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com
nutrientes
Artigo
A restrição calórica evita a disfunção metabólica e as alterações
nos neuropeptídeos hipotalâmicos associados à obesidade,
independentemente do teor de gordura na dieta de ratos
Marina Marteun 1Amaia Rodreuguez 2,3
Victoria Cataluman 2,3, Miguel López 3,4
----
---
Citação: Martín, M .; Rodríguez, A .;
Gómez-Ambrosi, J .; Ramírez, B .;
Becerril, S .; Catalán, V .; López, M .;
Diéguez, C .; Frühbeck, G .; Burrell,
MA Caloric Restriction Prevents
Disfunção Metabólica e as Mudanças
no Hipotalâmico
Neuropeptídeos associados à obesidade
independentemente do teor de gordura na
dieta de ratos. Nutrientes 2021, 13, 2128.
https://doi.org/10.3390/ nu13072128
Editores Acadêmicos:
Emiliana Giacomello, Luana Toniolo e
Marcellino Monda
Recebido: 14 de maio de 2021
Aceito: 15 de junho de 2021
Publicação: 22 de junho de 2021
Nota do editor: O MDPI permanece neutro
em relação às reivindicações jurisdicionais em
mapas publicados e afiliações institucionais.
Direito autoral: © 2021 pelos autores.
Licenciado MDPI, Basel, Suíça. Este
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creativecommons.org/licenses/by/
4.0 /).
Nutrientes 2021, 13, 2128. https://doi.org/10.3390/nu13072128
, Javier Gómez-ambrosi 2,3 , Beatriz Rameurez 2,3, Sara Becerril 2,3,
, Carlos Diéguez 3,4, Gema Frühbeck 2,3,5 e marçoeuum A. Burrell 1,3,*
1 Departamento de Patologia, Anatomia e Fisiologia, Universidade de Navarra, IdiSNA, 31008 Pamplona, Espanha;
mmartinr.1@unav.es
2 Laboratório de Pesquisa Metabólica, Cleunica Universidad de Navarra, IdiSNA, 31008 Pamplona, Espanha;
arodmur@unav.es (AR); jagomez@unav.es (JG-A.); bearamirez@unav.es (BR); sbecman@unav.es (SB);
vcatalan@unav.es (VC); gfruhbeck@unav.es (GF)
3 CIBER Fisiopatologeua de la Obesidad y Nutrición (CIBEROBN), Instituto de Salud Carlos III, 28029
Madrid, Espanha; m.lopez@usc.es (ML); carlos.dieguez@usc.es (CD)
4 Departamento de Fisiologia, CIMUS, Universidade de Santiago de Compostela-Instituto de Investigación
Sanitaria, 15782 Santiago de Compostela, Espanha
5 Departamento de Endocrinologia e Nutrição, Cleunica Universidad de Navarra, 31008 Pamplona, Espanha
* Correspondência: mburrell@unav.es ; Tel .: + 34-948-425600 (ramal 806247)
Resumo: A restrição de energia é a primeira terapia no tratamento da obesidade, mas os mecanismos
biológicos subjacentes não foram completamente esclarecidos. Analisamos os efeitos da restrição da dieta
hiperlipídica (HFD) na perda de peso, nos níveis circulantes de hormônios intestinais e na expressão de
neuropeptídeos hipotalâmicos. Ratos Wistar machos de dez semanas de idade (n = 40) foram distribuídos
aleatoriamente em quatro grupos: dois alimentados ad libitum com uma dieta normal (ND) (grupo N) ou um
HFD (grupo H) e dois submetidos a uma restrição calórica de 25% de ND (grupo NR) ou HFD (grupo HR ) por 9
semanas. Uma restrição de 25% de HFD ao longo de 9 semanas leva a uma perda de peso de 36% em relação ao
grupo alimentado com HFD ad libitum acompanhada por valores normais no índice de adiposidade e índice de
eficiência alimentar (FER). Essa restrição também acarretou a normalização da expressão do mRNA
hipotalâmico de NPY, AgRP e POMC, sem alterações no CART. A restrição calórica não conseguiu melhorar a
homeostase da glicose, mas reduziu a hiperinsulinemia induzida por HFD. Em conclusão, a restrição de 25% de
HFD reduziu a adiposidade e melhorou o metabolismo na obesidade experimental, sem alterações na glicemia.
A restrição do HFD desencadeou a normalização do NPY hipotalâmico,
Palavras-chave: restrição alimentar; hormônios intestinais; neuropeptídeos hipotalâmicos e obesidade
1. Introdução
A obesidade constitui um grande problema de saúde persistente relacionado ao aumento da morbidade
e mortalidade [1] A intervenção dietética ainda é considerada a pedra angular para o tratamento da obesidade
e suas alterações metabólicas associadas [2] Muitos pacientes com obesidade podem obter redução de peso
em curto prazo apenas com dieta, mas a manutenção do peso em longo prazo é muito mais difícil. O aumento
nas taxas de obesidade nos últimos 30 anos tem sido relacionado a aumentos no tamanho das porções de
alimentos baratos com alta densidade energética e palatáveis. Portanto, uma redução no tamanho da porção
parece uma alternativa lógica como uma primeira abordagem terapêutica antes de progredir para uma dieta
normal. As intervenções dietéticas devem ser personalizadas, adaptadas às preferências alimentares e permitir
abordagens flexíveis para reduzir a ingestão de calorias, a fim de fortalecer a motivação e adesão dos pacientes
com obesidade [3] A este respeito, vários estudos de controle mostraram que dietas com baixo teor de
carboidratos e alto teor de gordura (HFD) em pacientes com obesidade e diabetes induzem efeitos favoráveis
de curto prazo na perda de peso, glicose no sangue e insulina [4] A restrição calórica alivia múltiplas
complicações da obesidade e do envelhecimento,
https://www.mdpi.com/journal/nutrients
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incluindo resistência à insulina, dislipidemia, hipertensão, aterosclerose e inflamação sistêmica [5,

6] No entanto, não está claro se a perda de peso causada por uma HFD restrita é acompanhada
por modificações nos sinais envolvidos na regulação do peso corporal e da homeostase
energética.
O peso corporal é regulado por complexos mecanismos homeostáticos que incluem
interações entre órgãos periféricos e o sistema nervoso central [7] No hipotálamo, o núcleo
arqueado (ARC) constitui um dos principais centros reguladores de alimentação. Neurônios ARC
contendo os peptídeos orexigênicos neuropeptídeo Y (NPY) e peptídeo relacionado a agouti (AgRP)
e os fatores anorexigênicos proopiomelanocortina (POMC) e transcrito regulado por cocaína e
anfetamina (CART) recebem e integram informações sobre o estado metabólico [8,9] Essa
integração ocorre por meio de receptores para hormônios como a leptina, o peptídeo 1
semelhante ao glucagon (GLP-1), o peptídeo YY (PYY) e a grelina [10], e também detectando os
níveis circulantes de nutrientes, como glicose e ácidos graxos [11]
A hipótese do presente estudo era que a restrição calórica em ratos alimentados com uma HFD poderia
produzir benefícios metabólicos. Portanto, analisamos se a redução do peso corporal derivada de um HFD
restrito está ligada a modificações na homeostase da glicose, tamanho dos adipócitos, níveis de hormônio
intestinal e expressão de neuropeptídeos hipotalâmicos.

2. Materiais e métodos
2.1. Animais Experimentais e Desenho de Estudo
Ratos Wistar machos de dez semanas de idade (n = 40) (criadouro da Universidade de Navarra) com
peso corporal médio de 308 ± 11 g foram enjaulados individualmente em uma sala sob temperatura
controlada (22 ± 2 ◦C), umidade relativa (50 ± 10%), ventilação (pelo menos 15 trocas completas de ar / h)
e um ciclo claro-escuro 12h12 (luzes acesas às 8h00). Para analisar o efeito da obesidade induzida por
dieta e restrição calórica, os ratos foram divididos em quatro grupos dietéticos por 9 semanas (n = 10 /
grupo): ratos alimentados ad libitum com um ND (grupo N) (12,1 kJ: 4% de gordura, 82% de carboidratos
e 14% de proteína, dieta 2014S, Teklad Global Diets, Harlan, Barcelona, Espanha) ou um HFD (grupo H )
(23,0 kJ / g: 59% de gordura, 27% de carboidratos e 14% de proteína, dieta F3282; Bio-Serv, Frenchtown,
NJ, EUA) e ratos alimentados com um ND (grupo NR) ou um HFD (grupo HR) com um restrição calórica de
25%. Após jejum de 8 horas, os ratos foram sacrificados por decapitação. Amostras de sangue foram
coletadas imediatamente e os soros foram obtidos por centrifugação a frio (4◦C) em 700× g por 15 min e
armazenado em -20 ◦C. Os depósitos de tecido adiposo branco perirrenal, subcutâneo e epididimal (WAT)
foram colhidos, pesados e um pequeno fragmento dos tecidos adiposos foi fixado em formaldeído a
4%. O cérebro também foi dissecado e congelado para estudo da expressão de neuropeptídeos
hipotalâmicos. Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as Diretrizes
Européias para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (diretriz 2010/63 / EU) e foram aprovados
pelo Comitê de Ética para Experimentação Animal da Universidade de Navarra (049/10).

2.2. Peso corporal, composição corporal e índice de eficiência alimentar

O peso corporal foi registrado duas vezes por semana e a ingestão alimentar foi monitorada
diariamente. O índice de adiposidade foi calculado como a soma do peso dos depósitos WAT perirrenal,
subcutâneo e epididimal em valores absolutos (g) ou relativos (g / peso corporal). A taxa de eficiência
alimentar (FER) foi determinada como peso corporal ganho por semana dividido pela energia total (kcal)
consumida durante este período.

2.3. Medições de sangue

As concentrações de glicose sérica foram determinadas com um sensor de glicose
automático sensível (Ascensia Elite, Bayer, Barcelona, Espanha). As concentrações séricas de
leptina, PYY, GLP-1 e insulina em jejum foram medidas usando um kit de painel de hormônio
intestinal de rato MILLIPLEX ™ MAP (RGT-88K Millipore Corporation, Billerica, MA, EUA) de acordo
com as recomendações do fabricante. Os níveis séricos totais de grelina foram avaliados usando
um kit ELISA comercial (EZRGRT-91K, Millipore). Os coeficientes de variação intra e inter-ensaio
para medições da grelina total foram <5%.
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2.4. Análises Histológicas

Amostras subcutâneas de WAT foram fixadas em formaldeído a 4%, embebido em paraf-Five
fin. µAs seções-m foram coradas com hematoxilina-eosina. Três campos por seção
de cada animal foram fotografados com os 20× objetivo e diâmetros de, no mínimo, 100
adipócitos / seção foram determinados com o plugin do software Adiposoft (versão 1.13) do
software ImageJ (MATLAB).

2,5. Hibridização in situ para neuropeptídeos hipotalâmicos

Seções cerebrais coronais do criostato (16 µm) foram obtidos e armazenados em -80 ◦C até a
hibridização. A hibridização in situ foi realizada conforme descrito anteriormente [12] As seções
foram sondadas com oligonucleotídeos específicos para AgRP, CART, NPY e POMC (Tabela1) Essas
sondas eram 3′extremidade marcada com 35S-αdATP (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA) usando
desoxinucleotidil transferase terminal (New England Biolabs; Ipswich, MA, EUA). A incubação das
seções com um excesso de sondas não marcadas permitiu confirmar a especificidade das sondas.
As secções congeladas foram tratadas com paraformaldeído a 4% em tampão fosfato 0,1 mol / L
(pH 7,40) à temperatura ambiente (TA) durante 30 min e depois desidratadas usando 70, 80, 90,
95% e etanol absoluto (5 min cada). A hibridização foi realizada durante a noite a 37◦C em uma
câmara úmida. A solução de hibridização continha 0,5× 106 cpm (AgRP, CART e POMC) ou 1 × 106
(NPY) cpm por lâmina da sonda rotulada, 4× tampão de citrato de sódio salino (SSC), formamida
50% desionizada, 1× Solução de Denhardt, 10% de sulfato de dextrana e 10 µDNA de
espermatozóide de salmão de filamento único tosado g / mL (todos eles, Sigma-Aldrich; St. Louis,
MO, EUA). Em seguida, as seções foram lavadas em 1× SSC em RT, quatro vezes em 1× SSC em 42 ◦
C (30 min por lavagem), uma vez em 1× SSC à temperatura ambiente por 1 h e, em seguida,
enxaguado em água e etanol. Finalmente, as seções foram secas ao ar e expostas ao Hyperfilm β-
Max (KODAK; Rochester, NY, EUA) em temperatura ambiente. Todas as lâminas foram expostas nas
mesmas condições e desenvolvidas em revelador / reforçador (Revelador G150, AGFA HealthCare:
Mortsel, Bélgica) e Fixador (Fixação manual G354; AGFA HealthCare: Mortsel, Bélgica). As seções
foram escaneadas e o sinal de hibridização foi medido por densitometria usando o software
ImageJ-1.33 (NIH; Bethesda, MD, EUA). A densidade óptica (OD) do sinal de hibridização foi
quantificada e corrigida pela OD de seu valor de fundo adjacente. Um retângulo foi delineado,
sempre com as mesmas dimensões, envolvendo o sinal de hibridização sobre cada núcleo e sobre
as áreas cerebrais adjacentes de cada seção [12] Foram utilizadas dezesseis a vinte seções para
cada animal (4-5 lâminas com 4 seções por lâmina), e a média foi usada como valor de
densitometria para cada animal.

Tabela 1. Lista de oligonucleotídeos de hibridização in situ.

Gene ID GenBank Sequência (5′-3′)

Agrp NM_033650.1 CGACGCGGAGAACGAGACTCGCGGTTCTGTGGATCTAGCACCTCTGCC

Carrinho NM_017110 CCGAAGGAGGCTGTCACCCCTTCACA
Npy NM_012614.2 AGATGAGATGTGGGGGGAAACTAGGAAAAGTCAGGAGAGCAAGTTTCATT
Pomc NM_139326 TCCATAGACGTGTGGAGCTG
Agrp, neuropéptido relacionado com agouti; Carrinho, prepropeptídeo transcrito regulado por cocaína e anfetamina; Npy, neuropeptídeo Y;Pomc,
proopiomelanocortina.

2.6. Análise Estatística

Os dados são mostrados como médios ± SEM. As diferenças entre os grupos foram analisadas por
uma ANOVA de duas vias (dieta× restrição calórica) ou uma ANOVA unilateral seguida pelo teste post
hoc da diferença mínima significativa (LSD), se uma interação foi detectada. As análises estatísticas
foram realizadas no software SPSS v. 15.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA).
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3. Resultados

3.1. A restrição calórica melhorou o fenótipo obeso mesmo em ratos alimentados com HFD

Como mostrado na figura 1A, todos os grupos experimentais exibiram peso corporal
semelhante durante os primeiros 3-4 dias do experimento. Diferenças significativas foram
identificadas a partir do dia 3. Como esperado, o grupo H apresentou o maior peso corporal
(507± 18 g) ao final do experimento, quase dobrando o inicial, enquanto o grupo NR exibiu a
menor massa corporal (329 ± 4 g). Particularmente relevante foi a evolução do grupo HR, que
apresentou peso corporal semelhante ao do grupo N ao longo do período experimental (p =
0,165), sendo ainda menor ao final do estudo.

Figura 1. Curvas de crescimento do peso corporal (UMA), porcentagem de ganho de peso (B) e adiposidade de corpo
inteiro em absoluto (C) e parente (D) valores dos quatro grupos experimentais durante as 9 semanas de intervenções
dietéticas. uma p < 0,05 efeito da dieta; b p < 0,05 efeito da restrição calórica. ***p < 0,001 vs. o mesmo grupo
alimentado com um ND; †††p < 0,001 vs. o mesmo grupo alimentado ad libitum.

A porcentagem de aumento de peso corporal em cada grupo durante as 9 semanas do experimento é

ilustrada na Figura 1B. Como esperado, os grupos alimentados com um HFD mostraram um ganho de peso
maior do que aqueles alimentados com uma dieta normal (p < 0,0001) (Figura 1B) e índices de adiposidade
relativa e absoluta mais elevados (Figura 1CD). Os grupos alimentados ad libitum experimentaram uma
porcentagem mais pronunciada de aumento de peso corporal do que os grupos correspondentes submetidos à
restrição calórica (p < 0,0001). A comparação entre os grupos N e FC foi novamente digna de nota, visto que o
percentual de aumento do peso corporal (p = 0,124), bem como absoluto (p = 0,988) (Figura 1C) e relativo (p =
0,721) (Figura 1D) os valores do índice de adiposidade foram semelhantes nos dois grupos.

A observação histológica de amostras WAT subcutâneas dos quatro grupos revelou

diferenças evidentes no tamanho dos adipócitos (Figura 2) Como esperado, o grupo H apresentou
a maior porcentagem de adipócitos grandes (diâmetro> 150µm) (Figura 2C), enquanto o grupo NR
apresentou a maior porcentagem de pequenos adipócitos (diâmetro <150 µm) (Figura 2B). O WAT
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do grupo HR exibiu adipócitos hipertróficos (diâmetro ≥ 250 µm) intercalados entre uma
população majoritária de pequenos adipócitos (diâmetro ≤ 50 µm) (Figura 2D).

Figura 2. Distribuição do diâmetro dos adipócitos de WAT subcutâneo obtido de ratos alimentados com uma dieta
normal (ND) (UMA) ou uma dieta rica em gordura (HFD) ad libitum (C) ou sujeito a uma restrição calórica de 25% de ND
(B) ou HFD (D) por 9 semanas. Seções histológicas representativas de WAT subcutâneo coradas com hematoxilina-
eosina são mostradas na parte superior dos histogramas.

3.2. A restrição calórica reduz a eficiência alimentar, independentemente do tipo de dieta

Uma vez que o ND e o HFD fornecem um conteúdo de energia diferente, a ingestão de alimentos é
ilustrada tanto como gramas totais de alimentos consumidos e as quilocalorias correspondentes ingeridas
(Figura 3) A evolução da ingestão de alimentos em gramas em relação ao peso corporal (Figura3A, C) revelou
maior consumo de alimentos em grupos alimentados com uma dieta normal com ou sem restrição calórica (p <
0,0001). No entanto, os grupos alimentados com um HFD ingeriram mais calorias (p < 0,0001) (Figura 3B, D) e
exibiu um FER maior (p < 0,0001) (Figura 3C) do que aqueles alimentados com uma dieta normal. Não foram
observadas diferenças significativas no conteúdo de energia total dos alimentos ingeridos pelos grupos N e HR (
p = 0,916), nem nos valores FER (p = 0,193).
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Figura 3. Curvas de ingestão diária de alimentos em gramas (UMA) e quilocalorias (B) dos animais experimentais (n =
10 por grupo). Os gráficos de barras representam a ingestão alimentar cumulativa em relação ao peso corporal em
gramas (C) e em quilocalorias (D), bem como índice de eficiência alimentar (FER) (E) durante intervenções dietéticas. uma
p < 0,05 efeito da dieta; b p < 0,05 efeito da restrição calórica. ***p < 0,001 vs. o mesmo grupo alimentado com um ND;
†††p < 0,001 vs. o mesmo grupo alimentado ad libitum; ###p < 0,001 vs. N.

3.3. Restrição calórica melhorou o perfil metabólico mesmo em ratos alimentados com HFD

As características gerais do perfil metabólico de animais experimentais durante as

intervenções dietéticas estão resumidas na Figura 4. O consumo de um HFD aumentou tanto a
glicose (p < 0,0001) e insulina (p < 0,0001) concentrações, enquanto a restrição diminuiu apenas os
níveis circulantes de insulina (p < 0,0001) (Figura 4A, B). Os grupos N e HR tiveram insulinemia
semelhante (p = 0,614), mas a glicemia foi maior no grupo HR (p < 0,01) (Figura 4A, B).
De acordo com os dados do índice de adiposidade, a leptinemia foi aumentada nos grupos
alimentados com HFD e ad libitum (p < 0,001) (Figura 4C). Além disso, como esperado, o consumo
de HFD diminuiu os níveis de grelina (p < 0,0001), enquanto a restrição os aumentou (p < 0,05)
(Figura 4D). No caso do GLP-1 circulante, nenhuma alteração foi observada entre os quatro grupos
(Figura4E). As concentrações séricas de PYY diminuíram nos grupos alimentados com um HFD (p <
0,05) (Figura 4F). Curiosamente, os grupos N e HR mostraram leptinemia semelhante
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(p = 0,266) (Figura 4C) e grelinemia (p = 0,196) (Figura 4D), mas diferentes níveis séricos de
PYY, que eram maiores no grupo N (p < 0,05) (Figura 4F).

Figura 4. Glicose sérica em jejum (UMA), insulina (B), leptina (C), grelina total (D), GLP-1 (E) e PYY (F) níveis dos
quatro grupos experimentais. uma p < 0,05 efeito da dieta; b p < 0,05 efeito da restrição calórica.

3.4. Restrição calórica melhorou o perfil metabólico mesmo em ratos alimentados com HFD

A expressão dos neuropeptídeos hipotalâmicos que controlam o apetite, NPY, AgRP, POMC e
CART foi medida por hibridização in situ (Figura 5) O tipo de dieta e a restrição afetaram os
neuropeptídeos orexígenos NPY e AgRP de maneira diferente. O efeito da restrição na expressão
de NPY dependeu do tipo de dieta (Figura5A), de modo que a restrição da dieta normal causou
uma diminuição no NPY (p < 0,01). Em contraste, a restrição do HFD aumentou o NPY (p < 0,01).
AgRP foi diminuído nos grupos alimentados com HFD (p < 0,05) e aumentou nos grupos
alimentados com dieta restrita, embora tenha havido apenas um efeito marginal (p = 0,055) em
dieta normal e HFD (Figura 5B). Curiosamente, N e HR apresentaram
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expressão comparável de NPY, AgRP e POMC, mas não de CART. A expressão de CART foi menor
nos grupos alimentados com o HFD (p < 0,05) e ad libitum (p < 0,0001) (Figura 5D).

Figura 5. Expressão gênica hipotalâmica de neuropeptídeos NPY (UMA), AgRP (B), POMC (C) e CART (D) no
núcleo arqueado dos quatro grupos experimentais. uma p < 0,05 efeito da dieta; b p < 0,05 efeito da restrição
calórica. *p < 0,05; **p < 0,01 vs. o mesmo grupo alimentado com um ND; ††p < 0,01 vs. o mesmo grupo
alimentado ad libitum.

4. Discussão
A carga global significativa de sobrepeso e obesidade requer estratégias de estilo de vida que facilitem o
controle do peso corporal a longo prazo. Os programas dietéticos de perda de peso baseiam-se principalmente
na diminuição do teor de gordura ou carboidrato nos alimentos, juntamente com uma redução importante no
tamanho da refeição [13] Embora essa redução frequentemente resulte em perda de peso inicial, os pacientes
com obesidade muitas vezes não conseguem manter o tratamento [14] Numerosos estudos apoiam os efeitos
benéficos da restrição alimentar, mas apenas alguns deles analisaram os resultados da restrição de um HFD [15
-17] Além disso, os resultados disponíveis são difíceis de comparar porque esses estudos diferem em vários
parâmetros (espécie / humanos, duração do período experimental ou porcentagem de restrição de ingestão). O
presente estudo demonstra que a restrição de 25% de uma HFD por 9 semanas levou a uma evolução do peso
corporal e índice de adiposidade semelhantes à ingestão ad libitum de uma dieta normal. Outros autores
concluíram que os animais alimentados com um HFD com conteúdo calórico semelhante ao do grupo de
controle acarretam aumento da adiposidade na ausência de alterações significativas no peso corporal [18] e
que a composição corporal não é normalizada, a menos que a gordura dietética seja reduzida [19] No entanto,
nossos resultados em relação à ingestão de alimentos demonstram claramente que a ingestão de dietas com o
mesmo conteúdo calórico, mas com diferentes quantidades de gordura, leva à normalização do peso corporal e
da adiposidade corporal. Assim, o conteúdo de gordura na dieta não é o único determinante da gordura
corporal quando a ingestão calórica não é excessiva.
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A ingestão de dietas com alto teor de gordura exerce efeitos deletérios no metabolismo,
principalmente na homeostase da glicose. Estudos anteriores indicam que a restrição energética diminui
a glicose plasmática e melhora a tolerância à glicose e a sensibilidade à insulina [20,21], mesmo ao
restringir um HFD [22] Nossos dados revelaram que a ingestão de um HFD restrito resulta em valores
normais de insulina, mas glicemia mais elevada, sugerindo a persistência da resistência à insulina, que
está relacionada ao tipo de dieta e não à quantidade de perda de peso ou teor de gordura corporal.

A melhora da homeostase da glicose geralmente está associada a modificações na morfologia do

tecido adiposo [23] A hiperplasia e hipertrofia de adipócitos são independentes do peso corporal, mas se
correlacionam com a sensibilidade à insulina [23-25] De forma consistente, observamos diferenças
evidentes no tamanho dos adipócitos entre os grupos alimentados com a dieta normal ad libitum e com
o HFD restrito. O grupo HR apresentou uma população heterogênea de adipócitos contendo adipócitos
muito grandes e muito pequenos. Essas observações concordam com outros autores que relatam que
indivíduos com obesidade cujos depósitos de gordura são constituídos predominantemente por alguns
adipócitos grandes exibem maior intolerância à glicose do que aqueles indivíduos com o mesmo grau de
obesidade, mas com muitos adipócitos pequenos [24] Assim, o tamanho aumentado dos adipócitos pode
ser considerado um marcador independente de resistência à insulina e hiperleptinemia [26] Os
mecanismos subjacentes responsáveis pela dimensão das células de gordura são complexos e parecem
estar relacionados à dinâmica de armazenamento de adipócitos e taxa de remoção em diferentes locais
e situações metabólicas [23,27,28] Os dados do nosso estudo sugerem que não apenas a distribuição,
mas também a morfologia do WAT devem ser considerados ao avaliar a homeostase da glicose e
obesidade.
A desregulação da homeostase da glicose causada pela ingestão de um HFD também pode
levar a modificações de alguns peptídeos reguladores, como GLP-1 ou PYY. Além de melhorar a
glicemia [29], O GLP-1 reduz o apetite, apoiando assim seu uso no tratamento da obesidade e suas
comorbidades [30,31] No presente estudo, as concentrações séricas de GLP-1 permaneceram
inalteradas, o que está de acordo com observações anteriores [32] No entanto, outros autores
sugerem que mais de 11 semanas de modificações na ingestão resultam em uma mudança
progressiva na concentração de GLP-1 circulante [33] Portanto, parece plausível que a duração de
nossa intervenção dietética não seja suficiente para detectar modificações significativas no GLP-1.
Por outro lado, diferentes estudos têm mostrado a relevância do PYY na etiologia da obesidade e
diabetes tipo 2 [34-36] PYY atua no hipotálamo para ativar os neurônios da melanocortina que
afetam a sensibilidade à insulina [37] Nossos dados estão de acordo com esta observação, uma vez
que a ingestão de HFD levou a uma redução significativa nas concentrações de PYY. Ao comparar
os grupos N e HR, os níveis séricos de PYY foram menores no grupo HR. A hipótese de que o
controle glicêmico seria melhorado com HFD restrito não foi apoiada pelos resultados do estudo.
Parece que o perfil hormonal que melhora a secreção de insulina inclui a elevação dos níveis de
PYY e GLP-1 [38]
A grelina e a leptina constituem fatores cruciais para o controle da composição corporal e
homeostase da glicose. Muitos estudos determinaram que a presença de macronutrientes específicos no
lúmen do trato gastrointestinal influencia as concentrações séricas de diferentes hormônios
gastrointestinais [39-41] A análise global da influência do tipo de dieta e restrição resultou em diferenças
significativas nos níveis circulantes de grelina e leptina. Vale ressaltar que não foram encontradas
diferenças significativas na comparação dos grupos N e HR. Considerando a evolução paralela do peso
corporal e da ingestão energética de ambos os grupos, pode-se concluir que as modificações na grelina
e na leptina são influenciadas principalmente pela composição corporal. No caso da leptina, essa
correlação é clara, uma vez que WAT é a principal fonte de leptina [42] Relatos de modificações na
circulação da grelina após a alimentação de dietas com diferentes macronutrientes são altamente
variáveis [43-45] Embora os primeiros estudos com grelina indicassem seu papel fundamental no
controle da ingestão de alimentos [46-48], com base no presente estudo, uma correlação direta entre a
secreção de grelina e a composição corporal também pode ser sugerida. Novos insights indicam que a
ablação induzida de células de grelina em camundongos adultos não diminui a ingestão de alimentos e o
peso corporal, portanto, a grelina pode não ser tão determinante no controle do apetite e
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peso corporal [49] Assim, o sistema de grelina pode ter evoluído para desempenhar um papel na
proteção contra a fome e a hipoglicemia [50] como parece ocorrer no grupo NR.
Para avaliar diretamente os efeitos metabólicos de restringir um HFD no ARC, medimos a
expressão de neuropeptídeos hipotalâmicos. Os alvos neuronais prototípicos de primeira ordem
da ação da leptina, insulina e grelina são os neurônios catabólicos POMC / CART e os anabólicos
NPY / AgRP. Esses neurônios desencadeiam efeitos opostos no balanço energético e são regulados
reciprocamente por mudanças nos estoques de energia. As respostas adaptativas às perturbações
na massa gorda corporal envolvem mudanças na atividade dos neurônios NPY / AgRP e POMC /
CART no ARC. Alimentar um HFD produz uma diminuição na expressão de NPY hipotalâmico e
AgRP [7,51] Em contraste, a restrição aumenta a expressão de NPY / AgRP [52] e diminui o POMC /
CART [53] Nossos dados estão apenas parcialmente de acordo com essas premissas gerais. Em
primeiro lugar, a expressão anormal mais baixa de NPY no grupo NR poderia ser explicada pelo
fato de que a grelina induz efeitos orexigênicos em condições de alimentação livre, mas não tem
efeito em animais sob condições de balanço energético negativo, como restrição alimentar crônica
[54] Os grupos N e HR mostraram uma expressão semelhante de NPY, AgRP e POMC. Este achado
não é surpreendente, visto que ambos os grupos apresentaram peso corporal, índice de
adiposidade, ingestão total de calorias e FER semelhantes. No entanto, a menor expressão de
CART no grupo HR em comparação com o grupo N não segue essa tendência. Alguns autores
relataram que a TARC afeta vários processos biológicos na homeostase de lipídeos e glicose.
Dependendo do contexto hormonal, CART tem efeitos semelhantes aos da insulina ou
antagonistas da insulina [55,56] Consequentemente, a menor expressão de CART no grupo HR
pode estar relacionada à desregulação da homeostase da glicose observada neste grupo. Em linha
com nossas observações, vários estudos relataram correlações incongruentes da expressão
hipotalâmica de fatores orexigênicos NPY e AgRP, bem como peptídeos anorexigênicos POMC e
CART sob condições de restrição calórica e / ou ambiente obesogênico [57,58] Curiosamente, o
perfil molecular de neurônios hipotalâmicos em uma resolução de célula única revelou grupos
molecularmente distintos de neurônios que expressam AgRP e POMC com funções metabólicas
potencialmente divergentes, regulação hormonal e resposta a mudanças dietéticas [59-62] Devido
à complexidade da regulação desses centros hipotalâmicos, mais estudos são necessários para
desvendar o mecanismo pelo qual diferentes dietas afetam a expressão dos neuropeptídeos
hipotalâmicos.

5. Conclusões
Em conclusão, a ingestão restrita de HFD leva a uma redução no peso corporal, adiposidade,
FER, grelina circulante e níveis de leptina semelhantes aos produzidos por uma dieta normal ad
libitum. Além disso, a restrição de HFD também normaliza a expressão de NPY, AgRP e POMC no
ARC, mas não melhora a homeostase da glicose. Níveis alterados de expressão circulante de mRNA
de PYY e CART no ARC podem estar envolvidos na desregulação glicêmica. A restrição de um HFD
pode ser usada como uma terapia inicial em pacientes com sobrepeso e obesos, a fim de alcançar
melhorias importantes no estado de energia antes de progredir para uma dieta normal. O
desenvolvimento de intervenções dietéticas de primeiro passo que não envolvam uma mudança
dramática na dieta habitual de pessoas com sobrepeso ou obesidade pode representar uma
alternativa interessante nos estágios iniciais do tratamento da obesidade.

Contribuições do autor: Conceptualização, MM, JG-A., MAB e GF; metodologia, MM, AR, JG-A., BR,
SB, VC, ML, CD e MAB; análise formal, MM, AR, JG-A., BR, SB, VC,
ML, CD e MAB; redação - preparação do rascunho original, MM e MAB; redação - revisão e edição,
MM, AR, JG-A., BR, SB, VC, ML, CD, GF e MAB; supervisão, MM e MAB; aquisição de financiamento,
AR, ML e GF Todos os autores leram e concordaram com a versão publicada do manuscrito.

Financiamento: Este trabalho foi apoiado pelo Ministerio de Economeuay Competitividad

(SAF2015-71026R) e Fondo de Investigación Sanitaria-FEDER (PI19 / 00785 e PI19 / 00990). CIBEROBN é
uma iniciativa do Instituto de Salud Carlos III, Espanha.
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Declaração do Conselho de Revisão Institucional: Todos os procedimentos experimentais seguiram as

Diretrizes Européias para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (diretriz 2010/63 / EU) e foram aprovados
pelo Comitê de Ética para Experimentação Animal da Universidade de Navarra (049/10).

Declaração de disponibilidade de dados: Os dados apresentados neste estudo estão disponíveis mediante solicitação ao autor
para correspondência. Os dados não estão disponíveis publicamente devido a restrições de privacidade.

Agradecimentos: Os autores agradecem a todo o pessoal do Criadouro da Universidade de Navarra, em

particular Elena Ciordia, Juan Percaz e Eneko Etxetxikia. Também expressamos nossa gratidão a Javier
Garceua por sua ajuda especializada com os estudos histológicos.

Conflitos de interesse: Os autores declaram não haver conflito de interesses.

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