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Captura por microdissecação a laser em infecções cervicais pelo

papillomavirus humano: Números de cópias de vírus em metilação


heterogênea de DNA de tecido canceroso e normal.
Mina Kalantari, Alejandro Garcia Carranca, Claudia Dalia Morales Vazquez,
Rosemary Zuna, Delia Perez Montiel, Itzel E. Calleja-Macias, Bo Johansson, Sonia
Andersson, Hans-Ulrich Bernard

O artigo “Captura por microdissecação a laser em infecções cervicais pelo


papillomavirus humano: Números de cópias de vírus em metilação heterogênea de
DNA de tecido canceroso e normal” é de autoria de Mina Kalantari do departamento
de biologia molecular e bioquímica da Universidade de Irvine na Califórnia; Alejandro
Garcia Carranca do instituto de investigações biomédicas da Universidade Nacional
Autônoma da cidade do México, México; Claudia Dalia Morales Vásquez do Instituto
de investigações biomédicas da Universidade Nacional Autônoma da cidade do
México, México; Rosemary Zuna do departamento de Patologia, Centro de ciências
da saúde da Universidade de Oklahoma, cidade de Oklahoma; Delia Perez Montiel
do Departamento de Patologia, Instituto Nacional de Cancerologia, México; Itzel E.
Calleja Macias do departamento de biologia molecular e bioquímica da Universidade
de Irvine na Califórnia; Bo Johansson da divisão de virologia clínica, departamento
de medicina laboratorial, Hospital Universitário Karolinska de Huddinge, Instituto
Karolinska, Sonia Andersson do Instituto de Ciências Clínicas, divisão de Obstetrícia
e Ginecologia do Hospital Universitário Karolinska, Huddinge, Instituto Karolinska;
Hans-Ulrich Bernard do departamento de biologia molecular e bioquímica da
Universidade de Irvine na Califórnia e do Programa em saúde Pública da
Universidade de Irvine, Califórnia.

Esses autores têm levado ao conhecimento da comunidade científica e da


população em geral vários estudos de grande relevância na área da saúde,
contribuindo assim na evolução dos conhecimentos e do desenvolvimento
tecnológico na área.

O artigo é dividido em cinco partes, sendo que a primeira é o resumo do texto,


onde eles discorrem sobre as partes mais importantes do mesmo. Demonstrando se
a técnica utilizada no estudo, através da análise de tumores, satisfaz o objetivo
proposto no início da pesquisa. Além de relatar os métodos e materiais utilizados
para se chegar ao resultado esperado.

A segunda parte é a introdução, onde os autores falaram sobre como a


biologia molecular do Papillomavirus tem sido extensivamente estudada, sobre como
estes estudos têm revelado informações cada vez mais detalhadas em relação ao
vírus. Falaram dos tipos prevalentes que estão relacionados com o câncer, os quais
são o HPV-16 e o HPV-18 que são sexualmente transmissíveis e que em uma
fração das mulheres infectadas desenvolvem uma neoplasia no colo uterino.
Segundo os autores a progressão histológica da neoplasia gera heterogeneidade
devido às seqüências de mutações e expansões clonais o que leva a termos poucas
informações sobre as alterações espaciais e temporais de infecções pelo HPV no
mesmo local anatômico. Esse problema pode ser superado pela técnica de captura
por microdissecação a laser, que utiliza um feixe de laser para fazer secções no
tecido sobre controle microscópico para isolar núcleos de células moleculares que
permitam a comparação das populações de células que são histologicamente ou
patologicamente distintas.

Pode-se observar que a técnica tem grande êxito e abri novos caminhos
sobre a histologia e a patologia molecular na pesquisa do câncer do colo do útero.

O estudo do DNA do HPV, utilizando LCM, procurou demonstrar se este está


restrito às células patologicamente distintas ou se está presente em células normais
adjacentes, a fim de compreender a doença subclínica e o conceito de latência do
HPV em biologia e patogênese, utilizando experiências-piloto para saber se o
mesmo DNA preparado pode ser usado para estudar a epigenética de genomas de
HPV.

Na terceira parte, os autores descrevem os resultados obtidos no decorrer da


pesquisa. Estes observaram que o número de cópias do genoma de HPV varia
muito de tumor para tumor. Concluído, portanto, que a técnica de PCR em tempo
real permite uma abordagem quantitativa, que é, no entanto, sensível à identificação
dos iniciadores e amplicons. Além de demonstrar um gene celular específico, bem
como o DNA a partir de aglomerados de células mesenquimais e epiteliais
escamosos fora do tecido canceroso. Análise de tecidos normais fora das margens
histológicas do tumor resultou em amostras positivas dando origem a um valor CT
para HPV-16 ou HPV-18, que pode ser interpretado como prova da presença de
DNA de HPV em populações de células histologicamente normais. Constatou-se que
a maioria das amostras continha menos de uma cópia de DNA de HPV por célula,
comprovando o baixo número de cópias de replicação de DNA de HPV em um
subgrupo de células histologicamente normais. Após ter sido feito o PCR em tempo
real para sinal de HPV nas amostras, foi confirmada a hipótese de que HPVs
normalmente não infectam o estroma. O estudo também demonstrou que o
flanqueamento do tecido normal gera um sinal que mostra que a dupla infecção por
diferentes tipos de HPV pode ocorrer em células vizinhas.

Na quarta parte, os autores discutem se os resultados encontrados estão de


acordo com o objetivo proposto no trabalho. O seguinte estudo confirmou que é
possível detectar o genoma HPV, bem como um gene no controle celular por
amostras gerada de LCM em formol-fixo e amostras de parafinas-embebidas com
alta sensibilidade de maneira semiquantitativa. Sendo o objetivo de a pesquisa
ajudar a compreender os fenômenos das infecções pelo HPV subclínico e latência,
não é possível resolver estas questões para HPVs, as observações sugerem que
squamous epiteliais histologicamente normal, adjacente, com remotas lesões
cancerosas, abriga genoma do HPV, porém é possível concluir que squamous
epiteliais do colo do útero histologicamente normal pode conter genomas de HPV.

Um aspecto importante foi à observação de que o genoma do HPV,


especificamente os genes L1, tendem a tornar-se hipermetilados como
conseqüência da recombinação do DNA celular. Como isso ocorre freqüentemente
durante a carcinogênese, mas não durante o ciclo de vida normal dos HPVs, a
metilação do gene L1 pode ser interpretada como um biomarcador de células
tumorais.

A investigação das amostras geradas por LCM são frequentemente pequenas


para os estudos epigenéticos. Com a análise de todo o tumor, observou-se que os
padrões de metilação heterogênea, indicam diversidade epigenéticas, mesmo em
pequenos aglomerados de células.

A pesquisa com LCM foi orientada pelas amostras formol-fixas, que não
permitem a abordagem restrição-ligadura, devido a necessidade de amplicons
maiores do que algumas centenas de pares de base, que só podem ser obtidos a
partir de amostras frescas.

Os autores se basearam nos estudos feitos por Chew et al., 2005a, 2005b,
que afirma que a LCM baseada em lesões de papilomavírus é uma técnica que
ajuda a confirmar a presença de HPV em células de adenocarcinomas endocervical.
A LCM também tem sido utilizado para o diagnóstico de DNA de cabeça-pescoço e
carcinomas epidermóides (HNSCCs) (Anderson et al., 2007), e para elucidar as
diferenças moleculares contida entre HPV e HPV independente HNSCCs (Pyeon et
al., 2007).

As publicações e os dados do estudo confirmam o poder da tecnologia LCM


para investigar as propriedades biológicas e a patogenicidade de infecções por
papilomavírus que variam entre as diversas células das populações afetadas pelo
vírus.

Na quinta e última parte, os autores relatam os materiais e os métodos


utilizados no estudo. As amostras de tecido consistiam de carcinoma de células
escamosas e glandulares de colo do útero, formol-fixas, parafinas-embebidas, a
partir de 26 pacientes que foram biopsiados ou submetidos à cirurgia. Treze dessas
amostras continham HPV-16, doze HPV-18, e uma amostra ambos os vírus,
baseado no diagnóstico através da detecção de amplicons após a PCR com o tipo
específico de oligonucleótidos. Os genótipos do HPV foram confirmados por análise
de DNA por PCR a partir de finas seções preparadas por LCM. A LCM foi usada
para dissecar grupos com o número de células variáveis, normalmente cerca de
1000, mas variam em algumas amostras de 100-2000 células. Foi utilizada a
preparação de DNA a partir de amostras geradas por LCM. Usou-se uma
abordagem da PCR em tempo real para detectar e quantificar o DNA de HPV-16 e
18. Foi utilizado o seqüenciamento por bissulfito para a determinação do status de
metilação dos genes L1 do HPV -16 e 18 e controle de regiões longas.

Como acadêmico do curso de Biomedicina e conhecedor das técnicas usadas


durante este estudo, bem como da importância do estudo de Papillomavirus é
possível dizer que as técnicas utilizadas ajudam a evitar ou minimizar o número de
erros que possam prejudicar no diagnóstico do vírus estudado, no caso o HPV. A
técnica de LCM é importante na pesquisa biológica ampliando o uso de técnicas de
biologia molecular já existente, pois possui uma alta sensibilidade para investigar as
infecções por papillomavirus, podendo até mesmo quantificar o genoma do HPV nos
tecidos infectados. O seqüenciamento por bissulfito é importante por complementar
o diagnóstico em doenças causadas por papillomavirus, fazendo a análise da
metilação do DNA, ou seja, verificar a epigenética. Com relação a PCR em tempo
real, é melhor utilizado devido sua rapidez que facilita no caso de cânceres o
diagnóstico precoce, além de diminuir as possibilidades de contaminação em
relação ao PCR normal. Podemos concluir que os estudos feitos utilizando as
técnicas empregadas nos dão uma maior segurança no diagnóstico de doenças
causadas por papillomavirus, abrindo atalhos para que possa haver mais estudos
relacionados ao tema..