ( n = 3),
com imagens NIR representativas embutidas em seus respectivos pontos de tempo; * P <0,05
(ANOVA de um fator com comparações múltiplas de Tukey). A linha tracejada indica o ponto de
saturação da câmera. Barras de erro indicam SD.

Otimização da geometria da microagulha

Para determinar a geometria de microagulha ideal para esta aplicação, a análise de elementos
finitos foi realizada. Cinquenta formas que variam de um cone a um cilindro a uma altura fixa de
1500 μm foram analisadas mecanicamente para garantir a entrega profunda de QDs em uma
camada de pele permanente (sem queda) (figs. S6 e S7). Os critérios importantes do projeto
foram fornecer ampla resistência a falhas mecânicas e, ao mesmo tempo, atingir um alto volume
de entrega, definido como o volume próximo à ponta da microagulha em dissolução. A análise de
elementos finitos identificou que microagulhas com diâmetros de 100 ou 200 μm eram propensas
a falhas devido à flexão e carregamento axial; portanto, todos os estudos subsequentes usaram
6

agulhas de 300 μm de diâmetro.Fig. 3 e figs. S6 e S7). O aumento de α geralmente contribuiu

para um maior volume de droga administrável, melhor resistência à flambagem e diminuição da
tensão máxima e deslocamento sob carga axial enquanto aumenta a tensão máxima sob
dobra. A partir dessas simulações, um valor de 0,5 foi selecionado para α. A tensão máxima de
von Mises para nossa geometria de microagulha escolhida sob flexão e carregamento axial foi
de 9,46 e 8,71 MPa, respectivamente; o deslocamento axial e de flexão foram considerados
desprezíveis e o fator de carga crítica foi de 0,0146 (fig. S6). Depois de considerar esses fatores
junto com o volume distribuível, uma microagulha com uma base cilíndrica de 300 μm de largura
que tinha 750 μm de altura e um cone superior de 750 μm de altura foi selecionada como
candidata líder para um estudo mais aprofundado.

Fig. 3 Modelagem, fabricação e avaliação da microagulha.

Imagens ópticas de microagulhas e dados de análise de elementos finitos de ( A e B ) uma

agulha cônica de 1500 μm de altura e 300 μm em sua base; ( C e D ) uma microagulha de 300
μm em sua base com um cone de 750 μm no topo de um cilindro de 750 μm; e ( E e F ) uma
microagulha de 300 μm em sua base com um cone de 250 μm no topo de um cilindro de 1250
μm. ( G ) Imagem SEM de uma matriz de microagulhas solúvel com base na geometria mostrada
em (C). ( H ) Força de penetração ex vivo por agulha com base na geometria da
microagulha; n = 3; *** P <0,001 e **** P < 0,0001 (ANOVA de um fator com comparações
múltiplas de Tukey). (I ) Requisitos de força de penetração independentes de espaçamento em
pele de porco ex vivo ( teste t de Student ). Em (B), (D) e (F), 0 e 100 representam o pior e o
melhor valor, respectivamente, para cada parâmetro de α entre 0 e 1.

Para verificar os dados de modelagem in silico, selecionamos três matrizes 3 × 3 de

microagulhas: Um cone de 1500 μm ( Fig. 3, A e B ), um cilindro / cone de 750/750-μm ( Fig. 3,
C e D ), e um cilindro / cone de 1250/250 μm ( Fig. 3, E e F ) foram impressos usando
polimerização de dois fótons para criar um molde mestre em fotorresiste. Essas formas foram
mantidas quando os mestres fotoresistentes foram usados para produzir moldes de
polidimetilsiloxano inverso (PDMS) e microagulhas dissolvíveis, em última análise, compostas
por poli (álcool vinílico) e sacarose ( Fig. 3G ).

A força necessária para penetrar a pele humana sintética ou pele de porco explantada com
agulhas otimizadas com in silico não degradáveis (cilindro / cone 750/750-μm) não foi
significativamente diferente das agulhas cônicas ( P = 0,46 e P = 0,07, respectivamente), que
têm foi necessário um volume distribuível menor, mas substancialmente menos força do que as
agulhas mais rombas (cilindro / cone de 1250/250 μm) ( Fig. 3H ). Diminuir o espaçamento das
microagulhas de 3,23 para 1,57 mm (tamanhos de remendo de 1 cm por 1 cm e 0,5 cm por 0,5
cm, respectivamente) não afetou a quantidade de força necessária para a penetração ( Fig.
7

3I) Como resultado, confirmamos nossa seleção de microagulhas com altura de 1500 μm,
diâmetro de 300 μm e α de 0,5 como a melhor combinação de profundidade de penetração,
resistência à fratura mecânica e capacidade máxima de liberação de micropartículas.

Design de sistema de imagem de smartphone e penetração ex vivo na pele

Para habilitar a geração de imagens de NIR QDs em um ambiente de campo, projetamos um
sistema de geração de imagens barato baseado em smartphone. Um diodo emissor de luz (LED)
NIR de 780 nm foi emparelhado com um filtro de passagem curta de 800 nm e condensador
asférico com difusor para excitar os QDs ( Fig. 4A ). Para a detecção de fluorescência NIR, um
smartphone Nexus 5X (Google) foi retirado de seu filtro NIR de passagem curta e emparelhado
com um filtro de vidro colorido de passagem longa de 850 nm e um filtro dielétrico de passagem
longa de 850 nm definido em um poli ( ácido lático) tridimensional (3D) - capa de telefone
impressa ( Fig. 4B ). A obtenção de imagens de um patch de microagulha carregado com QD
com e sem os filtros de emissão de passagem longa demonstrou a capacidade de filtrar a luz de
fundo enquanto retém a transmissão do sinal NIR QD ( Fig. 4, C e D) Todas as imagens foram
realizadas sob iluminação ambiente interna, sem medidas tomadas para reduzir o fundo do
ambiente.

Fig. 4 Modificações do smartphone e detecção de marcação NIR na pele.

( A ) Fotografia do LED desmontado usado para iluminação NIR em 780 nm combinado com um
filtro de passagem curta de 800 nm e condensador asférico. ( B ) Fotografia de smartphone de
imagem NIR desmontado, consistindo em um smartphone Google Nexus 5X com o filtro de
passagem curta interno removido e substituído por dois filtros de passagem longa externos de
850 nm em uma capa de telefone impressa em 3D. Imagens de um patch de microagulha de 16
agulhas contendo QDs encapsulados em PMMA foram coletadas com o smartphone adaptado
sob iluminação interna ambiente ( C ) sem os filtros passa-longa de 850 nm e ( D ) com o par de
filtros passa-longa de 850 nm sob iluminação LED da mesma distância. A inserção mostra uma
imagem com uma exposição mais alta. ( E ) Ótico e (F ) Imagens SEM de microagulhas
carregadas com micropartículas fluorescentes antes da aplicação na pele. ( G ) Imagens ópticas
e ( H ) SEM de microagulhas após a administração em pele de porco explantada. Imagens
adaptadas de smartphone de pele de porco antes da aplicação da microagulha ( I ) sem e ( J )
8

com filtros passa-longa de 850 nm. Imagens adaptadas de pele de porco em smartphone após a
aplicação ( K ) sem e ( L ) com filtros passa-longa de 850 nm. Imagens adaptadas de
smartphones de pele humana pigmentada antes da aplicação com microagulha ( M ) sem e ( N )
com os filtros passa-longa de 850 nm. Imagens de smartphone de pele humana após a aplicação
( O) sem e ( P ) com os filtros passa-longa de 850 nm. Nota: As barras de escala em imagens
filtradas por NIR são aproximadas com (J), (L), (N) e (P) tomadas aproximadamente à mesma
distância. Componentes em (A) e (B) cortados para maior clareza.

Em seguida, testamos a capacidade das microagulhas de distribuir micropartículas fluorescentes

em amostras de tecido explantado. Um aplicador simples com mola foi usado para administrar
microagulhas em pele de porco ex vivo e pele de cadáver humano por um período de 2 minutos,
de acordo com o tempo de uso ideal identificado pela organização global de saúde PATH
( 19 ). Antes da aplicação, as microagulhas pareciam afiadas com pontas opticamente escuras
onde as micropartículas carregadas com QD foram incorporadas ( Fig. 4, E e F ). Após a
aplicação, as microagulhas foram embotadas como resultado da dissolução parcial da ponta
( Fig. 4, G e H) Embora muitas micropartículas fluorescentes tenham permanecido dentro do
corpo da agulha, a transferência de partículas carregadas com QD da matriz de microagulhas 4
× 4 em pele de porco ( Fig. 4, I a L ) e pele humana pigmentada ( Fig. 4, M para P ) era óbvio
quando fotografado usando nossa câmera de smartphone adaptada NIR, mas não aparente a
olho nu, como pretendido.

Imagens de padrões, análise manual e reconhecimento de padrões baseado em

aprendizado de máquina
Depois de confirmar a penetração e dissolução ex vivo, um estudo de 8 dias foi realizado para
avaliar a entrega in vivo. Emplastros de microagulha contendo QDs foram administrados no
flanco traseiro de ratos Wistar, conforme mostrado no filme S1. Antes da administração, os pelos
no local da aplicação foram removidos com barbeador elétrico e creme depilatório. As
microagulhas foram aplicadas usando um aplicador com mola e mantidas no lugar por 2 min
para permitir a dissolução parcial. Este estudo revelou a importância de encapsular os QDs para
garantir seu parto e permanência prolongada no corpo. Os QDs não encapsulados resultaram
em uma transferência muito pequena e inconsistente para a pele, provavelmente devido à sua
hidrofobicidade ( Fig. 5A) Alternativamente, os QDs encapsulados mostraram uma transferência
muito maior de fluorescência para a pele que resultou em um sinal NIR que foi 10 vezes maior
do que os QDs não encapsulados ( Fig. 5B ). Ao longo dos dias após a administração, o sinal de
QDs não encapsulados não era mais aparente após 24 horas, enquanto o sinal de QDs
encapsulados diminuiu nos primeiros 2 dias após a aplicação, mas depois pareceu estabilizar
( Fig. 5C ).
9

Fig. 5 Imagem in vivo de padrões NIR na pele de roedores.

Local de administração após a entrega de um adesivo de microagulha 4 × 4 contendo ( A ) QDs

não encapsulados ou ( B ) QDs encapsulados em PMMA. ( C ) Estudo de curto prazo da
intensidade do sinal após a aplicação de microagulha de QDs não encapsulados ou
encapsulados em PMMA na pele de rato, n = 4. Imagens de ( D ) círculo, ( E ) cruz e ( F )
padrões retangulares registrados 24 semanas após administração de QDs encapsulados em
PMMA a ratos. Mapas de cores em escala logarítmica do mesmo círculo ( G ), ( H ) cruz e ( I )
padrões de retângulo mostrados em (D) e (F). ( J) Número de marcações detectadas 24
semanas após a administração, n = 5. ( K ) Quantificação da razão sinal-ruído para o padrão de
círculo que não mostra alterações entre 12, 24 e 36 semanas, n = 15 (ANOVA de uma via com
Comparações múltiplas de Tukey). ( L ) Gráfico mostrando a probabilidade média do algoritmo
de aprendizado de máquina (todos os padrões detectados corretamente), n = 5. Imagens em
tons de cinza extraídas do canal vermelho da imagem Red Green Blue (RGB) gerada por
smartphone adaptada.

Em seguida, para testar a longevidade das micropartículas de PMMA contendo QD in vivo,

administramos adesivos contendo oito microagulhas em um dos três padrões distintos - um
círculo no dia 0, uma cruz no dia 28 e um retângulo no dia 56 - e realizados longitudinalmente
imagem ao longo de 9 meses ( Fig. 5, D a I ). No dia da aplicação, as marcas eram visíveis na
pele para 100% das agulhas (120 de 120) com contraste muito alto. No ponto de 24 semanas,
92% (110 de 120) permaneceram visíveis com contraste um pouco menor do que no dia da
aplicação. O número de marcas por padrão neste momento foi 7,3 ± 0,8, que foi amplamente
independente da distribuição espacial das microagulhas no momento da administração (7,4 ±
0,8, 7,2 ± 0,8 e 7,4 ± 0,8 para o círculo, cruz e retângulo , respectivamente) ( Fig. 5J) As marcas
fluorescentes exibiram um sinal médio que foi 29, 23 e 29 vezes maior do que o fundo em 3, 6 e
9 meses após a administração, respectivamente, ao considerar o agregado de todos os padrões
10

( Fig. 5K ). Não houve diferenças estatísticas entre o sinal em 3 e 6 meses ( P = 0,53), 3 e 9

meses ( P = 0,998), ou 6 e 9 meses ( P = 0,50).

Embora os padrões fossem fáceis de identificar manualmente, nosso objetivo era automatizar
esse processo para melhorar sua facilidade de implementação e, portanto, o impacto clínico
potencial. Para eliminar a necessidade de treinamento de pessoal e minimizar as oportunidades
de erro humano, desenvolvemos um algoritmo de aprendizado de máquina baseado na rede
neural AlexNet ( 20 ) para classificar automaticamente cada padrão (fig. S8). Usando essa rede
neural, fomos capazes de classificar corretamente 100% dos padrões de imagem de teste (210
imagens no total) que foram coletados quinzenalmente por até 30 semanas. Além de classificar
corretamente todos os padrões, a probabilidade dessas classificações também era muito alta,
sem tendência para probabilidades mais baixas ao longo do tempo ( Fig. 5L) Das 210 imagens
analisadas, a probabilidade de classificação mais baixa para a imagem foi de 98,4% para o
padrão cruzado em um rato no dia 154. Esses dados sugerem que as mudanças na intensidade
do sinal ocorrem logo após a administração (dentro de 3 meses), mas isso não afeta a detecção
confiabilidade. Isso também é apoiado por imagens qualitativas mostradas na Fig. 6 que
retratam os sinais do dimmer entre 0 e 12 semanas, mas nenhuma perda substancial adicional
entre 12 e 24 semanas.

Fig. 6 Imagem longitudinal de marcações NIR na pele de roedores.

Cortadas, mas de outra forma brutas, imagens de smartphone coletadas de uma distância fixa
mostrando o sinal NIR intradérmico de QDs encapsulados em PMMA entregues por meio de
adesivos de microagulha em ratos 0, 12 e 24 semanas após a administração. O texto na parte
inferior de cada imagem indica as configurações de coleta de imagens, densidade ISO e
velocidade do obturador (SS) em segundos.
11

Biocompatibilidade de micropartículas carregadas com QD e entrega em conjunto com

vacina de poliomielite
Em seguida, procuramos testar a biocompatibilidade in vitro e in vivo de nossos QDs. A
avaliação in vitro da citotoxicidade confirmou que nossos QDs personalizados compostos
de núcleos CuInSe 2 e cascas de ZnS: Al eram menos tóxicos para macrófagos do que PbS QDs
disponíveis comercialmente com um tratamento de superfície de ácido oleico semelhante ( Fig.
7A ). Considerando que nenhuma toxicidade dependente da dose foi observada na faixa de
concentrações testadas de S10C5H QD, observamos uma tendência na toxicidade de PbS QD
com uma queda significativa na viabilidade celular a 1000 μg / ml ( P < 0,05).

Fig. 7 Resposta biológica a QDs encapsulados em PMMA.

( A ) Citotoxicidade in vitro de PbS QDs disponíveis comercialmente em comparação com

S10C5H QDs não encapsulados e encapsulados em PMMA ao longo de 24 horas em uma linha
de células de macrófagos de camundongo (Raw 264,7). n = 3, * P < 0,05, *** P < 0,001 e **** P
< 0,0001 (ANOVA de dois fatores com comparações múltiplas de Tukey). Amostras histológicas
representativas coletadas de ratos que receberam partículas de PMMA distribuídas por
microagulha contendo S10C5H QDs ( B e C ) 1 dia, ( D e E ) 2 semanas, e ( F e G) 4 semanas
após a administração corada com hematoxilina e eosina ou tricrômico de Masson,
respectivamente. As setas indicam a localização das micropartículas. ( H ) Títulos totais de
anticorpo anti-poliovírus tipo 2 imunoglobulina G e ( I ) títulos de anticorpos neutralizantes de
poliovírus tipo 2 que não mostram diferenças após três doses de IPV2 administradas por meio de
injeções subcutâneas ou microagulhas com ou sem QDs encapsulados em PMMA, n =
5. Tracejado a linha indica o limite acima do qual os humanos são considerados imunes.

O exame histológico da resposta local do tecido revelou dano ao tecido consistente com a
penetração da agulha 1 dia após a administração ( Fig. 7, B e C ). Uma reação de corpo
12

estranho mínima foi observada em 2 semanas ( Fig. 7, D e E ) e 4 semanas ( Fig. 7, F e G) Em

ambos os momentos posteriores, parecia haver um pequeno número de macrófagos e células
gigantes de corpo estranho no local da administração. Não foi observada encapsulação fibrosa
ao longo dos pontos de tempo coletados, apoiando a biocompatibilidade das micropartículas. Em
geral, esses resultados sugerem que os QDs S10C5H encapsulados em PMMA permanecem
amplamente locais e são bem tolerados pelo corpo. Estas observações estavam de acordo com
a observação visual de animais vivos ao longo dos dias após a administração da microagulha,
que não mostrou sinais óbvios de irritação após a data da aplicação.

Para observar a compatibilidade desta abordagem com a entrega da vacina, avaliamos a

resposta imune a três doses de vacina de poliovírus inativado Salk tipo 2 (IPV2) administrada em
0, 1 e 2 meses com ou sem micropartículas carregadas com QD. IPV2 coadministrado com
títulos de anticorpos IPV2 totais e neutralizantes induzidos por micropartículas que não eram
estatisticamente diferentes ( P = 1,00 e P = 0,91, respectivamente) daqueles alcançados por
IPV2 administrado apenas por microagulhas ( Fig. 7, H e I ). Os títulos totais e neutralizantes
induzidos por microagulhas contendo micropartículas carregadas com QD e IPV2 também foram
não inferiores a três injeções subcutâneas de IPV2 ( P = 0,25 e P =0,32, respectivamente)
apesar do uso de uma formulação subótima, sugerindo um forte efeito poupador de dose porque
apenas 25 ± 2% da vacina reteve sua D-antigenicidade durante a fabricação da microagulha e
uma grande fração de IPV2 permaneceu não entregue nas microagulhas incompletamente
dissolvidas. Apesar da dose substancialmente mais baixa de antígeno entregue em sua
conformação que confere imunidade, os anticorpos neutralizantes alcançados estavam bem
acima do limite considerado protetor pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos
Estados Unidos ( 21 ).

DISCUSSÃO
Para maximizar a utilidade dessa tecnologia para campanhas de vacinação, nosso objetivo foi
criar uma plataforma compatível com vacinas administradas por microagulha que pudesse
codificar dados de um indivíduo de forma confiável por pelo menos 5 anos após a
administração. Além disso, esse sistema também precisava ser altamente biocompatível,
entregar uma quantidade suficiente de corante após um tempo de aplicação de 2 min ou menos
e ser detectável usando um smartphone minimamente adaptado. Dadas as limitações de
corantes orgânicos (fotobranqueamento e solubilidade em água) e corantes inorgânicos
[toxicidade de metais de terras raras ( 22), baixa fluorescência e dificuldade de processamento],
os QDs foram uma opção atraente como uma alternativa potencialmente brilhante, fotoestável e
ajustável. No entanto, a implementação clínica de QDs foi impedida pela toxicidade de seus
elementos centrais, como cádmio e chumbo ( 23 ). Para superar essas preocupações de
segurança - que são especialmente importantes porque esses materiais seriam dados a crianças
saudáveis - optamos por sintetizar QDs personalizados compostos de elementos mais bem
tolerados. Identificamos uma faixa de emissão fluorescente ideal de 850 a 1100 nm. Operar
nesta faixa atenua a potencial oposição cultural às marcas visíveis da pele, reduz o fundo da luz
ambiente, minimiza a absorção de luz pelo tecido em comprimentos de onda abaixo de 850 nm
( 24) e maximiza a detecção de sinal, evitando a baixa sensibilidade de detectores à base de
silício baratos à luz acima de 1100 nm ( 25 ). Embora o uso de fluoróforos na extremidade
superior da janela NIR-II (1000 a 1700 nm) melhoraria ainda mais a transparência do tecido e
reduziria o fundo ( 26 ), detectores apropriados para esses comprimentos de onda (arseneto de
índio e gálio) são normalmente considerados de custo proibitivo ( 27 ), o que poderia tornar essa
abordagem inviável para implementação generalizada.
13

O fotobranqueamento com fluoróforo sob acelerada exposição à luz solar nos permitiu prever a
perda de sinal associada à exposição ao sol por longos períodos de tempo. Como esperado, os
fluoróforos orgânicos degradaram-se com relativa rapidez, apesar da proteção da pele
fortemente pigmentada, que absorve uma grande fração da luz ultravioleta (UV) e visível. Esses
corantes também exibiram forte auto-extinção no estado seco e, portanto, tiveram que ser
estudados no estado disperso e hidratado. Esta propriedade de auto-extinção é problemática
para este sistema de gravação fornecido com microagulha porque limita a densidade de
empacotamento do corante e, portanto, seu brilho. Alternativamente, os QDs tiveram um
desempenho muito bom sob exposição à luz e têm um deslocamento de Stokes maior, o que os
permite evitar uma reabsorção substancial e, portanto, ser usados em um formato densamente
compactado.

Embora o ensaio de fotobranqueamento acelerado não imite perfeitamente o caso de uso do

mundo real, ele fornece evidências que sustentam a longevidade dos QDs em comparação com
os corantes orgânicos. Além disso, esta configuração experimental pode superestimar o
fotodegradação porque assume que a pele está sob luz solar direta a cada hora do dia em que o
sol está fora. Se administrado na coxa, onde as vacinas atuais são administradas a bebês, essa
área pode ser coberta por roupas e / ou em uma área que não seja exposta à luz solar direta por
alguma parte do dia. Além disso, o fotobranqueamento também pode ser aprimorado neste
experimento porque a luz sete vezes mais intensa resulta em maior transferência de energia por
tempo, potencialmente permitindo que a degradação do QD prossiga mais rapidamente.

PMMA foi usado como um material encapsulante não degradante para QDs para melhorar a
biocompatibilidade e aumentar a permanência do tecido. O grande tamanho das micropartículas
(15,7 ± 5,3 μm) também foi hipotetizado para minimizar a depuração porque estudos anteriores
mostraram que as partículas maiores são mais resistentes à depuração por macrófagos, o tipo
de célula mais relevante para a limpeza de material estranho ( 28 ). A flexibilidade do
revestimento de superfície QD também nos permitiu tornar os QDs solúveis no mesmo solvente
orgânico que o PMMA, o que ajudou a melhorar significativamente o carregamento, dado que
uma técnica de emulsão dupla tradicional (água em óleo em água) não pode atingir 60% (w / w)
carregando.

Nossa hipótese é que, ao contrário das vacinas fornecidas por microagulha, que devem
simplesmente quebrar a barreira de água da pele para fornecer sua carga útil de forma eficaz
( 29 ), essas micropartículas fluorescentes devem ser distribuídas abaixo das camadas de pele
removidas para garantir sua residência de longo prazo no tecido. Portanto, nosso objetivo foi
criar agulhas de 1500 μm de comprimento. Para penetrar com sucesso nesta profundidade, as
microagulhas devem resistir ao estresse mecânico, deflexão e deslocamento após a inserção na
pele. Para fornecer QDs encapsulados em PMMA de forma eficaz na pele, as microagulhas
devem perfurar a pele sem fraturar. O fator de carga crítica de 0,014557 foi maior do que os
valores relatados para microagulhas de carboximetilcelulose usando os mesmos procedimentos
de simulação ( 30) A seleção final de α = 0,5, altura = 1500 μm e largura = 300 μm evita robustez
mecânica criticamente baixa contra todos os principais mecanismos de falha mecânica. Usar um
diâmetro maior e um α maior aumentou o volume do material e, assim, o número de partículas
carregadas com QD que estão disponíveis para transferência para a pele. A desvantagem disso
é o aumento potencial da dor e maiores requisitos de força de penetração. No entanto, embora a
percepção da dor tenha demonstrado aumentar com o diâmetro das agulhas hipodérmicas
( 31 - 33 ), a quantidade de dor induzida por nosso adesivo de microagulha é provavelmente
menor do que para agulhas tradicionais, como foi mostrado em outro lugar ( 34) Além disso, um
estudo anterior mostrou que o ângulo da ponta não afeta significativamente a dor na inserção da
agulha ( 35 ), portanto, o efeito de α (ângulo da ponta efetivo) na percepção da dor não foi
14

considerado. Essas agulhas são ligeiramente menores em diâmetro do que uma agulha de
calibre 30 e, portanto, devem minimizar a dor e a força necessária para a penetração na pele
( 36 ). Por último, o espaçamento lateral das microagulhas resulta em um patch e,
posteriormente, padrão intradérmico, com pegada de 0,25 cm 2 . Este espaçamento foi
suficientemente grande para permitir que cada agulha atue independentemente e, assim, permitir
que os requisitos de força escalem linearmente com o número da agulha ( 37 ).

Na última década, os smartphones se tornaram onipresentes em muitas áreas do mundo,

incluindo o mundo em desenvolvimento, apesar da infraestrutura limitada ( 38) Como esses
telefones oferecem capacidade de processamento on-board, aplicativos de câmera e módulos de
câmera de baixo custo para o consumidor, optamos por adaptar um smartphone existente para
permitir imagens NIR em vez de construir um sistema de imagens completamente novo. Além
disso, acreditamos que a familiaridade com a função desses dispositivos diminuirá a curva de
aprendizado para imagens NIR em um ambiente de campo. Considerando que uma câmera
Nexus 5X padrão é construída com um filtro de passagem curta para evitar que a luz NIR afete
as imagens, queríamos exatamente o oposto - a eliminação da luz na faixa visível e a passagem
da luz NIR. Além disso, precisávamos dos novos filtros para bloquear a luz refletida da
iluminação LED. Portanto, depois de remover o filtro de passagem curta padrão, adicionamos um
par de filtros de passagem longa de 850 nm, que bloqueariam tanto a luz ambiental quanto a
iluminação de LED.39 ). Essas óticas foram encaixadas em uma caixa de telefone impressa em
3D customizada para componentes rosqueados SM1 (1.035 ″ -40) para caber com componentes
óticos disponíveis comercialmente.

Como tanto a excitação quanto a emissão de luz podem ser absorvidas pelo corpo,
precisávamos criar um sistema em que ambos os estágios estivessem dentro da janela de
imagem óptica. Embora os QDs sejam amplamente excitáveis e exibam maior rendimento
quântico quando saem em comprimentos de onda mais baixos (UV e luz visível), a alta absorção
de componentes do tecido como hemoglobina, água e melanina nesses comprimentos de onda
atenua muito o sinal. Dados os estudos anteriores que examinaram a absorção relativa desses
componentes, a excitação em comprimentos de onda mais altos foi considerada
compensadora. Por exemplo, nosso principal candidato, S10C5H, exibiu um PL QY de 43,6 ±
0,1% após excitação com um laser de 405 nm e um PL QY de 31,3 ± 0,1% quando excitado com
um laser de 808 nm, mas seria submetido a um aumento na absorção de hemoglobina e
melanina na ordem de uma unidade logarítmica cada (40 ). Escolhemos usar um LED de 780 nm
em vez de um laser devido ao custo reduzido, questões de segurança e manutenção
combinadas com maior portabilidade. A adaptação de um laser a essa configuração exigiria um
difusor ou divisor de feixe para espalhar a luz, mecanismos de segurança e, potencialmente,
algum tipo de aparelho de resfriamento. Esses componentes adicionariam custo, complexidade e
tamanho, indesejáveis para o uso móvel distribuído. Como alternativa, um LED ofereceu baixo
custo, iluminação inerentemente difusa e vantagens de segurança / energia. A única
consideração necessária para usar um LED foi o perfil de emissão consideravelmente mais
amplo (largura total de 28 nm na metade do máximo); no entanto, isso foi resolvido usando um
filtro de passagem curta simples de 800 nm para garantir um intervalo de 50 nm entre a luz de
excitação e a luz coletada pelo smartphone adaptado.

As imagens NIR coletadas com o smartphone em várias classificações de ISO e velocidade do

obturador foram cortadas manualmente para permitir a comparação da intensidade do sinal NIR
ao longo do tempo. ISO manual e velocidades do obturador foram necessárias para permitir a
comparação longitudinal. A configuração de exposição automática não foi bem adaptada para
imagens NIR, como era de se esperar, e muitas vezes selecionava configurações de exposição
mais altas para tornar o campo mais claro a ponto de o fundo ficar claro e o sinal altamente
15

saturado. A seleção do ISO correto para um padrão foi fundamental para uma análise precisa da
relação sinal-ruído (SNR) e também da classificação do aprendizado de máquina. Para permitir a
quantificação de SNR precisa, foram selecionadas configurações de imagem consistentes que
produziram pixels não saturados em todos os pontos de tempo. No futuro,

A maior redução no sinal identificável do usuário ocorreu logo após a administração, sugerindo
que algumas microagulhas não entregaram micropartículas carregadas com QD a uma
profundidade suficiente - um fenômeno possivelmente exacerbado pela alta elasticidade da pele
de roedor ( 41 ). Uma parte das partículas pode ter sido depositada na pele em vez de na pele e
posteriormente eliminada por perturbação externa. O sinal QD estabiliza rapidamente e, em
seguida, apresenta um SNR bastante consistente em 3, 6 e 9 meses, indicando que a eliminação
de micropartículas provavelmente ocorre principalmente em pontos de tempo iniciais (menos de
3 meses). Isso é ainda suportado pela imagem de padrões in vivo em pontos de tempo curtos,
que mostraram perda considerável nos dias após a aplicação antes da estabilização.

AlexNet foi escolhido por sua precisão de classificação, tendo sido originalmente treinado em
mais de 1 milhão de imagens e tendo demonstrado a capacidade de classificar imagens em
1000 categorias ( 20) Apesar de relativamente poucos dados de treinamento (30 imagens por
padrão), AlexNet classificou as imagens com alta precisão. No geral, 80 imagens foram testadas
para o padrão circular, 70 para o padrão cruzado e 60 para o padrão retangular originado de
cinco aplicações distintas por padrão. A rede neural convolucional baseada em transferência
modificada usando AlexNet forneceu confiança de detecção precisa. Além disso, como não
houve tendência de menor probabilidade de classificação de aprendizado de máquina em 3, 6 e
9 meses, parece que os padrões são estáveis após um período agudo de perda de sinal, que
também é suportado por dados quantitativos de curto prazo e longo prazo dados qualitativos de
longo prazo. Com base em imagens ópticas de microagulhas antes e após a administração,
imagens NIR in vivo e projeções para fotobranqueamento de experimentos in vitro,

Com relação à precisão, os algoritmos de aprendizado de máquina para classificação de imagem

correspondem e normalmente excedem a inspeção manual ( 42 , 43) Considerando que o olho
humano é mal equipado para distinguir diferenças de valores de tons de cinza baixos em
imagens que são escuras ou têm contraste pobre (por exemplo, valores de tons de cinza de 1
versus 10), a capacidade do AlexNet de usar informações quantitativas em vez de qualitativas
parece tornar essa distinção trivial. Este efeito é facilmente aparente quando os valores da foto
em tons de cinza são representados como um mapa de calor do arco-íris. AlexNet era
particularmente valioso quando as marcações estavam faltando, escurecidas ou com imagens
em um ângulo incomum. Dados os dados de treinamento mínimos usados, era importante que
as imagens fossem coletadas usando configurações que se aproximassem aproximadamente da
faixa de brilho / propagação do sinal das imagens usadas para o treinamento. Mais dados de
treinamento e / ou exposição automática consistente atenuariam esse problema potencial a
longo prazo. Similarmente, mais padrões podem ser incorporados ao modelo para expandir a
variedade de dados que podem ser codificados. No caso de uso do mundo real, essa
classificação automatizada eliminará a subjetividade da classificação que pode interferir na
precisão dessa abordagem. Dados sintéticos também podem ser produzidos usando aumento de
imagem para treinar o algoritmo sem a necessidade de aplicativos de patch reais. No entanto, a
precisão desse método poderia ser menor se a variabilidade na aplicação exibida nos dados
sintéticos não replicasse os recursos de aplicações reais de remendo com microagulha nos
dados de teste. Em nossa experiência, o treinamento do AlexNet com 5.000 imagens sintéticas
resultou em uma precisão de classificação de dados do mundo real de 92% para o círculo e 97%
para a cruz e o retângulo. Os dados de treinamento futuros também podem incluir uma quarta
categoria de classificação para todas as imagens que não se assemelham muito a nenhum dos
16

padrões. Isso seria essencial para uso no mundo real quando a presença de um padrão é
incerta.

Para que este sistema de codificação seja clinicamente útil, microagulhas e micropartículas NIR
devem ser biocompatíveis e, se aplicável, manter a utilidade de quaisquer vacinas administradas
em conjunto. A histologia mostrou que as partículas foram bem toleradas no corpo, semelhantes
aos corantes de tatuagem à base de PMMA, em grande parte inertes ( 44 ), embora alguns
macrófagos tenham sido observados. O acúmulo de macrófagos observado ao redor das
partículas foi menor do que outros estudos mostraram para micropartículas de poli (ácido
lático- co- glicólico) ( 45 ), por exemplo, que estão presentes em muitos sistemas de entrega de
medicamentos aprovados pela Food and Drug Administration dos EUA ( 46) Além disso, as
imagens histológicas demonstraram que as partículas entregues por microagulhas foram
entregues a uma profundidade semelhante a tatuagens profissionais ( 47 ), o que apóia seu
potencial para detecção de NIR a longo prazo.

Além do valor autônomo de uma plataforma de codificação e detecção de informação

intradérmica, esse sistema pode oferecer maiores vantagens quando administrado com
vacinas. Ao entregar os dois agentes no mesmo adesivo de microagulha, existe o potencial de
obter vantagens de custo de produção e eliminar a possibilidade de uso indevido (como aplicar o
adesivo de codificação sem a vacina). No entanto, para funcionar em combinação com vacinas
de microagulha atualmente em desenvolvimento, NIR QDs encapsulados com PMMA não devem
interferir com a resposta imune robusta gerada pela administração de antígeno
intradérmico. Para garantir a entrega QD suficiente e a estabilidade da vacina após a fabricação
(um processo que inclui vários dias sob alto vácuo), a quantidade de sacarose na formulação de
microagulha e o tempo de aplicação foram aumentados. Apesar dessas modificações, uma
diminuição na estabilidade da vacina (conversão de IPV2 D em C) ainda foi observada e um
volume considerável da microagulha não foi transferido para a pele durante a aplicação, o que
seria esperado para reduzir a magnitude da resposta imune. No entanto, os grupos tratados com
microagulha produziram títulos de anticorpos totais e neutralizantes contra IPV2 que eram
semelhantes às injeções subcutâneas de dose correspondente teórica e estavam acima do limite
conhecido por conferir proteção em humanos, independentemente da presença de QDs
encapsulados. Isso foi observado apesar das perdas substanciais durante a formulação e
administração e é provavelmente devido aos efeitos de economia de dose da entrega
intradérmica ( que seria esperado para reduzir a magnitude da resposta imune. No entanto, os
grupos tratados com microagulha produziram títulos de anticorpos totais e neutralizantes contra
IPV2 que eram semelhantes às injeções subcutâneas de dose correspondente teórica e estavam
acima do limite conhecido por conferir proteção em humanos, independentemente da presença
de QDs encapsulados. Isso foi observado apesar das perdas substanciais durante a formulação
e administração e é provavelmente devido aos efeitos de economia de dose da entrega
intradérmica ( que seria esperado para reduzir a magnitude da resposta imune. No entanto, os
grupos tratados com microagulha produziram títulos de anticorpos totais e neutralizantes contra
IPV2 que eram semelhantes às injeções subcutâneas de dose correspondente teórica e estavam
acima do limite conhecido por conferir proteção em humanos, independentemente da presença
de QDs encapsulados. Isso foi observado apesar das perdas substanciais durante a formulação
e administração e é provavelmente devido aos efeitos de economia de dose da entrega
intradérmica (16 , 17 ). Embora a adição de polímero pudesse ter um efeito adjuvante, isso não
foi observado, provavelmente devido à natureza bem tolerada e amplamente inerte de nossas
micropartículas de PMMA, conforme demonstrado em nossos dados histológicos. Esses
resultados apóiam o potencial clínico do uso dessas microagulhas para coadministrar um agente
de marcação invisível e uma vacina em uma aplicação.
17

Este estudo fornece suporte para detecção de padrões confiável e de longa duração usando
QDs; no entanto, como muitos estudos pré-clínicos, é limitado em duração e depende de
pequenos modelos de animais. Apresentamos dados que caracterizam a expressão do sinal ao
longo de 9 meses em animais e fotobranqueamento de luz solar acelerado in vitro, o que sugere
que as marcações detectáveis persistiriam no ponto de tempo alvo de 5 anos. Com base na
histologia e estudos de imagem longitudinais, não anteciparíamos uma diminuição substancial do
sinal dentro de 5 anos após a aplicação; no entanto, não demonstramos isso explicitamente por
causa das restrições de tempo, que excedem a expectativa de vida típica de nosso modelo
animal.

Em resumo, demonstramos uma prova de conceito para uma plataforma capaz de registrar
dados invisivelmente na pele. Para estabelecer este sistema, sintetizamos, encapsulamos e
entregamos QDs fotoestáveis sem cádmio e sem chumbo na pele usando uma matriz de
microagulha personalizada, adaptamos um smartphone para criar um sistema de imagem NIR
barato e demonstramos a capacidade de detectar padrões com precisão em vivo por um período
de 9 meses usando um algoritmo de aprendizado de máquina semiautomático. A transferência
dessa tecnologia para a clínica exigirá várias etapas adicionais, incluindo estudos pré-clínicos de
segurança e toxicologia, aumento de escala de fabricação e estudos iniciais em
humanos. Estudos adicionais in vivo em pequenos animais ajudarão na caracterização robusta
de respostas locais e sistêmicas a micropartículas de PMMA carregadas com QD e patches de
microagulha para garantir a qualidade, segurança e confiabilidade. Estudos formativos nos quais
os usuários testam os dispositivos, incluindo a embalagem e a rotulagem, precisarão ser
conduzidos para melhorar os componentes para comercialização e para fabricar dispositivos
para teste em estudos humanos. Em última análise, acreditamos que essa tecnologia invisível
“no corpo” abre novos caminhos para o armazenamento de dados descentralizado e aplicativos
de biossensorio que podem influenciar a forma como o atendimento médico é fornecido,
especialmente no mundo em desenvolvimento.

MATERIAIS E MÉTODOS

Design de estudo
Esses estudos foram elaborados para avaliar a adequação das micropartículas fluorescentes
NIR intradérmicas como um método confiável de detecção de longo prazo. Para avaliar essa
tecnologia em condições de campo típicas, usamos um smartphone adaptado à luz ambiente
para determinar os critérios de sucesso, exceto em circunstâncias em que dados espectrais e /
ou altamente quantitativos foram necessários para caracterizar nossos materiais. Os estudos in
vivo foram geralmente preferidos para avaliar o desempenho de nossos sistemas de entrega e
detecção e os animais foram aleatoriamente designados para diferentes grupos experimentais
no início de cada estudo. O uso de aprendizado de máquina para detecção eliminou a
necessidade de cegamento. Os estudos in vitro foram realizados com três réplicas e estudos in
vivo com cinco réplicas, salvo indicação em contrário. Os dados de nível de sujeito individual são
relatados no arquivo de dados S1.

Síntese QD
Núcleos estequiométricos de CuInSe 2 foram sintetizados misturando 1,5 mmol de iodeto de
cobre (I) e 1,5 mmol de acetato de índio (III) em 1,5 ml de 1-dodecanotiol (DDT) e 45 ml de 1-
octadeceno (ODE) com base em um procedimento modificado ( 48 ). A mistura de reação foi
então desgaseificada sob vácuo por 20 min, purgada com nitrogênio por 20 min e desgaseificada
por mais 45 min a 120 ° C. A seguir, 1,5 ml de ácido oleico foram adicionados à mistura e a
18

solução foi desgaseificada durante 20 min. Após outra purga de nitrogênio de 20 min, a solução
foi aquecida a 175 ° C antes da injeção da solução estoque de selênio. Uma solução estoque de
selênio foi primeiro preparada pela mistura de 3 mmol de pó de selênio e 3 ml de oleilamina
(OLA) em 3 ml de DDT ( 49) A solução de selênio foi desgaseificada sob vácuo por pelo menos
30 min a 60 ° C antes de ser injetada na mistura de reação. A mistura reaccional foi aquecida a
200 ° C e mantida a esta temperatura durante 30 min sob protecção de azoto.

Cascas de ZnS: Al foram formadas em torno dos núcleos CuInSe 2 através da adição gota a gota
de uma solução estoque contendo zinco e alumínio. O precursor de zinco da solução estoque foi
preparado misturando 30 mmol de acetato de zinco em 30 ml de OLA e 30 ml de ODE,
desgaseificando por 20 min e purgando com nitrogênio por 20 min. Em seguida, a solução foi
aquecida a 120 ° C e desgaseificada sob vácuo. A mistura precursora de Al consistindo em 9
mmol de Al (IPA) 3 , 5,4 ml de DDT e 36 ml de ODE foi desgaseificada por 20 min e purgada com
nitrogênio por 20 min. O recipiente foi então selado e sonicado durante 1 hora a 60 ° C ( 50) A
solução estoque de alumínio foi então adicionada à solução estoque de zinco usando uma
seringa de vidro e uma agulha longa. Depois de misturar os precursores de zinco e alumínio, a
solução estoque de revestimento resultante foi adicionada gota a gota à mistura de
reação de núcleos de CuInSe 2 a 0,1 ml / min usando uma bomba. Ao mesmo tempo, 15 ml de
DDT foram adicionados a uma taxa de 0,5 ml / min para desencadear termicamente a liberação
de enxofre ( 51) A reação foi deixada prosseguir durante vários períodos de tempo, dependendo
da formulação. Posteriormente, a solução reaccional foi arrefecida à temperatura ambiente e
precipitada duas vezes em acetona, uma vez numa solução 50:50 de acetona e metanol e mais
duas vezes em metanol. Entre cada rodada de precipitação, os QDs foram ressuspensos em
uma quantidade mínima de tolueno e ácido oleico que foi adicionado gota a gota até que a
solução se tornasse transparente. Após a etapa final de precipitação, os QDs foram dispersos
em tolueno.

Análise de fotodegradação
Os corantes orgânicos exigiam condições de imagem diferentes dos corantes inorgânicos e QDs
por causa de seu pequeno deslocamento de Stokes e, portanto, alta propensão a se auto-
extinguirem no estado seco. Os fluoróforos orgânicos foram dissolvidos em água a uma
concentração de 10 μg / ml, que se verificou estar dentro da gama de absorvância linear para
todos os corantes. Cinquenta microlitros de cada corante foram adicionados a uma placa de 384
poços de parede preta, coberta com uma lâmina de quartzo de 1 mm de espessura e selada com
parafilme nas bordas para evitar a evaporação durante a exposição à luz. A placa foi então lida
usando um espectrofotômetro Tecan Infinite M200 para determinar as intensidades de
fluorescência de Alexa Fluor 790 [excitação / emissão 784/814 nm (ex / em)], DyLight 800
(760/810 nm ex / em), IRDye 800CW (768/798-nm ex / em), IR-820 (710/820-nm ex / em), Sulfo-
Cianina7 (750/773-nm ex / em), VivoTag 800 (785/815-nm ex / em),

As amostras foram então colocadas sob um Simulador Solar de Teste de Célula PV de 300W
Modelo 16S-300-002 (Luz Solar). A lâmpada de xenônio de arco curto livre de ozônio foi usada
com um filtro de massa de ar 1.5 e lentes de foco para expor as amostras a condições que
imitam a distribuição espectral e a densidade de potência da luz solar em sete vezes a
intensidade do sol (695 mW / cm 2) Um pedaço de pele pigmentada de cadáver humano com 2
mm de espessura de doadores com idade entre 21 e 68 anos que se identificaram como afro-
americanos foi sobreposto na amostra para recapitular a absorção de luz pelo tecido acima de
um fluoróforo intradérmico. A pele foi mantida hidratada por um fluxo contínuo de água sobre a
superfície e resfriada por baixo usando um Resfriador de Placa Fria Termelétrica Peltier CP-
200HT-TT (Tecnologia TE) para evitar danos à pele. As amostras foram removidas
19

periodicamente do simulador solar e fotografadas usando o espectrofotômetro. Esta experiência

foi repetida três vezes com uma réplica cada.

Corantes inorgânicos e QDs foram capazes de ser fotografados em seu estado seco, então um
protocolo modificado foi usado. Os orifícios foram perfurados em uma folha de silicone preta
usando um punção de biópsia de aço inoxidável de 2 mm para criar espaço para os corantes. A
folha de silicone foi então tratada com plasma de ar por 1 min em alta potência a 500 mtorr. A
folha foi então colocada em uma lâmina de quartzo de 2,54 cm por 2,54 cm, o que permitiu que
ela aderisse de forma impermeável. As suspensões de conversão infravermelha 2 (IRDC2) e
IRDC3 a 10 mg / ml em água foram depositadas 2 μl por vez e deixadas secar até que um total
de 10 μl fosse depositado. As mesmas etapas foram realizadas para ZnS: CuInSe 2 revestido
com AlSoluções QD a 10 mg / ml em tolueno. Fita dupla-face e parafilme foram então usados
para selar uma lâmina de vidro para o outro lado do silicone preto. A amostra foi então colocada
sob um pedaço de pele pigmentada de cadáver em um bloco de metal sob hidratação contínua
em um refrigerador de placa fria e exposta à luz em sete vezes a intensidade solar. Em pontos
de tempo predeterminados, as amostras foram removidas da luz e fotografadas usando uma
plataforma de imagem NIR personalizada que consiste em um laser de 500 mW emitindo em 808
nm e montagem termoelétrica resfriada alimentada por um controlador de diodo a laser
LDC210C e controlador de temperatura TED200C, um 15 × Expansor de feixe galileano
acromático, espelho de prata protegido, filtro de emissão de passagem longa de vidro colorido de
850 nm e USB 3 de alta sensibilidade. 0 câmera semicondutora de óxido de metal complementar
(DCC3240N) afixada a uma placa de ensaio óptica (Thor Labs) dentro de um gabinete de
trabalho escuro (US Laser). As imagens foram coletadas em diferentes comprimentos de
exposição para diferentes corantes, variando de 10 a 2.000 ms. O comprimento de exposição
mais longo que não saturou a profundidade do pixel de 10 bits foi usado para cada corante em
todos os pontos de tempo. Devido à duração deste experimento, todas as amostras (n = 3) foram
executados simultaneamente. Para todos os experimentos de fotobranqueamento, a pele foi
substituída a cada 2 a 4 dias para reduzir os efeitos da degradação da melanina. Os dados de
intensidade foram quantificados usando ImageJ (National Institutes of Health) e normalizados
selecionando uma região de interesse (ROI) em torno de um poço e comparando a intensidade
acima do fundo nessa imagem com a intensidade acima do fundo do ROI correspondente no
início do experimento ( 52 ). Todos os dados de fotobranqueamento são relatados como dias
simulados de exposição com base em um ciclo claro / escuro de 12 horas.

Encapsulamento QD
As micropartículas de PMMA carregadas com QD foram formadas usando uma técnica de
evaporação de solvente / emulsão de óleo em água. Resumidamente, 150 mg de QDs e 100 mg
de PMMA foram dissolvidos em 2 ml de diclorometano. Esta solução foi então adicionada a 50
ml de 1% de poli (álcool vinílico) (PVA) [88% hidrolisado, M w(peso molecular médio ponderal),
31.000] solução em água. A solução resultante foi emulsificada a 5000 rotações por minuto
(RPM) durante 1 min usando um homogeneizador digital ULTRA-TURRAX T 18 (IKA Works) e
subsequentemente agitada a 250 RPM durante 3 horas para permitir que o solvente evapore. As
partículas foram centrifugadas a 1000 força centrífuga relativa (RCF), após o que o
sobrenadante foi removido. As partículas foram então lavadas quatro vezes adicionando água
desionizada, centrifugação a 1000 RCF e remoção do sobrenadante. As partículas resultantes
foram ressuspensas em água desionizada e medidas usando um Multisizer 3 (Beckman Coulter)
com uma abertura de 100 μm. Os dados foram suavizados usando uma janela móvel de 11
quadros e plotados como um histograma com 300 caixas de tamanhos iguais variando de 2,1 a
59,9 μm. Micropartículas carregadas com QD foram então fotografadas usando microscopia
óptica e microscopia eletrônica de varredura (SEM) para observar sua forma. A imagem óptica
20

foi realizada usando um microscópio de inspeção Olympus MX40 com uma câmera digital
industrial ToupCam (ToupTek Photonics). Em preparação para SEM, as amostras foram
depositadas em fita de carbono de dupla face e revestidas com uma fina camada de Au / Pd
usando um Sistema de pulverização catódica Hummer 6.2 (Anatech) para evitar o
carregamento. A imagem foi então realizada usando um microscópio eletrônico de varredura
JEOL JSM-5600LV com uma tensão de aceleração de 5 kV. as amostras foram depositadas em
fita de carbono de dupla face e revestidas com uma fina camada de Au / Pd usando um Hummer
6.2 Sputtering System (Anatech) para evitar o carregamento. A imagem foi então realizada
usando um microscópio eletrônico de varredura JEOL JSM-5600LV com uma tensão de
aceleração de 5 kV. as amostras foram depositadas em fita de carbono de dupla face e
revestidas com uma fina camada de Au / Pd usando um Hummer 6.2 Sputtering System
(Anatech) para evitar o carregamento. A imagem foi então realizada usando um microscópio
eletrônico de varredura JEOL JSM-5600LV com uma tensão de aceleração de 5 kV.

A estabilidade do pH de S10C5H QDs em PMMA foi determinada lançando uma solução no

fundo de uma placa para evitar agitação após a adição do tampão. QDs (150 mg) e 100 mg de
PMMA foram adicionados a 2 ml de diclorometano e sonicados durante 5 min. Usando uma
pipeta de vidro, cerca de 5 μl da solução QD foram adicionados ao fundo de uma placa de fundo
de vidro de parede preta de 96 poços e secos durante a noite. PBS (200 μl) foi então adicionado
a cada poço e as amostras foram incubadas a 37 ° C por 24 horas. Nesta fase, a intensidade
inicial das amostras QD-PMMA foram analisadas usando uma plataforma de imagem NIR
personalizada, conforme descrito acima. Para investigar o efeito do pH na intensidade dos QDs,
o PBS foi substituído por uma solução tampão em pH 4, 5, 6, 7,4 (PBS) ou 10. A placa foi então
selada para minimizar a perda de solvente e incubada a 37ºC ° C. Após 1, 4 e 22 horas, as
amostras foram removidas da incubadora e a intensidade QD foi medida usando o sistema de
imagem NIR personalizado com um tempo de coleta de 40 ms. Os dados de intensidade foram
quantificados no ImageJ e normalizados selecionando uma ROI em torno de um poço e
comparando a intensidade acima do fundo nessa imagem com a intensidade acima do fundo da
ROI correspondente no início do experimento.

Fabricação e caracterização de microagulha dissolvível

Emplastros de microagulha solúveis em água contendo micropartículas carregadas com QD nas
pontas das agulhas foram fabricados usando um processo de fundição de solvente. Primeiro, as
micropartículas foram ressuspensas em água, pipetadas na parte superior do molde PDMS (4 μl
por microagulha) e centrifugadas a 3234 RCF por 5 min. O excesso de solução foi removido do
topo do molde e a solução foi deixada secar, deixando partículas nas pontas do molde. Este
processo foi repetido quando o carregamento foi inferior ao desejado ou distribuído de forma
desigual. Cerca de 300 μl de uma solução de 17% (p / v) de sacarose e 17% (p / v) de PVA em
água foi então dispensado no topo do molde e centrifugado a 3234 RCF por 5 min. Os moldes
foram então deixados em temperatura ambiente durante a noite em uma capela de fluxo laminar
como um estágio inicial de secagem. Discos de acrílico cortados a laser foram então fixados em
fita dupla-face e fixados na parte de trás do remendo de microagulha solidificado. O remendo foi
então cuidadosamente removido do molde e armazenado por mais 72 horas sob dessecação a
vácuo.

Modificações de smartphone
Uma câmera de smartphone foi adaptada com componentes ópticos comercialmente disponíveis
adquiridos da Thorlabs para aprimorar a detecção de NIR QD no NIR. Para habilitar a detecção
de NIR, o filtro infravermelho de passagem curta foi removido de um smartphone Google Nexus
21

5X. Uma capa de smartphone foi então projetada e impressa em 3D para fazer uma interface
perfeita com os componentes ópticos com rosca SM1 diretamente na frente da câmera
traseira. Um filtro dielétrico de passagem longa de 850 nm (FEL0850) e um filtro de vidro colorido
de passagem longa de 850 nm (FGL850) foram colocados em paralelo em um tubo de lente
conectado à caixa do smartphone e mantido no lugar com um anel de retenção. Para iluminação
QD, um LED montado de 780 nm e 200 mW (M780L3) alimentado por um driver de LED T-Cube
(LEDD1B) e fonte de alimentação de 15 V, 2,4 A (KPS101) foi usado. Para aumentar a forma e o
espectro de emissão, um filtro passa-curto dielétrico de 800 nm (FEL0800) e lentes
condensadoras asféricas com difusor (ACL2520U-DG6-B) foram usados em um tubo de lente
ajustável. Todas as imagens foram realizadas usando o aplicativo Camera FV-5 Lite (FGAE
Studios).

Biocompatibilidade de QDs encapsulados

Microagulhas contendo QDs encapsulados foram administradas a ratos Wistar (Charles River
Laboratories) de 8 a 12 semanas de idade pesando cerca de 250 g para avaliar a
biocompatibilidade in vivo. Os ratos foram anestesiados por inalação contínua de isoflurano a
2,5% durante a administração e o processo de imagem. A remoção do cabelo foi realizada antes
da administração da microagulha raspando o flanco traseiro com um barbeador elétrico e
aplicando creme depilatório por cerca de 2 min. A área foi então enxaguada para remover o
excesso de cabelo, esterilizada com um cotonete de etanol e deixada secar. As microagulhas
foram aplicadas usando um aplicador com mola MPatch Mini (Micropoint Technologies) por 2
min. Os ratos foram devolvidos às suas gaiolas e alojados até pontos de tempo terminais em 1
dia, 2 semanas e 4 semanas ( n= 4 por ponto de tempo). No momento do sacrifício, os ratos
foram sacrificados por asfixia com CO 2 . A pele foi explantada e fixada em fixador de tecido sem
formalina (Sigma-Aldrich) por 24 a 72 horas. A parte relevante do tecido foi identificada por meio
do smartphone adaptado, transferida para etanol 70% e embebida em cera de parafina. As
amostras foram seccionadas e coradas com hematoxilina e eosina ou tricrômico de Masson. A
interpretação da reação de corpo estranho foi realizada sob a orientação de um patologista
veterinário experiente.

Imagem longitudinal in vivo de padrões NIR

Dois experimentos de imagem longitudinal foram realizados para avaliar a perda de sinal de
curto prazo após a administração e residência de longo prazo de partículas entregues por
microagulha. Em ambos os casos, os QDs foram administrados a ratos usando adesivos
solúveis de microagulha, conforme descrito acima, e fotografados periodicamente para observar
a intensidade do sinal ao longo do tempo. Em cada ponto de tempo, os ratos foram anestesiados
sob inalação contínua de isoflurano 2,5% e fotografados com o LED de 780 nm e smartphone
adaptado a NIR, mantendo uma distância de imagem consistente.

No primeiro experimento, microagulhas contendo ZnS encapsulado em PMMA e livre (não

encapsulado) de ZnS: CuInSe 2 revestido com AlOs QDs foram comparados para avaliar os
benefícios potenciais do encapsulamento na intensidade do sinal inicial e na retenção do
sinal. Os QDs encapsulados foram incorporados em microagulhas solúveis usando o protocolo
detalhado acima. Os QDs não encapsulados não eram facilmente dispersíveis em água, de
modo que o procedimento de carregamento foi ligeiramente modificado. Antes do carregamento,
os moldes de PDMS foram tratados com plasma de ar usando um Harrick Plasma Cleaner PDC-
091-HP em alta potência a 500 mtorr por 1 min. QDs em tolueno (4 μl por microagulha) foram
então depositados nos moldes de microagulha e centrifugados em 3234 RCF por 5 min. O
22

tolueno foi então deixado secar. Uma solução de sacarose e PVA foi então aplicada aos moldes
e centrifugada nas agulhas e deixada secar usando as etapas de fabricação descritas acima.

Depois de aplicar patches de 16 microagulhas, as configurações de imagem não saturantes mais

altas foram identificadas e usadas em todos os pontos de tempo subsequentes para aquele
grupo. Para o grupo não encapsulado, essas configurações eram ISO 100 com uma velocidade
do obturador de130/s. Para o grupo encapsulado, essas configurações foram ISO 100 com uma
velocidade do obturador de130/ ou 1200/s. Para cada animal e ponto no tempo, cerca de 20
imagens foram coletadas com mira levemente diferente do LED, que era controlada de forma
independente da câmera que permanecia em local fixo. Uma macro ImageJ foi então usada para
dividir as imagens em seus três canais constituintes de vermelho, verde e azul, salvar o canal
vermelho no formato de tons de cinza e identificar as imagens com a intensidade máxima. Esta
imagem com o melhor objetivo foi então usada para a quantificação subsequente do sinal de
fundo acima. Resumidamente, ROIs circulares de 80 pixels foram aplicados a cada um dos 16
pontos na matriz 4 × 4 para quantificar o sinal médio. A intensidade média da escala de cinza
dos pixels restantes foi subtraída para gerar valores comparáveis longitudinalmente para o sinal
acima do fundo.

Com base neste estudo de curto prazo, um segundo estudo de longo prazo foi realizado usando
QDs encapsulados em padrões de microagulha de oito agulhas (círculo, cruz ou retângulo) para
detecção de imagem e análise de aprendizado de máquina. As matrizes foram administradas em
0 (círculo), 4 (cruzado) e 8 (retângulo) semanas para simular um esquema de vacinação comum
no mundo em desenvolvimento. Um grupo separado foi iniciado em paralelo para gerar um
conjunto de dados de imagem para treinar o algoritmo de aprendizado de máquina. As imagens
foram coletadas a cada 2 semanas em uma variedade de velocidades ISO e do obturador,
processadas e usadas para análise SNR e classificação de aprendizado de máquina.

Entrega de vacina baseada em microagulha

A solução usada para moldar as microagulhas foi alterada em favor de sacarose adicional (2: 1 w
/ w sacarose: PVA) para melhorar potencialmente a estabilidade da vacina durante o
processamento. Uma solução de 34% (p / v) de sacarose e 17% (p / v) de solução de PVA
contendo 3,2 DU de Salk IPV2 (cepa MEF-1; Statens Serum Institut) foi centrifugada em moldes
de microagulha PDMS usando os procedimentos detalhados acima. Após o processamento,
alguns patches de microagulha foram coletados, ressuspensos em tampão de ensaio e avaliados
usando um ensaio imunossorvente ligado a enzima monoclonal de sanduíche específico para
antígeno D (ELISA) para IPV2 para determinar a quantidade da vacina ainda em seu estado de
imunidade. Um anticorpo monoclonal contra o poliovírus IPV2 (HYB 294-06-02, Thermo Fisher
Scientific) foi usado como anticorpo de captura e detecção, o que foi possível devido aos vários
locais de ligação idênticos na IPV. Para evitar a reatividade cruzada entre as espécies, um kit de
peroxidase de rábano Lightning-Link (Novus Biologicals) foi usado para pré-vincular o epítopo de
detecção. Resumidamente, 100 μl de anticorpo diluído 1: 1500 em tampão carbonato (pH 9,6)
foram adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços Nunc Maxisorp LockWell e incubados
durante a noite a 4 ° C em um agitador orbital. As placas foram então lavadas com PBS
contendo 0,05% de Tween 20 três vezes e incubadas em 300 μl de tampão de bloqueio
contendo o tampão de lavagem e 5% (p / v) de leite desnatado por 1 hora a 37 ° C. As placas
foram novamente lavadas e carregadas com 50 μl de amostras. Após 2 horas de incubação a 37
° C, as placas foram lavadas cinco vezes e o anticorpo modificado com Lightning Link foi
adicionado a 1: 833 em PBS. Após 1 hora de incubação, as placas foram lavadas mais cinco
vezes e, em seguida, 100 μl de um substrato SIGMAFAST OPD (Sigma-Aldrich) foram
adicionados após a ressuspensão de acordo com o protocolo do fabricante. Após uma mudança
23

de cor, 150 μl de ácido sulfúrico 1 M foram adicionados a cada poço para interromper a reação, e
os valores de absorbância foram lidos a 490 nm com uma referência de fundo de 630 nm usando
um espectrofotômetro.

Os adesivos de microagulha não usados para ELISA foram aplicados a ratos por um período de
5 minutos usando o protocolo descrito acima. Após a aplicação, a porção das microagulhas
remanescente no adesivo foi coletada, ressuspensa em tampão de ensaio e medida através do
ELISA de antígeno D IPV2. Um grupo de ratos de controle recebeu uma injeção subcutânea de
dose correspondente no flanco traseiro. Esses procedimentos foram repetidos 4 e 8 semanas
mais tarde para fornecer aos ratos a segunda e a terceira doses. Os ratos foram sangrados na
veia da cauda do frasco a cada 2 semanas após a administração para coletar soro para análise
imunológica. O sangue foi coletado em tubos BD SST (produto nº 365967, Becton Dickinson) e
usado de acordo com o protocolo do fabricante para obter soro, que foi subsequentemente
armazenado a −20 ° C até o uso. Um ELISA de anticorpo anti-IPV2 total foi realizado
internamente usando um ELISA indireto,53 ). Os títulos de anticorpos neutralizantes de IPV2
foram determinados pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos Estados Unidos
usando um protocolo publicado anteriormente ( 21 ).

Análise estatística
As estatísticas foram realizadas no GraphPad Prism usando o teste t de Student para
comparações pareadas e análise de variância unilateral (ANOVA) com o teste de comparações
múltiplas de Tukey para comparar grupos múltiplos a um nível de significância de α = 0,05. Os
experimentos de toxicidade in vitro avaliando o tipo e a concentração de QD foram analisados
usando ANOVA de duas vias a um nível de significância de α = 0,05. Todos os experimentos in
vitro foram realizados em triplicado experimental, a menos que indicado de outra forma. Todos
os experimentos in vivo foram realizados com cinco réplicas experimentais, a menos que
indicado de outra forma. Os dados são relatados no texto como médias ± DP.

MATERIAIS COMPLEMENTARES

stm.sciencemag.org/cgi/content/full/11/523/eaay7162/DC1

Materiais e métodos

Fig. S1. Propriedades ópticas de corantes orgânicos.

Fig. S2. Evolução das propriedades de emissão de fluorescência com o tempo de

descascamento.

Fig. S3. Caracterização do tempo de vida da fluorescência da série S10C QD.

Fig. S4. Composição e propriedades físicas de S10C5H QDs.

Fig. S5. Estabilidade de pH de QDs encapsulados em PMMA.

Fig. S6. Análise por elementos finitos de forças mecânicas em microagulhas.

Fig. S7. Otimização da geometria da microagulha usando análise de elementos finitos.

Fig. S8. Treinamento e validação de aprendizado de máquina.

24

Tabela S1. Caracterização espectral de formulações QD personalizadas.

Tabela S2. Parâmetros de ajuste multiexponencial para curvas de decaimento de

fotoluminescência.

Filme S1. Administração intradérmica e imagem de QDs encapsulados.

Arquivo de dados S1. Dados individuais de nível de assunto.

Referências ( 54 - 62 )

Apêndice
Visualize / solicite um protocolo para este artigo do Bio-protocolo .
http://www.sciencemag.org/about/science-licenses-journal-article-reuse
Este é um artigo distribuído sob os termos da Licença Padrão do Science Journals .

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Agradecimentos: Agradecemos a WH Gates, D. Hartman, S. Hershenson, S. Kern, B. Nikolic,

K. Owen, L. Shackelton, C. Karp e D. Robinson pela orientação; RT Bronson para especialização
em patologia; e o Departamento de Medicina Comparada do MIT para
aconselhamento. Agradecemos a W. Weldon e seu laboratório nos Centros de Controle e
Prevenção de Doenças dos EUA por realizarem estudos de títulos de anticorpos neutralizantes,
o Centro de Biotecnologia Swanson do Instituto Koch pelo suporte técnico, especificamente o
Hope Babette Tang (1983) Histology Facility and the Peterson (1957) Nanotechnology Materials
Core Facility, bem como o Harvard University Center for Nanoscale Systems, e WM Keck
Microscopy Facility no Whitehead Institute.
Financiamento:Este trabalho foi financiado pela bolsa OPP 1150646 da Fundação Bill &
Melinda Gates. O apoio da bolsa de estudos para KJM foi fornecido pelo Prêmio Nacional de
Serviço de Pesquisa NIH Ruth L. Kirschstein (F32EB022416). LJ agradece a Associação de
Promoção de Inovação Juvenil CAS (2018042), a Fundação Nacional de Ciências Naturais da
China (81671755) e o Conselho de Bolsas de Estudo da China (201604910444) pelo apoio
financeiro. Este trabalho foi apoiado em parte pelo Koch Institute Support (core) Grant P30-
CA14051 do National Cancer Institute. Este trabalho foi realizado em parte no Centro da
Universidade de Harvard para Sistemas em nanoescala (CNS), um membro da Rede Nacional
de Infraestrutura Coordenada de Nanotecnologia (NNCI), que é apoiado pela National Science
Foundation sob o prêmio NSF no. 1541959. Contribuições dos autores:KJM, RL, AJ, LW e
PAW desenvolveram o conceito. KJM, LJ, RL e AJ projetaram os experimentos e escreveram o
manuscrito. LJ projetou e sintetizou QDs. LJ, HSNJ, CFP e JY realizaram caracterização e
análise óptica. MGB e MG supervisionaram a síntese e análise de QD. LJ, HSNJ e WT
realizaram o encapsulamento QD. MS realizou as simulações de modelagem
computacional. Microagulhas projetadas e fabricadas pela KJM, SYS e MC. KJM, SYS, CFP, FL,
MP, NP e AK projetaram a óptica do smartphone. KJM, LJ, HSNJ, SYS, SYT, TG, JC, JLS e MT
realizaram os experimentos in vitro. KJM, SYS e MC realizaram os estudos ex vivo. KJM, SYS,
MC, SR e ST realizaram os experimentos in vivo e as análises correspondentes. MS e
DVConflitos de interesses: Um pedido de patente intitulado “Microneedle tattoo patch and use-
using” descrevendo a abordagem apresentada aqui foi apresentado por KJM, LJ, SYS, HSNJ, AJ
27

e RL (US 62 / 558,172). RL divulga potenciais interesses concorrentes no link

abaixo: www.dropbox.com/s/yc3xqb5s8s94v7x/Rev%20Langer%20COI.pdf?dl=0 . Disponibi
lidade de dados e materiais: Todos os dados associados a este estudo estão presentes no
artigo ou nos Materiais Suplementares. O arquivo do código do computador está acessível ao
público: doi.org/10.5281/zenodo.3571386.

• Copyright © 2019 Os autores, alguns direitos reservados; licenciado exclusivo American

Association for the Advancement of Science. Nenhuma reivindicação de obras originais do
governo dos EUA