Pró-Reitoria Acadêmica

Escola de Saúde e Medicina

Programa de Pós-Graduação Stricto Sensu em Ciências
Genômicas e Biotecnologia
Tese de Doutorado

Perfil Clínico e Genômico de Pacientes com Mielofibrose

Autor: Alexandre Nonino

Orientador: Prof. Dr. Rinaldo Wellerson Pereira

Brasília - DF
2019
 ALEXANDRE NONINO

Perfil Clínico e Genômico de Pacientes com Mielofibrose

Tese apresentada ao curso de Pós-

graduação Stricto Sensu em Ciências
Genômicas e Biotecnologia da Universidade
Católica de Brasília, como requisito parcial
para a obtenção do Título de Doutor em
Ciências Genômicas e Biotecnologia

Orientador: Prof. Dr. Rinaldo Wellerson

Pereira

Brasília
2019
N813p Nonino, Alexandre.
Perfil clínico e genômico de pacientes com Mielofibrose/ Alexandre
Nonino – 2019.
114 f.: il. ; 30 cm.

Tese (Doutorado) – Universidade Católica de Brasília, 2019.

Orientação: Prof. Dr. Rinaldo Wellerson Pereira.

1. Neoplasias Mieloproliferativas. 2. Mielofibrose. 3. Genômica. 4.

Prognóstico. I. Pereira, Rinaldo Wellerson, orient. II. Título.

CDU 616

Ficha elaborada pelo Sistema de Bibliotecas da Universidade Católica de Brasília (SIBI/UCB)

Para Eliseu, Conceição, Lu, Lipe e Nanda
 AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Rinaldo Wellerson Pereira, meu orientador, pela confiança e liberdade que me
proporcionou, pelas discussões riquíssimas tendo ciência ou qualquer outro tema de fundo e
pelo exemplo de buscar “mens sana in corpore sano”.

À Profa. Juliana Forte Mazzeu, por ter acreditado na formação de uma linha de pesquisa
sobre Mielofibrose, pela disponibilização da estrutura do laboratório de Genética da UnB e pelo
auxílio inestimável na análise dos CMAs.

À Profa. (e futura colega médica) Cíntia do Couto Mascarenhas, pelo apoio nos estágios
iniciais deste projeto.

A Graciana, João Rogério e Agenor, colegas do laboratório de Biologia Molecular da

Unidade de Hematologia do HBDF, pela coleta, preparo e armazenamento das amostras
utilizadas neste estudo.

Aos amigos médicos hematologistas do Hospital de Base do DF e do Cettro – Centro

de Câncer de Brasília, especialmente a Juliana Minuncio e Carlos Alberto Silveira, pelo
incentivo e auxílio na identificação dos casos e coleta de dados clínicos, e a todos os demais,
pela dedicação aos pacientes.

Aos hematologistas Paulo Campregher e Fábio Pires e ao bio-informata Renato Puga,

do Hospital Israelita Albert Einstein, pelo auxílio na realização e análise dos sequenciamentos.

A Luciana, meu porto seguro.

A Deus, que me proporcionou todos estes encontros.

 RESUMO

NONINO, Alexandre. Perfil Clínico e Genômico de Pacientes Com Mielofibrose. 2019. 111
folhas. Tese de Doutorado (Pós-graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia) –
Universidade Católica de Brasília, Brasília, 2019.

Mielofibrose (MF) é a Neoplasia Mieloproliferativa (NMP) clássica menos prevalente

e a de pior prognóstico. É caracterizada por hematopoiese clonal, inflamação causada por
citocinas circulantes, alterações no estroma medular, metaplasia mieloide e causa sintomas
debilitantes, aumento de risco de morbidade e mortalidade por falência medular, complicações
trombóticas e hemorrágicas e transformação para leucemia aguda. Dados de caracterização
clínica e, especialmente, genômica são escassos em pacientes brasileiros com esta neoplasia.
Neste estudo avaliamos coorte de pacientes seguidos em centros do Distrito Federal de 2013 a
2018, por meio de coleta de informações clínicas, laboratoriais e caracterização do perfil
mutacional pela realização de MLPA, NGS e Chromosomal Microarray Analysis. A Sobrevida
Total mediana desta coorte foi próxima a 3 anos e reflete, em parte, a maior prevalência de
pacientes com escore prognóstico de alto risco. Setenta e oito porcento dos pacientes
apresentavam mutações cooperativas adicionais às mutações driver e 84% tinham regiões de
ganhos ou perdas cromossômicas ou áreas de perda de heterozigose sem alteração de cópias
(CN-LOH). Estas últimas frequentemente estavam associadas ao mecanismo de aquisição de
homozigose para genes mutados. Disrupção monoalélica do gene supressor de tumor RB1 por
mutação ou deleções do braço longo do cromossomo 13 (13q) foi encontrada em 15% dos
casos. Entre os genes de interesse mutados, 3 de 27 pacientes apresentaram mutação de CSF1R,
alteração raramente descrita em NMPs. A aplicação de escore prognóstico personalizado,
baseado em 63 dados clínicos e genômicos, mostrou desempenho superior ao escore
convencional IPSS. Nossos resultados apontam para oportunidades de melhora da assistência
de saúde aos pacientes brasileiros com MF, que incluem melhor caracterização prognóstica.

Palavras-chave: Neoplasias Mieloproliferativas; Mielofibrose; Genômica; Prognóstico

 RESUMO EM LINGUA ESTRANGEIRA

Abstract: Myelofibrosis (MF) is the least prevalent of the classical Myeloproliferative

Neoplasms (MPNs) and the one with the worst prognosis. It is characterized by clonal
hematopoiesis, inflammation caused by elevated circulating cytokine levels, bone marrow
stromal changes and myeloid metaplasia, which cause debilitating symptoms, and increased
risk for morbidity and mortality due to thrombotic or hemorrhagic events, cytopenias and
transformation to acute leukemia. There are scarce data on the clinical and genomic
characteristics of Brazilian patients with MF. We evaluated a cohort of patients followed at
health services in Distrito Federal – Brazil, from 2013 to 2018, by collecting clinical and
laboratory data and by characterization of their mutational profile with MLPA, NGS and
Chromosome Microarray. Overall survival was 3 years, which partially reflects the high
prevalence of patients with high risk prognostic score. Seventy eight percent of the patients had
cooperative mutations in addition to their driver mutation and 84% had chromosomal gains,
losses or areas of copy-neutral loss of heterozigosity (CN-LOH). The latter were frequently
associated with acquisition of homozygosis of mutated genes. Monoallelic disruption of the
tumor suppressor gene RB1 was found in 15%. Among the mutated genes of interest, we found
3 out of 27 patients with mutations in CSF1R, which is rarely reported in MF. The performance
of a personalized prognostic system based on 63 clinical and genomic data was superior to the
conventional IPSS. We identify opportunities for improvement of medical assistance for
Brazilian patients with MF, including better prognostic characterization.

Palavras-chave em língua estrangeira: Myeloproliferative Disorders; Myelofibrosis; Cancer

Genes; Prognostic Factors
 Lista de Abreviaturas
AloTCTH – Transplante Alogênico de Células-Tronco Hematopoiéticas
aUPD – Dissomia Uniparental adquirida (acquired Uniparental Disomy)
CALR – Calreticulina
CGH - Hibridização Genômica Comparativa (Comparative Genomic Hybridization)
CHIP - Hematopoiese Clonal de Prognóstico Indeterminado (Clonal Hematopoiesis of
Indeterminate Significance)
CMA – Analise Cromossômica por Microarray (Chromosome Mycroarray Analysis)
CN–LOH - Perda de Heterozigose com Número de Copias Neutro (Copy Number
Neutral Loss Of Heterosigosity)
CNV – Variação de Número de Cópias (Copy Number Variation)
COSMIC - Catalogue of Somatic Mutations in Cancer
CSF1 - Fator de Crescimento de Monócitos/Macrófagos (Colony Stimulating Factor-1)
CTH – Células-Tronco Hematopoiéticas
CTL – Células-Tronco Leucêmicas
DIPSS – Dynamic International Prognostic Scoring System
Epo – Eritropoetina
FC - Fatores de Crescimento
FISH - Hibridização In-Situ por Fluorescência (Fluorescence In Situ Hybridization)
G-CSF - Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos (Granulocyte Colony
Stimulating Factor)
GM-CSF - Fator Estimulador de Colônias Granulócito-Macrófago (Granulocyte-
Macrophage Colony Stimulating Factor)
GST – Gene Supressor de Tumor
GWAS - Estudos de Associação Genômica Ampla (Genome-wide Association Studies)
HBDF – Hospital de Base do Distrito Federal
HR – Razão de Risco (Hazard Ratio)
IC – Intervalo de Confiança
IL3 – Interleucina 3
IPSS - International Prognostic Scoring System
JAK2 – Janus-quinase 2
Kb – quilobases
LMA – Leucemia Mieloide Aguda
LMC – Leucemia Mieloide Crônica
LMMC – Leucemia Mielomonocítica Crônica
LOH – Perda de Heterozigose (Loss of heterozigosity)
MAPK - Mitogen-Activated Protein Kinase
MAR – Regiões Minimamente Afetadas (Minimally Afected Region)
Mb – megabases
MF – Mielofibrose
MFP – Mielofibrose Primária
MLPA - Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
MPL – Receptor de Trombopoetina
NGS - Next Generation Sequencing
NMP – Neoplasias Mieloproliferativas
OMIM – Online Mendelian Inheritance in Men
OMS – Organização Mundial de Saúde
pb – pares de base
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction)
PI3K - Fosfatidil-Inositol Quinase 3 (Phosphatidyilinositol Kinase-3)
PV – Policitemia Vera
RE – Retículo Endoplasmático
ROC - Característica de Operação do Receptor (Receiver Operating Characteristic)
SDF1 - Stromal Derived Factor-1
SIFT - Separate Tolerable from Intolerable
SMD – Síndrome Mielodisplásica
SNP – Polimorfismo de Nucleotídeo Único (Single Nucleotide Polymorphism)
ST – Sobrevida total
STAT - Signal Transducer and Activator of Transcription
TE – Trombocitemia Essencial
TEV – Trombo-embolismo Venoso
TGF-Beta - Transforming Growth Factor Beta
TN – Triplo Negativo
TPO – Trombopoetina
UPD – Dissomia Uniparental (Uniparental Disomy)
WES - Sequenciamento de Exoma Total (Whole Exome Sequencing)
1 Sumário
1 Introdução ..................................................................................................... 14
1.1 Classificação das neoplasias hematológicas....................................................... 14
1.2 Neoplasias mieloproliferativas .......................................................................... 14
1.2.1 Classificação e características gerais .................................................................. 14
1.2.2 Elucidação das alterações genéticas e dos mecanismos fisiopatogênicos das
NMPs clássicas Ph negativas ........................................................................................................ 17
1.2.2.1 Mutações do gene JAK2 ............................................................................................ 17
1.2.2.2 Mutações do gene MPL ............................................................................................. 18
1.2.2.3 Mutações do gene da Calreticulina (CALR)................................................................ 18
1.2.2.4 Mutações determinantes das NMPs clássicas são exclusivas e convergem para a
ativação da via JAK-STAT. ........................................................................................................................ 19
1.2.2.5 Relação entre mutações driver e apresentação clínica ............................................. 20
1.2.2.6 Mutacões somáticas adicionais nas NMPs ................................................................ 21
1.2.2.6.1 Genes envolvidos em vias de sinalização. ......................................................... 22
1.2.2.6.2 Reguladores epigenéticos .................................................................................. 22
1.2.2.6.3 Maquinário de Processamento de RNA mensageiro ......................................... 23
1.2.2.6.4 Heterogeneidade da arquitetura clonal ............................................................ 24
1.2.2.7 Hematopoiese Clonal de Prognóstico Indeterminado (C.H.I.P.)................................ 24
1.2.2.8 Predisposição germinativa e Síndromes Mieloproliferativas Familiares ................... 25
1.2.2.9 Seleção clonal determinada por Perda de Heterozigose........................................... 26
1.2.2.10 Gênese das CN-LOH ................................................................................................. 26
1.2.2.11 aUPDs nas Neoplasias Mielóides ............................................................................. 28
1.2.2.11.1 aUPD do segmento 9p ..................................................................................... 28
1.2.2.11.2 aUPD do segmento 1p ..................................................................................... 29
1.2.2.11.3 Outras aUPDs de interesse nas neoplasias mieloides...................................... 29
1.3 Mielofibrose ..................................................................................................... 29
1.3.1 Epidemiologia ..................................................................................................... 29
1.3.2 Manifestações clínicas........................................................................................ 30
1.3.3 Alterações laboratoriais ..................................................................................... 31
1.3.4 Frequência das mutações driver ........................................................................ 31
1.3.5 Mielofibrose pós-TE e pós PV ............................................................................. 32
1.3.6 Desenvolvimento da fibrose reticulínica e esgotamento das CTH normais ....... 32
1.3.7 Alterações citogenéticas na MF ......................................................................... 33
1.3.8 Prognóstico da MF.............................................................................................. 34
1.3.8.1 Influência das mutações driver no prognóstico ........................................................ 35
 1.3.8.2 Influência do tipo e número de mutações cooperativas no prognóstico .................. 37
1.3.9 Tratamento da MF.............................................................................................. 38

2 Justificativa e Objetivos ................................................................................. 39

1.1 Justificativa ....................................................................................................... 39
2.1 Objetivo geral ................................................................................................... 39
2.2 Objetivos específicos ........................................................................................ 39

3 Materiais e métodos ...................................................................................... 40

3.1 Tipo e população do Estudo .............................................................................. 40
3.2 Parâmetros clínicos e laboratoriais ................................................................... 42
3.3 Coleta e preparação de amostras ...................................................................... 42
3.4 Caracterização das mutações driver .................................................................. 43
3.4.1 Pesquisa das mutações driver por MLPA............................................................ 43
3.4.1.1 Protocolo do MLPA .................................................................................................... 44
3.5 Sequenciamento do painel de genes de interesse ............................................. 45
3.5.1.1 Estratégia para a identificação de genes mutados .................................................... 47
3.6 Análise Cromossômica por Microarranjo (CMA) ................................................ 48
3.6.1.1 Protocolo do CMA ..................................................................................................... 49
3.7 Análise Estatística ............................................................................................. 51

4 Resultados ..................................................................................................... 52
4.1 Achados clínicos e laboratoriais ........................................................................ 52
4.1.1 Distribuição das mutações driver ....................................................................... 53
4.2 Tratamentos e desfechos clínicos ...................................................................... 55
4.2.1 Complicações trombóticas e hemorrágicas ....................................................... 56
4.2.2 Progressão para fase acelerada ou blástica ....................................................... 56
4.2.3 Sobrevida Total................................................................................................... 56
4.2.3.1 ST versus mutações driver ......................................................................................... 57
4.2.3.2 ST versus IPSS ao diagnóstico .................................................................................... 57
4.2.3.3 Impacto de outros fatores analisados sobre a ST ...................................................... 58
4.3 Resultados do Next Generation Sequencing ...................................................... 59
4.4 Alterações cromossômicas detectadas por CMA ............................................... 62
4.4.1 Padrões de associação entre alterações genômicas .......................................... 65
4.5 Avaliação prognóstica baseada nos achados genômicos.................................... 67

5 Discussão ....................................................................................................... 71
6 Conclusões ..................................................................................................... 83

7 Referências .................................................................................................... 85

8 Apêndice 1 - Artigo científico ......................................................................... 98

9 Apêndice 2 – Resultados individuais dos pacientes com MF ......................... 106

 14

1 INTRODUÇÃO

1.1 CLASSIFICAÇÃO DAS NEOPLASIAS HEMATOLÓGICAS

A maioria das neoplasias malignas dos tecidos hematopoiéticos e linfoides são

classificadas em diferentes categorias diagnósticas, definidas por características clínicas,
morfológicas, imunofenotípicas e genéticas. Quando possível, os diferentes tipos de cânceres
hematológicos são agrupados de acordo com sua linhagem, como segue1:
i) Neoplasias Linfoides: derivadas de células progenitoras B ou T ou de linfócitos B
ou T maduros.
ii) Neoplasias Histiocíticas/Dendríticas: derivadas de células que normalmente
desenvolvem-se a apresentadoras de antígenos profissionais (células dendríticas) ou
macrófagos teciduais (histiócitos).
iii) Neoplasias mieloides: derivadas das células progenitoras da medula óssea que se
desenvolvem a eritrócitos, granulócitos, monócitos e plaquetas. Podem ser sub-
agrupadas em 3 classes clínico-patológicas distintas:
(1) Leucemias Mieloides Agudas (LMAs): definidas pela presença de mais de 20%
de blastos mieloides na medula óssea ou sangue periférico ou, ainda, por
alterações citogenéticas específicas, independentemente do número de blastos.
(2) Síndromes Mielodisplásicas (SMDs): desordens que mostram displasia medular
e hematopoiese ineficaz.
(3) Neoplasias Mieloproliferativas (NMPs).

1.2 NEOPLASIAS MIELOPROLIFERATIVAS

1.2.1 Classificação e características gerais

As NMPs são constituídas por doenças hematológicas clonais cujas principais

características fenotípicas, em suas fases crônicas, são: produção excessiva de células mieloides
diferenciadas, curso clínico relativamente longo e risco de progressão para fases avançadas.
Estas últimas, por sua vez, são caracterizadas por insuficiência medular progressiva e/ou
evolução clonal para leucemias agudas2. A tabela 1 mostra as entidades nosológicas incluídas
entre as NMPs, segundo a classificação da Organização Mundial da Saúde (OMS), atualizada
em 20161.
 15

Tabela 1 – Classificação das Neoplasias Mieloproliferativas Segundo a OMS

Neoplasias Mieloproliferativas (NMPs)

Leucemia Mielóide Crônica, BCR-ABL +
Leucemia Neutrofílica Crônica
Policitemia Vera
Mielofibrose
Pré-Fibrótica/Estágio precoce
Estágio Fibrótico
Trombocitemia Essencial
Leucemia Eosinofílica Crônica
Mastocitose Sistêmica
NMPs inclassificáveis
Fonte: Arber (2016)1

Na maioria dos casos, as mutações ou rearranjos causadores de mieloproliferação

ocorrem nas Células-Tronco Hematopoiéticas (CTH) ou Células Progenitoras, em genes que
codificam proteínas envolvidas na transdução de sinais externos à célula e que controlam a
ativação de vias intracelulares reguladoras do crescimento, diferenciação, metabolismo,
migração e morte celular programada. As CTH assim transformadas, chamadas de Células-
Tronco Leucêmicas (CTL), exibem ativação constitutiva destas vias, viés de maturação para a
linhagem mieloide e vantagem proliferativa sobre as CTH normais3. O impacto extrínseco do
clone tumoral promove alterações no nicho medular, que reforça esta vantagem4.
A primeira patologia deste grupo de neoplasias a ter uma anormalidade genética descrita
foi a Leucemia Mieloide Crônica (LMC), caracterizada por sua lesão molecular causal, o gene
de fusão BCR-ABL, resultante da translocação entre os cromossomos 9 e 22 (conhecida como
cromossomo Philadelphia). Esta mutação codifica a proteína BCR-ABL, com atividade de
tirosina-quinase constitutivamente ativa, que é essencial e suficiente para desenvolvimento da
doença5. A LMC constitui-se num modelo para compreensão da evolução das NMPs: costuma
apresentar-se inicialmente em uma fase crônica, caracterizada por fenótipo mieloproliferativo
oligo-sintomático. Se deixada sem tratamento – ou nos casos de falha deste – a doença progride
para uma fase acelerada, com aumento dos sintomas, redução da capacidade de
amadurecimento dos progenitores hematopoiéticos e consequente insuficiência medular
progressiva. Esta fase evolui para um quadro de excesso de blastos e citopenias graves,
conhecida como crise blástica, que se assemelha a um quadro de leucemia aguda e é
majoritariamente fatal. Esta progressão para fases avançadas está associada a instabilidade
genética progressiva e aquisição de novas mutações pelo clone neoplásico6. O desenvolvimento
 16

de inibidores da tirosina-quinase BCR-ABL como o Imatinibe constituiu um marco no

desenvolvimento de terapias com alvo molecular específico, transformando a LMC, de uma
neoplasia maligna curável apenas com Transplante de Células-Tronco Hematopoiéticas
alogênico (AloTCTH), em uma doença controlável com uso de drogas orais, com pouca
toxicidade7.
Como, durante muito tempo, as demais NMPs não tinham alterações genéticas
específicas identificadas, elas foram chamadas de NMPs Philadelphia negativas. Dessas, as
mais comuns – também chamadas de clássicas – são a Policitemia Vera (PV), a Trombocitemia
Essencial (TE) e a Mielofibrose (MF)8. As características cardinais destas 3 NMPs clássicas
são, respectivamente, aumento da massa eritrocitária, contagem elevada de plaquetas e fibrose
na medula óssea (figura 1). Elas podem apresentar as mesmas alterações genéticas
determinantes de fenótipo mieloproliferativo e manifestações laboratoriais e clínicas comuns,
como hipercelularidade na medula óssea, esplenomegalia, risco aumentado para ocorrência de
tromboses, sangramentos e evolução para SMD, LMA ou ainda, nos casos de PV e TE, para
fase fibrótica9. O risco destas complicações, contudo, é diferente entre as NMPs. Por exemplo,
as taxas de evolução clonal para LMA variam de menos de 5% na TE até 30% na MF10.

Figura 1. Características cardinais das NMPs clássicas.

Na PV (linha 1) há aumento da massa eritrocitária (tubo à esquerda), medula óssea (MO) com hiperplasia mieloide e fibrose
medular ausente ou leve. Na TE (linha 2) há plaquetose, MO normocelular, com hiperplasia megacariocítica e fibrose ausente ou
leve. Na MF (linha 3) ocorre padrão leuco-eritroblástico no sangue e, classicamente, fibrose medular.
Fonte: Adaptado de Campbell (2006)2
 17

Alguns tipos de neoplasias mieloides crônicas tem características comuns a NMPs e a

SMDs, sendo separadamente classificadas como síndromes de overlap NMP/SMD, como é o
caso da LMC atípica BCR-ABL negativa e da Leucemia Mielomonocítica Crônica (LMMC)1.

1.2.2 Elucidação das alterações genéticas e dos mecanismos fisiopatogênicos das NMPs
clássicas Ph negativas

Dameshek em 1951 foi o primeiro a abordar a considerável sobreposição do quadro

clínico destas patologias e usou o termo Síndromes Mieloproliferativas para descrevê-las11.
Em 1974, mostrou-se que progenitores eritróides de pacientes com PV eram capazes de
crescimento in vitro na ausência de eritropoietina, demonstrando a independência ou
hipersensibilidade destes precursores aos Fatores de Crescimento (FC)12. Pouco depois, estudos
de inativação do cromossomo X em células de mulheres com NMPs sugeriram que elas eram
originadas de um único clone de CTH13,14.
Outras pistas sobre os mecanismos de doença incluíram a associação entre ativação de
tirosina-quinases e neoplasias mieloides crônicas2, como a LMC, a Mastocitose Sistêmica e a
Leucemia Eosinofílica Crônica, e o achado de ativação excessiva das vias JAK-STAT (Signal
Transducer and Activator of Transcription) e PI3K (Fosfatidil-Inositol Quinase 3) nas NMPs
clássicas15,16.

1.2.2.1 Mutações do gene JAK2

Em 2005, diferentes grupos descreveram uma única mutação de ponto no gene JAK2,
em cerca de 95% dos pacientes com PV e 50-60% dos pacientes com TE e MF17–19.
JAK2 (Janus-quinase 2) é uma tirosina-quinase essencial para a eritropoiese e para a
diferenciação da linhagem mieloide. Promove a sinalização intra-celular dos receptores das
citocinas Eritropoietina (Epo), Trombopoetina (TPO), Interleucina-3 (IL-3), Fator Estimulador
de Colônias de Granulócitos (G-CSF) e de Colônias Granulócito-Macrófago (GM-CSF).
Quando o FC se liga ao seu receptor, ocorre uma mudança conformacional deste último,
levando à fosforilação e ativação da JAK2. A proteína ativada, por sua vez, fosforila a porção
citoplasmática do receptor, promovendo o acoplamento de proteínas efetoras da iniciação de
cascatas de sinalização intracelular, principalmente as vias JAK- STAT, PI3K e RAS- MAPK
(Mitogen-Activated Protein Kinase) (figura 2). JAK2 é também necessária para o
processamento intracelular e exposição na membrana celular dos receptores de Eritropoetina
(EPO-R) e de Trombopoetina (MPL).
 18

Figura 2. Papel da JAK2 na transdução de sinal induzido por Fatores de Crescimento.

Sem sinalização
Na presença de ligante, o receptor de Epo sofre alteração conformacional, autofosforilação e fosforilação de JAK,
seguida de ativação de vias intracelulares. JAK2 mutante promove estes efeitos na ausência de Epo.
Fonte: Campbell (2006)2

A mutação mais frequente ocorre no Exon 14 do gene JAK2, com a substituição de

Valina por Fenilananina no códon 617 (V617F), dentro do domínio pseudo-quinase JH2, que
tem efeito auto-inibidor sobre o domínio quinase JH1. A perda da atividade inibitória causada
pela mutação leva à ativação, independente de citocinas, das vias JAK-STAT e, em menor
intensidade, PI3K e MAPK.
A quase totalidade dos pacientes com PV que não tem a mutação JAK2 V617F
apresentam mutações com ganho-de-função no Exon 12 do mesmo gene20.

1.2.2.2 Mutações do gene MPL

Em 2006, mutações de ponto no códon 515 (W515L e W515K) e, menos
frequentemente, em S505N, do gene que codifica o receptor de Trombopoetina (MPL) foram
descritas em 5% e 1% dos pacientes com MF e TE, respectivamente21,22. Estas mutações não
são encontradas em pacientes com PV e levam a alterações conformacionais do receptor
semelhantes às induzidas pela ligação da trombopoetina e à ativação da via JAK-STAT
independente da presença de citocina.

1.2.2.3 Mutações do gene da Calreticulina (CALR)

Em 2013, mutações do gene CALR foram descritas simultaneamente por 2 grupos, na
maioria dos pacientes com TE e MF que não apresentavam mutações dos genes JAK2 ou
MPL23,24. Estas mutações são inserções ou deleções no exon terminal, causando deslocamento
do quadro de leitura e proteína mutante com porção C-terminal alterada.
 19

Este achado foi inicialmente surpreendente, uma vez que a CALR não é um receptor de
citocinas e não era um participante conhecido da via JAK-STAT. Suas funções mais bem
caracterizadas são de molécula chaperona no Retículo Endoplasmático (RE), auxiliando na
aquisição da conformação espacial de suas proteínas clientes e de reguladora da homeostase de
cálcio25. Contudo, o conhecimento de que MPL é uma proteína cliente de RE, de que mutação
de CALR é encontrada apenas em pacientes com TE e MF (similar às mutações de MPL) e,
ainda, de que CALR mutante em modelos animais causa fenótipo mieloproliferativo apenas na
presença de MPL, sugeria que estes mutantes ativavam a sinalização de MPL26. Estudos
subsequentes demonstraram que o mecanismo molecular desta ativação se dá pela ligação entre
a porção C-terminal da CALR mutante e MPL, induzindo fosforilação de JAK2 e ativação da
sinalização downstream27.
Mais de 50 mutações diferentes de CALR foram descritas. Duas delas, porém, perfazem
aproximadamente 80% dos casos: E364fs (tipo 1), quando ocorre deleção de 52 pares de base
(pb) e K385fs (tipo 2), quando há inserção de 5pb28.

1.2.2.4 Mutações determinantes das NMPs clássicas são exclusivas e convergem para a
ativação da via JAK-STAT.
A descoberta das mutações dos genes JAK2, MPL e CALR explica o mecanismo de
desenvolvimento de doença em ao menos 90% dos casos das NMPs clássicas, através da
convergência da ativação da via JAK-STAT (figura 3).
Estudos de Sequenciamento de Exoma Total (Whole Exome Sequencing, WES) em
pacientes Triplo-Negativos (TN) encontraram outras mutações com ganho-de-função nos genes
JAK2 e MPL, com consequente ativação da mesma via29.
Figura 3. Mutações dos genes JAK2, MPL e CAL-R levam a mieloproliferação excessiva por meio da ativação
constitutiva das mesmas vias de sinalização downstream.

Fonte: Nangalia (2017)26

 20

As mutações de JAK2, MPL e CALR são somáticas e consideradas mutuamente

exclusivas, embora raras exceções tenham sido descritas30. Elas são determinantes para o
desenvolvimento de fenótipo mieloproliferativo e podem estar associadas a outras mutações
cooperativas (principalmente na MF), algumas das quais podem anteceder o seu aparecimento.
Por este motivo, considera-se que são melhor descritas como determinantes de fenótipo
(phenotypic drivers ou simplesmente drivers) do que fundadoras.

1.2.2.5 Relação entre mutações driver e apresentação clínica

As diferentes mutações driver levam a apresentações clínicas e desfechos de longo
prazo diversos. Por exemplo, pacientes com mutações no exon 12 do gene JAK2 cursam com
eritrocitose isolada20. Isto se dá porque este mutante se acopla preferencialmente ao receptor de
Epo.
Na TE, pacientes com mutações em CALR e MPL demonstram fenótipo similar, com
plaquetose isolada, embora aqueles com a primeira mutação apresentem idade mediana de
diagnóstico mais precoce do que nos casos com mutação de MPL ou JAK2.
Já pacientes com critérios diagnósticos de TE e mutação de JAK2, além de mais velhos,
apresentam níveis mais altos de hematócrito e leucócitos, maior risco de transformação para
PV (evolução não encontrada nos casos de MPL e CALR mutados) e de tromboses31. De fato,
as entidades nosológicas PV e TE JAK2 V617F são hoje consideradas fenótipos diferentes na
evolução de uma mesma neoplasia, corroborando a observação de Dameshek, há mais de meio
século, de que “consideramos difícil estabelecer qualquer linha divisória; De fato, há tantas
formas de transição, que pode-se, de forma igualmente razoável, nomear uma única condição
por dois termos diferentes”11.
Desde a descrição da mutação JAK2 V617F em 2005, grande interesse foi gerado para
se entender o mecanismo pelo qual uma mesma mutação genética poderia resultar em diferentes
apresentações clínico-laboratoriais, o que hoje já é parcialmente compreendido: nas NMPs com
JAK2 V617F, o padrão dos parâmetros hematológicos (proliferação megacariocítica
preferencial e trombocitose isolada na TE ou panmielose na PV e MF) está associado, entre
outras variáveis, à carga alélica de JAK2 V617F, calculada como a razão entre transcritos
mutantes e selvagens. Animais transgênicos e pacientes com carga alélica em granulócitos
superior a 50%, por convenção chamados de homozigotos, apresentam maior tendência à
hipercelularidade medular global e eritrocitose que aqueles com carga alélica inferior32,33.
Em torno de 30% de pacientes com MF e PV apresentam a mutação em homozigose,
quando pesquisada em granulócitos totais. Carga alélica >50% é incomum (2-4%) na TE 19,34.
 21

Fatores específicos dos pacientes também podem influir na apresentação, como gênero,
adequação de estoques de ferro, função renal/níveis de Epo e variações genéticas germinativas,
além do tipo de CTH ou progenitora em que ocorre a mutação (figura 4).

Figura 4. Apresentação Clínica das NMPs na fase crônica e relação com mutações driver.

A tendência à ocorrência preferencial de eritrocitose ou plaquetose é dependente da genética da doença e fatores

relacionados ao paciente, que induzem sinalização preferencial de Epo ou MPL
Fonte: Nangalia (2017)26

Nos casos de ocorrência de mutação cooperativa à mutação driver, a ordem de aquisição

pode influenciar o fenótipo. Por exemplo, ocorrência de mutação do gene TET2 em um clone
com JAK2 mutado predispõe a fenótipo de PV, enquanto a aquisição na ordem reversa
predispõe a TE35
O tipo de mutação driver também tem impacto na apresentação clínica e prognóstico da
MF, como abordado mais à frente, na descrição desta doença.

1.2.2.6 Mutacões somáticas adicionais nas NMPs

Aproximadamente um terço dos pacientes com NMPs apresentam alterações somáticas
em genes associados a neoplasias mieloides em geral (incluindo SMDs, LMAs e quadros de
Hematopoiese Clonal de Prognóstico Indeterminado), de forma adicional às mutações driver.
A figura 5 mostra a prevalência destas mutações nas diferentes NMPs clássicas.
Estas mutações acometem diferentes processos celulares. Os mais importantes estão
listados abaixo.
 22

Figura 5. Prevalência (%) das mutações somáticas adicionais e proporções relativas entre as 3 NMPs clássicas.

As mutações envolvendo genes associados à regulação epigenética e estrutura da cromatina são as mais frequentes.
Fonte: Grinfeld (2017)36

1.2.2.6.1 Genes envolvidos em vias de sinalização.

Como seria de se esperar, tendo em vista o papel das vias de sinalização de receptores
na fisiopatologia das NMPs, encontram-se mutações em membros downstream destas vias ou
mutações de perda-de função em reguladores negativos dos receptores de FC. São exemplos,
respectivamente, as mutações afetando genes que codificam proteínas da via de sinalização de
RAS e mutações dos reguladores SH2B3 (alias LNK) e CBL. Estas alterações tendem a ser
encontradas apenas nas fases mais avançadas das NMPs.

1.2.2.6.2 Reguladores epigenéticos

O gene mais comumente mutado é membro da família TET, ten-eleven translocation 2
(TET2). Mutações de perda-de-função deste gene são encontradas em cerca de 10% dos casos
de NMPs. TET2 converte 5-metilcitosina (5-mC) em 5-hidroximetilcitosina (5-hmC), processo
particularmente importante na regulação gênica em células-tronco e desenvolvimento
embrionário. A redução de 5-hmC encontrada nos mutantes é associada com aumento da
capacidade de auto-renovação da CTL, viés de maturação para linhagem mieloide e bloqueio
de maturação nas células progenitoras. Mutações de TET2 são encontradas em todas as NMPs
e pode estar associada a pior Sobrevida Total (ST) e aumento de progressão para LMA37.
Mutações nos genes de Isocitrato Dehidrogenase 1 e 2 (IDH1 e IDH2) são descritas em
até 5% dos casos. Estas enzimas levam à conversão de isocitrato a alfa-cetoglutarato, mas os
 23
22

mutantes têm produção excessiva de 2-hidroxiglutarato, hipermetilação de histonas e inibição

de atividade de TET2. Mutações de IDH são mais frequentemente encontradas em MF e NMPs
de atividade de TET2. Mutações de IDH são mais frequentemente encontradas em MF e NMPs
transformadas.
transformadas 36
.
OOgene
geneda
daDNA-metil-transferase
DNA-metil-transferase33(DNMT3),
(DNMT3),responsável
responsávelpela
pelametilação
metilaçãode denovo
novode
de
dinucleotideos CpG,
dinucleotideos CpG, pode
pode apresentar
apresentar mutações
mutações de
de perda-de-função
perda-de-função em
em todas
todas as
as NMPs.
NMPs. AA
desregulaçãoepigenética
desregulação epigenéticaaumenta
aumentaaaexpressão
expressãodedegenes
genestipicamente
tipicamenteexpressos
expressosem
emCTH
CTH(como
(como
GATA3eeRUNX1)
GATA3 RUNX1)eeinfra-regulação
infra-regulaçãode
defatores
fatoresde
dediferenciação
diferenciação(como
(comoIkaros),
Ikaros),resultando
resultandoem
em
bloqueiomaturativo
bloqueio maturativoeeexpansão
expansãodas
dasCTL
CTL.38
.
Mutaçõesde
Mutações degenes
genesenvolvidos
envolvidosem
emmetilação
metilaçãode
dehistonas
histonasestão
estãohiper-representados
hiper-representadosem
em
MFeeNMPs
MF NMPstransformadas
transformadaseesão
sãotambém
tambémfrequentemente
frequentementedescritas
descritasem
emSMDs
SMDseeLMAs.
LMAs.EZH2
EZH2
(Enhancerofofzeste
(Enhancer zeste2)
2)ééoocomponente
componentecatalítico
catalíticodo
dopolycomb
polycombrepresive
represivecomplex
complex22(PRC2),
(PRC2),que
que
agena
age natri-metilação
tri-metilaçãoda
dalisina
lisina27
27da
dahistona
histonaH3.
H3.Em
EmNMPs,
NMPs,mutações
mutaçõesde
deEZH2
EZH2são
sãode
deperda-
perda-
de-funçãoeeassociadas
de-função associadasaaaumento
aumentodadaauto-renovação
auto-renovaçãodas
dasCTHs.
CTHs.Também
Tambémcomuns
comunssão
sãomutações
mutações
de Additional Sex Combs Like 1 (ASXL1), um componente de PRC1, mas que também regula
de Additional Sex Combs Like 1 (ASXL1), um componente de PRC1, mas que também regula
atividade de PRC2. Elas também causam redução da metilação de H3K27.
atividade de PRC2. Elas também causam redução da metilação de H3K2736.

Figura 6. Resumo das vias regulatórias epigenéticas afetadas por mutações conhecidas nas NMPs.
Figura 6. Resumo das vias regulatórias epigenéticas afetadas por mutações conhecidas nas NMPs.

Bloqueio de Diferenciação
Expansão de Células-Tronco
Progressão de Doença

Mutações de ganho ou perda de função em diferentes genes associados à regulação epigenética e estrutura da
Mutaçõeslevam
cromatina de ganho ou perda
a aumento de função de
de expressão emgenes
diferentes genesa associados
associados à regulação
expansão das epigenética
CTH e bloqueio e estrutura da
de maturação.
cromatina levam a aumento de expressão de genes associados a expansão das CTH e bloqueio de maturação.
Fonte: Grinfeld (2017)3636
Fonte: Grinfeld (2017)

1.2.2.6.3 Maquinário de Processamento de RNA mensageiro

1.2.2.6.3 Maquinário de Processamento de RNA mensageiro
Mutações em componentes do spliceossomo, incluindo Splicing Factor 3B subunit 1
Mutações em componentes do spliceossomo, incluindo Splicing Factor 3B subunit 1
(SF3B1), Serine-Arginine-Rich Splicing Factor 2 (SRSF2), U2 Small Nuclear RNA Auxiliary
(SF3B1), Serine-Arginine-Rich Splicing Factor 2 (SRSF2), U2 Small Nuclear RNA Auxiliary
Factor 1 (U2AF1) e Zinc Finger RNA Binding Motif and Serine/arginine Rich 2 (ZRSR2),
também são encontradas em NMPs, particularmente na MF e em casos de síndrome de overlap
 24

Factor 1 (U2AF1) e Zinc Finger RNA Binding Motif and Serine/arginine Rich 2 (ZRSR2),
também são encontradas em NMPs, particularmente na MF e em casos de síndrome de overlap
NMP/SMD. O papel destas mutações na patogênese não é totalmente compreendido, mas levam
a mis-splicing de múltiplos genes e agem também desregulando a função de PRC236.
A figura 6 esquematiza a inter-relação de diferentes vias de controle epigenético e de
splicing que levam à desregulação de genes envolvidos no comportamento das CTH.
1.2.2.6.4 Heterogeneidade da arquitetura clonal
Estudos de Sequenciamento de Próxima Geração (Next Generation Sequencing, NGS)
direcionados a genes de interesse, quando realizados em colônias de células mononucleares
derivadas de pacientes com NMPs, permitem inferir a ordem de aquisição das mutações
somáticas cooperativas, entender a arquitetura clonal e a correlação do número ou tipo de
mutação com os desfechos clínicos. Um destes estudos37 mostrou que pacientes com sub-clones
apresentando mutações somáticas adicionais tem maior risco de transformação leucêmica e pior
sobrevida.
A figura 7 mostra a arquitetura clonal de 8 pacientes com NMPs. Uma das observações
importantes destes estudos é de que a grande maioria de mutações somáticas já estavam
presentes ao diagnóstico da NMP e muito poucas mutações adicionais são detectadas durante
seguimento.

1.2.2.7 Hematopoiese Clonal de Prognóstico Indeterminado (C.H.I.P.)

O Sequenciamento de Genoma Total (Whole Genome Sequencing, WGS) em
indivíduos sem diagnóstico de patologias hematológicas, buscando mutações somáticas
recorrentes em neoplasias mieloides, mostra que estas raramente são encontradas em indivíduos
jovens (<1% abaixo dos 50 anos)39–41. Contudo, com o avançar da idade, a frequência de achado
de mutações clonais aumenta para em média 10% nos indivíduos acima de 60 anos (9,5% nos
indivíduos com idade entre 70 e 79 anos e 18,4% nos idosos com mais de 90 anos). A maioria
destas ocorre nos mesmos 3 genes cooperativos mais frequentemente mutados nas NMPs:
DNMT3, TET2 e ASXL1. Clones contendo mutações JAK2 V617F e TP53 também são
relativamente frequentes39–41.
Pacientes com Hematopoiese Clonal tem risco aumentado de desenvolvimento de
Neoplasias Mieloides em relação àqueles sem este achado, com Razão de Risco (Hazard Ratio,
HR) superior a 11. Contudo, a maioria dos portadores ainda assim não desenvolverá canceres
hematológicos. Esta condição é, por isso, denominada Hematopoiese Clonal de Prognóstico
Indeterminado (Clonal Hematopoiesis of Indeterminate Prognosis, C.H.I.P.). Uma interessante
 25

observação é a de que estes indivíduos têm risco aumentado para o desenvolvimento de eventos
arteriais coronarianos (HR=2.0) e de mortalidade em geral (HR=1.4)41.

Figura 7. Padrão de evolução clonal de pacientes com NMPs com mutações somáticas múltiplas

Estudos em colônias derivadas de CTL permitem inferir a arquitetura clonal e a sequência de aquisição das
mutações. A maioria das mutações já está presente ao diagnóstico.
Fonte: Lundberg (2017)37

1.2.2.8 Predisposição germinativa e Síndromes Mieloproliferativas Familiares

Cerca de 10% dos pacientes com NMPs tem outros membros da família afetados e há
uma tendência a que familiares apresentem o mesmo fenótipo de MPN, o que sugere fortemente
a existência de fatores de suscetibilidade germinativos.
As variações genéticas germinativas que predispõem ao desenvolvimento de NMPs,
demonstradas por Estudos de Associação Genômicas (GWAS), podem ser de 2 tipos: 1)
Polimorfismos que resultam em pequena predisposição ao desenvolvimento de doença e 2)
Variantes raras, com alta penetrância para desenvolvimento das neoplasias, encontradas em
casos de NMPs familiares42.
Exemplos do primeiro tipo são o haplótipo JAK2 46/1 e um polimorfismo do gene
TERT. Ambos conferem risco de 1,5 a 3,5 vezes maior de desenvolver uma NMP43–45. A
frequência do haplótipo JAK2 46/1 em 90 indivíduos brasileiros sem NMP foi de 27%46.
Nos casos de Síndromes Mieloproliferativas Familiares, os locos possivelmente
responsáveis pela predisposição foram encontrados apenas em alguns poucos pedigrees.
 26

Exemplos são genes envolvidos na sinalização JAK-STAT (SH2B3), na diferenciação mieloide

(GFI1B), no reparo de DNA (ATM, CHEK2) e na regulação epigenética (TET2).
Há 2 modelos de como alterações germinativas podem levar à predisposição às MPNs.
A observação de que o haplótipo 46/1 do gene JAK2 encontra-se normalmente em cis com
JAK2 V617F levanta a possibilidade de que este alelo predisponha à aquisição da mutação
driver. Outra possibilidade é de que certas condições genéticas germinativas possam alterar
funções celulares, aumentando as consequências moleculares e celulares de uma mutação driver
em um clone MPN nascente, fazendo com que ele se torne dominante. Exemplo deste modelo
são as duplicações dos genes ATG2B e GSKIP, que causam hipersensibilidade dos progenitores
de megacariócitos à TPO, especialmente na presença de JAK2 V617F47.

1.2.2.9 Seleção clonal determinada por Perda de Heterozigose

Os genomas dos cânceres são caracterizados por instabilidade e acúmulo progressivo de
alterações genéticas. A Perda de Heterozigose (Loss of Heterozigosity, LOH) é uma delas. LOH
é decorrente de deleção de material cromossômico em um alelo (e consequente expressão
exclusiva do alelo restante) ou por duplicação da região cromossômica materna ou paterna e
concorrente perda do outro alelo. Este segundo mecanismo dá origem à Perda de Heterozigose
com Número de Copias Neutro (Copy Neutral – Loss of Heterozigosity, CN-LOH). A figura 8
representa os possíveis mecanismos patogênicos derivados de LOH, seja por deleção ou por
CN-LOH, também chamada de Dissomia Uniparental (Uniparental Dissomy, UPD).
CN-LOH pode promover vantagem clonal sobre as células normais por meio de
duplicação de alterações germinativas predisponentes a neoplasias, por aquisição de padrão de
imprints impróprios e por duplicação de mutações somáticas adquiridas. Estas últimas podem
causar duplicação de um oncogene ou de uma mutação inativadora de um gene supressor de
tumor (GST). Mutações associadas a CN-LOH são previsivelmente co-dominantes, isto é,
causam vantagem seletiva quando em heterozigose e ainda mais acentuada quando em
homozigose. Assim, áreas de UPD adquiridas (aUPDs) são regiões preferenciais de busca de
mutações gênicas em neoplasias.

1.2.2.10 Gênese das CN-LOH

As CN-LOH podem ser constitucionais (não clonais), quando ocorrem por defeitos
meióticos (por exemplo, por resgate de trissomia), por evento mitótico em estágio embrionário
precoce (levando à formação de mosaico para a UPD) ou, ainda, por autozigosidade (herança
da mesma região alélica ancestral de ambos os pais). A figura 9 mostra mecanismos mitóticos
da formação de CN-LOH. Estas alterações, quando constitucionais, frequentemente levam a
 27

doenças do desenvolvimento por expressão anormal de genes com imprint, mas podem ser
encontradas em controles saudáveis48.

Figura 8. Ações patogênicas de LOH.

CN-LOH pode levar a duplicação de alteração germinativa predisponente a neoplasia (A), ou de uma mutação adquirida (B);
também pode levar a perda de uma marca epigenética repressiva (C) ou redução de expressão gênica por duplicação de marca
epigenética repressiva (D); Deleções podem levar ao aparecimento de efeitos de uma alteração germinativa predisponente (E), de
mutações (F) ou a consequências de alterações do equilíbrio de padrões epigenéticos (G, H) e de haplo-infuficiência (I).
Fonte: O’Keefe (2010)49

As CN-LOH adquiridas por células neoplásicas, assim como outros defeitos

cromossômicos adquiridos, servem como marcadores de clonalidade. Os mecanismos que
levam à propensão para quebras cromossômicas e perda de fita unialélica não são bem
conhecidos, mas provavelmente envolvem deficiências adquiridas ou herdadas dos mecanismos
de reparo de DNA, do maquinário de formação dos fusos mitóticos e encurtamento dos
telômeros49. As regiões de recombinação frequentemente correspondem a sítios conhecidos de
instabilidade genômica e de alterações cromossômicas descritas em neoplasias.
UPDs não são detectadas por métodos como Bandeamento Cromossômico,
Hibridização In-Situ por Fluorescência (FISH) e Hibridização Genômica Comparativa (CGH).
A aplicação sistemática de SNP-arrays como ferramenta para o estudo citogenético mostra que
CN-LOH são frequentemente encontradas em vários canceres, incluindo os hematológicos.
É essencial que lesões somáticas das células tumorais sejam distinguidas de alterações
germinativas, uma vez que regiões de LOH germinativas são encontradas em até 15% de
indivíduos controles50. Embora a análise concomitante de DNA germinativo represente o
 28

padrão-ouro para esta distinção, critérios de tamanho da área de CN-LOH são frequentemente
utilizados. UPDs germinativas tipicamente são menores [mediana de 1,3 megabases (Mb) e 99º
percentil em 8,5 Mb]51 que as adquiridas. Em neoplasias hematológicas, as regiões de LOH
frequentemente tem extensão superior a 20-25 Mb. 49,52.
From www.bloodjournal.org by ALEXANDRE NONINO on January 2, 2018. For personal use only.

Figura 9. Mecanismos mitóticos de formação de CN-LOH.

BLOOD, 8 APRIL 2010 ! VOLUME 115, NUMBER 14 COPY NEUTRAL LOSS OF HETEROZYGOSITY 2733

Figure 2. Mitotic mechanisms of formation of CN-

LOH. (A) CN-LOH can occur as the result of mitotic
A
recombination between homologous chromosomes. De-
pending on how the chromosomes are sorted during
mitosis, daughter cells with CN-LOH can arise. (B) CN-
LOH can also arise as the consequence of deletion
followed by recombination using the homolog as a tem-
plate for correction.

A) resultante de recombinação mitótica entre cromossomos homólogos; B) Como consequência de deleção seguida
whereby the de lostrecombinação
region is replaced using the remaining
usando o homólogo a Thus,
allele as como copy number variants and segmental duplications may
modelo
template can lead to segmental LOH (Figure 2). represent DNA breakage-prone regions that may contribute to the
Fonte: O’Keefe
Mitotic recombination (2010)a 49major
is considered ; contributor to generation of chromosomal alterations by facilitating nonallelic
acquired CN-LOH.27 In the first whole-genome SNP-A study of homologous recombination, similar to fragile sites.35-37 Additional
aUPD in AML, large regions of CN-LOH were identified in 20% of mechanistic clues have been derived from colon cancer, in which
the patients studied; 8 separate nonrandom regions were identi- mitotic recombination appears to be important for inactivating
fied,6 differing in locations from those identified in similar studies tumor suppressor genes. The APC gene located at 5q21 is
1.2.2.11 aUPDs nas Neoplasias Mielóides
of epithelial cancers.28,29 Most regions of homozygosity were frequently mutated, often in a homozygous constellation resulting
partial but extended to the telomere, consistent with UPD occurring from CN-LOH, through a mitotic recombination mechanism.38
1.2.2.11.1 aUPD do segmento 9p
as a result of a single mitotic recombination. Subsequent studies of Studies demonstrate that copy number changes in aneuploid/
other myeloid malignancies also identified partial aUPD as the polyploid colorectal tumors generally occur as additional genetic
most frequent type of CN-LOH in these disorders.1 However, events, whereas LOH by mitotic recombination is an early event
Esta alteração foi descrita em cerca de um terço dos pacientes com PV53 e seu
investigations of the molecular basis for somatic NF1 inactivation that initiates tumorigenesis.39 By mapping mitotic recombination
in childhood leukemias associated with neurofibromatosis type I breakpoints between the centromere and APC, they were again
significado ficou obscuro até a descrição das mutações de JAK2. Os pontos de quebra se
elegantly illustrated that interstitial UPD can also represent a found to be nonrandom, with the highest frequency close to locus
pathway of aUPD by double-homologous recombination events30; control regions at 68 to 71 Mb, far from APC. Low copy repeats
distribuem ao longo do braço curto do cromossomo 9, entre o lócus JAK2 e o centrômero,
8 of 10 cases had large LOH, half were partial UPD, but 4 had predispose to chromosomal breakage, perhaps via replication fork
interstitial UPD. Preferred sites of mitotic recombination were also stalling, leading to mitotic recombination and ultimately CN-LOH.
identified, with a clustering of the centromeric and telomeric In contrast, breakpoints involved in APC copy number 18 loss
sugerindo que não há um sítio frágil específico para recombinações .
breakpoints. Similarly, a careful analysis of the sites of aUPD clustered to a different, more centromeric region near a suggested
origin in low-risk MDS showed that 43% of UPD regions were area of the greatest chromosomal fragility. Consequently, it is
aUPD9p em pacientes com JAK2 mutado é o principal mecanismo de aquisição de
localized to within or as part of a previously identified fragile site.31 possible that breakage through the centromere cannot be readily
Fragile locations correspond to known sites of frequent genomic repaired by mitotic recombination because the exposure of pericen-
homozigose para a mutação, o que pode influir, através de efeito de dose do gene, no fenótipo
instability. They are associated with the breakpoints of chromo- tromeric repeats produces a chromosome that is prone to nonspe-
somal aberrations in hematologic malignancies32 and often track cific pairings and recombination.
with regulatory microRNA amplifications and deletions.33 Specific oncogenes have also been implicated in mechanisms of
da doença. Como há grande variação na taxa de recombinação mitótica em indivíduos normais,
A high-resolution SNP-A profiling of mantle cell lymphoma genomic instability, which make these intriguing candidates to
(MCL) cell lines and primary tumors34 has provided additional consider as potentially mechanistically involved in the generation
fatores genéticos e ambientais que influenciem esta suscetibilidade podem ter impacto em qual
insight into mechanics of aUPD. In MCL, pathognomonic t(11; of CN-LOH. For example, BRCA1/2 has been linked to UPD seen
14)(q13;q32) are associated with secondary chromosomal alter- in ovarian cancer.40 Cyclin D1 is overexpressed in the majority of
ations, including frequent areas of partial UPD, such as54
NMP pode-se desenvolver . UPD17p MCLs, which have abundant aUPD.34 UPD has also been associ-
coinciding with homozygous TP53 inactivation. The breakpoints ated with microsatellite instability in AML with normal karyo-
flanking the genomic alterations, including regions of UPD, were type.41 The JAK2 V617F mutation is frequently observed in classic
significantly associated with genomic regions enriched in copy MPN, and disease progression is associated with biallelic acquisi-
number variants and segmental duplications, suggesting that recom- tion of the mutation through mitotic recombination and aUPD.
bination at these regions may play a role in the genetic instability. However, in manipulated cell lines and CD34! cells from patients
 29

1.2.2.11.2 aUPD do segmento 1p

Nos casos de NMPs com mutações no exon 10 do gene MPL, a carga alélica do mutante
varia consideravelmente, de 1% até 100%. Cargas alélicas altas estão associadas ao achado de
CN-LOH de 1p e estão associadas ao desenvolvimento de mielofibrose 55.
1.2.2.11.3 Outras aUPDs de interesse nas neoplasias mieloides
Várias outras áreas de aUPD foram descritas nas neoplasias mielóides em geral52,56–58 e
a investigação destas regiões levou à identificação de vários genes mutados em homozigose,
com papel demonstrado na fisiopatogenia e impacto prognóstico nas neoplasias.
Um exemplo é a aUPD de 11q, achado mais comum em síndromes de overlap
NMP/SMD59. O gene afetado na maioria destes casos foi CBL, um regulador negativo das vias
de sinalização dos receptores de FC.
Ainda, aUPD4q levou à identificação de mutações do gene TET2 e a UPD7q à
identificação de mutações de EZH2, além de evidenciar a importância de genes envolvidos na
epigenética - particularmente aqueles codificando membros de PRC2 – na gênese da doença.
Estas descrições exemplificam como a determinação de regiões com alterações
numéricas e CN-LOH podem auxiliar, através da definição de Regiões Minimamente Afetadas
(minimally affected regions, MAR), na busca por genes alvo com papel na patogênese das
NMPs.

1.3 MIELOFIBROSE

A Mielofibrose é a patologia de pior prognóstico entre as NMPs e já foi previamente

denominada de Mielofibrose Crônica Idiopática e de Metaplasia Mielóide Agnogênica. Pode
apresentar-se como caso de novo, quando é chamada de Mielofibrose Primária (MFP) ou como
evolução de um caso prévio de PV ou TE, sendo denominada Mielofibrose pós PV/TE.

1.3.1 Epidemiologia

MFP é a menos frequentes das NMPs, com incidência inferior a 1,5 casos por 100.000
pessoas por ano. Acomete preferencialmente indivíduos de meia idade e idosos, com discreta
preponderância entre homens (em torno de 60% dos casos). Em coortes de países
desenvolvidos, a idade mediana foi de 60 a 67 anos, com apenas cerca de 5% de indivíduos
acometidos com menos de 40 anos60–62. Há poucos dados publicados sobre a epidemiologia no
Brasil63,64.
 30

1.3.2 Manifestações clínicas

As características e manifestações mais frequentes relacionadas à MF estão listadas na

Tabela 2. Até 30% dos pacientes podem ser assintomáticos e ter o diagnóstico estabelecido
durante investigação de hepato-esplenomegalia e/ou alterações no exame hematológico. Fadiga
é a queixa mais comum63. Também são frequentes queixas associadas à esplenomegalia
(desconforto em hipocôndrio esquerdo) e sintomas ou sinais de estado hipermetabólico
(também chamados constitucionais), como emagrecimento, febre baixa, dores ósseas e
sudorese noturna.
As visceromegalias são resultantes de hematopoiese extra-medular (também chamada
metaplasia mieloide). Esplenomegalia maciça é uma marca da MF, frequentemente alcançando
a fossa ilíaca. Também pode-se desenvolver síndrome de hipertensão portal secundária a
hiperfluxo na circulação esplâncnica ou por obstrução intra-hepática secundária à metaplasia
mieloide no fígado. Hematopoiese extra-medular também pode atingir outros órgãos, embora
esta seja uma complicação menos frequente.
A incidência de eventos trombóticos arteriais e venosos é de cerca de 2 por paciente-
ano, similar à observada na TE e inferior à PV. Esta predisposição decorre das citoses e de
anormalidades nas células endoteliais causadas por citocinas inflamatórias65.

Tabela 2 – Manifestações Clínico-laboratoriais de pacientes com MFP

Característica Resultado/Frequência
Idade (mediana) 14-92 (65)
Homens 62%
Fadiga 50-70%
Sintomas Constitucionais 34%
Esplenomegalia > 10cm do Rebordo Costal 31%
Necessidade Transfusional 38%
Anemia (Hemoglobina < 10g/dl) 54%
Leucocitose (>25.000/mm3) 16%
Leucopenia (<4.000/mm3) 16%
Plaquetopenia (<100.000/mm3) 26%
Blastos circulantes >1% 56%
Fonte: Adaptado de Tefferi (2012)62

Evolução para Leucemia Aguda ocorre em até 1/3 dos pacientes e é a causa mais
frequente de mortalidade, seguida de progressão de doença sem transformação leucêmica
(caquexia, citopenias) e de complicações trombóticas ou hemorrágicas66.
 31

1.3.3 Alterações laboratoriais

Anemia ocorre em cerca de metade dos pacientes e tem etiologia multifatorial, incluindo
redução da hematopoiese medular, hematopoiese ineficaz nos sítios de metaplasia mieloide,
sequestro esplênico, sangramentos, hemólise auto-imune ou secundária ao processo
inflamatório crônico. Um achado característico no sangue periférico é a presença de anisocitose
e dacriócitos. É frequente a dependência de transfusões de hemácias para controle dos sintomas
relacionados à anemia.
O padrão das contagens de plaquetas e leucócitos é bastante variável, desde plaquetose
e leucocitose, tipicamente associada a quadro leuco-eritroblástico, a plaquetopenia e
leucopenia. Citoses são mais frequentes ao diagnóstico, principalmente nos casos de
Mielofibrose Pré-Fibrótica, e as citopenias tendem a se instalar progressivamente com o avanço
da doença e aumento da fibrose medular.
Um achado típico da MF é o aumento do número de precursores hematopoiéticos
circulantes, que podem ser identificados pela expressão da molécula de superfície CD34. A
quantificação de precursores circulantes pode auxiliar no diagnóstico diferencial com outras
NMPs67.
A histologia da medula óssea mostra, na chamada fase pré-fibrótica, hiperplasia
granulocítica e megacariocítica e os precursores plaquetários tem atipia e heterogeneidade de
forma, variando de pequenas e com núcleos hipolobados até grandes e hiperlobados. A presença
destas atipias megacariocíticas e a hipercelularidade da série granulocítica ajuda na distinção
entre TE e MFP pré-fibrótica. Esta diferenciação é importante, pois esta última tem prognóstico
de sobrevida inferior68.
A fibrose medular está presente em quase todos os casos, mas com intensidade variável.
O critério da OMS1 classifica sua intensidade de 0 a 3 e permite a distinção entre MFP celular
(ou pré-MFP) e MFP estabelecida (overt) ou em estágio fibrótico.

1.3.4 Frequência das mutações driver

Ao menos 90% dos pacientes com MF apresentam mutações nos genes JAK2, CAL-R
ou MPL. Uma pequena fração dos chamados pacientes triplo negativos (TN) apresentam
mutações não canônicas no gene MPL, identificáveis em sequenciamento de alta cobertura29.
O tipo de mutação pode influenciar a apresentação da MF. Mutação de CAL-R está
associada a idade mais jovem, maiores contagens plaquetárias e melhores escores
prognósticos69.
 32

Parte dos casos TN que não apresentam mutações não canônicas em genes driver tem
apresentação similar a SMD com mielofibrose, incluindo displasia multi-linhagem, citopenias
severas e sobrevida curta70.

1.3.5 Mielofibrose pós-TE e pós PV

Aumento da fibrose reticulínica na medula óssea pode ocorrer em casos de PV e TE,

podendo evoluir para uma síndrome clinicamente indistinguível da MFP. O risco da chamada
MF pós-TE ou PV é da ordem de 5%-15% em 15 anos71 e há critérios diagnósticos propostos
para esta síndrome72. Provavelmente, ao menos alguns pacientes que recebem o diagnóstico de
MFP encontram-se em uma fase acelerada de PV ou TE não previamente reconhecidas.
Nas NMPs com mutação JAK2 V617F, o risco de progressão para MF está associado à
carga alélica da mutação. Casos com carga alélica estável e superior a 50%, ou com aumento
progressivo, mostram risco significativamente superior àqueles estáveis com carga alélica
inferior a 50%73. Nos casos de MFP com mutação JAK2 V617F, a carga alélica mediana é
próxima a 50%, semelhante aos casos de PV e superior aos casos de TE (que tem carga de
aproximadamente 25%). Nos casos de MF pós PV/TE, é superior a 70%34.
Homozigose para MPL mutado também está associada a desenvolvimento de fibrose
medular55.

1.3.6 Desenvolvimento da fibrose reticulínica e esgotamento das CTH normais

As células estromais e os fibroblastos responsáveis pela fibrose aumentada, angio-

gênese e neo-formação óssea, características histológicas da MF, não derivam do clone
neoplásico, mas representam uma reação policlonal a citocinas produzidas por megacariócitos
e monócitos do clone mieloproliferativo, incluindo Transforming Growth Factor Beta (TGF-
Beta), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) e Vascular Endothelial Growth Factor
(VEGF)74. O modelo aceito de progressão da doença é de que o clone tumoral leva a produção
desregulada de citocinas inflamatórias e alterações do nicho medular, e este reforça a vantagem
competitiva das CTL75, levando ao esgotamento da hematopoiese normal e à mobilização das
células tumorais para o sangue periférico e para sítios de hematopoiese extramedular, conforme
ilustrado na figura 10. De fato, foi demonstrado que a proporção de CTL em relação às CTH
normais é bastante superior nos casos de MFP e MF pós PV quando comparadas à PV76. A
mobilização dos progenitores hematológicos está associada à redução da expressão de CXCR4,
que é o receptor para Stromal Derived Factor-1 (SDF-1), responsável pelo homing destas
células na medula óssea.
 33

Um estudo de nosso grupo de pesquisa avaliou a expressão de CD47 – uma proteína

marcadora de self e inibidora de fagocitose por macrófagos – e sua modulação por TGF-Beta e
SDF-1 nas CTL da MF e normais. Nossos achados foram de redução de expressão de CD47 nas
células CD34 positivas de pacientes com MF em relação às células de controles,
independentemente da mutação driver e da exposição às citocinas, sugerindo que a inibição de
fagocitose das células neoplásicas pelo CD47 não tem papel na vantagem das CTL e
progenitores clonais sobre sua contraparte não clonal77 (Apêndice 1).

Figura 10. Passos chaves do desenvolvimento da MF.

As mutações fundadoras conferem vantagem proliferativa e viés para a linhagem mieloide. O clone neoplásico
altera o nicho medular, que por sua vez reforça a vantagem das CTL sobre as CTH normais.
Fonte: Mead (2017)78

1.3.7 Alterações citogenéticas na MF

Até metade dos pacientes com MF apresentam alterações citogenéticas identificáveis

por cariótipo convencional. Embora não haja alteração cariotípica específica desta neoplasia,
mais de 90% dos pacientes com alterações citogenéticas apresentam 20q-, 13q- +8, +9, 12p- ou
anormalidades dos cromossomos 1 e 7. As três primeiras são as mais frequentes e ocorrem,
individualmente, em 15 a 25% dos casos com alterações79. A deleção do 20q às vezes precede
a mutação driver.2,80.
 34

A análise por bandeamento permite a diferenciação de 400 a 500 bandas por

componente haplóide, conferindo sensibilidade de detecção de alterações cromossômicas
superiores a 5 Mb. Tem, ainda, a limitação de depender da formação de metáfases, o que nem
sempre é possível.
O método de FISH pode identificar alterações de até poucas Kb e não depende de
metáfases, mas não permite identificar alterações desconhecidas ou anormalidades
cromossômicas globais. A Hibridização Genômica Comparativa por arranjo de
oligonicleotídeos (Oligo-Array-based comparative genomic hybridization, oligo-aCGH),
permite análise de alto rendimento e com melhor sensibilidade (até 100kb) na identificação de
variação de número de cópias (copy number variations, CNV)81. Testes com arranjos que
incluem marcadores não polimórficos e sondas para identificação de Polimorfismos de
Nucleotídeos Únicos (Single nucleotide polymorphism, SNP) são chamados de Chromosomal
Microarrays Analysis (CMA) e, além das alterações de número de cópias, permitem também a
identificação de LOH, com cobertura superior a 90% do genoma82. Suas principais limitações
em relação ao bandameamento cromossômico são o custo elevado e a incapacidade de detectar
alterações cromossômicas estruturais balanceadas.
CMAs passaram a ser progressivamente utilizados na caracterização das alterações
cromossômicas das Neoplasias Mieloproliferativas e Síndromes de overlap MNP/SMD, onde
a ocorrência de translocações balanceadas é infrequente. Este método mostrou-se mais sensível
que o bandeamento cromossômico ao detectar alterações numéricas crípticas na maioria dos
casos (principalmente microdeleções dos cromossomos 1, 5, 9, 12, 20), amplificação de 20p13,
UPDs envolvendo o segmento 9p (que engloba o locus do gene JAK2), segmento 11q
(associado a mutações de CBL) e segmentos dos cromossomos 1,11 e 2258,59,83–85.

1.3.8 Prognóstico da MF

A ST de pacientes com Mielofibrose é bastante variável. Estudo populacional de 1999

mostrou ST de 52% em 3 anos de seguimento61. Sobrevidas mais longas têm sido reportadas
por vários estudos não populacionais, com ST mediana superior a 60 meses. A ST, contudo, é
impactada por características clínico-laboratoriais presentes ao diagnóstico86 ou desenvolvidas
ao longo do seguimento87.
Um dos Sistemas de Escore Prognóstico mais utilizados é o International Prognostic
Scoring System (IPSS), que deve ser calculado no diagnóstico e considera as variáveis descritas
na Tabela 3. Este escore separa os pacientes em 4 grupos de risco (Baixo, Intermediário-1,
Intermediário-2 e Alto), com STs medianas variando de mais de 15 anos, no baixo risco, até
 35

1,5 anos, no alto risco86. A figura 11 mostra a Curva de Sobrevida Total dos diferentes grupos
de risco estratificados segundo o IPSS.
Este sistema pode ser adaptado – atribuindo-se maior valor ao achado de anemia (2
pontos) – a fim de ser utilizado em qualquer momento do seguimento, sendo então denominado
Dynamic IPSS (DIPSS)87.

Tabela 3. Sistema Prognóstico IPSS

Fator de Risco
Idade > 65 anos
Hemoglobina < 10 g/dL
Leucócitos > 25x109/mm3
Blastos circulantes > 1%
Sintomas Constitucionais
Fonte: Passamonti (2010)87
Ponto por fator Estratificação de Risco
1 Baixo: 0 pontos
1 Intermediário 1: 1 ponto
1 Intermediário 2: 2 pontos
1 Alto: ≥ 3 pontos
1

Fatores prognósticos independentes do IPSS, incluindo alterações cariotípicas

desfavoráveis, foram identificados e passaram a ser incluídas nos escores prognósticos. O
sistema DIPSS-Plus é um exemplo disso. Este sistema atribui: 0 pontos para DIPSS baixo, 1
ponto para Intermediário-1 (Int-1), 2 pontos para intermediário-2 (int-2), 3 pontos para alto
Risco, além de 1 ponto para citogenética desfavorável (cariótipo complexo ou anormalidades
incluindo +8, -7/7q-, i(17q), -5/5q-, 12p-, inv(3) ou rearranjos do 11q23), 1 ponto para plaquetas
< 100.000/mm3 e 1 ponto para dependência transfusional. Os pacientes são, então, classificados
como de risco baixo (0 pontos), Int-1 (1 ponto), Int-2 (2-3 pontos) e Alto (4-6 pontos). No
estudo que validou este escore a ST mediana variou de 15,4 anos no baixo risco a 1,3 anos no
alto risco88. Este esquema prognóstico separa as alterações citogenéticas em favoráveis e
desfavoráveis. Análise mais recente sugere separar as alterações cariotípicas em 3 grupos, com
ênfase em um grupo de muito alto risco, constituído pelas anormalidades −7, i(17q), inv(3)/
3q21, 12p−/12p11.2, 11q−/11q23, ou trissomias não incluindo + 8/ + 989.
A intensidade das alterações na medula óssea dos pacientes com MF representam um
contínuo fenotípico, mas a separação de pacientes segundo o estágio da doença (pré-fibrótica
vs fibrótica), de acordo com as definições da OMS em 201690, também tem impacto
prognóstico. O grupo com fibrose estabelecida tem maior frequência de mutações subclonais
detrimentais e maior risco segundo o DIPSS, com piores desfechos de longo prazo68.

1.3.8.1 Influência das mutações driver no prognóstico

O tipo de mutação driver está associado a diferentes riscos de transformação leucêmica
e de mortalidade. Mutações de CALR conferem melhor prognóstico de forma independente do
 36

DIPSS-Plus91. Alguns estudos sugerem que o prognostico favorável das mutações de CALR é
restrito às mutações do tipo 192. Em contraste, os pacientes sem uma das 3 mutações canônicas,
chamados triplo negativos (TN) tem maior risco de progressão e mortalidade. Prognóstico de
ST inferior também foi associada aos casos de carga alélica de JAK2 V617F baixa (<25%)93.
From www.bloodjournal.org by guest on April 3, 2018. For personal use only.
A figura 12 mostra a ST de uma coorte de pacientes com MF de acordo com o tipo de mutação
BLOOD, 14 AUGUST 2014 x VOLUME 124, NUMBER 7 From www.bloodjournal.org
MUTATIONS byMYELOFIBROSIS
AND PROGNOSIS OF PRIMARY guest on November
1065 15, 2018. For personal use o
driver.
2898 CERVANTES et al BLOOD, 26 MARCH

Figura 11. Estimativa de ST por Kaplan-Meyer de Pacientes com MFP de acordo com escore IPSS.

Figure 2. Cumulative incidence of thrombosis in PMF patients stratified ac-
cording to their driver mutation. Vertical tick marks indicate right-censored patients.
JAK2-mutant patients had a higher incidence of thrombosis than those with CALR
mutation (P 5 .021). This difference remained statistically significant after adjusting for
age (SHR, 2.19; 95% CI, 1.15-4.18; P 5 .017), the estimated risk of thrombosis being
about 2-fold in JAK2-mutant compared with CALR-mutant patients.
Figure 3. Cumulative incidence of leukemic transformation in PMF patients
stratified according to their driver mutation. Vertical tick marks indicate right-censored
patients. Triple-negative patients had higher incidence of leukemic transformation compared
with both CALR-mutant and JAK2-mutant patients (maximum P value equal to .043).

with either JAK2-mutant (P 5 .019) or triple-negative patients

These latter patients showed a higher incidence of leukemic trans- (P , .001).
formation compared with both CALR -mutant (P 5 .016) and JAK2- When considering the type of CALR mutation, patients carrying
mutated patients (P 5 .043). After adjusting for age, the risk of a type 1 CALR mutation had a better OS compared with patients
leukemic transformation remained higher in triple-negative patients carrying JAK2 (V617F) (P , .001). No difference in OS was
compared with JAK2-mutant patients (P 5 .04), whereas the observed between patients with type 1 and those with type 2 CALR
significance of the difference between triple-negative and CALR - mutation (P 5 .235), and between patients with type 2 CALR
mutant patients was borderline (P 5 .052). mutation and those with JAK2 (V617F) (P 5 .311). These results
O IPSS define 4 grupos Figure com ST2. Actuarial survival
mediana were curves
variando
prognosticOS
deof18
confirmed theadjusting
after 4 risk groups
meses aformaisof patients
time-dependent according
de 10 DIPSS,
anos to
with a better
of patients with type 1 CALR mutation compared with those with
OS according to JAK2, CALR , and MPL the new PMF
mutation status system.
Fonte: Cervantes (2009)94 JAK2 (V617F) (HR 2.01, P 5 .04), and no difference between patients
The median follow-up of the study population was 3.5 years (range, with type 1 and those with type 2 CALR mutation, as well as between
0.1-30.8 years). Death occurred in 176 patients (28.5%), including patients with type 2 CALR mutation and those with JAK2 (V617F). Figure 4. Relative survival of the 4 risk
Several variations of the model were tested. Thus, when
Escores prognósticos combinando o tipo de mutação driver aos parâmetros
115 of 399 patients with JAK2 (V617F) (29%), 27 of 140 with a
CALR exon 9 indel (19%), 10 of 25 (40%) 70withyears
an MPLwas usedRelative
(W515) as the clínico-
general population. Expected survival (!)
cutoff for age, a decrease in the
contribution of JAK2, CALR , and MPL mutation status survival (E) with 95% CI.
discriminating
mutation, and 24 of 53 triple-negative patients
95 (45%). power of asthe modelbywas IPSS observed. This was even
laboratoriais ou apenas à idade (considerando mutações de alto risco os casos TN e com JAK2
Median OS was 17.7 years in CALR -mutant, 9.2 years in JAK2-
to OS predicted or DIPSS

mutant, 9.1 years in MPL-mutant, and 3.2more pronounced The

years in triple-negative whenimpacttheof thevariables
driver mutationsageon OS
andwas constitutional
independent of IPSS
patients, as shown in96
Figure 4. In univariatesymptoms
<25%) tem sido propostos. analysis, CALRwere
-mutantremoved
at diagnosisfrom
and ofthe model. DIPSS
time-dependent When(maximum
the prognostic
P value equal Figure 4 shows the relative survival
patients had a better OS than JAK2-mutant (hazard ratio [HR] 2.3, to .033).
value of the monocytosis was tested in the subgroup of 675 patients observed, during the first 5 years, the
P , .001), MPL-mutant (HR 2.6, P 5 .009), and triple-negative To further examine the impact of driver mutations on the clinical
patients Figura 12.
(HR 6.2, P ST de
, .001). In apacientes
multivariate com
withanalysis MFP
the data, itbaseados
did not
corrected course no
increaseacordo
of the status
the prognostic
disease, we mutacional
subdivided weight
PMF of into
patients the2model.
subgroups
the low-risk group did not differ
for age, CALR -mutant patients maintainedPatients
a better OSwithout
comparedsplenomegaly
according to theiratIPSS diagnosis survived subgroup
risk: the “lower-risk” longer included
than general population, being shorter on
the remainder, but the difference did not reach statistical signifi- patients in the intermediate risk-1 gr
cance, whereas the variable splenomegaly did not improve the was noted only after 3 years, wher
PMF prognostic score. On the other hand, the possible effect of group, such an effect was evident sin
splenectomy in the patients’ evolution was not evaluated, as the this effect being even more pronounc
study was designed to analyze the prognostic significance of Other variables analyzed
presenting and not evolutive data.
The results of the validation of the PMF prognostic score are In patients with available karyotype
shown in Figures S2 and S3. netic abnormalities was associated
(P " .001) and showed a signific
Analysis of the relative mortality
survival even after adjustment for th
Figure 3 depicts the relative survival of the series compared with Of note, the presence of an abnorma
Figure 4. Kaplan-Meier analysis of survival of PMF
patients stratified according to their driver mutation. that of the general population. As can be seen, once the demo- prognosis, but only in the 2 intermed
Vertical tick marks indicate right-censored patients. In
univariate analysis, CALR-mutant patients 95 graphic effects of age, sex, country of origin, and year of diagnosis high- and low-risk groups.
Fonte: Rumi (2014) had a better
OS than JAK2-mutant (HR 2.3, P , .001), MPL-mutant
were excluded, a marked effect of the disease on the patients’ In patients assessed for JAK2 st
(HR 2.6, P 5 .009), and triple-negative patients (HR 6.2,
P , .001). Three JAK2-mutant patients had short survival was observed. Indeed, mortality at 5 and 10 years from was found between presence of the
follow-up and were not included in the analysis.
diagnosis was 40% and 60% greater, respectively, than the 65 years (P ! .002). However, n
expected mortality in a general population with similar demo- between JAK2 status and the progno
graphic characteristics. Beside, the 5 prognostic factors identified In patients with available blood C
at the stepwise Cox regression model also proved to be the ones this parameter correlated with blood
significantly influencing on relative survival (data not shown). 1% (P ! .004), but not with prognos
CD34# cell counts greater than 300
ated with shorter survival, their prog
adjusted by prognostic score.
 37

1.3.8.2 Influência do tipo e número de mutações cooperativas no prognóstico

Um estudo envolvendo 897 pacientes europeus e americanos identificou que mutações
em ASXL1, EZH2, SRSF2 e IDH1/2 eram mais frequentes nos grupos de IPSS de alto risco e
correlacionavam-se à redução de ST e aumento de risco de progressão para LMA, de forma
independente do risco clínico97. Pacientes com uma destas mutações pertencem a uma categoria
de Alto Risco Molecular e quanto maior o número destas mutações detrimentais, pior o
prognóstico da MFP98, como evidenciado na figura 13.
Outros modelos combinam o valor prognóstico associado das mutações driver e das
cooperativas/subclonais. Um estudo agrupou pacientes de acordo com a presença de mutações
de CALR e ASXL1 (a mais relevante das mutações subclonais). Pacientes com CALRmut/ASXL1wt
tiveram ST mediana de 10,4 anos; Aqueles com CALRwt/ASXL1wt ou CALRmut/ASXL1mut tiveram
ST mediana de 5,8 anos; O grupo com CALRwt/ASXL1mut teve ST curta, de 2,3 anos.
Há, ainda, proposição de sistemas para o estabelecimento de prognóstico que visam
integrar as informações clínicas (parâmetros hematológicos, presença de sintomas, intensidade
da fibrose), cariotípicas e/ou moleculares (tipo e número de mutações), como é o caso do
Molecular IPSS (MIPSS70)99 e do Genetics-based PSS (GPSS), a fim de identificar a fração
de pacientes com DIPSS de risco baixo com mau prognóstico e vice-versa, para melhor
selecionar o tratamento para cada paciente com MF100.

Figura 13. Sobrevida Total (A) e Sobrevida Livre de Leucemia (B) estratificada pelo número de mutações
Cooperativas de Alto Risco.

Fonte: Gugliemelli (2014)98

Um importante estudo recente38 avaliou 2035 pacientes com NMPs, 309 dos quais com
MFP, correlacionando dados clínicos com achados de alterações genômicas (mutações em um
painel de 69 genes associados a canceres mieloides, CNVs e CN-LOH) e propuseram uma
 38

classificação genômica das NMPs, definindo 8 grupos com diferentes riscos de transformação
para a fase fibrótica, progressão para LMA e óbito. Criaram e validaram, ainda, um modelo
prognóstico baseado em 63 variáveis clínicas e genômicas capaz de gerar previsões
personalizadas para o risco destes eventos, tanto para pacientes com PV e TE como para os
com MFP, através de ferramenta disponível na Internet. O desempenho deste modelo, neste
estudo, foi superior aos sistemas acima descritos101.

1.3.9 Tratamento da MF

Atualmente, o AloTCTH constitui o único tratamento potencialmente curativo para a

MF e é indicado aos pacientes com escores prognósticos mais avançados, idade inferior a 70
anos e clinicamente aptos102. Contudo, a maioria dos pacientes não são candidatos para este
tratamento e o objetivo de seus cuidados será de paliação dos sintomas e prolongamento de
ST103.
Ruxolitinibe é um inibidor de JAK1/2 e única droga-alvo aprovada para tratamento da
MF. Os estudos clínicos que levaram a sua aprovação mostraram redução significativa da
esplenomegalia e dos sintomas constitucionais, além de prolongamento de ST quando
comparado a um grupo controle tratado com outras drogas ou suporte clínico104,105. Contudo,
ao contrário do observado na terapia-alvo da LMC, a redução do clone neoplásico costuma ser
pequena e os resultados positivos são devidos, principalmente, ao controle dos sintomas e
redução das complicações como caquexia e infecções. No Brasil, esta droga está aprovada para
pacientes com MF de risco DIPSS Int.2 e Alto Risco não candidatos a AloTCTH, mas não está
disponível na rede pública.
Os demais tratamentos visam controle e paliação de sinais/sintomas específicos.
Anemia pode ser tratada com suporte transfusional, uso de corticosteroides e
imunomoduladores (como a Talidomida), andrógenos e EPO. Esplenomegalia e sintomas
constitucionais são tratados com agentes citorredutores como a Hidroxiureia e com radioterapia
esplênica ou esplenectomia. Radioterapia também pode ser eficaz no controle de sítios de
hematopoiese extramedular103. Interferon-alfa tem resultados heterogêneos na MF, mas pode
ter papel no controle de casos precoces da doença106.
Embora os tratamentos farmacológicos listados acima possam controlar ou mitigar
temporariamente as manifestações da doença, o tratamento da MF persiste sendo uma
necessidade não atendida na onco-hematologia.
 39

2 JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS

1.1 JUSTIFICATIVA

Dados clínicos e, principalmente, genômicos de coortes brasileiras de pacientes com

MF são escassos. Conhecer estes aspectos dos pacientes tratados em nosso meio permite avaliar
a adequação da assistência de saúde atualmente oferecida e estimar o possível impacto da
incorporação de novas tecnologias de diagnóstico, prognóstico e terapêutica.

2.1 OBJETIVO GERAL

Analisar o perfil das alterações genéticas, incluindo as mutações driver, mutações

subclonais/cooperativas e alterações genômicas estruturais (como CNV e CN-LOH), em
pacientes portadores de MFP e MF pós PV/TE, seguidos em Centros de Onco-Hematologia
brasileiros, e correlacioná-las com a apresentação clínica e os desfechos de longo prazo.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

a) Descrever as características clínicas, prognósticas, padrões terapêuticos e desfechos

de longo prazo em uma coorte de pacientes brasileiros com MF, comparando-as com
coortes internacionais e nacionais.
b) Determinar, nesta coorte, a prevalência das mutações driver e mutações em genes
cooperativos e seu impacto na apresentação da doença.
c) Determinar a prevalência e tipo de CNVs e de CN-LOH na mesma coorte,
correlacionando-os ao perfil mutacional.
d) Identificar Regiões Minimamente Afetadas e genes potencialmente envolvidos na
fisiopatogênese da MF.
e) Testar o desempenho de modelo de classificação genômica e avaliação prognóstica
individualizada descrito por Grinfeld et al38, comparando-o com o desempenho do
IPSS.
 40

3 MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 TIPO E POPULAÇÃO DO ESTUDO

Trata-se de estudo observacional, de coorte, retrospectivo.

A população estudada é de pacientes com diagnóstico de MFP, estabelecido conforme
os Critérios Diagnósticos da OMS de 2008107 (Tabela 4) ou Mielofibrose pós TE/PV72 (Tabela
5) e atendidos na Unidade de Hematologia do Hospital de Base do Distrito Federal (HBDF) ou
no Cettro - Centro de Câncer de Brasília, no período de janeiro de 2013 a dezembro de 2018.
Após a publicação da revisão dos critérios diagnósticos da OMS de 2016 (Tabela 6), os
pacientes tiveram diagnósticos reconfirmados e foram também incluídos aqueles classificados
como portadores de MFP em fase pré-fibrótica1 (Tabela 7). A seleção dos casos se deu por meio
de busca em prontuários eletrônicos, registros pessoais de médicos assistentes e registros de
tratamentos (HBDF e Cettro), registros de realização de testes moleculares para BCR-ABL e
JAK2 V617F do laboratório de Biologia Molecular e de hemotransfusões (HBDF). Cinquenta
e seis casos com diagnóstico de MF foram encontrados. Três deles, porém, foram descartados
da análise: 1 por insuficiência de dados médicos no prontuário e 2 por não preencherem os
critérios diagnósticos de MF e MF pós TE segundo a OMS e IWGMRT. A coorte do estudo
foi, portanto, de 53 pacientes.
Os dados clínicos e laboratoriais foram obtidos por revisão de prontuários médicos
38

eletrônicos, registros eletrônicos de laboratórios e durante consulta médica.

Tabela 4 - Critérios diagnósticos para Mielofibrose Primária, OMS, 2008
Tabela 4. Critérios Diagnósticos de MFP (OMS 2008)

Critérios maiores 1. Proliferação e atipia megacariocítica*, geralmente

(necessários todos) acompanhada por fibrose reticulínica e/ou colagênica. Na
ausência de fibrose reticulínica importante as atipias de
megacariócitos devem ser acompanhadas por aumento da
celularidade da medula óssea ajustada pela idade,
proliferação granulocítica e frequentemente diminuição da
eritropoese (i.e., fase celular pré-fibrótica)
2. Não satisfazer os critérios da OMS para LMC BCR-ABL+,
PV, TE, síndromes mielodisplásicas ou outras neoplasias
mielóides
3. Presença de mutação JAK2 V617F ou outro marcador
clonal, ou ausência de fibrose reticulínica reacional ‡

Critérios menores 1. Leucoeritroblastose

(no mínimo 2, em 2 2. Anemia não atribuída a uma comorbidade
determinações consecutivas) 3. Esplenomegalia palpável
4. DHL elevado
* Pequenos ou grandes megacariócitos com relação núcleo/citoplasma anormal, núcleo
hipercromático, bulboso ou irregular e aglomerados densos.
‡ Fibrose reticulínica secundária a infecção, doença auto-imunes ou outras condições inflamatórias
crónicas, tricoleucemia ou outras neoplasias linfóides, malignidade metastática ou mielopatias
tóxicas (crônicas).
Adaptado de: Swerdlow S.H., Campo E., Harris N.L., Jaffe E.S., Pileri S.A., Stein H., Thiele J. VJW
(Eds. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. 4th
Fonte: Thiele (2009)107 Edition. Lyon: International Agency for Research on Cancer, 2008; 2008.

Tabela 5 - Critérios diagnósticos para Mielofibrose Primária Pré-Fibrótica, OMS, 2016

Critérios maiores 1. Proliferação e atipia megacariocítica, sem fibrose

(necessários todos) reticulínica > grau 1, acompanhada de aumento da
celularidade da medula óssea ajustada pela idade,
 41

Tabela 5. Critérios diagnósticos de MF pós PV e pós TE da IWGMRT

MF pós PV MF pós TE
Critérios 1. Diagnóstico prévio documentado de 1. Diagnóstico prévio documentado de
Maiores policitemia vera, definido pelos trombocitemia essencial, definido
(ambos critérios da OMS pelos critérios da OMS 

necessários) 2. Fibrose da medula óssea grau 2-3 (na 2. Fibrose da medula óssea grau 2-3 (na
escala 0-3) ou grau 3- 4 (na escala 0- escala 0-3) ou grau 3-4 (na escala 0-
4). 4)
Critérios 1. Anemia ou perda sustentada da 1. Anemia e diminuição de 2g/dL do
Menores necessidade de flebotomia ou nível basal de hemoglobina
(ao menos 2, tratamento citorredutivo para 2. Esplenomegalia crescente, definida
em 2 policitemia 
 como um aumento de 5 cm da
determinações 2. Leucoeritroblastose em sangue esplenomegalia palpável (distância da
consecutivas) periférico 
 ponta do baço ao reborso costal
esquerdo) ou o surgimento de
3. Esplenomegalia crescente, definida
esplenomegalia palpável 

como um aumento de 5cm da
esplenomegalia palpável (distância 3. DHL elevado 

da ponta do baço ao reborso costal 4. Desenvolvimento de sintomas
esquerdo) ou o surgimento de constitucionais: perda ponderal 
>
esplenomegalia palpável 
 10% em 6 meses, sudorese noturna
4. DHL elevado 
 e/ou febre inexplicada 

5. Desenvolvimento de sintomas
constitucionais: perda ponderal 
>
10% em 6 meses, sudorese noturna
e/ou febre inexplicada
Fonte: Barosi (2008)72

Todos os sujeitos incluídos e os controles eram maiores de 18 anos e concordaram com

a participação no estudo, assinando Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Este projeto
de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação de Ensino e Pesquisa
em Ciências da Saúde (FEPECS), sob número de registro CAAE 19493613.5.0000.5553
39 e
parecer número 525.330.
Tabela6.6Critérios
Tabela - Critérios diagnósticos
diagnósticos para Mielofibrose
de MFP Primária
em Fase Fibrótica Fibrótica,
da OMS 2016 OMS, 2016

Critérios maiores 1. Proliferação e atipia megacariocítica, acompanhada de

(necessários todos) fibrose reticulínica e / ou colagênica graus 2 ou 3
2. Não satisfazer os critérios da OMS para LMC BCR-ABL+,
PV, TE, síndromes mielodisplásicas ou outras neoplasias
mielóides
3. Presença de mutação JAK2, CALR ou MPL; na ausência
destas mutações, presença de outro marcador clonal, † ou
ausência de fibrose reticulínica discreta reacional ‡

Critérios menores 1. Anemia não atribuída a uma comorbidade

(mínimo 1, confirmado em 2 2. Leucocitose > 11 x 109 / L
determinações consecutivas) 3. Esplenomegalia palpável
4. DHL elevado
5. Leucoeritroblastose
† Na ausência de qualquer das mutações driver, a pesquisa das mutações colaborativas mais
freqüentes (por exemplo, ASXL1, EZH2, TET2, IDH1 / IDH2, SRSF2, SF3B1) ajudam na
determinação da natureza clonal da doença.
‡ Fibrose secundária a infecção, doença auto-imune ou outras condições inflamatórias crônicas,
leucemia de células pilosas ou outras neoplasias linfóides, malignidade metastática ou mielopatias
tóxicas (crónicas).
1
Fonte: Arber
Adaptado de:(2016)
Arber DA, Orazi A, Hasserjian R, Borowitz MJ, Beau MM Le, Bloomfield CD, et al. The
2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and
acute leukemia. Blood. 2016;127(20):2391–406.

Tabela 7 - Critérios diagnósticos para Mielofibrose pós Policitemia Vera, IWG-MRT, 2008
 hipercromático, bulboso ou irregular e aglomerados densos.
‡ Fibrose reticulínica secundária a infecção, doença auto-imunes ou outras condições inflamatórias
crónicas, tricoleucemia ou outras neoplasias linfóides, malignidade metastática ou mielopatias
tóxicas (crônicas).
Adaptado de: Swerdlow S.H., Campo E., Harris N.L., Jaffe E.S., Pileri S.A., Stein H., Thiele J. VJW 42
(Eds. . WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. 4th
Edition. Lyon: International Agency for Research on Cancer, 2008; 2008.

Tabela 5 - Critérios diagnósticos para Mielofibrose Primária Pré-Fibrótica, OMS, 2016

Tabela 7. Critérios diagnósticos de MFP em Fase Pré-Fibrótica da OMS 2016

Critérios maiores 1. Proliferação e atipia megacariocítica, sem fibrose

(necessários todos) reticulínica > grau 1, acompanhada de aumento da
celularidade da medula óssea ajustada pela idade,
proliferação granulocítica e frequentemente diminuição
da eritropoese
2. Não satisfazer os critérios da OMS para LMC BCR-ABL+,
PV, TE, síndromes mielodisplásicas ou outras neoplasias
mielóides
3. Presença de mutação JAK2, CALR ou MPL; na ausência
destas mutações, presença de outro marcador clonal, †
ou ausência de fibrose reticulínica discreta reacional ‡

Critérios menores 1. Anemia não atribuída a uma comorbidade

(no mínimo 1, confirmado em 2 2. Leucocitose > 11 x 10 9 / L
determinações consecutivas) 3. Esplenomegalia palpável
4. DHL elevado
† Na ausência de qualquer das mutações driver, a pesquisa das mutações colaborativas mais
freqüentes (por exemplo, ASXL1, EZH2, TET2, IDH1 / IDH2, SRSF2, SF3B1) ajudam na
determinação da natureza clonal da doença.
‡ Fibrose reticulínica discreta (grau 1) secundária a infecção, doença auto-imune ou outras
condições inflamatórias crónicas, tricoleucemia ou outras neoplasias linfóides, malignidade
metastática ou mielopatias tóxicas (crônicas).

Fonte: Arber de:1 Arber DA, Orazi A, Hasserjian R, Borowitz MJ, Beau MM Le, Bloomfield CD, et al. The
(2016)
Adaptado
2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and
acute leukemia. Blood. 2016;127(20):2391–406.

3.2 PARÂMETROS CLÍNICOS E LABORATORIAIS

As informações coletadas referiam-se ao diagnóstico (MFP em Fase Fibrótica, em Fase

Pré-Fibrótica ou MF pós PV/TE), gênero, idade ao diagnóstico, tempo de seguimento,
estratificação de risco de acordo com IPSS, DIPSS e DIPSS plus, tratamentos realizados e
desfechos clínicos (fenômenos trombóticos/hemorrágicos, evolução para leucemia aguda e
óbito).
Os parâmetros laboratoriais analisados foram os valores de Hemograma (incluindo
percentual de blastos circulantes) e Citogenética (cariótipo de medula óssea por bandas G) ao
diagnóstico e durante seguimento (até a data de óbito ou última avaliação clínica). As coletas
das amostras utilizadas para a pesquisa das mutações por NGS e de alterações cromossômicas
por CMA foram realizadas com mediana de + 72 dias (-139 dias a + 4781 dias) em relação à
data do diagnóstico (considerada aquela da realização da biópsia de medula óssea compatível
com MF).

3.3 COLETA E PREPARAÇÃO DE AMOSTRAS

As amostras de material biológico consistiram de alíquotas de 4 a 8 ml de sangue

periférico, coletadas por meio de flebotomia de membro superior realizada por profissional de
saúde habilitado, obedecendo técnica asséptica. Para os estudos de MLPA e CMA foram
incluídas amostras de material biológico de cinco indivíduos saudáveis para controle interno.
 43

O DNA genômico foi extraído da amostra de sangue total por meio do método Puregene
Salting out (Gentra, Minneapolis, MN, USA) de acordo com as instruções do fabricante. De
forma breve, produziu-se lise celular com soluções hipotônicas contendo EDTA. Ao lisado
adicionou-se solução de precipitação de proteínas, que contem acetato de amônia, e o material
foi centrifugado. Para a precipitação de DNA, o sobrenadante foi transferido para um tubo
contendo isopropanol e invertido lentamente até formação de precipitado que contem DNA.
Após nova centrifugação, o sobrenadante foi retirado e adicionou-se etanol absoluto, seguido
de nova centrifugação. O tubo foi, então, drenado e deixado em temperatura ambiente para
secagem. Por fim, acrescentou-se ao tubo 200-250 μL de água milliQ. A pureza e quantidade
do DNA foram determinadas no espectrofotômetro Nanovue® (GE).

3.4 CARACTERIZAÇÃO DAS MUTAÇÕES DRIVER

Quarenta e sete pacientes realizaram pesquisa da mutação JAK2 V617F por Reação em
Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction, PCR) alelo-específica108 no laboratório da
Unidade de Hematologia do HBDF ou em laboratórios não associados.

3.4.1 Pesquisa das mutações driver por MLPA

A técnica MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) para investigação

das mutações canônicas nos genes JAK2, CALR e MPL foi realizada em 30 casos da nossa
coorte de pacientes, no Laboratório de Genética da Faculdade de Medicina da Universidade de
Brasília (UnB)
A detecção das mutações de interesse baseia-se na ligação de dois oligonucleotídeos
(oligos) com sequências alvo imediatamente adjacentes e que são então fundidos em uma única
sonda através de uma ligase. Para que a ligação ocorra é necessário que os oligos sejam
perfeitamente complementares ao DNA alvo. Isto permite a detecção de mutações de ponto e
indels previamente definidas na região de ligação. As sondas são amplificadas por PCR
utilizando um único par de primers, comum a todas as sondas. Um dos primers é marcado com
uma sequência de tamanho específico, que permite a visualização dos produtos amplificados
por eletroforese capilar109. A figura 14 mostra estas etapas.
O eletroferograma é analisado por software eletrônico e a altura relativa de cada pico de
sonda, comparada à altura do pico no DNA de referência, reflete o número de cópias relativo
da sequência alvo da amostra.
Em nossa coorte de pacientes com MF foram utilizados os kits SALSA® MLPA®
probemix P420-A1 MPN mix 1 e SALSA® MLPA® P520-A1-0115 MPN mix 2 (MRC-
 44

Holland)110,111. Os kits continham 25 sondas de MLPA, sendo oito para mutações relacionadas
a NMPs, incluindo CALR tipos 1 e 2, KIT D816V, JAK2 V617F e exon 12 (2 sondas), MPL
W515K e W515L, além de 17 sondas de referência e nove fragmentos de controle. O mix P420-
A1 detecta mutações presentes em, no mínimo, 10 a 20% dos alelos. Para cargas alélicas mais
baixas é utilizado o mix P520-A1, com sensibilidade de detecção de mutações de51ponto com
carga alélica de até 1%.
Figura 14. EtapasFigura 11 - Visão geral da reação de MLPA
do MLPA

Fonte: Homig-Holzel (2012)109

3.4.1.1 Protocolo do MLPA

As reações foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante. De forma
resumida, as amostras de DNA de pacientes e controles foram desnaturadas em termociclador
a 98oC por 5 minutos. Após, foram resfriadas até 25oC e removidas do termociclador. Misturou-
se o DNA com(1)As
o mix deMLPA
sondas sondas, seguido
são formadas por 2de desnaturação
hemissondas, cada umaa ligada
95°Ca umporprimer,
1 minuto e hibridização
que devem se
hibridar a sequências complementares adjacentes. O segmento 3’ possui uma sequência marcadora
não-hibridante (verde), que dá à sonda um comprimento específico. Para iniciar a reação, a mistura de
o
overnight a 60°C. Após
sondas 16
MLPA é a 20 horas
adicionada ao DNAde hibridização,
desnaturado as amostras16foram
durante aproximadamente resfriadas
horas para hibridação.a 54 C e a
(2) Após hibridação ao DNA alvo os dois oligonucleótidos são ligados enzimaticamente, formando uma
cada uma foi adicionado o mixumdemodelo
única sonda e criando ligação,
para a contendo a subsequente.
reação de PCR enzima Ligase-65. Os tubos
(3) O par de primers de PCRforam
é então
comum a todas as sondas MLPA (X e Y); a reação de PCR amplifica os primers e, consequentemente,
as sondas a eles ligadas. (4) Devido aos diferentes comprimentos das sequências marcadoras, os
incubados a 54°C porde 15
produtos minutos,
amplificação de para ligação,
diferentes sondas e a 98°C
MLPA podemporser 5 minutosidentificados
separados, para inativação
e da
quantificados por eletroforese capilar. Quantidades relativas dos produtos de amplificação, em
Ligase-65. Após resfriados a 20°C, seguiram para amplificação por PCR. O produto da
amplificação foi então levado para eletroforese capilar no sequenciador automático ABI-3500
(Applied Biosystems). Para interpretação dos resultados, utilizamos o software Coffalyser.net
 45

(MRC-Holland). A figura 16 representa o eletroferograma de um controle positivo do probemix

59
para NMPs, contendo todas as mutações pesquisadas.

Figura 13 – Eletroferograma de indivíduo masculino, controle positivo da reação de MLPA

Figura 15. Controle positivo da reação de MLPA para NMPs.

O mix contem sondas para mutações (picos com setas vermelhas), fragmentos Q, de controle de quantidade de
DNA (setasAlém das sondas
pretas); paraD,
fragmentos mutações, o mix
de controle dede sondas contém
desnaturação fragmentos
do DNA Q, de controle
(setas verdes); de
fragmentos específicos
quantidade
para o cromossomo X de DNA
(seta (setas
rosa) e Ypretas); fragmentos
(seta azul) e sondasD,dedereferência
controle de desnaturação
posicionadas em do DNA conservadas do
regiões
(setas
DNA (esferas verdes); fragmento X, específico para o cromossomo X (seta rosa); fragmento Y,
verdes).
específico para 112
o cromossomo Y (seta azul), e sondas de referência posicionadas em
Fonte: Nascimento (2017) . do DNA (esferas verdes) que servem para validação interna da reação
regiões conservadas
e de controle de qualidade. As setas vermelhas indicam os picos referentes às mutações. A
altura dos picos referentes aos fragmentos Q e D indicam quantidade suficiente de DNA e
desnaturação adequada.
3.5 SEQUENCIAMENTO DO PAINEL DE GENES DE INTERESSE
Figura 14 – Eletroferograma de paciente masculino com a mutação CALR tipo 1
Realizamos NGS direcionado (target NGS) para painel de 255 genes envolvidos em
leucemogênese e falência medular (Tabela 9) em 27 pacientes da coorte.

Tabela 9. Lista dos genes incluídos no NGS

ABL1 CHEK2 FANCC KDM5A NPM1 RPS15 STAT5B

ACTL6B CLSTN1 FANCD2 KDM5C NRAS RPS17 SUZ12
AKT1 CREBBP FANCE KDM6A NSD1 RPS19 TERT
ALK CRLF2 FANCF KDM6B PAX5 RPS24 TET2
AMER1 CRLF2 FANCG KIF17 PBRM1 RPS26 TINF2
APC CSF1R FANCI KIT PCDH15 RPS27A TP53
ARHGAP26 CSF2RB FANCL KMT2A PDGFRA RPS29 U2AF1
ARID1A CSF3R
Pico em 124 FANCM à mutação
nt, correspondente KMT2Bdel52 daPDGFRB
CALR, indicadoRPS7 U2AF2
pela seta vermelha.

ARID1B CSNK1A1 FBXW7 KMT2C PDS5B RRAS2 WHSC1

ARID2 CTCF FLT3 KMT2D PHF6 RUNX1 WRAP53
ARNTL CTNNA1 FOXP1 KMT2E PIAS2 SAMHD1 WT1
ASXL1 CTNNB1 GATA1 KRAS PIGA SBDS XRCC2
 46

ASXL2 CUX1 GATA2 L3MBTL1 PIGT SETBP1 ZBTB33

ATM DAXX GLI1 LAMB4 PIK3CA SETD1B ZMYM3
ATRX DCLRE1C GLI2 LMO1 PIK3R1 SETD2 ZRSR2
BARD1 DDX23 GNA11 LRP1B PIK3R2 SETDB1
BCL10 DDX4 GNA12 LUC7L2 PKHD1 SF1
BCL2 DDX41 GNA13 MAML1 PPM1D SF3A1
BCOR DDX54 GNAQ MECOM PRMT5 SF3A3
BCORL1 DHX29 GNAS MED12 PRPF40B SF3B1
BIRC5 DHX33 GNB1 MET PRPF8 SH2B3
BIRC6 DKC1 GNB2 MIR142 PTCH1 SIMC1
BRAF DNMT1 GPR98 MGA PTEN SMARCA1
BRCA1 DNMT3A H3F3A MN1 PTPN11 SMARCA2
BRCA2 DNMT3B H3F3B MPL PTPRT SMARCA4
BRCC3 EED HIPK2 MRE11A RAD21 SMARCB1
BTRC EGFR HNRNPK MYB RAD50 SMARCC1
CALR ELANE HRAS MYBL2 RAD51C SMARCC2
CBL ELF1 IDH1 MYC RB1 SMARCD3
CBLB EP300 IDH2 MYCL RHOA SMC1A
CBLC ERBB4 IKZF1 MYCN RIT1 SMC1B
CDH23 ERG IRF1 NCOA3 RNF25 SMC3
CDK4 ERN1 IRF4 NF1 RPL10 SMG1
CDKN1B ETNK1 IRF8 NF2 RPL11 SOCS1
CDKN2A ETV6 JAK1 NFE2 RPL23 SRSF2
CDKN2B EZH2 JAK2 NFE2L2 RPL26 STAG1
CDKN2C FAM175A JAK3 NHP2 RPL35A STAG2
CEBPA FAM5C JARID2 NOP10 RPL36 STAG3
CFTR FANCA KDM2B NOTCH1 RPL5 STAT3
CHEK1 FANCB KDM3B NOTCH2 RPS10 STAT5A

A biblioteca de DNA genômico para o target NGS foi realizada com o kit SureSelectXT
Custom da Agilent, seguindo as instruções do fabricante. De forma sintética, o DNA foi
fragmentado por sonicação [pico de comprimento de 170 pares de base (bp)], seguido de reparo
de terminações, inserção de overhang 3’dA e ligação de adaptador. Após purificação em gel
dos produtos da ligação e remoção dos adaptadores não ligados, as amostras foram submetidas
a amplificação por PCR. A seguir, a captura das sequências de interesse, constituídas por exons
e regiões de splicing dos genes listados, foi realizada por hibridização com baits de RNA
customizados. A biblioteca foi hibridizada a estas sequências de RNA por 24hs a 65oC e,
posteriormente, as sequências hibridizadas foram capturadas por seleção por beads magnéticos.
 47

O DNA capturado passou, então, por amplificação por PCR e avaliação de qualidade em
bioanalyzer.
O NGS foi realizado em sequenciador Illumina Hiseq ® no laboratório Quick Biology
Inc. em Pasadena, California, EUA. Os dados do sequenciamento foram recebidos em arquivos
no formato FastQ. A etapa de filtro por qualidade e tamanho foi realizada por meio do software
CLC Bio Workbench 6.0.5 (http://www.clcbio.com). Após os filtros, as sequências foram
mapeadas contra o genoma humano (versão GRCh37/hg19 Ensembl) utilizando o software
BWA versão 0.7.10 (http://sourceforge.net/projects/bio-bwa/). A marcação de duplicatas de
PCR foi realizada com o software Picard, versão 1.94 (http://picard.sourceforge.net) e o
realinhamento ao redor de inserções/deleções e recalibramento da qualidade das bases, com as
ferramentas do Genome Analysis Toolkit (GATK; versão 2.7-4; http://www.broadinstitute.org
/gatk/index.php).
Para identificação de Variantes de nucleotídeo único (Single Nucleotide Variants, SNV)
foram utilizados os softwares MuTect (http://www.broadinstitute.org/cancer/cga/mutect) e
SomaticSniper (https://omictools.com/ somaticsniper-tool) e para identificação de indels foi
utilizado o software MuTect2 (http://www.broadinstitute.org/cancer/cga/mutect2).
Após a identificação das mutações o resultado foi convertido para Variant Call
Format 4.1 (VCF) e procedemos a anotação funcional das variantes com o software
ANNOVAR (http://www.openbioinformatics.org/ annovar/), que utiliza diversos algoritmos de
alteração funcional das proteínas e bancos de dados de frequência alélica.

3.5.1.1 Estratégia para a identificação de genes mutados

A seguinte estratégia, similar à utilizada por Grinfeld et al em uma população de
pacientes com NMPs38, foi utilizada:
• Mutações sinônimas foram retiradas.
• As variantes foram anotadas conforme sua presença nos bancos de dados populacionais
The Exome Aggregation Consortium (EXAC), The Exome Sequencing Project 6500 e
Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC); caso descritas como somáticas,
em quais tecidos as alterações foram encontradas e se havia qualquer outra variante
COSMIC afetando a mesma posição genômica ou aminoácido (aa) até 3 códons de
distância.
• Variantes idênticas àquelas no banco de dados COSMIC, descrevendo mutações
somáticas (adquiridas) idênticas ou no mesmo AA foram mantidas.
 48

• SNVs coincidentes com uma variante COSMIC (em posição genômica ou posição de
aa) não reportadas no COSMIC como somáticas e com frequência alélica (Variant
Allele Frequency, VAF) >40% foram removidas.
• SNVs com prevalência superior a 1% em qualquer um dos 3 bancos de dados
populacionais foram descartadas.
• SNVs não prevalentes nos bancos de dados de SNPs, que não coincidissem (por
mutação exata, coordenada genômica ou posição de aa) a uma variante COSMIC e que
tivesse VAF>40% foram removidas para reduzir potencial contaminação por SNP
germinativo raro e privado.
• SNVs não reportados em banco de dados de SNPs, ocorrendo em até 3 aa de distância
de uma variante reportada COSMIC foram mantidas se VAF menor que 40%, pela
possibilidade de que estas mutações representassem eventos somáticos não previamente
reportados.
• Variante com VAF <1% foram removidas.
• Inserções e deleções foram removidas se detectadas apenas em reads unidirecionais, se
localizadas em trechos de homopolímeros ou presentes em painel de amostras normais.
• Mutacões de perda de função (causadas por mutações nonsense, frameshift ou em sítios
de splicing) nos genes ASXL1, BCOR, CUX1, DNMT3A, TET2, PPM1D, EZH2,
GATA2, MBD1, RB1, RUNX1, SH2B3, NFE2, NF1, TP53, CBL, MLL3, ZRSR2 foram
mantidas, desde que descartados artefatos de sequenciamento.

Análises in silico de mutações missense de interesse foram realizadas por meio dos
aplicativos Provean, Polyphen2, SIFT (Separate Intolerable from Tolerable) e FATHMM.

3.6 ANÁLISE CROMOSSÔMICA POR MICROARRANJO (CMA)

A presença de alterações cromossômicas por CMA foi investigada em 33 pacientes, nl

Laboratório de Genética da Faculdade de Medicina da UnB.
Utilizamos GeneChip® das plataformas CytoScan HD® ou CytoScan® 750K Array
(Affymetrix, EUA) e as configurações de leitura disponíveis no GeneChip® Scanner 3000 7G
System (Affymetrix, EUA). Estes GeneChip® possuem milhares de cópias de diferentes sondas
com 25 nucleotídeos de comprimento, com sequências para determinação de SNPs e
marcadores não polimórficos, baseados no genoma de referência hg19. Cada cópia de cada
sonda tem uma posição definida no chip, o que permite medições múltiplas e independentes de
 40 49

cada região genômica.

várias regiões A figura
do chip 16 mostramedições
proporcionando a organização e visualização
múltiplas das reações
e independentes de cada de
região A
hibridização. genômica, aumentando
tabela 8 compara a precisão,
as coberturas confiabilidade
das plataformas e reprodutibilidade
CytoScan® 750k e HD. dos
resultados. Sendo assim os GeneChip® contêm centenas de milhares de sondas de
3.6.1.1 Protocolo do CMA
DNA individualizadas, que no seu conjunto representam todo o genoma humano
As reações foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante. Brevemente, o
incluindo variações intragênicas correlacionadas.
DNA foi submetido à digestão em sítios específicos com a enzima Nsp I (Affymetrix, EUA),
Figura 5 - (a) Nível de organização e visualização da reação de hibridação com os oligonucleotídeos
em termociclador,
em microarranjospara a obtenção
no GeneChip® de fragmentos
da plataforma de 750K
CytoScan® DNAArray
de (Affymetrix,
tamanhosEUA).
variados.
(b)
Representação esquemática comparando a diferença no nível de resolução entre os chips
Posteriormente, os fragmentos
CytoScan™HD de DNA
Array e 750k Array foramEUA).
(Affymetrix, ligados a adaptadoresesquemática
(c) Representação específicos NspI. as
comparando
diferenças na cobertura da densidade de sondas nas diferentes regiões do genoma no chip
CytoScan™750k Array (Affymetrix, EUA).
Figura 16. Organização e visualização da reação de hibridização do CMA

(a)

Fonte: adaptado de http://affimetrix.com; Chip Cytoscan 750k

Em (b)
seguida as amostras foram submetidas a PCR com objetivo de aumentar a
concentração final do DNA genômico. Amostra de produtos desta PCR foram, então,
submetidos a eletroforese em gel de agarose com brometo de etídeo a fim de confirmar o
sucesso dos passos prévios.
Tabela 8. Comparação entre as coberturas das plataformas de CMA utilizadas
Parâmetro CytoScan® 750k CytoScan® HD
Marcadores de número de Cópias
Número total de sondas 750.436 6.876.796
Marcadores não polimórficos 550.000 1.953.246
Marcadores de SNPs 200.436 743.304
Marcadores Intragênicos 532.850 1.410.535
Marcadores Intergênicos 217.586 1.286.015
Espaçamento médio 4.125 pb 1.148 pb
Intragênico 1.737 pb 880 pb
Intergênico 6.145 pb 1.737 pb
Percentual de genes cobertos (25 sondas/100kb)
Cancer genes 100% 100%
OMIM genes 83% 100%
RefSeq genes 80% 98%
Fonte: http://www. affimetrix.com
 50

Os fragmentos de DNA produzidos nas PCRs foram capturados com o uso de esferas
magnéticas (Affymetrix, EUA), seguido de eluição e quantificação em espectrofotômetro.
A seguir, o DNA foi fragmentado em termociclador após mistura com reagente de
fragmentação, que foi confirmada em eletroforese em gel com brometo de etídeo, pela presença
de fragmentos entre 25 e 125 pb.
Os fragmentos de DNA assim obtidos foram, a seguir, marcados com biotina, em reação
contendo a enzima TdT (Terminal Deoxynucleotydil Tranferase), em termociclador.
A seguir, promoveram-se as reações de hibridização. Esta mistura contendo os
fragmentos de DNA e tampão de hibridização foi aquecida e a mistura desnaturada foi
depositada imediatamente em cada um dos GeneChip®. Os chips foram então incubados em
no forno de hibridização (modelo Hybridization Oven 645, Affymetrix, EUA) a 50oC durante
16 a 18 horas a 60 rpm.
Posteriormente, a lavagem e marcação dos GeneChip® foi realizada em estação
automatizada Fluidics Station 450 (Affymetrix, EUA), com tampões de marcação contendo
estreptavidina e anticorpo antiestreptavidina ligado ao fluoróforo ficoeritrina. A seguir, os chips
foram colocados no GeneChip® Scanner 3000 7G (Affymetrix, EUA). As imagens captadas
por excitação da ficoeritrina foram inicialmente submetidas a análise de controle de qualidade
geral (QC) por meio do software Genotyping Console versão 3.2.2 (Affymetrix, EUA).
Os dados de captura foram então digitalizados e os arquivos gerados foram visualizados
e analisados por meio do software de análise Chromosome Analysis Suite (ChAS) versão 3.0
(Affymetrix, EUA), que permite filtrar os dados por parâmetros de qualidade e anotação das
alterações cromossômicas (duplicações, deleções, CNVs e LOH) ao longo do genoma de cada
amostra, após normalização dos achados em relação aos controles. A estratégia de filtragem
aplicada para anotação de alterações respeitou as recomendações do fabricante: a) deleções
foram definidas como mais de 25 sondas sequenciais deletadas, b) duplicações como mais de
50 sondas duplicadas e c) LOH como regiões superiores a 5Mb. Alterações menores que
envolvam genes associados a câncer, baseados no OMIM®, foram também consideradas.
A fim de reduzir o risco de considerarmos como somática uma alteração germinativa,
todas as análises envolvendo áreas de CN-LOH consideraram apenas aquelas maiores que 10
megabases (Mb) ou que ocorreram em áreas de genes de interesse concomitantemente mutados.
A identificação de genes contidos em MARs foi feita por listagem no próprio software
ChAS e por busca no University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browser (www.
http://genome.ucsc.edu), com filtro para genes OMIM e alterações contidas nos bancos de
dados ClinVar e COSMIC.
 51

O escore prognóstico personalizado foi calculado por meio da entrada dos dados clínicos
e genômicos em aplicativo baseado nos dados de Grinfeld et al38 e disponível em
https://cancer.sanger.ac.uk/mpn-multistage/.

3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA

As variáveis numéricas foram sumarizadas por mediana e variação, e as variáveis

categóricas por contagem e frequência relativa (%) de cada categoria.
Comparações entre variáveis quantitativas foram realizadas pelo teste exato de Kruskal-
Wallis e para análises das associações entre variáveis qualitativas empregamos os testes exatos
de qui-quadrado (quando mais de 3 variáveis) ou Fisher (2 variáveis).
Todas as análises de ST foram estimadas pelo método de Kaplan-Meier e comparadas
através do teste de log-rank (Mantel-Cox).
Consideramos como estatisticamente significantes os valores de p<0,05. As análises
estatísticas foram realizadas com auxílio dos softwares Numbers v.5.3(Apple Inc., 2018) e
Graphpad Prism v8.0.1 (GraphPad Software, Inc., 2018).
A avaliação de performance dos sistemas prognósticos IPSS e personalizado38 foi
realizadade duas formas: Primeiramente, pelo cálculo da concordância aos 48 meses,
equivalente à área sob a curva ROC (Receiver Operating Carachteristics), pelos métodos de
Harrell e Uno, implementados pelo procedimento PHREG no software SAS/STAT® 14.2.
Adicionalmente, a acurácia das predições foi avaliada com o escore de Brier (que é a média das
diferenças ao quadrado entre desfechos observados e preditos para cada paciente) e o erro de
predição absoluto (média das diferenças absolutas entre desfechos observados e preditos). Nos
casos em que os pacientes foram censurados antes dos 48 meses, o valor de ST observada foi
imputado usando a proporção média da sobrevida neste ponto-de-tempo.
 52

4 RESULTADOS

A figura 17 apresenta a disposição dos pacientes conforme o tipo de análises realizadas.

Os 53 pacientes tiveram diagnóstico estabelecido entre mai/2005 a ago/2017. Para fins de
análises de ST consideramos apenas os pacientes com diagnóstico posterior a janeiro de 2013,
uma vez que a inclusão de pacientes com diagnóstico prévio levaria a viés de seleção de
pacientes com melhor prognóstico. Por limitação do número de testes disponíveis, 36 dos 53
pacientes tiveram estudos genômicos realizados. A seleção destes pacientes foi aleatória.
Figura 17. Disposição dos pacientes segundo análises realizadas

4.1 ACHADOS CLÍNICOS E LABORATORIAIS

A tabela 10 lista os diagnósticos (segundo a classificação OMS 2016) e os principais

dados demográficos dos 53 pacientes da coorte. A mediana de idade foi de 63,5 anos com
predomínio do sexo masculino.
Nota-se que a apresentação do hemograma é extremamente variável, com achados desde
citopenias severas até citoses (principalmente plaquetoses) extremas. Quarenta e seis porcento
dos pacientes apresentavam anemia grau 2 ou maior (<10g/dL) ao diagnóstico.
 53

Tabela 10. Diagnósticos e dados epidemiológicos dos pacientes

Característica N
Diagnóstico segundo a OMS 2016 (%)
MFP em fase fibrótica 41 (77,4%)
MFP em fase pré-fibrótica 5 (9,4%)
MF pós TE 6 (11,3%)
MF pós PV 1 (1,9)
Gênero, N(%)
Masculino 29 (54,7%)
Feminino 24 (45,3%)
Idade mediana (intervalo) 63,5 (35-92)
História Familiar de NMP (%) 2 (3,7%)
Centro de Tratamento (%)
Público 43 (81,1%)
Privado 10 (18,9%)

A tabela 11 apresenta os principais achados laboratoriais e distribuição por escore

prognóstico IPSS. Três pacientes não tinham informação de IPSS disponível ao diagnóstico.

Tabela 11. Características laboratoriais, hematológicas, citogenéticas e de risco prognóstico convencional ao

diagnóstico

Característica N
Hemoglobina, mediana (variação) (g/dL) 10,8 (5,9-14,5)
Leucócitos, mediana (variação) (x109/L) 11.700 (1.600-110.00)
Plaquetas, mediana (variação) ) (x109/L) 247.000 (10.000-1.814.000)
Cariótipo de Medula Óssea
Anormal/Realizados (%) 4/22 (18,2%)
Normal/Realizados (%) 18/22 (81,8%)
Não Realizado (%) 31/53 (58,5%)
IPSS
Baixo Risco (% dos disponíveis) 9 (18%)
Risco Intermediário I (% dos disponíveis) 14 (28%)
Risco Intermediário 2 (% dos disponíveis) 11 (22%)
Alto Risco (% dos disponíveis) 16 (32%)
Indisponível 3(5,3%)

4.1.1 Distribuição das mutações driver

Quarenta e sete pacientes (88,7%) tiveram pesquisa da mutação JAK2 V617F realizada
por PCR alelo específico, por MLPA ou NGS. Destes, 24 (51,1%) mostraram positividade para
esta mutação. Houve discordância entre os métodos em 1 caso em que o paciente foi
 54

classificado como CALR mutado pelo MLPA (pico baixo pelo kit MPN MIX-2) e que a
alteração não foi encontrada no NGS.
A figura 18 mostra a distribuição das mutações driver obtidas pelos métodos de MLPA
e/ou NGS nos 36 pacientes submetidos a um ou ambos os métodos. Cinquenta porcento dos
casos apresentou mutação para JAK2 V617F.
Figura 18. Distribuição das mutações driver

Mutações de CALR foram encontradas em 36% dos pacientes e estão caracterizadas na

tabela 12. Duas destas mutações eram diversas daquelas de tipos 1 e 2; uma das mutações
diferentes, no melhor do nosso conhecimento, ainda não foi descrita na literatura.
Tabela 12. Categorização das mutações de CALR encontradas.

Legenda: as regiões 1, 2 e 3 representam sequencias de aminoácidos com carga negativa na molécula. Dependendo de quais destas
sequencias estejam deletadas, as mutações são classificadas como tipo 1-símile (seq. 2 e 3 deletadas), outras (se apenas 3 deletada)
e tipo 2-símile (todas as 3 seq. mantidas). A sequência consensual de 36aa dos mutantes (parcial no caso da nova variante) está
colorida em laranja.
 55

As características epidemiológicas, laboratoriais e associação com escores prognósticos

por grupos de pacientes de acordo com mutações driver estão apresentadas na tabela 13.

Tabela 13. Características dos pacientes ao diagnóstico segundo a mutação driver.

Valor-
Variáveis* JAK2 V617F CALR indel MPL TN p**
N 24 13 3 2 -
Idade 70 (43-92) 54,5 61 (59-62) 50,5(47-54)) 0,01
Hemoglobina (g/dL) 11,3 (5,9-14,5) 10,4 (7,2-13,0) 11,1 (10,0-12,8) 7,2 (6,8-7,5) 0,095
14.400 (4.970- 7.300 (2.100- 12.100 (8.200- 3.310 (1600-
Leucócitos, (x109/L) 40.600) 16.300) 34.000) 5020) 0,0029
232.000 420.000 247000 131.500
(10.000- (53.000- (26.000- (43.000-
Plaquetas, (x109/L) 1.814.000) 1.017.000) 580.000) 220.000) 0,68
IPSS N=22 N=10 N=3 N=2
Baixo Risco (% dos
disponíveis) 3 (13,6%) 3 (30%) 1 (33,3%) 0
Risco Itermediário I (%
dos disponíveis) 5 (22,7%) 5 (50%) 0 1(50%) 0,29
Risco Itermediário 2 (%
dos disponíveis) 3 (13,6%) 1 (10%) 1(33,3% 1(50%
Alto Risco (% dos
disponíveis) 11 (50%) 1 (10%) 1(33,3%) 0
* variáveis numéricas expressas em medianas; ***calculado pelo teste exato de Kruskal-Wallis ou exato de
qui-quadrado; TN: triplo negativo;

4.2 TRATAMENTOS E DESFECHOS CLÍNICOS

A Tabela 14. Lista os tipos e frequências de tratamentos a que os pacientes foram

submetidos.
Tabela 14. Tipos e Frequência de Tratamentos

Tratamento N (%)
Hidroxicarbamida ou outras terapias citorredutoras 32 (60,3%)
Anagrelida 2 (3,8%)
Imunomoduladores (Talidomida) com ou sem corticosteróides 10 (18.9%)
Eritropoetina 2 (3.8%)
Androgenos 6 (11.3%)
Ruxolitinibe 1 (1.9%)
Transplante Alogênico de Medula Óssea 2 (3.8%)
Esplenectomia/Radioterapia Esplênica 6 (11.3%)
Observação 12 (22.6%)

Dois pacientes masculinos de nossa coorte foram submetidos a AloTCTH aparentados.

Tiveram diagnóstico firmado aos 52 e 56 anos e IPSS Intermediário-2 e Baixo, respectivamente.
 56

O primeiro encontra-se vivo e sem manifestações de doença 24 meses após o procedimento. O

segundo paciente teve o procedimento indicado porque evoluiu com anemia e aumento do
número de blastos circulantes (para 6%), com progressão para DIPSS Intermediário-2, e faleceu
por complicações infecciosos cerca de 8 meses após o Transplante.

4.2.1 Complicações trombóticas e hemorrágicas

Em 16 casos (30,2%) havia registro de episódios de complicações trombo-embólicas

sérias, 7 deles (13,2%) ocorridos após o diagnóstico: Trombose Venosa Profunda/Trombo-
Embolismo Pulmonar (TEVs) (n=3), Doença Arterial Periférica (DAP) obstrutiva (n=3) e
Acidente Vascular Cerebral (n=1). Cinco pacientes apresentaram complicações hemorrágicas
graves.
A ocorrência de eventos isquêmicos arteriais e TEVs não foi diferente entre os grupos
JAK2 V617F positivos e negativos (valor-p=0,75). Contudo, 7 (30,4%) dos pacientes JAK2
mutados tinham, ao diagnóstico, histórico de TEV ou DAP prévia, frequência
significativamente superior àquela no grupo sem a mutação (4,2%, p=0,047).
A grande maioria (81,5%) dos pacientes com complicações trombo-embólicas tinham
co-morbidades associadas a risco cardiovascular, incluindo Hipertensão Arterial Sistêmica,
Diabetes Mellitus, Dislipidemia, Arritimias Cardíacas, Obesidade, Doença Venosa Periférica
grave, Insuficiência Renal Crônica e Tabagismo.

4.2.2 Progressão para fase acelerada ou blástica

Cinco (10,4%) casos apresentaram progressão para excesso de blastos (>10% de blastos
circulantes) ou Leucemia Aguda (>20% de blastos), após tempo mediano de seguimento de 26
meses (0,9-119,7 meses). Todos os pacientes faleceram após tempo mediano de 8,7 semanas (1
dia a 111 sem), o que revela prognóstico de ST limitada para aqueles que sofrem progressão de
doença.

4.2.3 Sobrevida Total

Trinta e um dos 53 pacientes (60,3%) haviam falecido até dez/2018, 27 deles por
complicações relacionadas à MF.
Dos 36 pacientes com diagnóstico posterior a jan/2013, 20 (55,5%) haviam falecido,
todos por problemas diretamente relacionados à doença. A figura 19 mostra a curva de
sobrevida total deste subgrupo de pacientes. Após seguimento mediano de 44 meses, a ST
mediana foi de 35,6m.
 57

Figura 19. Sobrevida Total dos pacientes com MF diagnosticados após 2013.

100

% Sobreviventes 50

0
0 20 40 60
meses

4.2.3.1 ST versus mutações driver

Dos pacientes diagnosticados após 2013 a ST medianas daqueles TN, com mutação
JAK2 V617F, MPL e CALR foram respectivamente de 4,4 meses, 26,3 meses, 41,6 meses e não
atingida (p=0,0689). A figura 20 mostra as curvas de Kaplan-Meyer dos pacientes segundo a
mutação driver.

Figura 20. Sobrevida Total segundo o tipo de mutação driver

4.2.3.2 ST versus IPSS ao diagnóstico

A análise de ST dos pacientes com diagnóstico após 2013 mostra que os pacientes com
IPSS alto tiveram ST mediana de apenas 14 meses, em contraste com ST não atingida nos
demais grupos (p=0,0046) (Figura 21A). Ao agruparmos as 4 categorias de IPSS em 2 grupos
– Riscos Baixo/Intermed.1 e Intermed.-2/Alto – as ST medianas foram, respectivamente de 18
meses versus Não Atingida (figura 21B).
 58

Figura 21 – Curva de Sobrevida Total segundo grupos IPSS

Legenda: A) ST de pacientes segundo IPSS; B) Pacientes agrupados com IPSS baixo e Intermed.1 ou Intermed.2 e Alto

4.2.3.3 Impacto de outros fatores analisados sobre a ST

Não encontramos diferenças estatisticamente significativas em relação à ST de
pacientes de acordo com a natureza do serviço de saúde (público versus privado). A ST também
não diferiu entre pacientes com diagnóstico de MFP (35,6 meses), MF pós PV/TE (36,5 meses)
e MF pré-fibrótica (Não Atingida) (p=0,785) (figura 22).

Figura 22- ST de acordo com o diagnóstico

 59

4.3 RESULTADOS DO NEXT GENERATION SEQUENCING

Amostras de 32 pacientes foram submetidas ao processo de construção de biblioteca e

foi eficiente em 27 casos, os quais seguiram para sequenciamento por síntese.
A figura 23 mostra a análise gráfica de cobertura do sequenciamento. Todos os pacientes
tiveram cobertura média superior a 1000 vezes.
Figura 23 – Análise de cobertura do NGS

Quatro pacientes (14,8%) não tiveram mutações cooperativas identificadas: 1 TN e 3

com mutações apenas em genes driver.
A figura 24 apresenta a frequência e tipos de mutações driver e cooperativas
identificadas. A descrição de cada mutação e sua respectiva frequência alélica encontram-se no
apêndice 2, que contém os dados individuais de cada paciente.
A figura 25 mostra as mutações encontradas em cada paciente (colunas), agrupadas por
função celular das proteínas codificadas. A mediana de mutações por paciente (incluindo as
mutações driver) foi de 3, variando de 0 a 7.
Além das mutações driver, aquelas em genes associados à regulação epigenética foram
as mais frequentes, encontradas em 59,2% dos pacientes.
 60

Figura 24 – Frequência e tipos de mutações encontradas no NGS

 61

Figura 25. Mutações driver e cooperativas por pacientes.

MF22MF25 MF19MF02 MF15MF18MF32 MF04MF17MF29 MF34MF28MF20 MF36MF08MF16 MF05MF31 MF24MF23MF03 MF30MF06MF33 MF10MF12MF35

Drivers JAK2 V617F

CALR
MPL
Reguladores ASXL1
Epigenéticos
EZH2
TET2
DNMT3A
IDH2
Vias de Transdução SH2B3
de Sinal
NRAS
CSF1R
PTPN11
GNAS
FLT3
PDGFRA
NOTCH1
CSF2RB
GLI1
Resposta ao PPM1D
Stress/Genes TP53
Supressores de
Tumores NF1
RB1
CHEK2
ATM
Processamento do SF3B1
RNA
SRSF2
U2AF1
Regulação da NFE2
Transcrição
ARID2
RUNX1
CREBBP
CUX1
BCOR
Legenda: Cada coluna corresponde a um paciente; as cores escuras representam mutações com VAF superior a 0,5.

Mutações em genes que codificam proteínas associadas à transdução de sinal foram

identificadas em 44% dos casos. A mais frequente (n=4, 14,8%) envolvia o gene SH2B3, que
 62

codifica a proteína LNK, que é um controlador negativo de transdução de sinal de vários

receptores de membrana, incluindo MPL, EpoR e o Receptor do Fator de Crescimento de
Monócitos e Macrófagos (CSF1)113. Tres (11,1%) dos pacientes apresentaram 2 diferentes
mutações [G413A (n=2) e V299M (n=1)] no gene CSF1R (c-FMS) que codifica o receptor de
CSF1, uma tirosina-quinase da família de receptores CSF1/PDGF (Platelet-Derived Growth
Factor). A tabela 15 apresenta a análise de predição in silico do impacto destas 2 mutações, nos
diferentes softwares utilizados.
Tabela 15 – Predição do impacto funcional das mutações de CSF1R
Mutação Software Escore Previsão de Alteração da
função
CSF1R G413A Provean -1,181 “Neutral”
PolyPhen2 0.992 “Probably damaging”
SIFT 0.00 “Affects protein
function”
FATHMM 0,5822 Deletéria
CSF1R V299M Provean -0,660 “Neutral”
PolyPhen2 0,382 “Benign”
SIFT 0,10 “Tolerated”
FATHMM 0,008 Neutra

Um terço dos pacientes apresentou mutações em genes envolvidos na resposta ao stress

celular/dano do DNA, considerados GSTs. O gene mais frequentemente mutado foi ATM
(Ataxia Telangetasia Mutated) (n=3). Um paciente (MF30) mostrava mutações missense em
TP53 e PPM1D e apresentou evolução para Leucemia Aguda e óbito 4 meses após o
diagnóstico.
Também um terço dos casos apresentou mutações em genes relacionados ao
processamento do RNA. Destas a mais frequente ocorreu em SF3B1 (n=5, 18,5%).
Mutações em genes associados à regulação da transcrição foram encontradas em um
quarto dos casos.

4.4 ALTERAÇÕES CROMOSSÔMICAS DETECTADAS POR CMA

Amostras de 33 pacientes foram analisadas pela técnica de CMA. Destes, 5 tiveram

arrays considerados normais e houve CNV ou CN-LOH em 28 pacientes (84,8%). A figura 26
apresenta a frequência, tipo e distribuição por cromossomos das alterações encontradas. A
figura 27 mostra uma visão do cariótipo com os tipos de alterações e as respectivas localizações
citogenéticas. Dezenove pacientes apresentaram CNVs, com mediana de uma alteração por
paciente (1-9) e tamanhos variando entre 100 Kb [del (12)(q24.31)] até 145 Mb (trissomia do
crom. 8).
 63

Figura 26 – Frequência e caracterização das alterações cromossômicas evidenciadas pelo CMA

Microdeleções foram encontradas em casos individuais, em regiões envolvendo os

seguintes genes de interesse (com o identificador do paciente): NOTCH2 (MF12), TP63
(MF19), TET2 (MF24) e MYB (MF28).
Nos 19 pacientes com informação concomitante de cariótipo, das 10 alterações de ganho
ou perda cromossômica identificadas pelo CMA em 6 pacientes, 4 foram também descritas pelo
Bandeamento Cromossômico (tamanho mínimo de 10,2 Mb). Seis regiões de perdas, com
tamanho variando entre 0,1 a 19 Mb (mediana de 1,95Mb) foram evidenciados apenas pelo
CMA. Dentre estas estão 2 de 3 deleções envolvendo o locus do gene RB1.
Todas as alterações descritas pelo cariótipo convencional foram encontradas pelo CMA,
com exceção de hiperdiploidia encontrada em 4/21 metáfases no paciente MF51 e add(20q) no
MF08, que apresentou cariótipo complexo.
CN-LOH foi o tipo de alteração mais frequentemente encontrada nos CMAs. Quando
restringimos a análise para: a) segmentos com extensão superior a 10 Mb ou b) segmentos
contendo mutação concomitante de gene de interesse (n=2, JAK2 e ASXL1), 21 dos 33 pacientes
(63,6%) apresentavam esta alteração. O número mediano de áreas de aUPD nestes 21 casos foi
3 por paciente, variando de 1 a 12.
 64

Figura 27 – Caryoview com as principais alterações encontradas pelo CMA.

Os cromossomos estão representados com tamanho semelhante para facilitar a visualização. Áreas de CN-LOH com tamanho
inferior a 10Mb estão representadas com traço mais delgado.
 65

4.4.1 Padrões de associação entre alterações genômicas

Alguns achados e associações entre as alterações genômicas devem ser destacados:

1) As mutações driver em JAK2, CALR e MPL foram mutuamente exclusivas,
confirmando redundância funcional nos mecanismos patológicos. Os 2 casos Triplo
Negativos não apresentavam mutações não-canônicas nestes genes.
2) Seis pacientes (18,1%) apresentavam CN-LOH envolvendo o segmento 9p24.2 (que
contem o gene JAK2), todas em casos com mutação JAK2 V617F (35% do total de
pacientes com esta mutação). A figura 28A mostra um caso representativo. Dos
cinco casos com esta aUPD e NGS realizado, todos apresentavam VAF superior a
0,5. Outros 2 casos apresentaram CN-LOH do braço curto do cromossomo 9, sem
atingir o segmento 9p24.2, um deles com mutação de JAK2 e outro TN.
3) Um caso adicional de mutação de JAK2 V617F e VAF>0,5 apresentou ganho do
segmento 9p envolvido. Um único caso com VAF>0,5 não tinha alteração no CMA.
4) Um caso com mutação driver em MPL apresentou CN-LOH de 1p.
5) Mutações nos genes EZH2, SH2B3 e ASXL1 com VAF superior a 0,5 mostraram-se
associados a CN-LOH.
6) Um paciente com mutação do TP53 apresentava deleção do outro alelo (em
mosaicismo) e VAF <0,5.
Figura 28 – Casos representativos de alterações identificadas no CMA

A: CN-LOH do segmento 9p (MF15); B: del(13q) delimitando MAR de 2,4Mb (MF06).

7) Cinco pacientes apresentaram disrupção do gene RB1: 4 com deleções intersticiais

no braço longo do cromossomo 13, que delimitavam uma MAR abrangendo as
 66

regiões 13q14-13q14.2 (com extensão de 2,4Mb) e 1 com mutação missense.

Destes, 4 haviam falecido, conferindo ST mediana para o grupo de 30 meses. A
figura 28B apresenta a visualização de um caso representativo.
8) Mutações de ASXL1 foram significativamente associadas a EZH2 (p=0,02),
sugerindo potencial sinergia das combinações de mutações.
9) Outras associações já descritas na literatura, em coortes maiores, apresentaram
tendência a associação na nossa coorte, mas não foram estatisticamente
significantes:
a. Cinquenta porcento das mutações de TET2 ocorreram em associação a
9p24.2 CN-LOH, enquanto apenas 16,7% dos pacientes sem mutação de
TET2 apresentavam esta aUPD (p=0,139).
b. Os 2 casos de del 20q co-ocorreram com CAL-R mutado (p=0,104).

A figura 29 mostra o Circos Plot das associações entre os achados mais frequentes de
CMA e as mutações driver.

Figura 29 – Circos Plot das associações de CNV e CN-LOH com as mutações driver
 67

4.5 AVALIAÇÃO PROGNÓSTICA BASEADA NOS ACHADOS GENÔMICOS

Os pacientes foram classificados, de acordo com os achados dos testes genômicos, em

um dos 8 grupos descritos por Grinfeld et al. A figura 30 mostra o algoritmo de classificação
proposto por aqueles autores e a distribuição dos 24 pacientes com dados de NGS e CMA
disponíveis.
Figura 30. Classificação dos pacientes segundo alterações genômicas encontradas.

É digno de nota que 12 dos 24 pacientes assim classificados encontram-se nos grupos 1
ou 2, que apresentaram, nas coortes que validaram o escore personalizado, os piores
prognósticos.
Calculamos o escore personalizado nos 27 pacientes submetidos a NGS, 24 dos quais
dispunham também de informações de alterações cromossômicas por CMA. O tempo de
seguimento mediano deste grupo de pacientes foi de 57 meses. A figura 31 apresenta as curvas
de Sobrevida Livre de Eventos (SLE) projetadas e o desfecho observado dos 15 pacientes que
haviam falecido até dez/2018.
 68

Figura 31 – Predição pelo escore prognóstico personalizado para os pacientes falecidos.

 69

A seguir, avaliamos o desempenho deste escore prognóstico para este grupo de 27

pacientes, por meio de produção de curva ROC (figura 32) e calculamos os índices de
concordância aos 48 meses, pelos métodos de Harrell e Uno (tabela 16), e de acurácia, pela
obtenção dos escores de Brier e de erro de predição absoluto, para os modelos IPSS e
personalizado.

Figura 32 - Curva de Característica de Operação do Receptor (ROC) de avaliação do sistema de prognóstico

personalizado

A figura 33 mostra que a ST observada em nossa coorte é, na maioria das vezes, inferior
à estimada pelo escore personalizado. Dois terços (10/15) dos casos tiveram ST abaixo da linha
de estimativa perfeita.

Tabela 16. Escores de concordância e acurácia obtidos para os modelos prognósticos IPSS e Personalizado.

Desfecho Preditor Harrell´s Uno´s C Escore Erro de

C Brier Predição
Absoluto
ST Modelo_Personalizado 0.6512 0,6530 0,3144 0,5109
ST IPSS 0,5846 0,6052 0,3763 0,5667
 70

Figura 33 – ST estimada versus observada pelo escore prognóstico personalizado

 71

5 DISCUSSÃO

A MF é a NMP clássica mais rara e de pior prognóstico. Sua apresentação clínica, as

abordagens terapêuticas, riscos de complicações e de morte são extremamente heterogêneos e
dados clínicos e genéticos sobre esta patologia em pacientes brasileiros ainda são escassos.
Neste estudo descrevemos demografia, distribuição em relação aos grupos prognósticos
convencionais, padrões terapêuticos, alterações genéticas e desfechos de longo prazo de uma
coorte de pacientes seguido em serviços de Onco-Hematologia da região Centro-Oeste do
Brasil, tornando possível comparar estes parâmetros com casuísticas internacionais e nacionais
publicadas. A tabela 17 apresenta dados de 4 destes estudos retrospectivos 63,64,114,115. A idade
mediana ao diagnóstico de nossa coorte de pacientes foi de 63,5 anos e está concordância com
a literatura, que estabelece este parâmetro entre os 63 e 72 anos. O predomínio do sexo
masculino também é um achado frequente nas populações reportadas.
Em relação aos escores prognósticos (IPSS), em 3 outras coortes brasileiras 63,64,115, mais
da metade dos pacientes apresentavam-se com IPSS baixo e intermediário 1 (55% a 71,9% dos
casos). Já na população deste estudo há predomínio de pacientes com escores mais elevados
(41,7% com IPSS Alto). Possível explicação para este achado é que pacientes em nossa região
podem chegar tardiamente ao diagnóstico e aos cuidados de um serviço terciário, com a doença
já em fase mais avançada.
A maioria dos casos teve diagnóstico de MFP em fase fibrótica (77,4%). O percentual
daqueles com MF em fase pré-fibrótica (9,4%) é baixo quando comparado a outras casuísticas
estrangeiras. Um estudo multicêntrico internacional com 661 pacientes com MF incluiu 42%
dos pacientes com diagnóstico de fase pré-fibrótica68. Nosso achado pode ser explicado por
eventual dificuldade no reconhecimento, pelos patologistas, dos achados morfológicos desta
fase da doença, que faz diagnóstico diferencial principalmente com a TE. Eventual atraso na
chegada aos serviços terciários também é uma possível explicação. Reforça esta hipótese o fato
de que 3 dos 6 pacientes com o diagnóstico de fase pré-fibrótica serem seguidos em serviço
privado de saúde (Cettro), embora em torno de 80% dos pacientes fossem acompanhados em
serviço publico de Saúde (HBDF). Apenas 2 pacientes (3,8%) referiram um irmão acometido
por outra NMP. Este percentual é inferior à taxa de cerca de 10% em casuísticas internacionais
e pode estar subestimado na nossa população, em virtude de eventual insuficiência de busca
ativa na anamnese dos pacientes e familiares. A presença do hapótipo 46/1 do gene JAK2 e
SNPs de TET2 e TERT, associado a casos de NMPs familiares, não foi pesquisada em nosso
estudo, uma vez que se encontram em regiões intrônicas dos genes.
 72

Tabela 17. Dados comparativos entre diferentes coortes de pacientes com MF.
Cervantes et Passamonti et Souza MC et Benites BD et Este estudo
al. 86* al.87* al.115 al64
Internacional Internacional 3 centros 1 centro 1 centro público
(Europa) (Europa e EUA) acadêmicos acadêmico e 1 privado (não
Características brasileiros brasileiro acadêmicos)
Tipo Observacional, Observacional, Observacional, Observacional, Observacional,
Retrospectivo Retrospectivo Retrospectivo Retrospectivo Retrospectivo
Período de 1980-2007 1980-2008 2000-2011 1992-2011 2013-2018
Observação
N 1131 525 62 74 53
Seguimento NR 39,6 44 NR 43,9
mediano (meses)
Idade mediana 64(10-90) 65 (NR) 71 (40-91) 71,5(31-92) 63,5 (35-92)
% de Homens 60,5% 63,8% NR NR 54,7%
Grupos de risco prognóstico (IPSS)
Baixo 22% NR 11% 26% 16,7%∎
Intermed.1 29% 44% 32% 22,2%∎
Intermed.2 28% 29% 26% 19,4%∎
Alto 21% 16% 31% 41,7%∎
Sobrevida Total 69m NA 84% em 4 NA 35,6m∎
mediana anos
Baixo/Int.1 135m (baixo) NA (baixo) 96% em 4 NA NA∎
95m (Int.1) 170m (int.-1) anos
Int.2 48m 48m 72% em 4 122m** 53% em 48m∎
Alto 27m 18m anos 49m** 13,9m∎
Tratamentos (%)
Hydroxicarbamida
ou outros agentes 335(64) 26 (42) 66 (89) 32 (60.4)
citorredutores
Anagrelide NR 3 (4) 2 (3,8)
Talidomida e/ou NR 187(36) 4 (6) 3 (4) 10 (18,9)
Prednisona
Eritropoetina 51(11) 2 (3,8)
Androgenos 88(16) 6 (11,3)
Ruxolitinibe 0 0 0 1 (1,9)
AlloTCTH 5(0,4) 8(1,5) 1(1,3) 2 (3,8)
Esplenectomia ou NR
Radioterapia 111(9,8) 46(9) 5 (6,8) 6 (11,3)
Esplênica
Observação apenas NR 3 (4) 12 (22.6)
NR: não reportado; NT: não testado; NA: não atingida; * pacientes com MF pré-fibrótica e MF pós PV/TE foram excluídos **
ST extrapolada a partir da curva de Kaplan-Meyer publicada ∎ Análise realizada apenas em pacientes com diagnóstico posterior
a 2013.
 73

Apenas 22 (41,5%) dos pacientes tiveram cariótipo convencional realizado ao

diagnóstico. Destes, 5 (22,7%) foram laudados como alterados, com achados de del(13q), +8, -
X, 1 cariótipo complexo e 1 cariótipo hiperdiploide.
Levando-se em conta que o cariótipo é um importante parâmetro diagnóstico (por poder
demonstrar clonalidade) e prognóstico (faz parte dos parâmetros para cálculos do DIPSS-Plus,
entre outros), este dado revela que a indicação médica e/ou disponibilidade deste exame é ainda
baixa em nosso meio. Um estudo retrospectivo em população brasileira com MF tratada em 3
centros acadêmicos nos estados de São Paulo e Goiás mostrou que 64,1% dos pacientes tinham
cariótipo realizado63.
Em relação à distribuição e impacto das mutações driver na apresentação clínico-
laboratorial, metade dos casos tinham mutação JAK2 V617F. A frequência de positividade para
esta mutação em pacientes com MF é bastante variável na literatura, mas na maioria das coortes
é encontrada entre 50 a 60% dos casos.
Em 14 pacientes com esta mutação e dados de NGS disponível, a frequência alélica foi
extremamente variável (1,5% a 96%), com mediana de 60%. Oito (57%) dos pacientes tinham
VAF >0,5 e esta alteração esteve associada com perda de heterozigose (n=5) ou ganho (n=1)
do segmento 9p24. Homozigose é tipicamente mais frequente em PV e MF, mas rara em TE, o
que pode ser consequência de que fatores predisponentes para ocorrência desta aUPD estejam
mais presentes nas 2 primeiras ou, alternativamente, pode ser que a mutação em homozigose
não tenha vantagem seletiva nas CTL de TE, mas apenas nas da MF e PV. É possível que
aUPD9p tenha outros efeitos além da indução de LOH de JAK2 V617F, uma vez que há
pacientes que adquirem a UPD antes da mutação116, sugerindo que esta LOH poderia carregar
vantagem competitiva, seja por seleção de um haplótipo específico de JAK2, seja por alterações
em outros genes do braço 9p36. Compatível com esta última hipótese é o fato de 2 dos casos na
coorte (MF17 e MF35) apresentaram CN-LOH atingindo o braço curto do cromossomo 9 mas
não se estendendo até o loco de JAK2.
Três pacientes (MF02, MF04 e MF28) apresentavam VAFs de JAK2 V617F bastante
baixos: 3%, 4,5% e 1,5%. Em um deles (MF04) não é possível saber se houve efeito de diluição
do material genético de células neoplásicas naquele de células não clonais (uma vez que
extraímos DNA de leucócitos totais e não de granulócitos), pois este paciente não tinha outras
mutações cooperativas. Nos outros 2 casos, porém, há mutações cooperativas patogênicas em
SRSF2 e AXSL1 (MF02) e U2AF1 (MF28) com VAFs maiores que 0,4, o que descarta a
possibilidade de diluição. De fato, a dinâmica do subclone contendo a mutação driver é bastante
heterogênea e ele pode mesmo desaparecer durante a evolução da doença: blastos de LMA
 74

secundária a MPNs JAK2 positivas não apresentam esta mutação em mais de 50% dos
casos78,117.
Nós não encontramos diferenças significativas entre diferentes frequências alélicas de
JAK2 mutado em relação à apresentação clínico-laboratorial ou ST. Outros estudos
retrospectivos, contudo, sugerem que pacientes com VAF superior a 50% tenham melhor
prognóstico que os heterozigotos96,118.
Trinta e seis porcento dos pacientes apresentavam mutação do exon 9 de CALR. A
literatura mostra que em cerca de 80% dos casos a mutação é uma deleção de 52 pb ou inserção
de 5pb. Em todos os casos mutados, porém, há uma característica comum, que é a perda parcial
(tipo 2) ou completa (tipo 1) das sequências de aminoácidos com carga elétrica negativa na
porção C-terminal da proteína. Mutações diferentes destas, a depender da alteração causada na
proteína, são classificadas como tipo 1-símile, tipo 2-símile ou, ainda, outras. As mutações tipo
1 e tipo-1 símile parecem impactar positivamente o prognóstico92,119. Na coorte aqui descrita,
2 pacientes apresentavam mutações diferentes das comuns, uma tipo 1-símile e outra tipo 2-
símile ainda não descrita na literatura ou incluída em bancos de dados de variantes patológicas.
Em ambas, a característica de perda de sequências eletricamente negativas estava presente. É
importante ressaltar que estas alterações não seriam detectadas em métodos como MLPA ou
PCR alelo-especificas, podendo levar a classificação inadequada dos pacientes.
Os casos apresentados com mutação JAK2 V617F tem idade significativamente superior
aos pacientes com mutação da CALR. Nossos dados estão em conformidade com os descritos
nas NMPs em geral. Especula-se que a intensidade de sinalização de MPL/JAK/STAT nos
casos com mutações de CALR seja superior aos casos com JAK2 e MPL mutantes, e este efeito
poderia encurtar o tempo entre a ocorrência da mutação e o início da apresentação clínica26.
Pacientes com mutação no gene JAK2 também apresentaram maiores taxas de leucócitos e uma
tendência não estatisticamente significativa a maiores escores IPSS.
Além das mutações driver, os genes mais frequentemente mutados foram aqueles
associados à regulação epigenética e estrutura da cromatina (TET2 e ASXL1, cada um em 25,9%
dos casos, DNMT3A em 22% e EZH2 em 14,8%) e relacionados ao maquinário de splicing
(SF3B1 em 18,5%, SRSF2 em 11,1% dos casos e U2AF1 em um caso). Estudos prévios
mostraram que cerca de 20 a 30% dos pacientes com MF apresentavam mutações nestes grupos
de genes, que sua prevalência era maior em pacientes com IPSS mais elevados e que sua
presença impactava o prognóstico dos pacientes de forma negativa97,120,121. Na nossa coorte,
detectamos mutações neste grupo de genes em 21/27 casos (78%). Além da maior prevalência
de pacientes com IPSS alto em nossa coorte, este maior percentual pode estar relacionado à
 75

estratégia de definição de genes mutados. O estudo no qual baseamos nossa estratégia descreve
mutações adicionais em cerca de 80% dos casos de MF JAK2 positivas e próxima a 55% de
pacientes com mutação de CALR38.
Uma consideração necessária é relacionada ao momento de coleta das amostras. O
tempo mediano da coleta da amostra para sequenciamento em nosso estudo, em relação à data
da biópsia de medula óssea, foi de 72 dias (-139 dias a + 4781 dias). Embora casos com tempos
longos entre o diagnóstico e a coleta pudessem influenciar os achados, por progressão de
subclones com maior número de mutações, em MF a maioria das anormalidades genéticas já
estão presentes no diagnóstico. A exceção são genes com JARID2 e TP53 que tendem a se
acumular quando da transformação leucêmica122.
Encontramos também mutações no gene CSF1R (alias c-fms) em 3 de 27 casos (11%).
CSF1R exerce seu papel fisiológico na presença dos ligantes CSF1 e IL34, que promovem
homodimerização e autofosforilação do receptor, seguidas de ativação de várias vias intra-
celulares, incluindo a via de PI3K-AKT. A sinalização de CSF1 exerce papel na sobrevivência,
proliferação e diferenciação de precursores hematopoiéticos, especialmente de monócitos e
macrófagos123. CSF1R também promove a liberação de citocinas pro-inflamatórias e regulação
dos osteoclastos124. A atividade do receptor é inibida por diversas pequenas moléculas,
incluindo imatinibe125. Mutações em CSF1R já foram descritas em LMA com diferenciação
monocitica e em LMMC126 e em casos de neoplasias histiocíticas127.
Dois dos nossos casos apresentaram a mutação G413S (MF16 e MF20) e um (MF19) a
mutação V279M. Apenas este último apresentava monocitose evidente (6612/mm3).
Ambas as mutações missense acometem as regiões repetitivas imunoglobulina-símile
do domínio extra-celular (figura 34). Há apenas um estudo descrevendo o achado de CSF1R
G413S em MF128. Este autor aponta que em outros receptores tirosina-quinases de membrana
com estrutura similar (c-KIT, EGFR, PDGFRalfa), mutações no domínio extra-celular levaram
a ativação do receptor independente de ligantes, por interferir com regiões de regulação
negativa.
A avaliação in silico forneceu resultado sugestivo de alteração da função da proteína
para a mutação G413S em 3 dos 4 aplicativos utilizados; todos foram sugestivos de alteração
benigna/tolerada para a V279M. Os algorítmos de análise das mutações são específicos para
cada aplicativo, mas em linhas gerais baseiam-se na característica físico-química da
substituição e grau de conservação da região mutada entre espécies. Frequentemente estes testes
precedem a realização de testes funcionais, determinando quais mutações mereceriam ser
 76

investigadas a seguir. Testes funcionais, entretanto, podem revelar que alterações consideradas
benignas ou neutras podem afetar de forma substancial a atividade da proteína129.

Figura 34 – Representação da proteína CSF1R e localização das mutações encontradas.

As mutações V279M e G413A acometem a porção extra-celular, nas regiões imunoglobulina-símile. Fonte:
modificado de Fischer et al130.

Em nosso estudo, utilizamos CMAs para a avaliação de alterações cromossômicas e

ampliamos o tamanho amostral em relação a análise prévia já publicada131. O uso de arrays de
alta definição constitui-se em uma abordagem robusta e detalhada para a detecção de CNVs
grandes e pequenas, bem como de regiões de CN-LOH, especialmente em neoplasias
hematológicas em que translocações são infrequentes, como é o caso das NMPs.
Como esperado, CMA teve sensibilidade superior à análise por bandeamento
cromossômico. Em 2 casos esta última técnica detectou alterações não identificadas no CMA:
1 caso de hiperdiploidia em 4/21 metáfases e 1 caso de add(20q) associada a cariótipo
complexo. Possível explicação é que esta última faça parte de uma translocação não balanceada.
Alterações de CNV ou CN-LOH extensas (>10Mb) foram encontradas em todos os
cromossomos, com exceção de 16 e 22. Ao contrário de descrições de alta frequência de
poliploidia132, apenas 5 dos casos (15%) apresentaram ganhos.
A frequência de CN-LOH encontrada (63,6%) é relativamente alta. Stegelmann e
colaboradores58 descreveram este achado em 27% dos casos de MFP. Usaram, porém, filtros
diferentes para definir as alterações.
Como previamente exposto, regiões de CN-LOH podem promover vantagem clonal
através de duplicação de mutações adqquiridas ou de alterações germinativas predisponentes a
neoplasias. Em nossa casuística encontramos associação de mutações com CN-LOH
envolvendo os locos dos genes MPL, EZH2, JAK2, SH2B3 e ASXL1. Estas mutações
apresentaram-se com carga alélica elevada, sugerindo vantagem seletiva.
Identificamos CNV em 19 (57,5%) dos casos. No estudo de Stegelmann et al.58, que
avaliou pacientes com NMPs por arrays de 250k SNPs, 53% daqueles com MFP demonstraram
 77

CNVs, incluindo deleções extensas do 20q11-q13 em 10% dos casos e trissomia do

cromossomo 8 em 8,5% dos casos; um paciente apresentava microdeleção do 17q11.2, que
incluia o GST Neurofibromatosis-1; os demais pacientes com MFP e com CNVs mostravam
pequenas perdas genômicas variadas (<5Mb), o que pode refletir a instabilidade genômica da
MF. Em outro estudo que analisou 20 pacientes com MFP com CMA array de alta sensibilidade
85
, CNVs estavam presentes nas células mieloides em todos os casos. Além das alterações já
previamente reportadas por outros estudos de SNP array83,84 [del(5q), del(20q), del(13q), +8,
UPD em 9p24 e anormalidades do cromossomo 1], várias outras alterações crípticas foram
evidenciadas, incluindo amplificação de 20p13 que envolve o locus do gene SIRPB1, cuja
expressão – medida por imunohistoquimica – mostrou-se elevada em pacientes com esta CNV.
Estes estudos exemplificam como este método pode auxiliar na descoberta de genes envolvidos
na fisiopatogênese das neoplasias.
Encontramos microdeleções envolvendo locos de alguns genes de interesse, todos com
prevalência de apenas um paciente:
• NOTCH2. É considerado um oncogene envolvido em várias neoplasias linfoides
B e T. Contudo há evidências de que a sinalização de NOTCH haja como
supressor de tumor em neoplasias mieloides e que perda de função em modelos
animais levam ao desenvolvimento de NMP133. Além do caso com microdeleção
do loco deste gene (MF12), um outro paciente (MF29) apresentou a mutação
P6fs.
• Del TP63. Acomete um GST da família do TP53. Anormalidades estruturais
recorrentes foram identificadas em pacientes com Neoplasias Linfóides134 e
SMD135.
• Del TET2. Este achado foi previamente descrito em 2/146 casos de NMPs
(1.4%) com sugestão de maior prevalência em casos com cariótipo anormal136.
No caso de nosso estudo, del(4q24) é a única alteração citogenética.

A CNV mais frequente na nossa casuística foi a del (13q), identificada em 4 pacientes.
Estes casos delimitaram uma MAR de 2,4Mb que contém o loco do gene RB1. Em um paciente
adicional encontramos mutação missense neste gene, perfazendo 15% de casos com disrupção
de RB1.
O gene de suscetibilidade ao Retinoblastoma foi o primeiro GST caracterizado do
ponto-de-vista molecular137. Seu produto pRB é um regulador negativo da proliferação celular
e, classicamente, mutações de RB1 tem caráter recessivo para o desenvolvimento do câncer
 78

ocular. Contudo, trabalhos recentes demonstram que a presença de um único alelo funcional é
insuficiente para manter a estabilidade genômica, especialmente se acompanhado de perda de
função de outros GST, como TP53138. Um dos casos (MF30) apresentava também del(17p)
associada a mutação de TP53 e cursou com transformação leucêmica e óbito após 31 meses de
follow-up. A ocorrência de mutações somáticas associada a perda de heterozigose (LOH) do
gene TP53, um dos mais bem caracterizados GSTs, está fortemente associada à transformação
leucêmica das NMPs. Mutações no TP53 podem estar presentes por muitos anos, em baixa
carga alélica, e quando ocorre a LOH, o clone rapidamente se expande levando à progressão
para LMA37.
A frequência da del(13q) é bastante variada em diferentes casuísticas139 e deleção
críptica, como encontrada em 1 dos casos, é considerada rara140. Numa série de 2035 casos de
NMPs, a prevalência deste achado foi inferior a 0,5%38. Um levantamento do MDAnderson
Cancer Center encontrou 17 casos com del(13q) isolada, que apresentavam maior número de
blastos, fibrose medular e esplenomegalia141. Esta alteração não é considerada um parâmetro
de mau prognóstico no DIPSS-Plus. Contudo, dos 5 casos com disrupção do RB1 de nossa
coorte, 4 haviam falecido, com ST mediana de 18,5 meses.
Del (18p11) foi encontrada em 2 pacientes, sendo que um deles (MF30) apresenta
cariótipo complexo, com várias regiões de perdas em diferentes cromossomos. Trata-se de uma
alteração raramente descrita em neoplasias hematológicas.
Del (20q) foi identificada em 2 pacientes. Genes de interesse contidos nesta MAR são:
SAMHD, PTPRT, L3MBTL1, MYBL2, PIGT e NCOA3. Trata-se de uma alteração detectada em
SMD, síndromes de Overlap e é especialmente prevalente em NMPs clássicas (10-15%)80.
Outra alteração frequente em neoplasias mieloides (especialmente SMD e LMA secundária) é
del (7q)142, identificada em 2 pacientes deste estudo, ambos com doença com escores
prognósticos elevados.
Quanto à terapêutica dos pacientes, dois dados são dignos de destaque. Embora 9
pacientes tivessem idade inferior a 60a e (D)IPSS int-2/Alto, apenas 2 foram levados a
AloTCTH. Também um único paciente teve acesso ao inibidor Ruxolitinibe, a despeito dos
dados de literatura mostrarem melhora de sobrevida com esta droga quando comparada às
demais terapias disponíveis104,105. Esta medicação é indicada para casos de risco Intermediário
2 e Alto, que perfazem mais de 50% desta coorte. O acesso à droga foi limitado porque apenas
recentemente teve sua cobertura tornada obrigatória aos pacientes da rede suplementar e não
está disponível na rede publica de saúde.
 79

Os pacientes com MF seguidos neste estudo tiveram ST inferior àquela descrita em

outras coortes (vide tabela 16). Em parte, isto se explica pela maior fração de pacientes com
IPSS alto. O follow-up de 43,9 meses é ainda curto para avaliar ST mediana dos pacientes com
melhores escores prognósticos (IPSS baixo e intermediário-1). Pacientes com IPSS
intermediário-2 tiveram ST próxima à descrita em casuísticas internacionais (em torno de 48
meses). Já aqueles com escore alto mostram prognóstico particularmente sombrio, com ST
mediana de apenas 13,9 meses.
A classificação de pacientes segundo grupos de escores prognósticos visa auxiliar os
médicos assistentes a prever o risco de complicações sérias e morte, a fim de tomar as decisões
terapêuticas corretas no momento ideal, como, por exemplo, indicar o aloTCTH quando os
riscos associados a este procedimento forem inferiores ao risco de mortalidade por
complicações da doença. Com este intuito, vários novos esquemas de classificação (DIPSS-
Plus, MIPSS70, GIPSS, etc.), que buscam incorporar variáveis genéticas que tenham impacto
prognóstico independente, foram propostos, mas não são amplamente utilizadas fora de
ambientes acadêmicos, mesmo em países desenvolvidos.
Todos estes sistemas prognósticos, contudo, padecem de duas falhas comuns. A
primeira é que são aplicados a pacientes com diagnósticos definidos com base em achados
fenotípicos. Como explicitamos previamente, a definição diagnóstica de pacientes com NMPs
baseada na apresentação clínica e patológica é frequentemente difícil e arbitrária. A segunda
limitação é a de alocar cada paciente a uma determinada categoria prognóstica (tipicamente 3
a 4 categorias). Esta alocação permite prever o comportamento mediano do grupo, mas é
frequentemente insuficiente para guiar decisões terapêuticas em cada caso individual.
A fim de contornar estes problemas, Grinfeld et al38 desenvolveram uma classificação
genômica que englobe todos os pacientes com NMPs e modelos de prognósticos em múltiplas
etapas para prever desfechos em pacientes individuais.
A figura 35 apresenta a distribuição dos 8 diferentes grupos genômicos para os pacientes
com TE, PV e MF daquele estudo (fig.34A) e a mesma distribuição na nossa coorte de pacientes
com MF submetidos a NGS e CMA (fig.34.B).
Em ambos os estudos, há maior prevalência conjunta de pacientes nos grupos MPN com
disrupção do TP53 e MPN com mutações em genes envolvidos na organização de cromatina e
controle do splicing naqueles pacientes classicamente definidos como tendo diagnóstico de MF.
No estudo original, estes 2 grupos tiveram pior prognóstico, com ST mediana de 2,4 e 3,5 anos,
respectivamente.
 80

Figura 35 - Distribuição de pacientes segundo a classificação genômica

A: Distribuição dos casos com TE, PV e MF na coorte de treino do estudo de Grinfeld et al. B: A mesma distribuição em pacientes
com MF na coorte de nosso estudo.
Nós avaliamos o desempenho do escore prognóstico personalizado proposto por estes
autores por meio do cálculo de concordância (C) para desfechos de sobrevida. De maneira
breve, estes índices são medidas da adequação para desfechos binários em um modelo de
regressão logística dependente de tempo. Um índice C igual a 1,0 significa que o modelo é
perfeito. Um valor de 0,5 significa que o modelo não é superior a predição por sorte.
O índice C pelos métodos de Harrell e Uno do modelo personalizado foram
nominalmente superiores àqueles obtidos para o IPSS. Ainda, o escore de Brier e o Erro
preditivo absoluto foram nominalmente inferiores para o primeiro modelo, sugerindo maior
acurácia. Após a publicação dos autores do Reino Unido, ainda não houve artigos publicados
de validação externa do modelo.
 81

Notamos que a maioria dos pacientes brasileiros submetidos a este modelo tem ST
inferior à prevista. A principal contribuição para este desvio se deu pelo óbito precoce de 5
pacientes, com ST variando entre 3 e 7 meses, por complicações associadas a doença avançada,
caracterizada por caquexia e citopenias, ou evento isquêmico agudo.
A importância da caracterização genômica individual dos pacientes pode ser
exemplificada por dois casos representativos desta coorte. O paciente MF19 teve diagnóstico
aos 59 anos com IPSS intermediário-1 (grupo com sobrevida total mediana estimada próxima
a 8 anos). Após apenas 19 meses de seguimento, evoluiu para LMA e óbito. Os dados de NGS
mostraram mutações em JAK2 (VAF <0,5), ASXL1, SRSF2, IDH2, PTPN11 e CSF1R e CMA
revelou del TP63 e del (21q). Com estes dados, a predição pelo modelo personalizado era de
ST mediana de 21,6 meses (vide figura 30). Em contraste, a paciente MF03 teve diagnóstico de
MF TN (driver investigada por PCR alelo-específico para JAK2 V617F e MLPA) aos 43 anos,
com IPSS e DIPSS-Plus inicial Intermediário-1 (por anemia grau 2) e, após 53 meses de
seguimento, cursou com progressão do DIPSS-Plus para Intermediário-2 (por plaquetopenia
grau 1). Neste momento, com 47 anos e com doadores aparentados HLA-compatíveis,
classicamente se recomenda avaliação para AloTCTH, pois a ST mediana deste grupo é de 35
meses. O NGS revelou mutação de CALR tipo 2-símile e SH2B3 em homozigose. A aplicação
do escore personalizado prediz ST mediana de 17 anos, com baixo risco de transformação para
LMA (figura 36). Com estes dados, portanto, seria razoável considerar apenas o tratamento
clínico da anemia e controle clínico e laboratorial próximos.

Figura 36 – Predição personalizada da paciente MF03.

 82

Acreditamos que nossos dados colaboram para a compreensão da diversidade genética

da MF em pacientes brasileiros. Esta diversidade embasa, em parte, a heterogeneidade de
manifestações clínicas e do comportamento biológico desta patologia.
Na abordagem das neoplasias hematológicas está ocorrendo uma mudança progressiva
de paradigma, da caracterização diagnóstica e prognóstica baseada em achados clínicos e
morfológicos para aquela baseada em achados genômicos. Embora necessária para melhorar o
manejo dos pacientes com MF, em nosso meio também enfrentamos desafios mais básicos,
como a necessidade de acesso precoce aos serviços de saúde, melhor controle de co-morbidades
(como doenças de risco cardiovascular) e uso de tecnologias terapêuticas eficazes estabelecidas,
a fim de melhorar a qualidade assistencial aos pacientes portadores desta grave neoplasia.
 83

6 CONCLUSÕES

A seguir apresentamos os pontos principais deste trabalho, ordenados pelos objetivos

específicos da pesquisa.

a) Apresentação clínica, distribuição quanto aos escores prognósticos convencionais,

padrões terapêuticos e desfechos de longo prazo

As características demográficas da coorte avaliada foram semelhantes a outras

casuísticas nacionais e internacionais, porém a frequência de pacientes com escore prognóstico
IPSS alto foi superior.
A Sobrevida Total mediana desta coorte foi próxima a 3 anos e reflete, em parte, a maior
prevalência de pacientes com alto risco.
Complicações trombóticas e/ou hemorrágicas foram frequentes em pacientes com MF
e estão associadas a fatores de risco clássicos para doenças cardiovasculares.
Pacientes que apresentaram progressão para excesso de blastos ou Leucemia Aguda
tiveram prognóstico particularmente sombrio.
O acesso a testes fundamentais, como citogenética, e a tratamentos de maior eficácia,
com Transplante de Células-Tronco Hematopoiétinas e Inibidores de JAK foi limitado.

b) Prevalência das mutações driver e em genes cooperativos e impacto na biologia da

doença

A distribuição quanto às mutações driver foi semelhante a outras casuísticas reportadas.

Uma das mutações encontradas no gene CALR ainda não foi descrita na literatura.
Pacientes com JAK2 mutado apresentaram-se com maior leucocitose e tem maior
incidência de eventos trombóticos previamente ao diagnóstico; pacientes com mutações de
CALR tiveram idade mais precoce ao diagnóstico.
Setenta e oito porcento dos pacientes apresentavam mutações cooperativas adicionais,
a maioria delas em genes associados à regulação epigenética e estrutura da cromatina e em
genes relacionados ao maquinário de splicing. Estas mutações costumam determinar
prognóstico de sobrevida inferior.
 84

c) Determinação da prevalência de alterações cromossômicas detectadas por CMA e

correlação com perfil mutacional

A técnica de CMA permitiu detectar regiões de ganhos, perdas e regiões de CN-LOH

na maioria dos casos.
Com frequência, CN-LOH esteve associada a mutações em genes com locos abrangidos
pela alteração, conferindo aumento da carga alélica. Esta associação foi particularmente
frequente para 9p aUPD e mutação JAK2 V617F.

d) Identificação de Regiões Minimamente Afetadas e genes potencialmente envolvidos

na fisiopatogênese da MF

A região deletada mais prevalente envolvia o loco do gene RB1. Cinco casos (15% dos
testados) apresentavam disrupção de RB1, sugerindo que haploinsuficiência deste gene
supressor de tumor tenha papel na fisiopatogênese da MF.
Onze porcento dos pacientes apresentaram mutação no gene CSF1R, alteração
raramente descrita em NMPs. Por se tratar de receptor de Fator de Crescimento associado a
proliferação de células mieloides, acreditamos que o papel destas mutações mereça ser melhor
caracterizado.

e) Avaliação do desempenho do modelo prognóstico personalizado

O escore prognóstico baseado em 63 dados clínicos e genômicos (modelo

personalizado) mostrou concordância e acurácia superior ao escore convencional IPSS.
A maior parte dos nossos pacientes, contudo, tem sobrevida total observada inferior
àquela predita por este escore.

Nossos resultados sugerem que há espaço para melhoria na qualidade da assistência

ofertada aos pacientes com MF em nosso meio, por meio de acesso precoce aos serviços de
saúde, melhor controle de fatores de risco cardiovascular, acesso a terapêuticas eficazes
estabelecidas e à avaliação prognóstica baseada em dados genômicos.
 85

7 REFERÊNCIAS

1. Arber DA, Orazi A, Hasserjian R, et al. The 2016 revision to the World Health
Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood.
2016;127(20):2391-2406. doi:10.1182/blood-2016-03-643544.The.
2. Campbell PJ, Green AR. The myeloproliferative disorders. N Engl J Med.
2006;355(23):2452-2504. doi:10.1056/nejmra063728.
3. Nonino A. CHAPTER 15 Molecular Targeted Therapies for Hematologic Malignancies.
In: Novak E, Rego E, eds. Physiopathogenesis of Hematological Cancer. Bentham
Publishers; 2012:218-227.
4. Mead AJ, Mullally A. Myeloproliferative neoplasm stem cells. Blood.
2017;129(12):1607-1616. doi:10.1182/blood-2016-10-696005.
5. Deininger MWN, Goldman JM, Melo J V, et al. The molecular biology of chronic
myeloid leukemia. Blood. 2000;96(10):3343-3356.
6. Quintás-Cardama A, Cortes J. Molecular biology of bcr-abl1 – positive chronic myeloid
leukemia. Blood. 2009;113(8):1619-1630. doi:10.1182/blood-2008-03-144790.
7. Druker B, Talpaz M, Resta D, et al. Efficacy and Safety of a Specific Inhibitor of the
Bcr-Abl Tyrosine. N Engl J Med. 2001;344(14):1031-1037.
doi:10.1056/NEJM200104053441401.
8. Barbui T, Barosi G, Birgegard G, et al. Philadelphia-negative classical
myeloproliferative neoplasms: critical concepts and management recommendations
from European leukemiaNet. J Clin Oncol. 2011;29(6):761-770.
doi:10.1200/JCO.2010.31.8436.
9. Rumi E, Cazzola M. Diagnosis , risk stratification , and response evaluation in classical
myeloproliferative neoplasms. Blood. 2017;129(6):680-693. doi:10.1182/blood-2016-
10-695957.referred.
10. Noor SJ, Tan W, Wilding GE, et al. Myeloid blastic transformation of myeloproliferative
neoplasms-A review of 112 cases. Leuk Res. 2011;35(5):608-613.
doi:10.1016/j.leukres.2010.07.031.
11. Dameshek W. Some speculations on the Myeloproliferative Syndromes. Blood.
1951;6:372-375.
12. Prchal JF. Bone Marrow Responses in Polycthemia Vera. N Engl J Med. 1974;290:1382.
13. Fialkow PJ, Faguet GB, Jacobson RJ, Vaidya K, Murphy S. Evidence that Essential
Thrombocythemia is a clonal disorder with origin in a Multipotent Stem Cell. Blood.
 86

1981;58(5):916-919.
14. Adamson JW, Fialkow PJ, Murphy S, Prchal JF, Steinmann L. Polycythemia Vera:
Stem-Cell and probable clonal origin of the disease. N Engl J Med. 1976;295:913-916.
15. Ugo V, Marzac C, Teyssandier I, et al. Multiple signaling pathways are involved in
erythropoietin-independent differentiation of erythroid progenitors in polycythemia
vera. Exp Hematol. 2004;32(2):179-187.
16. Komura E, Chagraoui H, De Mas VM, et al. Spontaneous STAT5 activation induces
growth factor independence in idiopathic myelofibrosis: Possible relationship with
FKBP51 overexpression. Exp Hematol. 2003;31(7):622-630. doi:10.1016/S0301-
472X(03)00085-7.
17. James C, Ugo V, Le Couédic JP, et al. A unique clonal JAK2 mutation leading to
constitutive signalling causes polycythaemia vera. Nature. 2005;434(7037):1144-1148.
doi:10.1038/nature03546.
18. Kralovics R, Passamonti F, Buser AS, et al. A Gain-of-Function Mutation of JAK2 in
Myeloproliferative Disorders. N Engl J Med. 2005;352(17):1779-1790.
19. Levine RL, Wadleigh M, Cools J, et al. Activating mutation in the tyrosine kinase JAK2
in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with
myelofibrosis. Cancer Cell. 2005;7(4):387-397. doi:10.1016/j.ccr.2005.03.023.
20. Scott LM, Tong W, Levine RL, et al. JAK2 Exon 12 Mutations in Polycythemia Vera
and Idiopathic Erythrocytosis. N Engl J Med. 2007;356(5):459-468.
doi:10.1056/NEJMoa065202.
21. Pikman Y, Lee BH, Mercher T, et al. MPLW515L is a novel somatic activating mutation
in myelofibrosis with myeloid metaplasia. PLoS Med. 2006;3(7):1140-1151.
doi:10.1371/journal.pmed.0030270.
22. Pardanani AD, Levine RL, Lasho T, et al. MPL515 mutations in myeloproliferative and
other myeloid disorders: A study of 1182 patients. Blood. 2006;108(10):3472-3476.
doi:10.1182/blood-2006-04-018879.
23. Nangalia J, Massie CE, Baxter EJ, et al. Somatic CALR Mutations in Myeloproliferative
Neoplasms with Nonmutated JAK2. N Engl J Med. 2013;369(25):2391-2405.
doi:10.1056/NEJMoa1312542.
24. Klampfl T, Gisslinger H, Harutyunyan AS, et al. Somatic mutations of calreticulin in
myeloproliferative neoplasms. N Engl J Med. 2013;369(25):2379-2390.
doi:10.1056/NEJMoa1311347.
25. Clinton A, McMullin MF. The Calreticulin gene and myeloproliferative neoplasms. J
 87

Clin Pathol. 2016;69(10):841-845. doi:10.1136/jclinpath-2016-203899.

26. Nangalia J, Green AR. Myeloproliferative neoplasms: from origins to outcomes. Blood.
2017;130(23):2475-2483. doi:10.1182/blood-2017-06-782037.
27. Araki M, Yang Y, Masubuchi N, et al. Activation of the thrombopoietin receptor by
mutant calreticulin in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Blood.
2016;127(10):1307-1316. doi:10.1182/blood-2015-09-671172.
28. Gángó A, Mózes R, Boha Z, et al. Quantitative assessment of JAK2 V617F and CALR
mutations in Philadelphia negative myeloproliferative neoplasms. Leuk Res.
2018;65(2018):42-48. doi:10.1016/j.leukres.2017.12.005.
29. Milosevic Feenstra JD, Nivarthi H, Gisslinger H, et al. Whole-exome sequencing
identifies novel MPL and JAK2 mutations in triple-negative myeloproliferative
neoplasms. Blood. 2016;127(3):325-332. doi:10.1182/blood-2015-07-661835.
30. Mansier O, Paz DL, Ianotto J, Bris Y Le. Clinical and biological characterization of MPN
patients harboring two driver mutations , a French Intergroup of Myeloproliferative
neoplasms ( FIM ) study. Am J Hematol.:1-7.
31. Rumi E, Pietra D, Ferretti V, et al. JAK2 or CALR mutation status defines subtypes of
essential thrombocythemia with substantially different clinical course and outcomes.
Blood. 2014;123(10):1544-1551. doi:10.1182/blood-2013-11-539098.E.R.
32. Tiedt R, Hao-Shen H, Sobas MA, et al. Ratio of mutant JAK2-V617F to wild-type Jak2
determines the MPD phenotypes in transgenic mice. Blood. 2008;111(8):3931-3940.
doi:10.1182/blood-2007-08-107748.
33. Godfrey AL, Chen E, Pagano F, et al. JAK2V617F homozygosity arises commonly and
recurrently in PV and ET, but PV is characterized by expansion of a dominant
homozygous subclone. Blood. 2012;120(13):2704-2707. doi:10.1182/blood-2012-05-
431791.
34. Vannucchi AM, Antonioli E, Guglielmelli P, Pardanani AD, Tefferi A. Clinical
correlates of JAK2 V617F presence or allele burden in myeloproliferative neoplasms: a
critical reappraisal. Leukemia. 2008;22:1299-1307. doi:10.1038/leu.2008.113.
35. Ortmann CA, Kent DG, Nangalia J, et al. Effect of Mutation Order on Myeloproliferative
Neoplasms. N Engl J Med. 2015;372(7):601-612. doi:10.1056/NEJMoa1412098.
36. Grinfeld J, Nangalia J, Green AR. Molecular determinants of pathogenesis and clinical
phenotype in myeloproliferative neoplasms. Haematologica. 2017;102(1):7-17.
doi:10.3324/haematol.2014.113845.
37. Lundberg Pontus, Karow Axel. Clonal evolution and clinical correlates of somatic
 88

mutations in myeloproliferative neoplasms. Blood. 2014;123(14):2220-2228.

doi:10.1182/blood-2013-11-537167.P.L.
38. Grinfeld J, Nangalia J, Baxter EJ, et al. Classification and Personalized Prognosis in
Myeloproliferative Neoplasms. N Engl J Med. 2018;379(15):1416-1430.
doi:10.1056/NEJMoa1716614.
39. Genovese G, Kähler AK, Handsaker RE, et al. Clonal Hematopoiesis and Blood-Cancer
Risk Inferred from Blood DNA Sequence. N Engl J Med. 2014;371(26):2477-2487.
doi:10.1056/NEJMoa1409405.
40. Xie M, Lu C, Wang J, et al. Age-related mutations associated with clonal hematopoietic
expansion and malignancies. Nat Med. 2014;20(12):1472-1478. doi:10.1038/nm.3733.
41. Jaiswal S, Fontanillas P, Flannick J, et al. Age-Related Clonal Hematopoiesis Associated
with Adverse Outcomes. N Engl J Med. 2014;371(26):2488-2498.
doi:10.1056/NEJMoa1408617.
42. Rumi E, Cazzola M. Advances in understanding the pathogenesis of familial
myeloproliferative neoplasms. Br J Haematol. 2017;178(5):689-698.
doi:10.1111/bjh.14713.
43. Kilpivaara O, Mukherjee S, Schram AM, et al. A germline JAK2 SNP is associated with
predisposition to the development of JAK2V617F-positive myeloproliferative
neoplasms. Nat Genet. 2009;41(4):455-459. doi:10.1038/ng.342.
44. Oddsson A, Kristinsson SY, Helgason H, et al. The germline sequence variant
rs2736100-C in TERT associates with myeloproliferative neoplasms. Leukemia.
2014;28(6):1371-1374. doi:10.1038/leu.2014.48.
45. Trifa AP, Bănescu C, Bojan AS, et al. MECOM, HBS1L-MYB, THRB-RARB, JAK2,
and TERT polymorphisms defining the genetic predisposition to myeloproliferative
neoplasms: A study on 939 patients. Am J Hematol. 2018;93(1):100-106.
doi:10.1002/ajh.24946.
46. Pagliarini e Silva S, Santos B, Pereira E, et al. Evaluation of the association between the
JAK2 46/1 haplotype and chronic myeloproliferative neoplasms in a Brazilian
population. Clinics. 2013;68(1):5-9. doi:10.6061/clinics/2013(01)OA02.
47. Saliba J, Saint-Martin C, Di Stefano A, et al. Germline duplication of ATG2B and
GSKIP predisposes to familial myeloid malignancies. Nat Genet. 2015;47(10):1131-
1140. doi:10.1038/ng.3380.
48. Simon-Sanchez J, Scholz S, Fung H, et al. Genome-wide SNP assay reveals structural
genomic variation , extended homozygosity and cell-line induced alterations in normal
 89

individuals. Hum Mol Genet. 2007;16(1):1-14. doi:10.1093/hmg/ddl436.

49. O’Keefe C, Mcdevitt M a, Maciejewski JP, Dc W. Copy neutral loss of heterozygosity:
a novel chromosomal lesion in myeloid malignancies. Blood. 2010;115(14):2731-2739.
doi:10.1182/blood-2009-10-201848.
50. Heinrichs S, Li C, Look AT. SNP array analysis in hematologic malignancies: Avoiding
false discoveries. Blood. 2010;115(21):4157-4161. doi:10.1182/blood-2009-11-203182.
51. Babushok D V., Xie HM, Roth JJ, et al. Single nucleotide polymorphism array analysis
of bone marrow failure patients reveals characteristic patterns of genetic changes. Br J
Haematol. 2014;164(1):73-82. doi:10.1111/bjh.12603.
52. Score J, Cross NCP. Acquired Uniparental Disomy in Myeloproliferative Neoplasms.
Hematol Oncol Clin North Am. 2012;26(5):981-991. doi:10.1016/j.hoc.2012.07.002.
53. Kralovics R, Guan Y, Prchal JT. Acquired uniparental disomy of chromosome 9p is a
frequent stem cell defect in polycythemia vera. Exp Hematol. 2002;30(3):229-236.
doi:10.1016/S0301-472X(01)00789-5.
54. Holt D, Dreimanis M, Pfeiffer M, Firgaira F, Morley A, Turner D. Interindividual
variation in mitotic recombination. Am J Hum Genet. 1999;65:1423-1427.
doi:10.1086/302614.
55. Rumi E, Pietra D, Guglielmelli P, et al. Acquired copy-neutral loss of heterozygosity of
chromosome 1p as a molecular event associated with marrow fi brosis in MPL -mutated
myeloproliferative neoplasms. Blood. 2013;121(21):4388-4396. doi:10.1182/blood-
2013-02-486050.E.R.
56. Klampfl T, Harutyunyan A, Berg T, et al. Genome integrity of myeloproliferative
neoplasms in chronic phase and during disease progression. Blood. 2011;118(1):167-
176. doi:10.1182/blood-2011-01-331678.
57. Rice KL, Lin X, Wolniak K, et al. Analysis of genomic aberrations and gene expression
profiling identifies novel lesions and pathways in myeloproliferative neoplasms. Blood
Cancer J. 2011;1(11). doi:10.1038/bcj.2011.39.
58. Stegelmann F, Bullinger L, Griesshammer M, et al. High-resolution single-nucleotide
polymorphism array-profiling in myeloproliferative neoplasms identifies novel genomic
aberrations. Haematologica. 2010;95(4):666-669. doi:10.3324/haematol.2009.013623.
59. Grand FH, Hidalgo-curtis CE, Ernst T, et al. Frequent CBL mutations associated with
11q acquired uniparental disomy in myeloproliferative neoplasms. Blood.
2009;113(24):6182-6192. doi:10.1182/blood-2008-12-194548.
60. Visani G, Finelli C, Castelli U, et al. Myelofibrosis with myeloid metaplasia: clinical and
 90

haematological parameters predicting survival in a series of 133 patients. Br J Haematol.

1990;75(1):4-9. doi:10.1111/j.1365-2141.1990.tb02609.x.
61. Mesa RA, Silverstein MN, Jacobsen SJ, Wollan PC, Tefferi A. Population-based
incidence and survival figures in essential thrombocythemia and agnogenic myeloid
metaplasia: An olmsted county study, 1976-1995. Am J Hematol. 1999;61(1):10-15.
doi:10.1002/(SICI)1096-8652(199905)61:1<10::AID-AJH3>3.0.CO;2-I.
62. Tefferi A, Lasho TL, Jimma T, et al. One thousand patients with primary myelofibrosis:
The Mayo Clinic experience. Mayo Clin Proc. 2012;87(1):25-33.
doi:10.1016/j.mayocp.2011.11.001.
63. Conchon M, Tavares RS, Pagnano KB, et al. Primary Myelofibrosis Brazilian Patient
Journey: From Initial Symptoms to Treatment. Clin Lymphoma Myeloma Leuk.
2015;15(September):S57-S58.
64. Benites B, Lima C, Lorand-Metze I, et al. Primary myelofibrosis: risk stratification by
IPSS identifies patients with poor clinical outcome. Clinics. 2013;68(3):339-343.
doi:10.6061/clinics/2013(03)OA09.
65. Barbui T, Finazzi G, Falanga A. Myeloproliferative neoplasms and thrombosis. Blood.
2013;122(13):2176-2184. doi:10.1182/blood-2013-03-460154.
66. Cervantes F, Dupriez B, Passamonti F, et al. Improving survival trends in primary
myelofibrosis: An international study. J Clin Oncol. 2012;30(24):2981-2987.
doi:10.1200/JCO.2012.42.0240.
67. Orvain C, Luque Paz D, Dobo I, et al. Circulating Cd34+ cell count differentiates
primary myelofibrosis from other Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasms:
a pragmatic study. Ann Hematol. 2016;95(11):1819-1823. doi:10.1007/s00277-016-
2784-x.
68. Guglielmelli P, Pacilli A, Rotunno G, et al. Presentation and outcome of patients with
2016 WHO diagnosis of prefibrotic and overt primary myelofibrosis. Blood.
2017;129(24):3227-3236. doi:10.1182/blood-2017-01-761999.
69. Tefferi a, Lasho TL, Finke CM, et al. CALR vs JAK2 vs MPL-mutated or triple-negative
myelofibrosis: clinical, cytogenetic and molecular comparisons. Leukemia.
2014;28(7):1472-1477. doi:10.1038/leu.2014.3.
70. Rumi E, Cazzola M. Diagnosis, risk stratification, and response evaluation in classical
myeloproliferative neoplasms. Blood. 2016:blood-2016-10-695957. doi:10.1182/blood-
2016-10-695957.
71. Passamonti F, Rumi E, Pungolino E, et al. Life expectancy and prognostic factors for
 91

survival in patients with polycythemia vera and essential thrombocythemia. Am J Med.

2004;117(10):755-761. doi:10.1016/j.amjmed.2004.06.032.
72. Barosi G, Mesa RA, Thiele J, et al. Proposed criteria for the diagnosis of post-
polycythemia vera and post-essential thrombocythemia myelofibrosis: A consensus
statement from the international working group for myelofibrosis research and treatment
[6]. Leukemia. 2008;22(2):437-438. doi:10.1038/sj.leu.2404914.
73. Alvarez-Larrán A, Bellosillo B, Pereira A, et al. JAK2V617F monitoring in
polycythemia vera and essential thrombocythemia: Clinical usefulness for predicting
myelofibrotic transformation and thrombotic events. Am J Hematol. 2014;89(5):517-
523. doi:10.1002/ajh.23676.
74. Tefferi A. Pathogenesis of myelofibrosis with myeloid metaplasia. J Clin Oncol.
2005;23(33):8520-8530. doi:10.1200/JCO.2004.00.9316.
75. Lataillade J-J, Pierre-Louis O, Hasselbalch HC, et al. Does primary myelofibrosis
involve a defective stem cell niche? From concept to evidence. Blood.
2008;112(8):3026-3035. doi:10.1182/blood-2008-06-158386.
76. James C, Mazurier F, Dupont S, et al. The hematopoietic stem cell compartment of
JAK2V617F-positive myeloproliferative disorders is a reflection of disease
heterogeneity. Blood. 2008;112(6):2429-2438. doi:10.1182/blood-2008-02-137877.
77. Nonino A, Nascimento JM, Mascarenhas CC, Mazzeu JF, Pereira RW, Jacomo RH.
CD47 expression is decreased in hematopoietic progenitor cells in patients with
myelofibrosis. Brazilian J Med Biol Res. 2019;52(1):1-7. doi:10.1590/1414-
431x20187784.
78. Mead AJ, Mullally A. Myeloproliferative neoplasm stem cells. Blood.
2017;129(12):1607-1616. doi:10.1182/blood-2016-10-696005.
79. Tefferi A, Mesa RA, Schroeder G, Hanson CA, Li CY, Dewald GW. Cytogenetic
findings and their clinical relevance in myelofibrosis with myeloid metaplasia. Br J
Haematol. 2001;113(3):763-771. doi:10.1046/j.1365-2141.2001.02796.x.
80. Stoner S, Yan M, Liu K. Hippo Kinase Inactivation Contributes to Del(20q)
Malignancies and Cooperates with JAK2-V617F to Promote Myelofibrosis in Mice. In:
Blood (ASH Meeting). Vol 132. ; 2018.
81. Brecqueville M, Rey J, Devillier R, et al. Array comparative genomic hybridization and
sequencing of 23 genes in 80 patients with myelofibrosis at chronic or acute phase.
Haematologica. 2014;99(1):37-45. doi:10.3324/haematol.2013.091454.
82. Song J, Shao H. SNP Array in Hematopoietic Neoplasms: A Review. Microarrays.
 92

2015;5(1):1. doi:10.3390/microarrays5010001.
83. Gondek LP, Dunbar AJ, Szpurka H, McDevitt MA, Maciejewski JP. SNP array
karyotyping allows for the detection of uniparental disomy and cryptic chromosomal
abnormalities in MDS/MPD-U and MPD. PLoS One. 2007;2(11).
doi:10.1371/journal.pone.0001225.
84. Dunbar AJ, Gondek LP, O’Keefe CL, et al. 250K single nucleotide polymorphism array
karyotyping identifies acquired uniparental disomy and homozygous mutations,
including novel missense substitutions of c-Cbl, in myeloid malignancies. Cancer Res.
2008;68(24):10349-10357. doi:10.1158/0008-5472.CAN-08-2754.
85. Visani G, Sapienza MR, Isidori A, et al. SNPs array karyotyping reveals a novel
recurrent 20p13 amplification in primary myelofibrosis. PLoS One. 2011;6(11):3-12.
doi:10.1371/journal.pone.0027560.
86. Cervantes F, Dupriez B, Pereira A, et al. New prognostic scoring system for primary
myelofibrosis based on a study of the International Working Group for Myelofibrosis
Research and Treatment. Blood. 2009;113(13):2895-2901. doi:10.1182/blood-2008-07-
170449.The.
87. Passamonti F, Cervantes F, Vannucchi AM, et al. A dynamic prognostic model to predict
survival in primary myelofibrosis: a study by the IWG-MRT (International Working
Group for Myeloproliferative Neoplasms Research and Treatment). Blood.
2010;115(9):1703-1708. doi:10.1182/blood-2009-09-245837.The.
88. Gangat N, Caramazza D, Vaidya R, et al. DIPSS plus: A refined dynamic international
prognostic scoring system for primary myelofibrosis that incorporates prognostic
information from karyotype, platelet count, and transfusion status. J Clin Oncol.
2011;29(4):392-397. doi:10.1200/JCO.2010.32.2446.
89. Tefferi A, Nicolosi M, Mudireddy M, et al. Revised cytogenetic risk stratification in
primary myelofibrosis: Analysis based on 1002 informative patients. Leukemia.
2018;32(5):1189-1199. doi:10.1038/s41375-018-0018-z.
90. Barbui T, Thiele J, Gisslinger H, Finazzi G, Vannucchi AM, Tefferi A. The 2016
revision of WHO classification of myeloproliferative neoplasms: Clinical and molecular
advances. Blood Rev. 2016;30(6):453-459. doi:10.1016/j.blre.2016.06.001.
91. Tefferi A, Lasho TL, Finke CM, et al. CALR vs JAK2 vs MPL-mutated or triple-
negative myelofibrosis: clinical, cytogenetic and molecular comparisons. Leukemia.
2014;28(7):1472-1477. doi:10.1038/leu.2014.3.
92. Guglielmelli P, Rotunno G, Fanelli T, et al. Validation of the differential prognostic
 93

impact of type 1/type 1-like versus type 2/type 2-like CALR mutations in myelofibrosis.
Blood Cancer J. 2015;5:e360. doi:10.1038/bcj.2015.90.
93. Guglielmelli P, Barosi G, Specchia G, et al. Identification of patients with poorer survival
in primary myelofibrosis based on the burden of JAK2 V617F mutated allele. Blood.
2009;114(8):1477-1484. doi:10.1182/blood-2009-04-216044.The.
94. Cervantes F, Dupriez B, Pereira A, et al. New prognostic scoring system for primary
myelofibrosis based on a study of the International working group for myelofibrosis
research and treatment. Blood. 2009;113(13):2895-2901. doi:10.1182/blood-2008-07-
170449.
95. Rumi E, Pietra D, Pascutto C, et al. Clinical effect of driver mutations of JAK2, CALR,
or MPL in primary myelofibrosis. Blood. 2014;124(7):1062-1069. doi:10.1182/blood-
2014-05-578435.
96. Rozovski U, Verstovsek S, Manshouri T, et al. An accurate, simple prognostic model
consisting of age, JAK2, CALR, and MPL mutation status for patients with primary
myelofibrosis. Haematologica. 2017;102(1):79-84. doi:10.3324/haematol.2016.149765.
97. Vannucchi AM, Lasho TL, Guglielmelli P, et al. Mutations and prognosis in primary
myelofibrosis. Leukemia. 2013;27(9):1861-1869. doi:10.1038/leu.2013.119.
98. Guglielmelli P, Lasho TL, Rotunno G, et al. The number of prognostically detrimental
mutations and prognosis in primary myelofibrosis: an international study of 797 patients.
Leukemia. 2014;28(9):1804-1810. doi:10.1038/leu.2014.76.
99. Guglielmelli P, Lasho TL, Rotunno G, et al. MIPSS70: Mutation-Enhanced International
Prognostic Score System for Transplantation-Age Patients With Primary Myelofibrosis.
J Clin Oncol. 2018;36(4):310-318. doi:10.1200/JCO.2017.76.4886.
100. Bose P, Verstovsek S. The evolution and clinical relevance of prognostic classification
systems in myelofibrosis. Cancer. 2016;122(5):681-692. doi:10.1002/cncr.29842.
101. Grinfeld J, Nangalia J, Baxter EJ, et al. Supplement to: Classification and Personalized
Prognosis in Myeloproliferative Neoplasms. N Engl J Med. 2018;379(15):1416-1430.
doi:10.1056/NEJMoa1716614.
102. Rondelli D, Goldberg JD, Isola L, et al. MPD-RC 101 prospective study of reduced-
intensity allogeneic hematopoietic stem cell transplantation in patients with
myelofibrosis. Blood. 2014;124(7):1183-1191. doi:10.1182/blood-2014-04-572545.of.
103. Cervantes F. How I Treat Myelofibrosis. Blood. 2014;124(17):2635-2643.
doi:10.1182/blood-2014-07-575373.discussion.
104. Waltzman R, Stalbovskaya V, Ph D, et al. JAK inhibition with ruxolitinib versus best
 94

available therapy for myelofibrosis. N Engl J Med. 2012;366(9):787-798.

105. Passamonti F, Maffioli M, Cervantes F, et al. Impact of ruxolitinib on the natural history
of primary myelofibrosis : a comparison of the DIPSS and the COMFORT-2 cohorts.
Blood. 2014;123(12):1833-1835. doi:10.1182/blood-2013-12-544411.There.
106. Nguyen HM, Kiladjian J-J. Is there a role for the use of IFN-α in primary myelofibrosis?
Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2012;2012:567-570.
doi:10.1182/asheducation-2012.1.567.
107. Vardiman J, Thiele J, Arber DA, et al. The 2008 revision of the WHO classification of
myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and important changes.
2009;114(5):937-952. doi:10.1182/blood-2009-03-209262.
108. Speletas M, Katodritoua E, Daioua C, et al. Correlations of JAK2–V617F mutation with
clinical and laboratory findings in patients with myeloproliferative disorders. Leuk Res.
2007;31(8):1053-1059. doi:10.1016/j.leukres.2006.09.005.
109. Homig-Holzel C, Savola S. Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)
in tumor diagnostics and prognostics. Diagn Mol Pathol. 2012;21(4):189-206.
doi:10.1097/PDM.0b013e3182595516.
110. MRC-Holland. SALSA MLPA Probemix P520-A2 MPN Mix 2 - Description Version 06.;
2017.
111. MRC-Holland. SALSA MLPA Probemix P420-A1 MPN Mix 1 - Description Version 03.;
2017.
112. Nascimento JM. Análise do perfil de mutações driver por MLPA em pacientes com
Mielofibrose. 2017.
113. Devallie J. The adaptor Lnk ( SH2B3 ): An emerging regulator in vascular cells and a
link between immune and inflammatory signaling. Biochem Pharmacol. 2011;82:1391-
1402. doi:10.1016/j.bcp.2011.06.023.
114. Monte-Mor B da CR, Ayres-Silva J de P, Correia WD, et al. Clinical features of
JAK2V617F- or CALR-mutated essential thrombocythemia and primary myelofibrosis.
Blood Cells, Mol Dis. 2016;60:74-77. doi:10.1016/j.bcmd.2016.03.003.
115. Souza MC, Rodrigues CA, Silva MRR, et al. Application of five prognostic survival
scores to primary myelofibrosis in 62 Brazilian patients. Med Oncol. 2013;30(555):1-7.
doi:10.1007/s12032-013-0555-2.
116. Vilaine M, Olcaydu D, Harutyunyan A, Bergeman J, Tiab M. Homologous
recombination of wild-type JAK2 , a novel early step in the development of. Blood.
2011;118(24):6468-6470.
 95

117. Theocharides A, Boissinot M, Garand R, et al. Leukemic blasts in transformed JAK2-

V617F – positive myeloproliferative disorders are frequently negative for the JAK2-
V617F mutation. 2007;110(1):375-380. doi:10.1182/blood-2006-12-062125.The.
118. Tefferi A, Lasho TL, Huang J, et al. Low JAK2 V617F allele burden in primary
myelofibrosis , compared to either a higher allele burden or unmutated status , is
associated with inferior overall and leukemia-free survival. 2008;22:756-761.
doi:10.1038/sj.leu.2405097.
119. Bilbao-sieyro C, Florido Y, Gómez-casares MT. CALR mutation characterization in
myeloproliferative neoplasms. Oncotarget. 2016;7(33):7-10.
120. Tenedini E, Bernardis I, Artusi V, et al. Targeted cancer exome sequencing reveals
recurrent mutations in myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 2013;28(5):1-8.
doi:10.1038/leu.2013.302.
121. Vainchenker W, Constantinescu SN, Bernard OA, Roussy IG, Roussy IG. New
mutations and pathogenesis of myeloproliferative neoplasms. Blood. 2011;118(7):1-3.
doi:10.1182/blood-2011-02-292102.
122. Guglielmelli P, Rotunno G, Pacilli A, Vannucchi AM. What Do Molecular Tests Add to
Prognostic Stratification in MF: Is It Time to Add These to Our Clinical Practice? Curr
Hematol Malig Rep. 2015;10(4):380-387. doi:10.1007/s11899-015-0285-y.
123. Stanley ER, Berg KL, Einstein DB, et al. Biology and Action of Colony – Stimulating
Factor-1. Mol Reprod Dev. 1997;48:4-10.
124. Chitu V, Stanley ER. Colony-stimulating factor-1 in immunity and inflammation. Curr
Opin Immunol. 2006;18:39-48. doi:10.1016/j.coi.2005.11.006.
125. Chase A, Schultheis B, Kreil S, et al. Imatinib sensitivity as a consequence of a CSF1R-
Y571D mutation and CSF1 / CSF1R signaling abnormalities in the cell line GDM1.
2009:358-364. doi:10.1038/leu.2008.295.
126. Ridge SA, Worwood M, Osciert D, Jacobs A, Ann R. FMS mutations in myelodysplastic,
leukemic, and normal subjects. Proc Natl Acad Sci. 1990;87(February):1377-1380.
127. Durham BH, Lopez‑Rodrigo E, Abramson DH, Picarsic J. Activating Mutations in
CSF1R and Additional Receptor Tyrosine Kinases in Sporadic and Familial Histiocytic
Neoplasms. In: ASH Annual Meeting. ; 2018:2-5.
128. Abu-Duhier FM, Goodeve AC, Care RS, et al. Mutational analysis of class III receptor
tyrosine kinases (C-KIT, C-FMS, FLT3) in idiopathic myelofibrosis. Br J Haematol.
2003;120(3):464-470. doi:10.1046/j.1365-2141.2003.04108.x.
129. Duarte AJ, Ribeiro D, Moreira L. In Silico Analysis of Missense Mutations as a First
 96

Step in Functional Studies : Examples from Two Sphingolipidoses. Int J Mol Sci.
2018;19(3409):1-10. doi:10.3390/ijms19113409.
130. Fischer JA, Rossetti S, Sacchi N. CSF1R (colony stimulating factor 1 receptor, formerly
McDonough feline sarcoma viral (v-fms) oncogene homolog). Atlas Genet Cytogenet
Oncol Haematol. 2009;13(2):120-125. doi:10.4267/2042/44403.
131. De Paula Junior MR, Nonino A, Nascimento JM, et al. High Frequency of Copy-Neutral
Loss of Heterozygosity in Patients with Myelofibrosis. Cytogenet Genome Res.
2018;154(2):62-70. doi:10.1159/000487627.
132. Singh NR, Morris CM, Koleth M, Wong K, Ward CM, Stevenson WS. Polyploidy in
myelofibrosis: analysis by cytogenetic and SNP array indicates association with
advancing disease. Mol Cytogenet. 2013;6(1):59. doi:10.1186/1755-8166-6-59.
133. Lobry C, Oh P, Mansour MR, Thomas Look A, Aifantis I. Notch signaling: Switching
an oncogene to a tumor suppressor. Blood. 2014;123(16):2451-2459. doi:10.1182/blood-
2013-08-355818.
134. Vasmatzis G, Johnson SH, Knudson RA, et al. Genome-wide analysis reveals recurrent
structural abnormalities of TP63 and other p53-related genes in peripheral T-cell
lymphomas. Blood. 20192;120(11):2280-2290. doi:10.1182/blood-2012-03-
419937.The.
135. Abbate AL, Cunsolo C Lo, Macrì E, et al. FOXP1 and TP63 involvement in the
progression of myelodysplastic syndrome with 5q- and additional cytogenetic
abnormalities. BMC Cancer. 2014;14(396):1-6. doi:10.1186/1471-2407-14-396.
136. Tripodi J, Hoffman R, Najfeld V, Weinberg R. Frequency of heterozygous TET2
deletions in myeloproliferative neoplasms. Cancer Manag Res. 2010;2(1):219-223.
doi:10.2147/CMR.S12829.
137. Dyson NJ. RB1: A prototype tumor suppressor and an enigma. Genes Dev.
2016;30(13):1492-1502. doi:10.1101/gad.282145.116.
138. Ishak CA, Dick FA. Conditional haploinsufficiency of the retinoblastoma tumor
suppressor gene. Mol Cell Oncol. 2015;2(1):3-5. doi:10.4161/23723548.2014.968069.
139. Demory J, Dupriez B, Fenaux P, Lai JL, Beuscart Re. Cytogenetic Studies and their
prognostic siginificance in Agnogenic Myeloid Metaplasia: a report on 47 cases. Blood.
1988;72(3):855-859.
140. Sinclair EJ, Forrest EC, Reilly JT, Watmore AE, Potter AM. Fluorescence in situ
hybridization analysis of 25 cases of idiopathic myelofibrosis and two cases of secondary
myelofibrosis: Monoallelic loss of RB1, D13S319 and D13S25 loci associated with
 97

cytogenetic deletion and translocation involving 13q14. Br J Haematol.

2001;113(2):365-368. doi:10.1046/j.1365-2141.2001.02754.x.
141. Mehrotra M, Patel KP, Chen T, et al. Genomic and Clinicopathologic Features of
Primary Myelofibrosis With Isolated 13q Deletion. Clin Lymphoma, Myeloma Leuk.
2015;15(8):496-505. doi:10.1016/j.clml.2015.03.018.
142. Desangles F. -7/del(7q) in adults. Atlas Genet Cytogenet Oncol Haematol.
1999;3(3):139-140. doi:10.4267/2042/37535.
 98

8 APÊNDICE 1 - ARTIGO CIENTÍFICO

 99

Brazilian Journal of Medical and Biological Research (2019) 52(1): e7784, http://dx.doi.org/10.1590/1414-431X20187784
ISSN 1414-431X Research Article
1/7

CD47 expression is decreased in hematopoietic

progenitor cells in patients with myelofibrosis
A. Nonino1,2, J.M. Nascimento2,3, C.C. Mascarenhas1, J.F. Mazzeu3, R.W. Pereira1 and
R.H. Jacomo4
1
Programa de Pós-Graduac¸ão em Ciências Genômicas e Biotecnologia, Universidade Católica de Brasília, Brasília, DF, Brasil
2
Unidade de Hematologia e Hemoterapia, Hospital de Base do Distrito Federal, Brasília, DF, Brasil
3
Faculdade de Medicina, Universidade de Brasília, Brasília, DF, Brasil
4
Sabin Medicina Diagnóstica, Brasília, DF, Brasil

Abstract

Myelofibrosis (MF) is characterized by increased circulating hematopoietic progenitor cells (HPCs), abnormal cytokine levels,
and the survival advantage of neoplastic progenitors over their normal counterparts, which leads to progressive disappearance
of polyclonal hematopoiesis. CD47 is a surface glycoprotein with many functions, such as acting as a phagocytosis inhibitor of
the expressing cell, that is increased in normal hematopoietic stem and progenitor cells mobilized into the blood and several
human cancer-initiating cells, such as in acute myeloid leukemia. We compared CD47 expression in hematopoietic stem and
progenitor cells of patients with MF and controls and found it to be decreased in progenitors of MF. Exposure of control HPCs to
the cytokines transforming growth factor b and stromal-derived factor 1, which are important regulators of hematopoietic stem
cell cycling and are overexpressed in patients with MF, did not modulate CD47 expression.

Key words: Myeloproliferative disorders; Primary myelofibrosis; Hematopoietic stem cells; Neoplastic stem cells; Antigens;
CD47

Introduction
Myelofibrosis (MF) is a myeloproliferative neoplasm
(MPN) that can present as de novo (primary) MF (PMF)
or as MF after transformation of polycythemia vera (PV)
or essential thrombocythemia (ET). MF is characterized
by clonal hematopoiesis, bone marrow stromal changes,
and myeloid metaplasia, which cause debilitating symp-
toms, hepatosplenomegaly, ineffective hematopoiesis,
and increased risk of morbidity and mortality because
of bone marrow failure, thrombotic/hemorrhagic events,
and transformation to acute leukemia (1). Patients with
MF frequently present with blood showing a leucoerythro-
blastic picture and an increased number of circulating
hematopoietic progenitor cells (HPC) characterized by
the expression of CD34 antigen. The increased number
of CD34 cells can help distinguish between MF and
other MPNs (2).
MF is an inflammatory disease with elevated circulat-
ing levels of many cytokines and growth factors, such as
transforming growth factor b (TGF-b) and stromal-derived
factor 1 (SDF-1) (3–5). TGF-b has been associated with
the development of bone marrow fibrosis and is involved,
together with SDF-1, in the regulation of quiescence or
cycling of hematopoietic stem cells (HSCs) (6). The
abnormal expression of these two cytokines and their
receptors on MF HSCs can be associated with myelopro-
liferation and enhanced circulation of myeloid progenitors,
and could collaborate in the disappearance of polyclonal
HSCs (7).
More than 85% of patients with MF have a mutually
exclusive mutation in one of the following three genes:
JAK2 (60–65%), MPL (5%), or CAL-R (20–25%). All of
these mutations, which are called ‘‘driver’’ mutations,
activate the janus kinase-signal transducer and activator
of transcription (JAK-STAT) pathway. The type of driver
mutation may have prognostic impact (8,9). Independently
of the driver mutation, circulating CAL-R protein is
increased in patients with MF, it participates in the
inflammatory network, and correlates with the aggressive-
ness of the disease (10). CAL-R induces phagocytosis,
is overexpressed on the surface of many human cancer
cells, and its prophagocytic signaling is opposed by
CD47 (11).
The ubiquitous cell surface glycoprotein CD47 (integrin-
associated protein) is an important regulator of integrin

Correspondence: A. Nonino: <nonino@cettro.com.br>

Received May 18, 2018 | Accepted October 17, 2018

Braz J Med Biol Res | doi: 10.1590/1414-431X20187784


CD47 expression in myelofibrosis progenitor cells
function, but it also interacts with other proteins, such as
thrombospondins (TSP) and signal regulatory proteins
(SIRP). Depending on the type of cell or biological context,
ligation of CD47 may result in cell activation or apoptosis.
For instance, ligation of CD47 with TSP-1, a glycopro-
tein derived from megakaryocytes, which is increased in
MF and causes activation of TGF-b (12), can induce
proliferation of some cancer cells, such as astrocytoma
cells, but not of their normal counterparts (13).
By binding to SIRPa, CD47 can function as a marker of
self on host cells (14,15). In the macrophage, triggering of
phagocytosis of a target cell is based on the balance
between positive prophagocytic signals and inhibitory
CD47/SIRPa signaling. In hemophagocytic lymphohistio-
cytosis, a systemic inflammatory disorder characterized
by phagocytosis of HSCs, these target cells were found to
express reduced levels of CD47 (16).
CD47 is upregulated on circulating HSCs and on
several human hematologic and solid cancer-initiating
cells (17–19). This can be an advantageous mechanism
for neoplastic cells over their normal counterparts, which
allows the former to evade phagocytosis by cells of the
innate immune system. CD47 expression on leukemic
stem cells (LSCs) predicted worse overall survival of
patients with acute myeloid leukemia (AML) and anti-CD47
blocking monoclonal antibodies preferentially enabled
phagocytosis of AML leukemic HSCs (20).
The objective of this study was to compare the expres-
sion of CD47 antigen on the surface of HSCs, HPCs, and
lineage-committed cells from patients with MF and con-
trols. We also tested whether the expression of CD47
could be modulated in control CD34-positive cells when
exposed to the abnormal concentrations of TGF-b and
SDF-1 seen in patients with MF.
Material and Methods
Sample collection
The study was approved by Escola Superior de
Ciências da Saúde do Distrito Federal Research Ethics
Committee. Patients and controls were followed at
Hospital de Base do Distrito Federal, Brasilia, Brazil and
gave informed consent in accordance with the Declaration
of Helsinki (1975, revised in 2000). Peripheral blood
samples (n=8) were obtained from patients with MF
whose diagnosis had been established according to the
2008 World Health Organization criteria (21) and con-
firmed by 2016 criteria (22) and that presented with
increased circulating CD34-positive cells (more than
10 cells/mL). Control marrow cells (n=4) were obtained
from previously treated patients with acute promyelocytic
leukemia (APL) who were in complete hematologic
remission after the end of maintenance chemotherapy and
who had their bone marrow collected as part of routine
minimal residual disease monitoring. All controls were
found to be in molecular remission. Table 1 shows the
Braz J Med Biol Res | doi: 10.1590/1414-431X20187784
100
2/7
main epidemiologic and clinical characteristics of patients
and controls.
Driver mutation genotyping
All patients had their genotype for JAK-2, V617F, CAL-R,
or MPL mutation tested by multiplex ligation-dependent
probe amplification assay with P420-X2 MPN Mix-2 (MrC
Holland, Netherlands).
Cell separation and CD34 enrichment
Mononuclear cells (MNCs) were isolated by density
gradient centrifugation using Ficoll-Paque (GE Healthcare
Bio-Science AB, Sweden). The MNC fraction was then
enriched for CD34 cells using a CD34+ immunomagnetic
isolation kit (Miltenyi Biotec, USA) according to the
manufacturers’ instructions. After enrichment, a minimum
of 0.5 ! 106 control cells (median 0.84 ! 106 cells) and
1 !106 cells from patients with MF (median 1.8 !
106 cells) were obtained and taken for further assays.
CD34 purity for controls and patients with MF ranged from
29 to 68% (median 60%) and 48 to 92% (median 75%),
respectively.
Cryopreservation
After separation and CD34 enrichment, MNC cells
were either frozen in isopropanol and kept at " 80°C or
directly cultured in the presence of cytokines. Before flow
cytometry analysis, cryopreserved cells were thawed at
37°C and washed twice in phosphate-buffered saline
(PBS).
Control cell cultures
MNC CD34-enriched control cells were incubated at
approximately 5 ! 105 cells/mL in serum-free medium
(Stemline II; Sigma-Aldrich, USA), in the presence or
absence of TGF-b (5 ng/mL; Sigma-Aldrich) or SDF-1
(0.5 ng/mL; Life Technologies, USA) for 72 h at 5% CO2
at 37.5°C.
Flow cytometry
Multiparameter analysis of purified cells for surface
antigen expression was performed by incubating thawed
or cultured cells at room temperature for 15 minutes in
PBS/1% bovine serum albumin and washed twice before
flow cytometric analysis. The monoclonal antibodies were
anti-CD34 APC-Cy7 (clone 581; Biolegend, USA), anti-
CD38 V450 (clone HIT2; Exbio, Czech Republic), anti-
CD90 PE-Cy7 (clone 5E10; Biolegend), anti-CD47 PerCP
Cy5.5 (clone CC2C6; Biolegend), PerCP Cy5.5 isotype
(clone MOPC-21, Biolegend), and lineage cocktail FITC
against CD3, CD14, CD16, CD19, CD20, CD56 (Cat.
No.6K01-T050; Exbio). Flow cytometric analysis was
performed on a Beckton-Dickson FACS Canto II. A mini-
mum of 2400 events (median 16,500) for CD34 positive
cells were obtained in each sample.
 101

CD47 expression in myelofibrosis progenitor cells 3/7

Table 1. Main epidemiologic and clinical characteristics of myelofibrosis patients and controls.

Characteristics Myelofibrosis patients Controls

Age, median (range) 66 (38–85) 36.5 (22–56)

Gender (N)
Male 3 1
Female 5 3
Diagnosis (N)
PMF fibrotic phase 6 NA
PMF pre-fibrotic 1
Post-ET MF 1
Dynamic international prognosis system (N) NA
Low 2
Intermediate 1 4
Intermediate 2 2
High 0
Hemoglobin (g/dL), median (range) 13.3 (8.7–14.9) 14.6 (13.9–14.8)
Leukocytes (cells/mm3), median (range) 26,800 (8,060–103,000) 5,250 (4,980–5,370)
Circulating blasts (%), range 0–2 0
Circulating CD34+ cells (/mm3), median (range) 59.5 (11.2–476) NA
Platelets (cells/mm3), median (range) 254,000 (165,000–381,000) 196,500 (164,000–276,000)
Chemotherapy at time of sample collection (N)
None 6 NA
Hydroxyurea 2

MF: myelofibrosis; PMF: primary myelofibrosis; ET: essential thrombocythemia.

For CD47 expression analysis of non-cultured cells, we
defined different cell populations as follows: HSC (CD34+
CD38- CD90+Lin-), pluripotential progenitor cells (PPC)
(CD34+CD38-CD90-Lin-), lineage-committed progenitors
(LCP) (CD34+CD38+Lin-), and differentiated cells (DC)
(CD34-Lin+) of patients and controls. Figure 1 shows the
gating strategy. For every population, CD47 expression
intensity was calculated by subtracting its mean fluores-
cence intensity (MFI) from the isotype MFI.
Statistical analysis
Statistics were calculated using Prism 4.0 software
(GraphPad Software, USA). Comparison of CD47 expres-
sion between MF and control cells and between treated
versus non-treated control cells used the Welch-corrected
Student’s t-test. For comparison of expression of different
groups of cells from patients with MF or controls, one-way
analyses of variance (ANOVA) was used. Post hoc
analysis of ANOVA data included test for linear trend and
correction for multiple comparisons with Bonferroni test.
Two-tailed P values o0.05 were considered statistically
significant.
Results
CD47 expression was reduced in MF CD34-positive cells
We measured CD47 expression in control and MF
CD34-positive cells. The mean MFI of control cells was
higher than that of MF cells (20181±1520 vs 14961±
955, P=0.0302) (Figure 2).
When we analyzed each cell compartment, the expres-
sion of CD47 was significantly reduced in MF PPCs (CD34+
CD38-CD90-Lin-) and LCPs (CD34+CD38+Lin-) (P=0.048
and 0.028, respectively) (Figure 3).
CD47 expression in CD34+ cells increased with
cell differentiation
Figure 4 shows that there was a pattern of increasing
CD47 expression along with the differentiation of CD34+
cells from HSC and PPC to LCP, for both patients with MF
and controls (P values for linear trend between column
mean and left-to-right column order: o0.001 and o0.05,
respectively).
Driver mutation did not influence CD47 expression
in MF HSC
The distribution of patients according to driver muta-
tion was as follows: four patients were JAK-2 V617-
positive, two were CAL-R type 2 (insertion)-positive,
one was MPL 515L-positive, and one was triple negative.
We compared CD47 expression in JAK2 V617F-positive
and -negative patients and CAL-R-positive and -negative
patients. There was no significant difference between
these groups (P=0.843 for JAK2-positive or -negative and
P=0.359 for CAL-R-positive or -negative patients).

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 102

CD47 expression in myelofibrosis progenitor cells 4/7

Figure 1. Gating Strategy. LCP: lineage committed progenitors; PPC: pluripotential progenitor cells; HSC: hematopoietic stem cells.

Figure 2. CD47 expression in control vs myelofibrosis (MF) CD34-positive (pos) cells. A, Histogram of representative experiments;
B, Comparison of average mean fluorescence intensity (MFI). Data are reported as mean±SD; Welch-corrected Student’s t-test.
PMF: primary myelofibrosis.

No other specific feature of patients with MF was found Discussion

to influence CD47 expression, including CD34-positive
cell frequency in the peripheral blood or hydroxyurea
(HU) treatment (P=0.25 for HU vs non-treated). When
the two patients treated with HU were excluded from the
comparison with control cells, the difference between
patients with MF and controls kept its significance
(P=0.026).
Exposure to cytokines did not influence CD47
expression
We analyzed CD47 expression in control CD34-
positive and HSCs after 3-day culture in stem cell media
exposed to SDF-1 and TGF-b in concentrations similar to
those previously described for the serum of patients with
MF. These cytokines did not seem to modulate CD47
expression in these experimental conditions (Figure 5).
The progressive exhaustion of normal HSCs and
mobilization of HPCs to the peripheral blood are hallmarks
of MF. Since mobilized normal HSCs and LSCs of some
acute myeloid neoplasms show increased CD47 expres-
sion, we hypothesized that this could also be found in
progenitor cells from patients with MF.
In this study, we compared the expression of CD47 in
different hematopoietic populations from controls (obtained
from bone marrow) and patients with MF (obtained from
peripheral blood). We found that CD34-positive cells
derived from patients with MF have lower CD47 than their
normal sessile bone marrow counterparts.
One previous study (17) demonstrated that CD47 is
upregulated in AML and blastic phase CML, but not in
other myeloproliferative disorders, including PV, post-PV

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 103

CD47 expression in myelofibrosis progenitor cells 5/7

Figure 3. CD47 expression in different cell compartments of control vs myelofibrosis (MF) cells. A, Histograms of representative
experiments; B, Comparison of average mean fluorescence intensity (MFI) (Welch-corrected Student’s t-test). Data are reported
as mean±SD. HSC: hematopoietic stem cells; PPC: pluripotential progenitor cells; LCP: lineage committed progenitors; DC:
differentiated cells.

Figure 4. Comparison of CD47 expression among different CD34-positive cell compartments (ANOVA with Bonferroni post-test). Data
are reported as mean±SD. A, Patients with myelofibrosis; B, Controls; MFI: Mean fluorescence intensity; HSC: hematopoietic stem
cells; PPC: pluripotential progenitor cells; LCP: lineage committed progenitors; ns: non-significant.

Braz J Med Biol Res | doi: 10.1590/1414-431X20187784


CD47 expression in myelofibrosis progenitor cells
Figure 5. CD47 expression after exposure to SDF-1 and TGF-!. A, Comparison in CD34 positive cells and B, Hematopoietic stem cells
(Welch-corrected Student’s t-test). Data are reported as mean±SD. MFI: mean fluorescence intensity.
MF, ET, and PMF (n=5). Unlike that report, our study
tested CD47 expression not only in total CD34-positive
population, but also in different hierarchic hematopoietic
populations. We found that there was an increasing
pattern for CD47 expression as patients’ or controls’
HPCs matured to LPC and that patients with MF showed
comparatively decreased CD47 expression in PPC (CD34
pos, CD90neg, CD38neg, Lin neg) and LCP (CD34 pos,
CD90neg, CD38pos, Lin neg).
As HPCs from patients with MF and controls were
submitted in vivo to different microenvironment conditions,
we tested whether this difference could be due to
hematopoietic cell exposure to two of the most pathophys-
iological important cytokines found elevated in patients
with MF serum, SDF-1 and TGF-b. We showed that CD47
expression in control CD34-positive cells or HSCs was not
modulated by high concentrations of these cytokines after
72-h culture in stem cell media.
We currently do not know whether our findings have
any relevance to the pathophysiology of MF. CD47 is a
glycoprotein with multiple roles. Although one of its best
characterized functions is inhibiting phagocytosis by
macrophages, even this role can be modulated by different
protein interactions, as demonstrated in red blood cells
(RBC). CD47 can act as a molecular switch controll-
ing RBC phagocytosis because it undergoes structural
changes in aged erythrocytes, favoring binding to TSP-1,
which is a protein that is abundant in the bone marrow
stroma of MF (12). This interaction with TSP-1 changes the
‘‘don’t eat me’’ signal to a phagocytosis-inducing signal
(23). Also, despite the description of CD47 expression as
an advantageous feature for neoplastic cells, CD47 ligation
by monoclonal antibodies can induce apoptosis in many
tumor cell lines, such as chronic lymphocytic leukemia cells
(24), and binding of CD47 by TSP-1 has also been
described to induce cell apoptosis (14).
Our study has some possible limitations that deserve
comment. Cells from controls and patients with MF were
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104
6/7
from different sources because bone marrow aspiration
in patients with MF is usually unsuccessful. However,
considering previous results showing that resident bone
marrow HSCs express less CD47 than circulating cells, the
different sources of cells could underestimate the difference
between controls and MF cells. It could also be argued that
the CD34 cells from patients with MF do not represent
solely the neoplastic clone, but a mixture of normal and MF
cells. However, unlike other MPNs, the neoplastic clone is
predominant in MF hematopoiesis and, again, the admix-
ture of normal and malignant cells could underestimate
the difference, instead of causing it. Although the control
samples were obtained from previously treated APL
patients instead of healthy individuals, they were free of
cytotoxic treatment for more than 3 months, were proven
not to have minimal residual disease by polymerase chain
reaction, and had normal blood counts and, therefore,
normal hematopoiesis. Two of the 8 patients with MF were
receiving treatment with HU at the time of sample collec-
tion, but their average CD47 expression did not differ from
those without HU. Also, excluding these 2 patients from
the analysis did not affect our findings.
In conclusion, in our experimental conditions, HPCs
from patients with MF have reduced CD47 expression
compared to control cells. These findings suggest that
CD47-related inhibition of phagocytosis of neoplastic cells
by macrophages may not play a role in the survival advan-
tage of MF progenitors over their non-clonal counterpart,
although this has not been tested.
We believe our results may stimulate further investiga-
tion on the possible role of HPCs’ CD47-reduced expres-
sion on the pathogenesis of MF.
Acknowledgments
We thank Peter Fogarty, MA English 1st Class, from
Edanz Group (www.edanzediting.com/ac), for editing a
draft of this manuscript.

CD47 expression in myelofibrosis progenitor cells
References
1. Tefferi A. Myelofibrosis with myeloid metaplasia. N Engl J
Med 2000; 342: 1255–1265, doi: 10.1056/NEJM200004273
421706.
2. Orvain C, Luque Paz D, Dobo I, Cottin L, Le Calvez G,
Chauveau A, et al. Circulating Cd34+ cell count differenti-
ates primary myelofibrosis from other Philadelphia-negative
myeloproliferative neoplasms: a pragmatic study. Ann
Hematol 2016; 95: 1819–1823, doi: 10.1007/s00277-016-
2784-x.
3. Rameshwar P, Chang VT, Thacker UF, Gascón P. Systemic
transforming growth factor-beta in patients with bone marrow
fibrosis--pathophysiological implications. Am J Hematol 1998;
59: 133–142, doi: 10.1002/(SICI)1096-8652(199810)59:
2o133::AID-AJH643.0.CO;2-Z.
4. Le Bousse-Kerdilès MC, Chevillard S, Charpentier A,
Romquin N, Clay D, Smadja-Joffe F, et al. Differential
expression of transforming growth factor-beta, basic fibro-
blast growth factor, and their receptors in CD34+ hemato-
poietic progenitor cells from patients with myelofibrosis and
myeloid metaplasia. Blood 1996; 88: 4534–4546.
5. Migliaccio AR, Martelli F, Verrucci M, Migliaccio G, Vannuc-
chi AM, Ni H, et al. Altered SDF-1/CXCR4 axis in patients
with primary myelofibrosis and in the Gata1low mouse
model of the disease. Exp Hematol 2008; 36: 158–171,
doi: 10.1016/j.exphem.2007.10.001.
6. Chabanon A, Desterke C, Rodenburger E, Clay D, Guerton
B, Boutin L, et al. A cross-talk between stromal cell-derived
factor-1 and transforming growth factor-beta controls the
quiescence/cycling switch of CD34(+) progenitors through
FoxO3 and mammalian target of rapamycin. Stem Cells
2008; 26: 3150–3161, doi: 10.1634/stemcells.2008-0219.
7. James C, Mazurier F, Dupont S, Chaligne R, Lamrissi-
Garcia I, Tulliez M, et al. The hematopoietic stem cell
compartment of JAK2V617F-positive myeloproliferative dis-
orders is a reflection of disease heterogeneity. Blood 2008;
112: 2429–2438, doi: 10.1182/blood-2008-02-137877.
8. Tefferi A, Lasho TL, Finke CM, Knudson RA, Ketterling R,
Hanson CH, et al. CALR vs JAK2 vs MPL-mutated or triple-
negative myelofibrosis: clinical, cytogenetic and molecular
comparisons. Leukemia 2014; 28: 1472–1477, doi: 10.1038/
leu.2014.3.
9. Rumi E, Pietra D, Pascutto C, Guglielmelli P, Martínez-Trillos
A, Casetti I, et al. Clinical effect of driver mutations of JAK2,
CALR, or MPL in primary myelofibrosis. Blood 2014; 124:
1062–1069, doi: 10.1182/blood-2014-05-578435.
10. Sollazzo D, Forte D, Polverelli N, Perricone M, Romano M,
Luatti S, et al. Circulating calreticulin is increased in
myelofibrosis: Correlation with interleukin-6 plasma levels,
bone marrow fibrosis, and splenomegaly. Mediators Inflamm
2016; 2016: 5860657, doi: 10.1155/2016/5860657.
11. Chao MP, Jaiswal S, Weissman-Tsukamoto R, Alizadeh AA,
Gentles AJ, Volkmer J, et al. Calreticulin is the dominant pro-
phagocytic signal on multiple human cancers and is counter-
balanced by CD47. Sci Transl Med 2010; 2: 63ra94,
doi: 10.1126/scitranslmed.3001375.
12. Muth M, Engelhardt BM, Kröger N, Hussein K, Schlué J,
Büsche G, et al. Thrombospondin-1 (TSP-1) in primary
myelofibrosis (PMF) - A megakaryocyte-derived biomarker
Braz J Med Biol Res | doi: 10.1590/1414-431X20187784
105
7/7
which largely discriminates PMF from essential thrombocy-
themia. Ann Hematol 2011; 90: 33–40, doi: 10.1007/s00277-
010-1024-z.
13. Sick E, Boukhari A, Deramaudt T, Rondé P, Bucher B, André
P, et al. Activation of CD47 receptors causes proliferation of
human astrocytoma but not normal astrocytes via an Akt-
dependent pathway. Glia 2011; 59: 308–319, doi: 10.1002/
glia.21102.
14. Oldenborg PA. CD47: a cell surface glycoprotein which
regulates multiple functions of hematopoietic cells in health
and disease. ISRN Hematol 2013; 2013: 614619, doi:
10.1155/2013/614619.
15. Oldenborg PA, Zheleznyak A, Fang YF, Lagenaur CF,
Gresham HD, Lindberg FP. Role of CD47 as a marker of
self on red blood cells. Science 2000; 288: 2051–2054,
doi: 10.1126/science.288.5473.2051.
16. Kuriyama T, Takenaka K, Kohno K, Yamauchi T, Daitoku S,
Dc W, et al. Engulfment of hematopoietic stem cells caused
by down-regulation of CD47 is critical in the pathogenesis of
hemophagocytic lymphohistiocytosis Engulfment of hema-
topoietic stem cells caused by down-regulation of CD47 is
critical in the pathogenesis of hemo. Blood 2012; 120: 4058–
4067, doi: 10.1182/blood-2012-02-408864.
17. Jaiswal S, Jamieson CHM, Pang WW, Park CY, Chao MP,
Majeti R, et al. CD47 is upregulated on circulating hema-
topoietic stem cells and leukemia cells to avoid phagocytosis.
Cell 2009; 138: 271–285, doi: 10.1016/j.cell.2009.05.046.
18. Jiang H, Fu R, Wang H, Li L, Liu H, Shao Z. CD47 is
expressed abnormally on hematopoietic cells in myelodys-
plastic syndrome. Leuk Res 2013; 37: 907–910, doi: 10.1016/
j.leukres.2013.04.008.
19. Chan KS, Espinosa I, Chao M, Wong D, Ailles L, Diehn M,
et al. Identification, molecular characterization, clinical
prognosis, and therapeutic targeting of human bladder
tumor-initiating cells. Proc Natl Acad Sci USA 2009; 106:
14016–14021, doi: 10.1073/pnas.0906549106.
20. Majeti R, Chao MP, Alizadeh AA, Pang WW, Jaiswal S, Gibbs
KD, et al. CD47 Is an adverse prognostic factor and thera-
peutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem
cells. Cell 2009; 138: 286–299, doi: 10.1016/j.cell.2009.05.045.
21. Vardiman J, Thiele J, Arber DA, Brunning RD, Borowitz MJ,
Porwit A, et al. The 2008 revision of the WHO classification
of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale and
important changes. Blood 2009; 114: 937–952, doi: 10.1182/
blood-2009-03-209262.
22. Barbui T, Thiele J, Gisslinger H, Finazzi G, Vannucchi AM,
Tefferi A. The 2016 revision of WHO classification of myelo-
proliferative neoplasms: clinical and molecular advances.
Blood Rev 2016; 30: 453–459, doi: 10.1016/j.blre.2016.
06.001.
23. Burger P, Hilarius-Stokman P, de Korte D, van den Berg TK,
van Bruggen R, Dc W. CD47 functions as a molecular switch
for erythrocyte phagocytosis. Blood 2012; 119: 5512–5521,
doi: 10.1182/blood-2011-10-386805.
24. Mateo V, Lagneaux L, Bron D, Biron G, Armant M, Delespesse
G, et al. CD47 ligation induces caspase-independent cell
death in chronic lymphocytic leukemia. Nat Med 1999; 5:
1277–1284, doi: 10.1038/15233.
 106

9 APÊNDICE 2 – RESULTADOS INDIVIDUAIS DOS PACIENTES COM MF

ID MF01

Dados Clínicos Masc., 66a; MF pós TE; IPSS=1

Driver CMA e/ou

JAK2 V617F
PCR

NGS não realizado

4p15.32p15.1(17,707,300-30,328,979)hmz
5q35.1q35.3(171,766,824-180,692,321) hmz
9p24.3p13.3(216,123-34,431,079)hmz
CMA
12q22q23.2(95,963,706-102,978,696) hmz
19p13.3p13.12(260,911-14,742,924)hmz
22q11.1q11.22(16,888,899-23,275,341) hmz

Sobrevida Vivo após 43,8m

ID MF02

Dados Clínicos Fem., 84a; MFP; IPSS=3

Driver CMA e/ou

JAK2 V617F
PCR

Gene Mutação VAF

JAK2 V617F 0,03
SRSF2 P95L 0,44
ASXL1 G704R 0,45
NGS GNAS R186H 0,04
DNMT3A D97fs,D286fs 0,45

TET2 K1142X e Y1579X 0,43

CUX1 E628X e E617X 0,38

1q24.2q25.2(170,365,327-176,346,512) hmz
1q41q42.13(222,161,988-229,516,511) hmz
4q28.3q34.3(133,645,289-179,928,406)hmz
12q13.2q24.33(56,002,232-133,778,166)hmz
CMA
17q21.2q24.3(39,624,325-69,311,217)hmz
17p12p11.1(13,675,000-22,217,883) hmz
17q11.1q12(25,309,336-36,049,552)hmz
Xq21.33q23(97,629,749-111,888,527) hmz

Sobrevida Óbito após 14m

ID MF03

Dados Clínicos Fem. 43 anos; MFP; IPSS=1

Driver CMA e/ou

Nenhuma
PCR

Gene Mutação VAF

A382fs e E405fs (Type
CALR 0,37
NGS 2-like)
SH2B3 S213R 0,65
NOTCH1 R938Q 0,49

CMA não realizado

Sobrevida viva após 53m

ID MF04

Dados Clínicos Fem., 43a; MFP; IPSS=0

Driver CMA e/ou

JAK2 V617F
PCR

Gene Mutação VAF

NGS JAK2 V617F 45
KMT2C/MLL3 Y987X 0,11

CMA 6p21.2p12.3(39811566_47318885) hmz;

Sobrevida viva após 96m

ID MF05
 107

Dados Clínicos Fem., 61a; MFP; IPSS=1

Driver CMA e/ou

CALR tipo 1
PCR

Gene Mutação VAF

CALR type 1 0,49
NGS
TET2 E368X 0,48
DNMT3A R882H 0,59
CMA 8

Sobrevida Óbito após 91m;

ID MF06

Dados Clínicos Fem., 46a; MFP; IPSS=1

Driver CMA e/ou

nenhuma
PCR

Gene Mutação VAF

CALR type 1-like 0,40
NGS SH2B3 S213R 0,44

DNMT3A 855_856insAGTACGAG 0,02

1p35.2p34.2(30,478,995-43,548,398)hmz
9q33.1q33.2(117,808,079-124,657,456) hmz
CMA 11q23.3q24.3(120,972,517-128,650,029) hmz
13q14.13q14.2(46,722,034-49,139,504)x1
Xq22.1q22.3(99,700,785-106,311,924) hmz

Sobrevida Viva após 107m;

ID MF07

Dados Clínicos Fem., 62a; MFP; IPSS=2

Driver CMA e/ou

MPL W515
PCR

NGS Não realizado

1p22.3p13.1(86,010,458-116,805,160)hmz
11p15.5p12(372,355-41,907,116)hmzmos
12q24.31(122,161,101-122,266,479)x1;
CMA
13q13.1q21.33(33,571,752-69,638,023)x1;
14q12(27,970,825-29,004,858)x3
19q13.33(49,274,808-49,513,502)x1;

Sobrevida Viva após 48 meses

ID MF08

Dados Clínicos Fem., 48a; MFP; IPSS não calculado

Driver CMA e/ou

CALR tipo 1
PCR
Gene Mutação VAF
CALR type 1 0,35
NGS CHEK2 R16G 0,44
ASXL1 Y591X 0,35
EZH2 R684C 0,30
3p26.2p24.3(3,807,650-22,204,563) hmz
7p22.3p22.1(861,359-5,499,980)x1
7p14.1p11.2(38,652,686-56,755,583)x1
7q22.3q31.2(107,395,740-116,562,288)x1
7q22.1q22.3(101,428,262-105,113,953)x1
CMA 7q31.32q32.1(122,748,812-127,779,114)x1
12p13.2p12.3(12,109,324-18,729,898)x1
12q21.2(76,448,583-80,275,907)x1
12q21.31q22(81,467,393-95,908,234)x1
18q11.2q12.1(24,767,485-32,456,354) hmz
20q13.13q13.2(47,848,257-53,158,589)x1

Sobrevida Falecida após 147m;

ID MF09

Dados Clínicos Masc., 68a; MFP; IPSS não calculado

 108

Driver CMA e/ou

CALR tipo 1
PCR

NGS não realizado

CMA 11q24.1q25(121,768,985-132,498,284)hmz

Sobrevida Falecido após 94m

ID MF10

Dados Clínicos Masc., 59a; MFP; IPSS+3

Driver CMA e/ou

MPL
PCR
MPL W515L 0,47
TET2 P1723S, Y867H 0,47
NGS
SRSF2 P95L 0,39
FLT3 D324N 0,45

1p36.33p21.1(849,466-96,290,550)hmzmos
CMA 3q13.31q29(114,957,134-
197,831,255)hmzmos

Sobrevida Falecido após 36m

ID MF12

Dados Clínicos Fem., 47a; MFP; IPSS=1

Driver CMA e/ou

nenhuma
PCR

ASXL1 G660insGRGSS 0.065

DNMT3A R882H 0,64
NGS
NF1 R1870L 0.059
CUX1 Q528H 0.045

1p12p11.2(120,553,551-120,624,056)x1
CMA
Xq13.1q21.1(70,848,162-77,290,593) hmz

Sobrevida Falecida após 118m;

ID MF13

Dados Clínicos Fem., 58a; MFP; IPSS não calculado

Driver CMA e/ou

CALR tipo 1
PCR

NGS não realizado

CMA normal

Sobrevida Viva após 123m;

ID MF14

Dados Clínicos Masc., 81a; MFP; IPSS=3

Driver CMA e/ou

JAK2 V617F
PCR

NGS não realizado

CMA normal

Sobrevida Falecido após 39m;

ID MF15

Dados Clínicos Masc., 50a; MFP; IPSS não calculado

Driver CMA e/ou

JAK2 V617F
PCR

JAK2 V617F 0,96

NGS
TET2 P1723S, Y867H 0,49
9p24.3p13.2(216123_36767970) hmz
1p31.1p22.2(82930924_89775908) hmz
CMA
16q21q22.2(65905022_72210865) hmz
1p13.3p13.2(107773687_113755018) hmz

Sobrevida Vivo após 51m

 109

ID MF16

Dados Clínicos Fem., 67a; MF pós TE; IPSS=1

Driver CMA e/ou

CALR tipo 2
PCR
Gene Mutação VAF
CALR tipo 2 0.36
EZH2 R684C 0,36
ASXL1 G642fs 0.41
NGS
CSF1R G413A 0.50
FLT3 D324N 0.36
PDGFRa S947R 0,36
KMT2C/MLL3 Y987X 0.41
CMA normal

Sobrevida Viva após 51m;

ID MF17

Dados Clínicos Masc., 66a; MFP; IPSS=2

Driver CMA e/ou

JAK2 V617F
PCR

Gene Mutação VAF

JAK2 V617F 0.36
NGS SF3B1 K700E 0,36

CREBBP Q1453K, Q1491K 0.50

CMA 13q13.2q14.3(34362403_53378532)x1-2,

Sobrevida Óbito após 30m;

ID MF18

Dados Clínicos Fem., 73a; MFP; IPSS=3

Driver CMA e/ou

JAK2 V617F
PCR

Gene Mutação VAF

NGS JAK2 V617F 0,73
TET2 T1070fs, Y1255X 0,35
CMA 9p24.3p21.1(216123_30661612) hmz

Sobrevida Viva após 93m

ID MF19

Dados Clínicos Masc., 59a; MF pré-F; IPSS=1

Driver CMA e/ou

JAK2 V617F
PCR

Gene Mutação VAF

JAK2 V617F 0,70
NGS
ASXL1 Q1315X 0,48
SRSF2 P95H 0,46

IDH2 R10Q, R88Q, R140Q 0,45

PTPN11 G503R 96
CSF1R V279M 0,48
3q28(189048804_190139329)x1
CMA
20q11.21q11.23(29510306_34971869) hmz,

Sobrevida Óbito após 19m;

ID MF20

Dados Clínicos Masc., 82a; MFP; IPSS=1

Driver CMA e/ou

JAK2 V617F
PCR
 110

Gene Mutação VAF

JAK2 V617F 0,54
NGS
SF3B1 K700E 0,42
CSF1R G413A 0.51

9p24.3q13(208,454-68,234,097)x3
CMA 18p11.32p11.21(136,227-15,170,636)x1
Xq21.33q22.2(97,970,490-103,210,146) hmz

Sobrevida Óbito após 43m;

ID MF21

Dados Clínicos Masc., 37a; MFP; IPSS=0

Driver CMA e/ou

CALR tipo 2
PCR

NGS Não realizado

CMA Normal

Sobrevida Vivo após 32m;

ID MF22

Dados Clínicos Masc., 69a; MFP; IPSS=4

Driver CMA e/ou

JAK2 V617F
PCR

Gene Mutação VAF

JAK2 V617F 0,72
ASXL1 H630fs 0,39
NGS EZH2 P522S 0,19
NRAS G12D 0,22
PTPN11 N308D 0,20
RB1 G310E 0,41

2p13.1p11.2(74,139,628-89,129,064)hmz
6q22.31q23.2(122,165,276-134,129,708)hmz
CMA
7q31.32q36.3(122,153,555-155,964,676)hmz
11p14.3p13(24,549,526-35,437,736)hmz

Sobrevida Óbito após 7m;

ID MF23

Dados Clínicos Fen., 48a; MF pré-F; IPSS=0

Driver CMA e/ou

CALR TIPO 1
PCR

Gene Mutação VAF

NGS
CALR type 1 0,32

1p33p31.1(47,858,053-69,907,944)hmz
2p13.2q13(71,835,787-113,889,134)hmz
3p13q22.1(72,568,037-131,849,410)hmz
6p22.3p12.3(15,735,087-49,880,005)hmz
7q21.11q22.1(83,470,313-103,219,027)hmz
9q33.1q33.2(120,027,912-125,306,402) hmz
CMA 10q25.1q26.13(107,670,340-124,523,169)hmz
11q12.1q13.5(56,930,833-76,123,829)hmz
11p11.2p11.12(46,304,337-51,563,636) hmz
15q14q21.3(39,625,545-57,874,494)hmz
16p13.2p13.11(9,182,576-16,159,628) hmz ???
Xp11.3p11.1(43,815,818-58,337,890) hmz
Xp21.1p11.4(34,218,865-40,790,309) hmz

Sobrevida Viva após 30m;

ID MF24

Dados Clínicos Masc., 35a; MFP; IPSS=0

Driver CMA e/ou

CALR TIPO 1
PCR
Gene Mutação VAF
NGS CALR type 1 0,48
DNMT3A R882H 0,16
 111

ATM H1802Q 0,13

CMA normal

Sobrevida Viva após 25m;

ID MF25

Dados Clínicos Masc., 56a; MFP; IPSS=0

Driver CMA e/ou

JAK2 V617F
PCR

Gene Mutação VAF

JAK2 V617F 0,89
NGS
ASXL1 P808fs 0,41
SF3B1 K666N 0,45

CMA 9p24.3p21.1(216123_30661612) hmz

Sobrevida Viva após 181m;

ID MF27

Dados Clínicos Masc., 62a; MFP; IPSS=3

Driver CMA e/ou

JAK2 V617F
PCR

NGS Não realizado

7q11.22q32.3(71110232_131244778)x1-2,
CMA
9p24.1p21.1(7923327_30334612) hmz

Sobrevida Óbito após 11m

ID MF28

Dados Clínicos Fem., 52a; MFP; IPSS=3

Driver CMA e/ou

JAK2 V617F
PCR

Gene Mutação VAF

JAK2 V617F 15
NGS U2AF1 M160delinsYEM 0,41
SH2B3 A125fs 0,79
RUNX1 M18R 0,07

6q23.2q23.3(134,130,889-136,907,587)1-2;
CMA
12q21.31q24.33(82919863_133777562) hmz

Sobrevida Viva após 51m;

ID MF29

Dados Clínicos Masc., 56a; MFP; IPSS=0

Driver CMA e/ou

JAK2 V617F
PCR

Gene Mutação VAF

JAK2 V617F 0.24
SF3B1 K700E e K666R 0,28
NGS
NF1 R440fs 0,10
GLI1 S258R 0,45
NOTCH2 P6fs 0,16

CMA Não realizado

Sobrevida Óbito após 22m;

ID MF30

Dados Clínicos Masc., 59a; MFP; IPSS=3

Driver CMA e/ou

CALR tipo 2
PCR

Gene Mutação VAF

NGS CALR type 2 399
TP53 C242F 0,27
 112

PPM1D V98M 0,51

DNMT3A E30A 0,43

4q28.3q31.3(137,982,758-153,732,214) hmz,
17p13.3p13.1(2,245,751-7,158,485)x1-2
5q15q31.2(94,322,981-139,358,626)x1-2,
6p25.3p24.3(157070_7870497)x1-2
6p21.31p12(34354382_66744310)x1-2
6q27(168,336,561-168,611,331)x3,
CMA 11p11.2(44,309,726-44,935,085)x3,
11p11.2(46,838,250- 47,071,043)x3,
13q13.1q21.32(32877758_67527643)X1-2
11q24.2q25(125921329_134937416)x2-3
13q11q12.2(19436286_27848790)x2-3
18q12.1q23(30,110,073-78,013,728)x1-2,
18p11.32p11.21(136,227-14,093,049)x1-2

Sobrevida Óbito após 4m;

ID MF31

Dados Clínicos Masc., 72a; MFP; IPSS=1

Driver CMA e/ou

CALR tipo 1
PCR

Gene Mutação VAF

CALR type 1 0,36
NGS TET2 S145N 0,44
NFE2 Y97X 0,03
KM2TC Q384E 0,09

CMA Não realizado

Sobrevida Óbito após 3m;

ID MF32

Dados Clínicos Masc., 73a; MFP; IPSS=3

Driver CMA e/ou

JAK2 V617F
PCR

Gene Mutação VAF

JAK2 V617F 0.92
NGS
TET2 F1372fs 0,47
ATM P604S 0,47

CMA 9p24.3p24.1(216123_6502279) hmz

Sobrevida Óbito após 4m;

ID MF33

Dados Clínicos Masc., 66a; MFP; IPSS=2

Driver CMA e/ou

CALR tipo 1
PCR

Gene Mutação VAF

NGS
CALR type 1 0,36

CMA 20q11.23q13.2(35,525,521-52,555,927)x1

Sobrevida Vivo após 27m;

ID MF34

Dados Clínicos Masc., 60a; MF pré-F; IPSS=1

Driver CMA e/ou

JAK2 V617F
PCR

Gene Mutação VAF

JAK2 V617F 0,36
DNMT3A Y719C, Y908C 383
NGS CSF2RB V59M 0,44
CREBBP G98V 0,48
ATM W156X, Y2080C 0,24
ARID2 V1649L 0,44
 113

CMA 4q24(105495445_106428401)x1

Sobrevida Vivo após 24m;

ID MF35

Dados Clínicos Fem., 54a; MFP; IPSS=3

Driver CMA e/ou

Nenhuma
PCR

NGS normal

Xp21.1p11.1(36681553_58227320) hmz
3q11.1q13.31(93558925_113577241) hmz
3p13p11.1(70516420_90485635) hmz
1q24.2q31.1(168752297-188155305) hmz
Xp22.2p21.3(12367433_28727874) hmz
15q25.2q26.2(82394360_97308588) hmz
CMA
8q22.1q22.3(93511761_103035545) hmz
22q11.21q12.1(19831757_27452743) hmz
9q21.2q21.32(79232202_86575594) hmz
9p23p22.1(12907792_19454906) hmz
Xq23(109050017_115067534) hmz
18p11.22p11.21(10039132_15079294) hmz;

Sobrevida Óbito após 4m;

ID MF36

Dados Clínicos Fem., 69a; MF pós-PV; IPSS=3

Driver CMA e/ou

JAK2 V617F
PCR
Gene Mutação VAF
JAK2 V617F 0,66
SH2B3 L438R 0,04
NGS
NRAS Y157fs 488
PPM1D Y408fs 0,07
SF3B1 K733Q 0,07

CMA 9p24.3p21.1(216123_28215883) hmz

Sobrevida Falecida após 3m

ID MF51

Dados Clínicos Masc., 71a; MFPIPSS=4

Driver CMA e/ou

JAK2 V617F
PCR

NGS Não realizado

7p22.3p15.3 (50,943-24,974,375) hmz

1q42.3q44 (234,740,879-249,198,164)hmz
2p12p11.2 (79,121,548-87,053,152)hmz
CMA
10p15.3p14 (135,330-7,475,945) hmz
2q11.1q11.2 (95,550,957-101,844,015)hmz
13q14.3q21.2 (54,383,476-59,824,028) hmz

Sobrevida Vivo após 21m;

ID MF52

Dados Clínicos Fem., 71a; MFP; IPSS=2

Driver CMA e/ou

JAK2 V617F
PCR

NGS Não realizado

 114

+21 (mosaico)
Xp22.31p11.4(7,951,091-37,806,422) hmz
1p36.12p34.1(20,745,484-46,602,294) hmz
5q13.2q15(70,688,401-95,373,029) hmz
1q24.2q31.1(167,513,158-190,595,906) hmz
3q26.1q26.33(161,478,714-181,637,333) hmz
11q12.1q13.3(56,694,717-69,935,447) hmz
4q31.1q31.3(141,107,903-154,118,168) hmz
4p15.2p14(24,026,197-36,594,816) hmz
CMA
5q11.2q13.2(57,244,231-68,826,246) hmz
17p13.3p12(18,900-10,899,108) hmz
8q24.21q24.23(129,807,800-139,253,064) hmz
6p25.3p24.3(203,877-9,394,888) hmz
17q11.1q12(25,309,336-33,152,705) hmz
17p12p11.2(15,010,225-22,170,994) hmz
7q34q35(138,494,644-145,018,143) hmz
12q24.32q24.33(128,634,798-133,777,562)
hmz

Sobrevida Vivo após 53m;

115