Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra

Laboratório de Microbiologia

Disciplina: Microbiologia Geral Coloração de Gram

Objectivos:
- Aprender a preparar, observar e interpretar uma coloração de Gram
-Identificar a morfologia, tipo de agrupamento e reação à coloração de Gram de várias espécies
bacterianas
- Identificar fatores que alteram os resultados da coloração de Gram

Introdução:
A coloração de Gram é uma coloração dupla ou diferencial, isto é, utiliza dois corantes e permite
distinguir grupos de bactérias com base na sua capacidade de retenção desses corantes.
Os corantes utilizados são o violeta de genciana - corante primário; e a fucsina de ziehl diluída ou
safranina - corante secundário. Além dos corantes utiliza-se também um mordente e um
diferenciador.
O mordente - soluto de lugol (solução iodo-iodetada) - aumenta a afinidade do corante para a bactéria
e torna a coloração mais rápida e mais estável.
O diferenciador - álcool-acetona - é um agente de descoloração que vai descorar umas bactérias,
ficando outras coradas com o 1º corante.
Na coloração de Gram o corante primário é aplicado sobre um esfregaço bacteriano, corando todas
as células de roxo. De seguida cobre-se o esfregaço com o mordente, permanecendo todas as
células coradas de roxo. A aplicação do diferenciador descora algumas células permanecendo outras
coradas de roxo, devido a diferenças na estrutura química da parede celular. Por último, actua o
corante secundário, que cora as bactérias que foram descoradas por acção do diferenciador.
As bactérias que retêm o corante primário designam-se por bactérias de Gram positivo e aparecem
coradas de roxo. As bactérias coradas de rosa designam-se por bactérias de Gram negativo.
O tempo de descoloração é crítico na diferenciação das bactérias Gram positivas das bactérias de
Gram negativo, uma vez que uma exposição prolongada ao diferenciador pode acabar por remover o
corante das bactérias de Gram positivo, enquanto que uma exposição insuficiente pode não retirar
todo o corante pimário das bactérias de Gram negativo.
A natureza química da parede celular bacteriana é o factor predominante no resultado da coloração
de Gram. A idade das células ou factores físico ou químicos que comprometam a integridade da sua
parede celular, representam alguns dos factores que podem afectar o resultado da coloração.

Microbiologia geral - FFUC Coloração de Gram

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Laboratório de Microbiologia

Disciplina: Microbiologia Geral Coloração de Gram

Protocolo: Coloração de Gram

1. Preparar um esfregaço bacteriano
2. Cobrir o esfregaço com Violeta de Genciana e deixar actuar durante 30 segundos
3. Eliminar o excesso de corante
4. Cobrir o esfregaço com o Soluto de Lugol e deixar actuar durante 30 segundos
5. Rejeitar o excesso de mordente
6. Inclinar a lâmina e deixar cair GOTA a GOTA o diferenciador Álcool-Acetona durante 5 a 10
segundos.
7. Lavar IMEDIATAMENTE com água destilada
8. Cobrir o esfregaço com Fucsina de Ziehl diluída e deixar actuar durante 10 segundos
9. Eliminar o excesso de corante
10. Lavar com água destilada e secar o excesso de água (com papel na parte de trás) e à chama
muito rapidamente (para não partir)
11. Colocar uma gota de óleo de imersão sobre o esfregaço
12. Observar ao microscópio com a objectiva de imersão (100x), tendo o cuidado de abrir o diafragma
e subir o condensador

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Disciplina: Microbiologia Geral Coloração de Gram

Resultados:

Registe os resultados observados: morfologia, tipo de agrupamento e reacção tinturial

Suspensão bacteriana:

Espécies testadas:

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