AULA1 BiolPrat

Aula 1
BIOLOGIA
Botânica - Práticas
2012/2013
Departamento de Biologia Vegetal
Francisco Carrapiço e Isabel Caçador
http://azolla.fc.ul.pt/aulas/BiologiaBotanica.html
Biologia (Botânica) Práticas Ano lectivo 2012/13
Normas de segurança no laboratório
 O laboratório é um local de trabalho a que está associado a manipulação de

equipamentos científicos e produtos químicos que, se indevidamente manipulados,
podem conter riscos para a saúde e mesmo em casos extremos pôr em causa a
própria vida.
 Usar sempre bata. Esta deve ser de algodão, evitando o uso de fibras sintéticas.
 Prender os cabelos com um elástico quando estes são compridos.
 Usar calçado adequado. Evitar o uso de calçado aberto que exponha o pé.
 Não beber ou comer no seu interior, incluindo mascar pastilhas elásticas.
 Usar material de vidro que não esteja danificado para evitar cortes ou ferimentos.
 Manter limpa a sua área de trabalho e separar o lixo produzido, utilizando os

recipientes existentes para o efeito.
 Lavar as mãos antes e depois de utilizar os reagentes e ou em experiências a

efectuar.
 Não abandonar o local de trabalho sem deixar tudo devidamente arrumado, não
esquecendo de desligar os equipamentos que foram utilizados.
 Saber onde está o equipamento de primeiros socorros.
 Em caso de acidente, procurar ajuda rapidamente junto do professor.

Microscópio óptico
1665
cutícula
http://microscopy.fsu.edu/primer/museum/hooke.html
Pé ou base
Braço
Tubo ou canhão
Parte Mecânica Platina ou porta objectos
Revólver ou porta-objectivas
Parafuso macrométrico
Parafuso micrométrico
Fonte Luminosa
Sistema de Iluminação
Condensador
Parte Óptica
Objectivas
Sistema de Ampliação
Oculares
Ano lectivo 2012/13
Biologia (Botânica) Práticas
Ampliação obtida pelos microscópios ópticos e electrónicos. Os microscópios ópticos incluem contraste
de fase e fluorescência. O ME inclui a transmissão (TEM) e varrimento (SEM)
Quadro comparativo da microscopia óptica e electrónica
Adaptado de Figueiredo, A.C. et al., 1996

Ano lectivo 2012/13
Abertura numérica da objectiva e limite de resolução
Abertura numérica da objectiva

NA= n(sin µ)
Fórmula de Abbe
Limite de resolução
ε=0,6λ/n(sin µ)
n= índice de refracção do meio entre a lente frontal da objectiva e a lamela

Ar= 1,00; óleo de imersão= 1,51
µ= metade da abertura angular, ie, semi-ângulo com vértice no cone formado pelos raios que,
saindo da preparação, atingem a lente frontal da objectiva
λ= comprimento de onda
O limite de resolução é definido como sendo a distância mínima existente entre

dois pontos de modo a ser ainda possível distingui-los como entidades separadas.
Depende do comprimento de onda da luz utilizada e da abertura numérica, e é dado
pela fórmula de Abbe.
Microscopia de contraste de fase
Microscopia de contraste de
Interferência (DIC) ou Nomarski
Microscopia de fluorescência
Principle of Fluorescence
1. Energy is absorbed by the atom which
becomes excited.
2. The electron jumps to a higher energy level.
3. Soon, the electron drops back to the ground
state, emitting a photon (or a packet of light) -
the atom is fluorescing.
Ano lectivo 2012/13
Micrografias ou fotografias de microscopia electrónica
Chlamydomonas – alga verde (Phylum Chlorophyta) Estruturas duma folha de angiospérmica observadas
Observada em MO e TEM em TEM e SEM
Unidades de medida utilizadas em microscopia
Unidade Símbolo Factor de

conversão
milímetro mm 1 mm = 1000 µm
ou 0,001 m
micrómetro µm 1 µm = 1000 nm
nanómetro nm 1 nm = 10 Å
Ångström Å 1 Å = 0,1 nm
ou 10-10 m
Como saber o valor final da ampliação da imagem do objecto em estudo?
Ampliação final = ampliação da ocular x ampliação da objectiva
exemplo: 10 x 40 = 400x
Preparações microscópicas temporárias e definitivas
Preparação definitiva- preparação efectuada mediante um processo em que o

material é submetido a um tratamento (fixação, desidratação , inclusão, microtomia)
que o torna não alterável.
Preparação temporária- preparação efectuada na altura e que se destina a uma
observação rápida, após o que, o material se altera. (Sevinate-Pinto, I. & Antunes, T., 2005)
Uma preparação microscópica é constituída por:
 Objecto ou material biológico. lamela

 Lâmina de vidro, onde é colocado o material a
observar.
 Lamela, igualmente de vidro, mas muito mais fina
que a lâmina e que se coloca sobre o material a lâmina
observar.
 Meio de montagem, líquido que pode ser incolor
ou não e que é colocado entre a lâmina e a
lamela e que embebe o material a observar. Um material biológico
exemplo de meio de montagem é a água ou a no meio de montagem
solução de Ringer.
Cuidados a ter na utilização do microscópio óptico
1. Começar a focagem sempre com a objectiva de menor ampliação.
2. Manter o microscópio numa posição confortável para que o utilizador possa

observar, e simultâneamente desenhar, o objecto que está a observar.
3. Após a utilização da objectiva de imersão, limpar convenientemente a lente

frontal da objectiva.
4. No caso de se tratar duma preparação temporária, retirá-la do microscópio e

separar a lamela da lâmina, colocando-as nos recipientes de lavagem.
5. Quando der por terminada a sua observação deixar no enfiamento do tubo a

objectiva de menor ampliação. Desligar a fonte luminosa e tapar o microscópio.
Técnica para efectuar uma preparação temporária
1. Colocar sobre uma lâmina de vidro uma gota de água (meio de montagem).
2. Fazer uma secção tranversal de um caule ou destacar uma epiderme do
material que lhe for fornecido e colocar esse material sobre a gota de água.
3. Com cuidado, para não se formarem bolhas de ar, colocar a lamela e observar
ao microscópio. As impressões digitais, quer na lâmina quer na lamela, devem
ser evitadas.
(Adaptado de Sevinate-Pinto, I. & Antunes, T., 2005)

Como proceder para focar com a objectiva de imersão
 Colocar a preparação na platina do microscópio

e ligar a fonte luminosa.
 Colocar no alinhamento do tubo a objectiva de

menor ampliação.
 Obter uma imagem nítida rodando o parafuso

macrométrico.
 Ajustar com o parafuso micrométrico.
 Rodar as objectivas até à da ampliação de 40x

e focar.
 Rodar a objectiva de 40x e colocar o revólver

na posição intermédia entre a objectiva de 40x e
100x
Efeito do óleo de imersão na transmissão da luz para
a lente frontal da objectiva (a). Com o ar entre o
 Colocar uma gota de óleo de imersão sobre a espécime e a lente frontal da objectiva alguma luz
preparação (lamela). refractada é transmitida para a objectiva, mas a
maior parte perde-se. (b) Com o óleo de imersão, a
maior parte da luz refractada é captada pela lente
 Rodar a objectiva de 100x de maneira que a frontal da objectiva devido ao alto indíce de
lente frontal fique em contacto com o óleo de refracção do óleo de imersão que é de 1,51, idêntico
imersão. Ajustar a focagem apenas com o ao do vidro. O indíce de refracção do ar é de 1,0.
parafuso micrométrico.
(Adaptado de Sevinate-Pinto, I. & Antunes, T., 2005)
Observação de células da epiderme interna da escama do bolbo de Allium cepa,

utilizando como meio de montagem o vermelho neutro

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 O laboratório é um local de trabalho a que está associado a manipulação de

 Prender os cabelos com um elástico quando estes são compridos.

 Não beber ou comer no seu interior, incluindo mascar pastilhas elásticas.

 Manter limpa a sua área de trabalho e separar o lixo produzido, utilizando os

 Lavar as mãos antes e depois de utilizar os reagentes e ou em experiências a

 Saber onde está o equipamento de primeiros socorros.

 Em caso de acidente, procurar ajuda rapidamente junto do professor.

Quadro comparativo da microscopia óptica e electrónica

Adaptado de Figueiredo, A.C. et al., 1996

Abertura numérica da objectiva e limite de resolução

Abertura numérica da objectiva

n= índice de refracção do meio entre a lente frontal da objectiva e a lamela

O limite de resolução é definido como sendo a distância mínima existente entre

Microscopia de contraste de fase

Micrografias ou fotografias de microscopia electrónica

Unidades de medida utilizadas em microscopia

Unidade Símbolo Factor de

Como saber o valor final da ampliação da imagem do objecto em estudo?

Ampliação final = ampliação da ocular x ampliação da objectiva

Preparações microscópicas temporárias e definitivas

Preparação definitiva- preparação efectuada mediante um processo em que o

Uma preparação microscópica é constituída por:

 Objecto ou material biológico. lamela

Cuidados a ter na utilização do microscópio óptico

1. Começar a focagem sempre com a objectiva de menor ampliação.

2. Manter o microscópio numa posição confortável para que o utilizador possa

3. Após a utilização da objectiva de imersão, limpar convenientemente a lente

4. No caso de se tratar duma preparação temporária, retirá-la do microscópio e

5. Quando der por terminada a sua observação deixar no enfiamento do tubo a

Técnica para efectuar uma preparação temporária

(Adaptado de Sevinate-Pinto, I. & Antunes, T., 2005)

Como proceder para focar com a objectiva de imersão

 Colocar a preparação na platina do microscópio

 Colocar no alinhamento do tubo a objectiva de

 Obter uma imagem nítida rodando o parafuso

 Ajustar com o parafuso micrométrico.

 Rodar as objectivas até à da ampliação de 40x

 Rodar a objectiva de 40x e colocar o revólver

Observação de células da epiderme interna da escama do bolbo de Allium cepa,

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