Módulo – 1 Introdução : Histórico da AIDS/SIDA, O Vírus da Imunodeficiêciencia

Humana (HIV) , Epidemiologia e Distribuição Geográfica

DIAGNÓSTICO DA SÍNDROME DA IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA POR MÉTODOS

SOROLÓGICOS,CELULARES E MOLECULARES.

Título do Módulo Introdução : Histórico da AIDS/SIDA, O Vírus da Imunodeficiêciencia

Humana (HIV), Epidemiologia e Distribuição Geográfica

Tutor Prof. Rogério Saad Vaz – ( Ver Link para Curriculum do Professor )
Coordenador do Curso de Biomedicina-FPP-PR
Curitiba –PR.
Duração sugerida para
O módulo 1 hora

Características do Texto
( legibilidade )

Objetivos . Introduzir o histórico – AIDS/SIDA , HIV

. Introduzir informações sobre Epidemiologia Distribuição Geográfica

Avaliação Uma questão dissertativa a ser disponibilizada até ( ver com Sérgio
Surugi) Peso 1

Período de realização conteúdo de dd/mm/aa até dd/mm/aa, avaliação até dd/mm/aa (ver com Prof. Sérgio Surugi)

Bibliografia
ANNA ALDOVINI , BRUCE D. WALKER
TECHNIQUES IN HIV RESEARCH , STOCKTON PRESS,1990
New York , London , Tokyo , Melbourne , Hong Kong

WATSON, J. D., GILMAN, M., WITKOWSKI, J., ZOLLER, M.

RECOMBINANT DNA , SCIENTIFIC AMERICAN BOOKS
NEW YORK NY USA 1997/8

ABBAS, A .K., LICHTMAN, A . H., POBER, J. S.

CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY
W.B. SAUNDERS COMPANY – Pennsylvania USA
1994/5/6/7/8

Marcia B. Carvalho, Nelson Hamerschlak ,Rogerio S.Vaz and Orlando C. Ferreira Jr. Risk Factor
Analysis and Serological Diagnosis of HIV-1/HIV-2 Infection in a Brazilian Blood Donor
Population : Validation of the World Health Organization Strategy for HIV Testing.
AIDS Magazine 1996, Vol.10 No 10: 1135-1140

Links Importantes : www.roche.com.br ou www.roche-hiv.com

Leia com atenção todo o texto

1. Introdução :
Histórico : AIDS/SIDA ( SÍNDROME DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA ADQUIRIDA)
O vírus da imudeficiência humana foi inicialmente identificado em 1983 , e em 1984 foi demonstrado ser a
causa da síndrome da imunodeficiência humana (AIDS/SIDA).

É estimado que cerca de 40 - 100 milhões de indivíduos estejam contaminados com o HIV a nível mundial ( a
partir do ano 2000).

Este vírus pertence ao gênero dos lentivírus , sendo o HIV-1 o tipo predominante na maioria dos países e o
HIV- 2 encontrado principalmente na África Ocidental.

Evidências epidemiológicas não confirmam sua origem, apesar de existirem algumas indicações de que possam
ter se originado da transmissão entre espécies humana e símia.

O HIV é transmitido pelo contato sexual , via parenteral , via mucosal ( raramente) , por exposição a sangue e
hemoderivados , durante a gravidez ou período perinatal , e pelo aleitamento materno. Traumas na região do
reto e a presença de lesões genitais ulcerativas podem aumentar os risco de transmissão do HIV durante o
contato sexual.

O HIV já foi encontrado em fluidos biológicos como : sangue, esperma, liquor, secreção vaginal, urina, lágrima,
saliva e leite materno., no entanto o contato com o sangue e esperma são as principais vias de transmissão.

A AIDS é uma doença com aspecto crônico e progressivo que é caracterizada por apresentar , nos estágios
finais , infecções oportunistas , neoplasias ou outras afecções decorrentes do comprometimento do sistema
imune celular.

HIV : Informações Gerais - Vírus da Imunodeficiência Humana

O HIV é um membro da Família Retroviridae, a qual é caracterizada pela presença única da enzima
transcriptase reversa , que permite que o vírus transcreva seu RNA em um DNA de dupla fita (cDNA ) a fim de
poder inserir esta forma proviral no genoma da célula hospedeira e utilizar o maquinário da célula para se
replicar.

O HIV é constituído por uma camada bilipídica , duas fitas simples de RNA, proteínas estruturais e a enzima
transcriptase reversa.

Fig.-HIV : Organização Estrutural do HIV

O gene gag codifica as proteínas estruturais do núcleo , como a p17 e p24; e p55 o gene env codifica as
glicoproteínas do envelope como gp41 e gp 120; já o gene pol codifica a transcripatse reversa. ( Ver tabela –
Funções dos genes do HIV-1)
TABELA – Funções dos Genes do HIV-1

Gene Função

env codifica as glicoproteínas do envelope (gp 160,gp120 e gp 41)

gag codifica as proteínas do estruturais do núcleo ( p17 , p24 e p55)
nef função desconhecida , porém atua in vivo para manter o alto nível
de infecção
pol codifica as enzimas virais, incluindo a transcriptase reversa
rev. codifica Rev, o qual regula a transferência do RNA não quebrado
(spliced) para o citoplasma

tat codifica Tat, o qual induz o alto nível de expressão dos genes do HIV
vif aumenta a infectividade do vírus das partículas virais
vpr codifica o ativador transcricional
vpu participa na montagem viral e liberação das partículas virais

O vírus apresenta tropismo por receptores CD4+ os quais estão presentes em linfócitos T, além de outras células
como monócitos, macrófagos alveolares e células da glia, células de langerhans, do colo, duodeno e do reto são
também alvo do HIV.

O linfócito CD4 é o elemento principal na resposta imune e a sua depleção progressiva permite a ocorrência de
infecções oportunistas, tumores malignos e outras manifestações que caracterizam a AIDS.

Clínica da AIDS :

A infecção por HIV inclui um período subclínico prolongado e um período posterior de imunodeficiência grave
(AIDS) resultando de uma deficência quantitativa e qualitativa progressiva de linfócitos CD4 .

A célula infectada inicialmente pode ser um linfócito CD4, um monócito ou uma célula dendrítica (dependendo
do modo de transmissão da infecção).

Os vírus que entram via corrente sanguínea são direcionados para o tecido linfóide, onde eles se replicam a um
nível crítico levando então a viremia. Dentro de um período curto de tempo um equiliíbrio dinâmico entre o
vírus e o hospedeiro é estabelecido, e é caracterizado por níveis extraordinários de replicação viral e uma
progressão rápida de destruição de células CD4 levando a sua diminuição e também a sua reposição.

Cerca de 10 bilhões de novos vírions de HIV-1 podem ser produzidos diariamente com uma meia-vida no
plasma de 12 horas.
O tempo médio da liberação de um vírion a partir de uma célula até a liberação de uma nova geração de vírus a
partir de outra célula infectada é de cerca de 8,6 horas e a vida média de uma célula CD4 infectada é de cerca de
2.2 dias. Em 50-70% dos indivíduos com infecção primária a síndrome de HIV aguda aparece de 3 a 6 semans
após a transmissão viral.

Esta síndrome aguda pode lembrar uma infecção viral aguda ou mononucleose, e usualmente dura de 1 a 2
semanas.

Sinais e sintomas podem incluir : febre, letargia, artralgia, mal-estar, mialgia, cefaléia, náuse, anorexia,
faringite, linfoadenopatia e rash eritematoso maculopapular, ulceração muco-cutânea, vômito,diarréia e perda
de peso.

Este vírus possui uma variação genética significativa devido a alta taxa de replicação de indivíduos infectados, e
já foram descritos mais de um subtipo em um mesmo paciente portador. Isto se torna relevante quando
consideramos a sensibilidade e especificidade dos testes para diagnósticos do HIV.

As técnicas laboratoriais para o diagnóstico de HIV são as seguintes:

- Testes de Triagem para Detecção de Anticorpos anti-HIV através de ensaios imunoenzimáticos

(ELISA/EIA).
- Pesquisa do Antígeno pricipal do “core”viral , o p-24 , objetivando a quantificação da antigenemia.
- Teste Confirmatório Sorológico – ensaio de imunoeletrotransferência ou Western Blot.
- Detecção do RNA viral por técnicas moleculares : métodos qualitativos

Técnicas Laboratoriais para a Avaliação de Progressão da AIDS

- Contagem de Linfócitos CD4+ e CD8+ : a diminuição do número de células CD4 ( contagem abaixo de
500 células/mm3 ) está fortemente correlacionado com o aumento de viremia , o que é um indicativo para
revisão de terapia anti-retroviral.
- Quantificação de Carga Viral – serve para avaliar a progressão da doença , indica em valores númericos (
número de cópias de RNA HIV-1/mL) a carga viral num dado momento clínico . Serve também para avaliar
se a terapia adotada deve se manter ou deve ser alterada.

Obs.: Carga viral alta geralmente está correlacionada com com contagem de células CD4 diminuida. Contudo
nem sempre esta relação obedece esta regra , a avaliação sempre deve ser individualizada , pois cada paciente
apresenta situações clínicas peculiares.

2. Epidemiologia e Distribuição Geográfica : HIV

O número de indivíduos contaminados a nível mundial é estimado em cerca de 40 – 100 milhões . Em algumas
regiões do globo a incidência da infecção já se estabilizou, enquanto em outras regiões os níveis não param de
crescer. Em certas regiões da África (Sub-Sahara) a prevalência de infecção atinge cerca de 10% da população
, níveis similares podem ser observados em regiões da Ásia (Sul e Sudoeste da Ásia) .

Nos EUA a transmissão entre homosexuais masculinos é o mecanismo mais comum de transmissão , assim
como a transmissão pelo uso de drogas injetáveis e a transmissão heterosexual , especialmente entre mulheres
cujos parceiros sexuais são usuários de drogas injetáveis e adotam comportamento sexual promiscuo (vários
parceiros sexuais).
Globalmente , diferentes subtipos de HIV tem sido identificados. Análises filogenéticas de sequências provirais
revelaram dois principais grupos genéticos de HIV : M ( - major/maior ou principal) e O ( others/outliers –
outros).

Os virus do grupo O são raros e encontram-se concentrados na África Ocidental. Dentro do grupo M , as
variantes de HIV são classificadas em subtipos de A – J de acordo com seu grau de similaridade genética.
Vírus do subtipo A apresentam distribuição mundial e são mais prevalentes na África Central e também são
encontrados na Europa , Russia, Ásia Oriental e América do Sul. O subtipo B compreendem a maioria
esmagadora dos vírus isolados nos EUA, e também apresentam alta prevalência na Europa, Australia, América
do Sul; variantes do subtipo B tem sido isolados na Tailândia, China, Malásia, e Japão.

África Oriental e do Sul , Índia são os principais focos de infecções com vírus do subtipo C, embora tais vírus
tenham sido isolados também na Europa, Rússia, China e Brasil . Vírus do subtipo D circularam primeiramente
na África Central, enquanto que os vírus do subtipo E são isolados predominantemente na região de maior
rápidez de expansão epidêmica da Ásia (região sudoeste).

Subtipos virais G, H e J tem sido isolados na África Central,; contudo , todos os três subtipos são incomuns.
Finalmente , vírus do subtipo I tem sido isolados a partir de pacientes no Chipre, embora esses vírus podem ser
atualmente recombinates de outros subtipos virais.

Fig.: Distribuição dos Subtipos de HIV a Nível Mundial

- A grande variação genética do HIV está diretamente correlacionada a atuação da enzima Transcriptase
Reversa (TR) , pois esta enzima ao transcrever a forma RNA para a cDNA (para integrar-se ao genoma da
célula hospedeira) não realiza a leitura e incorporação dos nucleotídeos de maneira correta . Isto , talvez seja
um mecanismo de defesa genético, pois ao realizar estas incorporações errôneas de maneira aleatória e
também associado a alta incidência de replicações virais, a TR coopera para o surgimento de uma variação
genética e como consequência a um número de subtipos cada vez maior.

A nível de terapia anti-retroviral , este é um ponto crítico a ser considerado, pois as drogas disponiveis até o
momento , não acompanham a velocidade de mutações que o HIV está sujeito, com isto a resitência as drogas
atuais são um fato inevitável. Estudos constantes de variabilidade genética são uma necessidade primordial para
desenvolvimento de novas drogas.

Obs.: Lembrando que o grau de virulência está associado a alguns subtipos de HIV , e estudos epidemiológicos
e de distribuição geográfica , são importantes para a compreensão do comportamento e possível surgimento de
novas variantes de HIV.

Pesquisadores francese e camaroneses , descobriram um novo tipo de vírus HIV, que acredita-se ser um
combinação de dois vírus já existentes , contudo genéticamente distintos.

Os trabalhos , que acabam de ser publicados na revista americana – Journal of Virology , foram levados adiante
sob a direção da cientista Martine Peeters , do Instituto de Investigações para o Desenvolvimento de
Montpellier , no sul da França .
A Dra. Peeters relatou a descoberta de um paciente infectado por dois vírus : O e M. E estes vírus uniram-se
para dar origem a uma nova variante o que levou a conclusão de que vírus extremamente diferentes
genéticamente também podem se recombinar. Esta descoberta poderá influir na a propagação ,no
desenvolvimento de novos testes e consequentemente no tratamento da doença.

A variante “O “ainda é pouco propagada no mundo, mas o fato de que ela pode unir-se a outra e ter suas
características biológicas modificadas poderá torná-la mais virulenta, explicou a Dra. Peeters.

Devido à raridade do “O “, os vírus deste grupo algumas vezes não são detectados através dos tetstes
convencionais de triagem sorológica (ELISA HIV 1+2 + O) , além de serem resistentes a certos tratamentos
contra a doença.

Há 18 mêses , uma nova variante do vírus da AIDS , geneticamente próxima a que infecta os chimpanzés , mas
muito diferente das que circulam nos países ocidentais, foi isolada em Camarões por outra equipe franco-
camaronesa , dirigida pppelo Prof. François Simon, virólogi do Hospital Bichat de Paris.

Até hoje , dois vírus da AIDS foram identificados : o HIV 1, na região africana dos Grandes Lagos , e o HIV 2 ,
na África Ocidental. Este último , menos virulento, foi superado pelo HIV 1.

Somente duas variantes destes dois vírus eram conhecidas : as do Grupo M e as do Grupo º A variante
descoberta – N – (nova), desscoberta em 1998 em Camarões e que acaba de ser revelada pela Dra. Peeters, são
derivadas do HIV 1 , principal responsável pela epidemia de AIDS no planeta.

Apesar de pertencer à família do HIV 1 , o vírus da AIDS mais perigosoaté agora , a variante “N “não era
considerada uma ameaça real pelos especialistas, o que se deve principalmente ao predomínio das variantes “M
“e “O “.

Contudo nem tudo é tão alarmante assim , pesquisadores do Hospital San Rafaelle, de Milão – Itália,
anunciaram a descoberta de uma anticorpo capaz de proteger pessoas expostas ao vírus da AIDS ( dados obtidos
no jornal italiano 10/03/00 Corriere della Sera).

A equipe , comandada pela Dra. Lucia Lopalco, estudou nos últimos quatro anos, 90 pessoas que tiveram
relações sexuais com parceiros soropositivos mas não foram contaminadas.

Em seis delas foi identificado um tipo de anticorpo que impedia o vírus penetrar na célula. A descoberta abre
um novo campo de pesquisa no combate ao vírus. “Agora se pode pensar em construir com a biotecnologia
anticorpos a serem ministrados nas primeiras fases da infecção ou em produzir uma vacina preventiva que
estimule a produção dos anticorpos pelo próprio organismo, disse a Dra. Lucia Lopalco.

1)- Questão Dissetativa – Módulo I Curso – HIV

Explique sintéticamente a base de variação genética do HIV e como isto pode influenciar na propagação
da doença, no desenvolvimento de novos testes e também no tratamento de pacientes HIV positivos.

Módulo – 2 Métodos Indiretos (Sorologia ) para diagnóstico da Infecção pelo HIV

DIAGNÓSTICO DA SÍNDROME DA IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA POR MÉTODOS

SOROLÓGICOS,CELULARES E MOLECULARES.

Título do Módulo Métodos Indiretos (Sorologia) para diagnóstico da Infecção pelo HIV
Tutor Prof. Rogério Saad Vaz – ( Ver Link para Curriculum do Professor )
Coordenador – Biomedicina-FPP-PR
Curitiba –PR.
Duração sugerida para
O módulo 1 hora

Características do Texto
( legibilidade )

Objetivos . Introduzir noções sobre métodos imunoenzimáticos - ELISA

. Introduzir noções sobre métodos sorológicos de confirmação :
Western Blot

Avaliação Uma questão dissertativa a ser disponibilizada até ( ver com Sérgio
Surugi) Peso 1

Período de realização conteúdo de dd/mm/aa até dd/mm/aa, avaliação até dd/mm/aa (ver com Prof. Sérgio Surugi)

Bibliografia
ANNA ALDOVINI , BRUCE D. WALKER
TECHNIQUES IN HIV RESEARCH , STOCKTON PRESS,1990
New York , London , Tokyo , Melbourne , Hong Kong

WATSON, J. D., GILMAN, M., WITKOWSKI, J., ZOLLER, M.

RECOMBINANT DNA , SCIENTIFIC AMERICAN BOOKS
NEW YORK NY USA 1997/8

ABBAS, A .K., LICHTMAN, A . H., POBER, J. S.

CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY
W.B. SAUNDERS COMPANY – Pennsylvania USA
1994/5/6/7/8

Marcia B. Carvalho, Nelson Hamerschlak ,Rogerio S.Vaz and Orlando C. Ferreira Jr. Risk Factor
Analysis and Serological Diagnosis of HIV-1/HIV-2 Infection in a Brazilian Blood Donor
Population : Validation of the World Health Organization Strategy for HIV Testing.
AIDS Magazine 1996, Vol.10 No 10: 1135-1140

Links Importantes : www.roche.com.br ou www.roche-hiv.com

Leia com atenção todo o texto

1. Introdução : Detecção de Anticorpos Anti-HIV no Soro

A AIDS é causada por um retrovírus denominado HIV . A infecção pelo HIV é conhecida mundialmentee
representa um sério problema de saúde pública. Anticorpos produzidos contra o HIV no soro de pacientes são
uma fonte para detecção dos métodos mais comuns de detrminação de exposição ao HIV (métodos de triagem).

O mais comum dos testes de triagem sorológica utilizados para a detecção de anticorpos anti-HIV é o ELISA (
enzima imunoensaio), e anível de confirmação sorológica o imunoblot ou western blot, esses ensaio são fáceis
de de serem realizados e fornecem resultados em um tempo relativamente curto.

O método ELISA , é o método mais comumente utilizado para detecção de anticorpos anti-HIV no soro de
pacientes , e é um ensaio de captura de anticorpos por detecção indireta.
O ELISA baseia-se no uso de antígenos purificados ligados a uma base sólida. Os anticorpos no soro do
paciente são incubados com os antígenos ligados a uma fase sólida, e qualquer um que reagir irá permanecer
ligado a matrix mesmo após a fse de lavagem para remoção do excesso de tampão.

Esses anticorpos serão detectados através do uso de anticorpos secundários marcados. Vários fatores podem
afetar a sensibilidade do ensaio, tais como a concentração de antígenos que estiverem ligados a fase sólida e as
características dos anticorpos secundários.

A qualidade do antígeno é crítica para a performance do ensaio. A primeira geração de ELIS refere-se a
antígenos preparados a partir de extratos de lisado viral infectados . A Segunda geração de ELISA era baseada
no uso de antígenos recombinantes . A terceira geração de ELISA baseou-se no uso de peptídeos sintéticos
como fonte de antígenos , permitindo deste modo aumentar a especificidade.

Existem já no mercado ELISAs que distinguem HIV 1 e 2 + O ( HIV grupo O). Estes ensaios usam comumente
peptídeos correspondendo as proteínas das regiões transmembrânicas do envelope do HIV 1 e HIV 2.

Ensaios comerciais baseiam-se em uma reação cromogênica que é lida em um espectrofotômetro para
determinação da densidade ótica. É o ensaio indireto que é utilizado de forma qualitativa para determinar se o
soro a ser testado contém anticorpos anti-HIV.

A concentração de anticorpos no soro que são capturados serão diretamente proporcionais a concentração de
anticorpos secundários e a concentração de enzimas presentes. É importante o uso do espectrofotômetro
recomendado pelo fabricante do Kit de ELISA comercial para o uso correto do comprimento de onda para a
detecção da densidade ótica.

Pontos a considerar : ELISA

Os métodos ELISA disponíveis no mercado (com licensa do FDA-USA e do Ministério da Saúde – Brasil)
demonstram uma sensibilidade de 100%. Contudo, esta sensibilidade não evita o período da “janela sorológica”.
Este período tem sido estimado entre 1 mês – 18 mêses ou mais (média mundial 3-6 mêses). Durante este
período , anticorpos não são produzidos e consequentemente não podem ser detectados através desta técnica,
mesmo estando opaciente infectado pelo HIV.

Uma vez que uma amostra seja identificada como reagente, a amostra deverá ser testada novamente ,
preferencialmente por outro método ELISA de fabricante diferente, ou de constituição antigênica .A retestagem
é necessária , não somente para confirmar o resultado , mas também para evitar o risco de resultados falsamente
positivos.

A maioria dos testes ELISA de última geração apresentam a sensibilidade e especialmente a especificidade
muito aumentadas , no entanto, ainda assim há a possibilidade de ocorrem falsos resultados positivos devido a
existência de outros vírus (além de outros fatores não virais) que apresentam estruturas antigênicas muito
semelhantes a do HIV , o que pode vir a causar reações cruzadas . Para minimizar este tipo de resultado, a
maioria dos países ocidentais adotou a realização de testes de triagem em duplicata , e caso hajam resultados
dispares , realiza-se um novo teste com nova amostra, e na persitência de resultados a confirmação deverá ser
feita por métodos como o Western Blot , e caso haja a necessidade de confirmação , realiza-se a PCR ( detecção
direta de ácidos nucleicos virais).

Obs.: vide último módulo sobre legislação brasileira.

2. Métodos de Confirmação Sorológica : Imunoblot ou Western Blot

Para este ensaio é necessário um extrato purificado com os principais antígenos do HIV . Estes antígenos são
separados por eletroforese em um gel de poliacrilamida e transferidos para um papel de nitrocelulose , onde
estarão separados ao longo da tira de nitrocelulose conforme o peso molecular de cada fração antigênica. Estas
tiras de nitrocelulose ricas em proteínas virais poderão ser utilizadas frente a soros de pacientes para análisar a
presença de bandas específicas que podem indicar a exposição do paciente ao HIV.

Existem três genes estruturais principais do HIV e um total de 9 produtos gênicos que são geralmente
visualizados em imunoblot padrão , sendo: (vide também Tabela do módulo I do Curso)

Glicoproteínas do envelope (env)

gp 160 - glicoproteína precursora do envelope

gp 120 - glicoproteína madura do envelope
gp 41 - gliproteína transmembrânica do envelope

Proteínas – polimerase (pol )

P 65 - proteína da transcriptase reversa

P 53 - proteína da transcriptase reversa
P 34 - proteína endonuclease

Proteínas do Núcleo ou antígenos grupo-específicos

P 55 - proteína precursora da gag

P 24 - proteína principal (major) da gag
P 17 - proteína amino-terminal gag

A amostra de soro que demonstrar reatividade a pelo menos 1 proteína de cada grupo de produtos gênicos
estruturais principais é geralmente considerada positiva. Reatividade a pelo menos um antígeno env ou a outro
antígeno pol ou antígeno gag é frequentemente também considerada positiva.

Reatividade a antígenos env sozinhos com o mínimo de duas proteínas env reconhecidas é considerado por
muitos laboratórios como sendo positivo. Outras combinações de reatividade para antígenos gag ou pol
sozinhos são considerados indeterminados , e , frequentemente as amostras são retestadas e novas amostras
adicionais são requeridas.

Resultados indeterminados persistentes , ou mesmo negativos , porém com continuada suspeita clínica, deverão
ser submetidos preferencialmente a métodos que não dependam de resposta sorológica , como a PCR (reação
em cadeia da polimerase) – método de biologia molecular que detecta diretamente a presença de ácidos
nucleicos virais.

1)- Questão Dissertativa – Módulo 2 do Curso HIV

Como interpretar um resultado de triagem sorológica (ELISA) cujos resultados obtidos foram : (teste em
duplicata)
1a bateria de testes : Reagente e Não Reagente
2a bateria de testes : Não Reagente e Não Reagente

Após estes resultados , como prosseguir laboratorialmente ?

Módulo – 3 Definição Diagnóstica por Métodos de Detecção de Ácidos Nucleicos

(PCR Qualitativo)

DIAGNÓSTICO DA SÍNDROME DA IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA POR MÉTODOS

SOROLÓGICOS,CELULARES E MOLECULARES.

Título do Módulo Definição Diagnóstica por Métodos de Detecção de Ácidos Nucleicos (PCR
Qualitativa)

Tutor Prof. Rogério Saad Vaz – ( Ver Link para Curriculum do Professor )
Coordenador – Biomedicina-FPP-PR
Duração sugerida para
O módulo 1 hora

Características do Texto
( legibilidade )

Objetivos . Introduzir o histórico da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

. Introduzir conceitos básicos de biologia molecular
. Conhecer aplicações da PCR para detecção do HIV

Avaliação Uma questão dissertativa a ser disponibilizada até ( ver com Sérgio
Surugi) Peso 0.5

Período de realização conteúdo de dd/mm/aa até dd/mm/aa, avaliação até dd/mm/aa (ver com Prof. Sérgio Surugi)

Bibliografia INNIS, M. A ., GELFAND,D. H. , SNINSKY, J. J., WHITE, T. J.

PCR PROTOCOLS – A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS
ACADEMIC PRESS INC , NEW YORK NY USA 1996/97/98

WATSON, J. D., GILMAN, M., WITKOWSKI, J., ZOLLER, M.

RECOMBINANT DNA , SCIENTIFIC AMERICAN BOOKS
NEW YORK NY USA 1997/8

ABBAS, A .K., LICHTMAN, A . H., POBER, J. S.

CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY
W.B. SAUNDERS COMPANY – Pennsylvania USA
1994/5/6/7/8
 Leia com atenção todo o texto

1. Introdução :

A técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) foi desenvolvida por Kary Mullis (bioquímico americano
de origem romena) em meados dos anos 80 e desde então tem revolucionado a área da genética molecular .
Com o advento da PCR tornou-se possível analisar os genes de maneira menos complicada e em menor tempo.
O maior problema de analisar genes , é que eles são como “alvos raros “em meio a um genoma complexo , que
em mamíferos podem chegar a 100.000 genes. A PCR pode amplificar “in vitro” cerca de 1.000.000 (um
milhão) de cópias de um segmento de DNA cuja sequência seja previamente conhecida , e isto sem a
necessidade de recorrer a outra técnica de biologia molecular : clonagem e sequenciamento (técnicas complexas
e que demandam de muito tempo para serem executadas).

P.C.R – Polymerase Chain Reaction

DNA – Ácido Desoxiribonucleico

2. Conceitos básicos de biologia molecular

As células contém em seu núcleo os cromossomos e neles está compactado o DNA , e o DNA por sua vez é
formado de nucleotídeos, e os genes são sequências específicas de nucleotídeos que são responsáveis pela
síntese de proteínas. O DNA (ácido desoxiribonucleico ) é uma molécula em forma de dupla hélice que contém
, através de um código químico , todas as informações necessárias para construir e manter um organismo vivo .
A molécula de DNA forma a base da herança genética em todos os , exceto em alguns vírus , que contém
apenas RNA (ácido ribonucleico).

O código genético do DNA é formado por nucleotídeos dispostos em fila como em um colar de pérolas. Cada
nucleotídeo contém uma base nitrogenada púrica , sendo : adenina (A) ou guanina (G) , e uma base
nitrogenada pirimidica : timina (T) ou citosina (C) . As bases são ligadas covalentemente a um açúcar
(desoxiribose) , que por sua vez é ligado a um grupo fosfato . Cada fita de DNA forma-se através de açúcares e
grupos fosfato alternados , ligados por pontes covalentes . O que vem conferir a estrutura do DNA a forma
helicoidal , é que as duas cadeias correm em direções opostas permitindo que as bases complementares fiquem
pareadas ( A – T e C – G ) .

As duas fitas da hélice são unidas por pontes de hidrogênio entre as bases específicas. O elo entre o código de
DNA dos genes e o código de aminoácidos das proteínas é o RNA (ácido ribonucleico). A estrutura química do
RNA é semelhante a do DNA , porém cada nucleotídeo do RNA possui uma ribose ao invés de uma
desoxiribose , e em vez da timina (T) , a uracila (U) é uma das pirimidinas do RNA, além disso o RNA é uma
molécula de fita sinples (ss) e o DNA de fita dupla (ds). Para a síntese proteíca , primeiro o RNA é sintetizado
a partir do modelo de DNA (template) , através de um processo denominado transcrição. O RNA que leva estas
informações codificadas é o RNA menssageiro (RNAm) , que é transportado do núcleo para o citoplasma , onde
sua sequência é traduzida para determinar a sequência de aminoácidos na proteína que está sendo sintetizada. O
mecanismo inverso de produção de DNA a partir de um molde de RNA , pode ocorrer quando um retrovírus
(RNA vírus , exemplo : HIV – vírus da Imunodeficiência Humana) utiliza uma enzima para transcrever
reversamente o seu material genético (RNA) em um DNA complementar (cDNA , dito provírus) para que possa
ser inserido no genoma da célula que invadiu ( linfócito T CD4). Este mecanismo é de extrema importância
para a compreensão da técnia da PCR , em especial quando estiver relacionada a amplificação de RNA (
exemplo : vírus da Hepatite C – RNA vírus) . O processo de replicação natural de DNA nas células é mediado
por uma enzima – a DNA polimerase . Esta enzima cataliza a incorporação de nucleotídeos A-T-C-G para a
duplicação da fita simples de DNA. A PCR também utiliza uma DNA polimerase para o processo de
amplificação de DNA in vitro.

3. Detecção do HIV pela PCR

A PCR foi uma das primeiras técnicas de biologia molecular a ser usada amplamente em laboratórios clínicos .
É uma técnica que amplifica sequências específicas de DNA através de ciclos repetidos de síntese de ácidos
nucleicos.

O método baseia-se no conceito que a enzima DNA-polimerase é capaz de sintetizar a fita complementar de
uma molécula de fita única de DNA, desde que na solução exista uma sequência iniciadora “primer” (
oligonucleotídeos sintéticos – ou seja – uma sequência curta e específica de nucleotídeos) e dNTPS
(nucleosídeos trifosfatados – A-T-C-G-) como substrato. O DNA de uma amostra ( exemplo : sangue ou de
biópsia) é purificado e isolado através de extração química ( com fenol/clorofórmio/etanol) , e em seguida
incubado com uma solução tamponada (tampão de PCR) contendo : primers , dNTPS , DNA Polimerase e íons
magnésio, onde a solução é submetida a vários ciclos de temperaturas alternadas ( uma PCR pode varia de 25 a
35 ciclos em média) , onde ao final serão obtidas mais de um milhão de cópias de sequência original .

A PCR qualitativa para detecção do provirus do HIV (cDNA) utiliza um par de primers a partir de uma
sequência altamente conservada do genoma viral , o que assegura a apmplificação e detecção eficiente de todas
as variantes deste vírus. Dois pares de primers tem sido extensivamente utilizados para a análise de amostras
infectadas pelo HIV-1.

Um par de primers, designnado SK38 e SK39, amplifica uma região do gag de 115 bp (115 pares de bases) do
HIV-1. O segundo par de primers – SK 45 e SK 101 amplifica uma região do gag de 130 bp que é conservada
entre isolados de HIV-1 e HIV-2.

Para a confirmação dos resultados , os produtos de amplificação de ambos pares de primers (SK38 /SK39 ,
SK145/SK101) são submetidos a hibridização com sondas (probes) específicas sendo respectivamente SK19 e
SK 102.

Caso haja a hibridização entre os produtos amplificados com as respectivas sondas , as amostras são
consideradas positivas para o HIV.

As amostras ideais para detecção qualitativa do cDNA do HIV , são as células que o vírus tem tropismo , isto
por que o genoma do HIV tem que se associar ao genoma da célula hospedeira para poder se replicar. Para isso
é necessário a extração do DNA das células de amostras de pacientes sob suspeita clínica de infecção .
Por isso, antes do processo de amplificação é necessário extrair o DNA da amostra clínica ( sangue / biópsia /
sêmen / cultura de células , entre outras). A extração de DNA é feita quimicamente em dois processos : 1) Lise
celular - utilizam-se ácidos , detergentes e enzimas – para separar e expor o DNA de outros constituintes
celulares, 2) Extração Química – utilizam-se fenol ( solvente orgânico) / clorofórmio e etanol - estes reagentes
solubilizam macromoléculas ( proteínas/lipídeos) para facilitar a purificação do DNA dos demais restos
celulares . o DNA é então isolado (já purificado) e ressuspendido em meio aquoso.

Após a realização da extração é necessário quantificar o DNA para possibilitar os cálculos para realizar a
amplificação. Esta quantificação pode ser feita em aparelhos automatizados ou através de eletroforese em gel de
agarose sódica onde se utilizam padrões. Geralmente em protocolos de PCR a concentração óptima para a
amplificação é de 1 ug/ul .

A PCR baseia-se então em três processos específicos : 1) Desnaturação do DNA , 2) Hibridização

(annealing) , 3) Extensão . Os ciclos são processados em um aparelho chamado de “termo amplificador/ ou
termo ciclador”( aparelho com computador onde as temperaturas são pré-programadas conforme a técnica e
protocolos específicos) .

A desnaturação é necessária para expor as sequências de nucleotídeos nas duas fitas de DNA e para que
ocorra a desnaturação a temperatura ideal deverá estar próxima do ponto de ebulição da água +/- 95C/ 30
segundos a 5 minutos. Uma vez desnaturado o DNA de fita dupla estará composto em duas fitas simples , o que
possibilitará a próxima etapa da PCR.

A hibridização (annealing) – Estando o DNA aberto (desnaturado ) o par de primers ( SK38 E SK 39 ou SK

145 E SK 101) poderá hibridizar-se a sequência procurada , caso ela esteja presente no DNA. A temperatura
ideal para esta fase , é de 56C - 63C.

Por exemplo : caso esteja-se procurando a sequência do vírus do HIV- 1(provírus ou cDNA do HIV) no DNA
da amostra e a sequência de nucleotídeos do vírus for por exemplo : A-A-T-C-C-C-C-G-G-T , então um dos
primers deverá ter a seguinte sequência : T-T-A-G-G-G-G-C-C-A ( complementar a sequência do vírus) . Fala-
se em par de primers , por que estando o DNA separado em duas fitas simples , uma com orientação inversa a
outra - orientação (+) 5’----------3’ e orientação (-) 3’------------5’ ) , um primer irá hibridizar-se
complementarmente em cada fita . A PCR é um método de alta especificidade garantida pelo design de seus
primers, sendo comhecido vulgarmente como o teste do tudo ou nada, caso não haja a hibridização dos primers
com o DNA da amostra não haverá amplificação e nem produtos a serem detectados.

Obs.: Sequência dos primers do HIV-1 (SK 38 e 39) direção 5’- 3’

Sequência dos primers do HIV-1 SK 145 e do HIV-2 SK 101 direção 5’- 3’

SK38 ATA ATC CAC CTA TCC CAG TAG GAG AAAT
Sk 39 TTGT GGT CCT TGT CTT ATG TCC AGA ATGC
Sonda (probe) SK19 : ATC CTG GGA TTA AAT AAA ATA GTA AGA ATG TAT AGC
CCTAC

SK 145 AGT GGG GGG ACA TCA AGC AGC CCA TGC AAAT
SK 101 GCT ATG TCA GTT CCC CTT GGT TCTC
Sonda (probe) SK 102 : GAG ACC ATC AAT GAG GAA GCT GCA GAA TGG GAT

Após a fase de hibridização , segue a de extensão , que é a incorporação de nucleotídeos dispersos no meio
aquoso (tubo de PCR). A temperatura ideal para a extensão é de 70C-72C . O processo de incorporação será
mediado por uma DNA polimerase – A Taq-polimerase - ( DNA polimerase extraída da bactéria Thermus
acquaticus ). Esta enzima é utilizada também por ser resistente a altas temperaturas . Os íons magnésio servem
de substrato para a enzima Taq-polimerase. O processo de amplificação irá se repetir com estas três etapas por
vários ciclos. A próxima etapa é a de detecção dos produtos de amplificação , os amplicons .

Detecção dos produtos Amplificados : amplicons

A detecção dos produtos amplificados pela PCR pode ser feito através de eletroforése em gel de agarose sódica.
No gel de agarose são pipetadas alíquotas das amostras amplificadas juntamente com um controle positivo e um
negativo. Como a sequência que foi amplificada é conhecida , o seus produtos de amplificação poderão
analisados através de seu perfil eletroforético , ou seja os produtos aparecerão no gel em forma de banda que
será proporcional ao número de pares de base (bp – base pairs) e de seu peso molecular. Se a banda estiver
alinhada com a banda do controle positivo , então a mostra será positiva para o ácido nucleico que estiver
sendo pesquisado ( por exemplo : cDNA do HIV) . A visualização das bandas e controles é feita da seguinte
maneira : O gel foi preparado com um corante quimioluminescente que se intercala com os nucleotídios do
segmento amplificado ( Brometo de Etídio) e após a corrida eletroforética as bandas podem ser vistas quando
expostas a luz ultra violeta . As amostras negativas não deverão apresentar bandas , caso isso ocorra , poderá ser
em função de uma contaminação por aerossóis (microdispersões ricas em amplicons) .

Obs.: amplicons para SK 38 e SK 39 irão produzir produtos de 115bp (perfil eletroforético)

amplicons para SK 145 e SK 101 irão produzir produtos de 130bp

Confirmação dos Resultados :

Caso haja a necessidade de confirmação dos resultados o procedimento deverá ser o seguinte:

Resultado Positivo (+) : Confirmar a positividade com a técnica de hibridização com sondas marcadas com
material radioativo ou não-isotópico

Obs.: Probes são similares aos primers , ou seja são também oligonucleotídeos específicos e deverão ser
complementares e se hibridizar com os produtos amplificados .

O procedimento é o seguinte : recorta-se a banda do gel (com uma lâmina) , o pedaço do gel será eluido para
separar o produto amplificado. Após a eluição , a solução será submetida a um processo térmico ( aquecimento
próximo a 95C) para que haja a desnaturação dos amplicons. Uma vez o DNA estando separado , as sondas
(probes) serão adicionadas. Após a hibridização a solução será resfriada para que os amplicons se reconstituam
(voltem a se enovelar). As amostras serão submetidas novamente a uma eletroforse , e como as sondas estão
marcadas , a visualização poderá ser analisada da seguinte maneira :
Para sondas marcadas com Fósfoto 32 (P-32) : Expor o gel a uma chapa de raios-x (temperatura baixa) ,
caso tenha havido hibridização , haverá então uma impressão na chapa de raios-X devido a emissão de
radioatividade presente no híbrido amplicon+sonda (comparando sempre com o controle positivo). Amostras
negativas não apresentarão bandas.

Figura : Hibridização com sondas radiomarcadas com P-32 ( amplicons SK38 e 39 , com sondas SK19
marcadas com P-32 , canaletas 1 , 2, 3 ,4, 5, 6,7 , 8 amostras de DNA de indivíduos soropositivos , canaleta 6 –
controle positivo (+) , canaleta 9 amostra de DNA de paciente soronegativo e 10 controle negativo.

Para sondas marcadas com substâncias não isotópicas ( biotina) : Após a adição da sonda marcada com
biotina , o gel será exposto a uma membrana de nitrocelulose embebida com um conjugado rico em
estreptavidina (forte afinidade por biotina) e também com enzima – fosfatse alcalina . A revelação será feita
com uma substância reveladora (cromogênica) e observada em aparelho colorimétrico ( sistema similar a uma
reação simples de E.L.I.S.A – enzima imuno ensaio) . Amostras positivas apresentarão intensidade
colorimétrica específica , amostras negativas não apresentarão visualização colorimétrica.

Indicações para a PCR Qualitativa :

. Diagnóstico de Infecção pelo HIV-1

. Diagnóstico de Infecção Aguda pelo HIV-1 durante ou após a soroconversão
. Confirmação de resultados sorológicos positivos , resultados de Western Blot
indeterminados
. Aplicado a indivíduos expostos a materiais perfuro cortantes contaminados com sangue
e/ou fluidos biológicos
. Diagnóstico diferencial de HIV-1 versus HIV – 2.

1) – Questão Dissertativa : Módulo III – Curso HIV

Caso o resultado da PCR para HIV – 1 fosse negativo , porém persistisse a suspeita clínica de infecção , e
sabendo-se que o paciente era proveniente da região dos grandes lagos da África, qual seria o
procedimento laboratorial a ser seguido?

Módulo – 4 Monitoração Molecular por Carga Viral e Celular de Pacientes HIV

Positivos
DIAGNÓSTICO DA SÍNDROME DA IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA POR MÉTODOS
SOROLÓGICOS,CELULARES E MOLECULARES.

Título do Módulo Monitoração Molecular por Carga Viral

Tutor Prof. Rogério Saad Vaz – ( Ver Link para Curriculum do Professor )
Coordenador – Biomedicina-FPP-PR
Duração sugerida para
O módulo 1 hora

Características do Texto
( legibilidade )

Objetivos . Introduzir o princípio da PCR Quantitativa / Carga Viral

. Introduzir métodos ,:PCR , NASBA e b-DNA .
. Introduzir conceito de aplicação da monitoração de céluas CD4/CD8 em
pacientes HIV positivos .

Avaliação Uma questão dissertativa a ser disponibilizada até ( ver com Sérgio
Surugi) Peso 0.5

Período de realização conteúdo de dd/mm/aa até dd/mm/aa, avaliação até dd/mm/aa (ver com Prof. Sérgio Surugi)

Bibliografia INNIS, M. A ., GELFAND,D. H. , SNINSKY, J. J., WHITE, T. J.

PCR PROTOCOLS – A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS
ACADEMIC PRESS INC , NEW YORK NY USA 1996/97/98

WATSON, J. D., GILMAN, M., WITKOWSKI, J., ZOLLER, M.

RECOMBINANT DNA , SCIENTIFIC AMERICAN BOOKS
NEW YORK NY USA 1997/8

ABBAS, A .K., LICHTMAN, A . H., POBER, J. S.

CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY
W.B. SAUNDERS COMPANY – Pennsylvania USA
1994/5/6/7/8

Leia com atenção todo o texto

1. Princípios da PCR Quantitativa (Carga Viral)

Introdução :
Os níveis sanguíneos do RNA do HIV (carga viral) cad vez está sendo mais usado por profissionais da saúde
para determinar quando se deve começar ou mudar o tratamento contra os retrovírus . Este exame é muito
importante no tratamento da infecção pelo HIV por que estudos prévios tem demonstrado que o nível de vírus
no sangue é um fator preditivo da progressão da doença . Em outras palavras , pacientes com altos níveis de de
RNA do HIV no sangue , tem a maior probabilidade de anvançar rapidamente a AIDS ( síndrome da
imunodeficiência adquirida) do que pacientes com baixos níveis de vírus no sangue.

Uma vez que este exame que monitora a carga viral é uma parte importante do tratamento da doença , é
necessário entender como este exame funciona e como é empregado .

O que é carga viral e como se quantifica ?

O exame de carga viral mede a quantidade de RNA do HIV que está no sangue . O RNA é o material genético
do HIV que contém as informações necessários para fazer mais partículas virais. Existem três provas diferentes
para monitorar a carga viral em uso atualmente:

2. Métodos PCR , NASBA E b-DNA

I)-PCR Monitor da Roche – é o mais comum dos exames , e seu princípio é muito similar ao método
qualitativo , vide módulos anteriores, a não ser pela adição de um padrão de quantificação interno (RNA QS –
RNA Internal Quantification Standard) e pela diluição dos amplicons . A detecção também é feita por método
colorimétrico, contudo os cálculos para obtenção dos resultados são também distintos e mais complexos.

Resumo do Procedimento :

O RNA viral é transcrito reversamente em DNA e amplificado com primers HIV-específicos marcados com
biotina, pela reação em cadeia da polimerase. Um padrão de quantificação interno é também amplificado (IQS).

Os produtos de amplificação são hibridizados por sondas de captura (oligonucleotídeos amplicon específicos)e
detectados com um conjugado ( Avidina- Peroxidase) por um método colorimétrico.

O número de cópias são quantificados pelo nível de produtos de amplificação do HIV e do IQS . A Roche
fornece um software para os cálculos de quantificação que são expressos em : números de cópias de RNA-HIV-
1/mL de plasma ou soro.

Obs. : Como se expressam as mudanças na carga viral ( No de cópias de RNA-HIV-1/mL) ?

As variações na carga viral são expressas com alterações logarítimicas. Esta terminação matemática denota uma
variação no valor do que está sendo quantificado por um fator de 10. Por exemplo : se carga viral inicial pela
PCR for de 20.000 cópias de RNA HIV-1 /mL de plasma , logo um aumento de 1 (um) registro equivale a 10
vezes de aumento da carga viral inicial , ou seja : 200.000 cópias / mL de plasma. Um aumento de 2 (dois)
registros equivale a 2.000.000 cópias de RNA-HIV-1/mL de plasma.

Usando o mesmo raciocínio , se houver o decréscimo de um registro , significa então que a carga viral diminuiu
de 20.000 cópias/mL para 2.000 cópias/mL . Uma diminuição de dois registros equivale a uma carga viral de
200 cópias/mL de plasma.

A sensibilidade da PCR Quantitativa vai determinar o limite de detecção do ensaio. Por exemplo : quanto menor
for o número de cópias que um ensaio detectar , mais sensível ele será. Kits de última geração já estão
detectando cerca de 50 cópias de genoma/mL . Para monitorar a terapia , quanto menor for o número de cópias
detectadas , mais eficaz a terapia. Carga viral alta , significa que deverá haver uma nova avaliação sobre a
terapia adotada.

II) – NASBA - Organon Teknika ( Amplificação do Ácido Nucleico Baseada na Sequência)

Este método também é primer dependente e é usado para a amplificação de ácidos nucleicos em uma única
temperatura (método isotérmico) , podendo gerar uma amplificação de bilhões de cópias do RNA ( no caso
HIV) em cerca de duas horas.

O prcesso de amplificação é bem distinto da PCR da Roche ,e envolve uma mistura de três enzimas – T7 RNA
Polimerase , RNAse H e a Transcriptase Reversa e dois primers.

A transcripatse reversa é uma enzima presente nos retrovírus que sintetiza DNA utilizando o RNA como molde

A RNAse H é uma enzima que degrada especificamente a porção de RNA dos híbridos RNA:DNA .

A T7 RNA Polimerase é uma enzima presente nos fagos T7 , que sintetiza RNA à partir de regiões de DNA
com sequências específicas.

Princípio do NASBA :

Inicialmente ocorre uma fase não cíclica , quando o primer 1 hibridiza com a sequência alvo de RNA, e ocorre a
formação de uma cópia de cDNA, resultando num híbrido RNA:DNA. Consequentemente , o RNA original é
degradado pela RNAse H , deixando um DNA de fita simples, com o qual o primer 2 hibridiza .

A transcriptase reversa pode sintetizar a Segunda fita a segunda fita de DNA , que incorpora a região promotora
da T7 RNA Polimerase ; pois o primer 2 contém a sequência de reconhecimento específica para este exame.

Desta forma , a terceira enzima , T7 RNA Polimerase , transcreve cópias de RNA à partir do promotor ,
gerando cerca de 100 cópias de cada amostra .

Cada molécula nova de RNA serve como molde para a fase cíclica do processo .Nesta fase , o primer 2 vai se
ligar às amostras gerando híbridos RNA:DNA , a RNAse H vai hidrolisar a fita de RNA , o primer 1 liga-se ao
DNA de fita simples ea transcriptase reversa sintetiza o DNA , gerando novamente um promotor ativo.

Tudo isso vai ocorrendo simultaneamente causando a amplificação de uma sequência alvo de maneira contínua ,
homogênea e isotérmica.

Detecção - NASBA :

A detecção dos produtos amplificados é feita por ECL ( eletroquimioluminescência) após hibridização com
sondas marcadas com Rutênio.

Sensibilidade do NASBA :

Os kits de última geração estão detectando cerca de 50 cópias de RNA-HIV-1 / mL.

III) – bDNA – Chiron-Bayer ( Análisa da Cadeia Ramificada do DNA e Amplificação do Sinal)

 ( Branched DNA – em inglês)

Princípio :
As amostras para este ensaio são geralmente : plasma , soro e em alguns casos pode-se utilizar amostras de
biópsia hepática – no caso de hepatites B e C (contudo a extração dos ácidos nucleicos é um pouco mais
complexa e específica).

Após a fase de extração dos ácidos nucleicos , o RNA viral é capturado em uma microplaca por sondas
específicas ( oligonucleotídeos sintéticos) . A fase sólida ligada ao RNA viral é hibridizada a múltiplas
moléculas de DNA ramificado (branched DNA) .

Sondas (oligonucleotídeos) marcadas com Fosfatase Alcalina são então hibridizadas ao DNA ramificado e
reagem com um substrato quimioluminescente (dioxetano) para produzir uma grande amplificação do sinal
luminoso (princípio de eletroquimioluminescência – ECL).

A quantidade de luz emitida é diretamente proporcional a quantidade de ácidos nucleicos (exemplo RNA do
HCV) .

Limite de Detecção do Exame :

0.2 milhões (M) Equivalentes /mL , também é fornecido o valor de log . Os cáculos são realizados por software
fornecido pela Chiron . As amostras são realizadas em duplicata.

Obs.: Não há equivalência entre as unidades/mL de plasma do bDNA com valores de No. de cóipas /mL como
dos métodos anteriores. Até cinco anos atrás era acreditado (por alguns laboratórios americanos) que One
equivalente (Eq) era aproximadamente 1 cópia de RNA/mL . Contudo , em estudos posteriores foi observado
que não havia correlação entre Eq e números de cópias/mL .

Porém, o bDNA não necessita de três áreas físicas para a realização do exame (como nos métodos anteriores) ,
pois não há amplificação dos ácidos nucleicos e sim do sinal obtido.

2) Monitoração de Células CD4/CD8 em pacientes HIV Positivos

Os métodos de quantificação do HIV ou carga viral foram desenvolvidos para complementar procedimentos já
adotados no seguimento de pacientes infectados . Até pouco tempo atrás a maioria dos laboratórios dispunham
de antigenemia quantitativa da p - 24 , e a contagem da subpopulação linfocitária CD4+ (células
hospedeiras do vírus) .

A monitoração de celularidade em pacientes HIV + , é um importante marcador prognóstico clínico. Contudo , a

monitoração dos pacientes somente pela celularidade não é o mais indicado , mas sim a conjunção deste exame
em associação com a carga viral, uma vez que a variação de níveis de células CD4+ podem variar
independentemente da carga viral .
Tem-se demonstrado, no entanto , que quando a carga viral está baixa , os níveis de CD4+ geralmente
aumentam. Contudo , a investigação para determinar se o aumento dos níveis de CD4+ se deve a presença de
células imunes com funcionamento normal , ainda está em estudos.

A contagem absoluta de Linfócitos CD4 , é utilizado para prever a progressão do HIV. Sendo o risco de
progressão aumentado com contagens de células CD4 < 200células/mL ( referência em adulto normal : pelo
menos 800 células/mL).

Então , a numeração de sub-populações linfocitárias CD4 e CD8 representam um elemento essencial de

monitoração de pacientes infectados pelo HIV. Este exame é realizado com o auxílio de anticorpos monoclonais
produzidos para reagir especificamente com antígenos de membrana de células alvo , por citometria de fluxo
em laboratórios especializados.

A citometria de fluxo trata-se de uma análise imunofenotípica de reconhecimento de diferentes tipos celulares ,
particularmente na classificação de linfócitos e céluals blásticas.

O HIV tem tropismo por céluas TCD4 + , ligando-se a receptores de superfície , levando à progressiva queda
no número de linfócitos . Na fase assintomática os níveis de CD4 caem gradativamente . As alterações
acometem a resposta humoral e celular com presença de altos títulos de anticorpos no soro e no liquor e
inversão da relação CD4/CD8 (referência – relação CD4/CD8 : 2 CD4 / 1 CD8 ).

A contagem de células CD4 associada a carga viral serve também para verificar se a terpia adotada esta sendo
eficaz , caso haja uma diminuição acentuada da celularidade associada a um aumento importande carga viral ,
significa que a terpia necessita ser modificada , provavelmente por resitência do subtipo de HIV frente aos
antiretrovirais.

Fig. : Gráfico – Curso Clínico de Paciente Soropositivo ( verificar a variação dos níveis de céluas CD4+ ao
longo da progressão da doença).

1) – Questão Dissertativa ; Módulo 4 – Curso HIV

Se você fosse dono de um laboratório e quisesse realizar a monitoração de carga viral para HIV , qual dos
três métodos acima você empregaria ? Justificar a sua resposta.