AulasT28&T29 Azoto

05/05/2020
Fisiologia
Vegetal
2019/2020
Aulas T-28, T-29 e T-30

Metabolismo do azoto, do
enxofre e do fósforo
Luísa Carvalho (lcarvalho@isa.ulisboa.pt)
1
Capítulo III - Metabolismo do azoto,

do enxofre e do fósforo
• Introdução ao metabolismo primário de compostos de azoto e enxofre.

• Assimilação do azoto: as enzimas assimilatórias redutoras do nitrato, nitrato e nitrito
redutases.
• Regulação da actividade da nitrato redutase.
• Incorporação do amoníaco em compostos orgânicos.
• A síntese do glutamato pelo ciclo glutamina sintetase/glutamato sintase e pela via da
glutamato desidrogenase.
• Ciclo fotorrespiratório do azoto.
• Assimilação do enxofre: redução assimiladora do sulfatião pelas plantas superiores -
activação e redução do sulfato; assimilação do sulfureto em cisteína.
• Regulação da assimilação do sulfato.
• Interacção entre o metabolismo do azoto e do enxofre: o papel do aminoácido O-
acetilserina.
• Assimilação do fósforo. 2
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Azoto
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Introdução
•Ciclos biogeoquímico e biológico do azoto

•Formas de azoto disponíveis e utilizadas
pelas plantas: nitrato, amónio e
dinitrogénio
•Importância dos compostos biológicos de
azoto nos organismos vivos 4
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Formas de azoto inorgânico disponíveis e utilizadas pelas plantas:

•Nitrato (NO3-)
•Amónio (NH4+) / amoníaco (NH3)
•Dinitrogénio ou azoto molecular (N2)
Ciclo do azoto
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Taxas anuais de fixação de N2 (Teragrama,Tg 1012 g = 106 ton)

Não biológica
Raios : 10 Tg
Síntese de fertilizantes : 50 Tg
Combustão de combustíveis fosséis : 20 Tg
Biológica
Terrestre (agrícola e florestal): 140 Tg
Marinha: 35 Tg
Formas de azoto inorgânico disponíveis para

plantas e microorganismos autotróficos
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Principais formas de azoto inorgânico disponíveis para

plantas e microrganismos: N2, NO3- e NH4+
•N2 Os organismos que fazem a fixação biológica do azoto contêm um

compexo multienzimático – a nitrogenase – capaz de quebrar a ligação
covalente tripla que une os dois átomos de azoto do N2. Nas plantas da
família das Leguminosas, estabelece-se uma relação simbionte entre
uma bactéria fixadora do azoto (do género Rhizobium), que fornece
NH4+ à planta, e a planta, que abastece a bactéria de fotoassimilados
(i.e., hidratos de carbono). A nitrogenase é inibida pelo O2, o que
justifica a presença da leg-hemoglobina nos nódulos, que ficam, assim,
avermelhados. A parte proteica da leg-hemoglobina é fornecida pela
planta e o respectivo grupo heme pela bactéria simbionte.
Principais formas de azoto inorgânico disponíveis para

plantas e microrganismos: N2, NO3- e NH4+
•NO3- Trata-se de uma forma de azoto que pode ser absorvida e

armazenada nos vacúolos das folhas das plantas. A sua redução ao
nível de amoníaco dá-se pela acção sequencial de duas importantes
enzimas, que consomem potencial redutor produzido pelas reacções
fotoquímicas da fotossíntese: a nitrato redutase (NR), que reduz o
nitrato a nitrito, e a nitrito redutase (NiR), que reduz o nitrito a
amoníaco.
• NH4+ Trata-se de uma forma tóxica de azoto, não podendo, por isso,
acumular-se nas células (desacopla as cadeias de transporte de
electrões). O amónio é assimilado, isto é, incorporado em
aminoácidos pelo funcionamento do ciclo da glutamina sintetase /
glutamato sintase (GS-GOGAT).
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pode ser definida como o processo pelo qual o azoto passa de

formas inorgânicas para combinação orgânica.
• à semelhança da assimilação do carbono e do enxofre (e
contrariamente à do fósforo), é feita por plantas e microrganismos.
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Ciclos de N na atmosfera
Ciclos de N na atmosfera à medida que passa da forma gasosa a iões

reduzidos antes de ser incorporado em compostos orgânicos nos
organismos. 12
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Importância dos compostos biológicos de azoto

nos organismos vivos
O azoto é um componente essencial de
-Aminoácidos, péptidos e proteínas;
- Nucleótidos, oligonucleótidos e ácidos
nucleicos;
- …e uma variedade enorme de outras
biomoléculas importantes.
Locais de síntese proteica na célula vegetal.
Importância dos compostos de

azoto no fluxo de informação
entre genes e proteínas. 13
Importância dos compostos biológicos com azoto

nos organismos vivos
Indoleacetic
acid (IAA)
Chlorophyll a
Alanine
Nicotine
Zeatin
Alguns compostos de azoto como

os alcalóides são sintetizados
apenas pelas plantas
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RUBISCO: exemplo de uma

proteína complexa das
plantas:
8 cópias da sub-unidade
grande (~53 kDa, síntese
no cloroplasto)
8 cópias de sub-unidade
pequena (~14 kDa, síntese
no citoplasma)
Nomes dos aminoácidos, abreviaturas com três letras ou

com uma letra.
Codões: no processo de tradução a leitura de cada três
nucleótidos de mRNA corresponde a inserção de um
aminoácido na cadeia polipeptídica
15
Para se manterem competitivas face aos microorganismos, as

plantas desenvolveram mecanismos de absorção rápida de iões
da solução do solo:
• Sistemas radiculares extensos, que
continuamente removem os nutrientes da
zona do solo à sua volta.
• As raízes fazem frequentemente
associações com fungos micorrízicos, que
aumentam o volume de solo coberto
pelas raízes (em associação), aumentando
assim a absorção de elementos minerais.
Nas elevadas concentrações que são

comuns após a fertilização azotada, a
absorção de nitrato e de amónio pelas
raízes pode exceder a capacidade que a
planta tem de assimilar esses iões,
levando à sua acumulação.
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Nitrato em excesso pode ser tóxico
As plantas podem armazenar

elevados níveis de nitrato ou
podem translocá-lo de uns
tecidos para outros sem efeitos
negativos. No entanto, em
animais, o excesso de nitrato
provoca meta-hemoglobinemia,
uma doença na qual o fígado
reduz o nitrato a nitrito, que se
liga à hemoglobina e a converte
numa forma que não se liga ao
oxigénio (meta-hemoglobina).
Os animais também podem
converter nitrato em
nitrosaminas, que são
cancerígenas.
17
Membrana:
Amónio em excesso pode tilacoide, num cloroplasto
ser tóxico Membrana mitocondrial na mitocondria
tonoplasto num vacuolo de uma célula de
• Ao contrário do nitrato, elevados raíz
níveis de amónio são tóxicos tanto
para plantas como para animais. O
amónio desacopla as cadeias de
transporte de electrões da
mitocôndria e do cloroplasto, isto
é, permite a continuação do fluxo
de electrões sem a correspondente
síntese de ATP de acordo com a
teoria quimiosmótica, e que
também é usado para armazenar
metabolitos nos vacuolos.
estroma, lumen, espaço

matriz, ou intermembranar
citoplasma ou vacuolo
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Amónio em excesso pode ser tóxico (cont.)

Amónio (NH4+) e amoníaco (NH3): a
membrana do tilacóide (como a
membrana interna da mitocôndria) é
impermeável ao H+, mas permeável ao
NH4+ e ao NH3.
Se [NH4+] na mitocôndria (nas plantas,
produzido pela fotorrespiração),
citoplasma ou cloroplasto aumenta, a
forma NH3 predomina no estroma do
cloroplasto devido ao pH alto.
O NH3 entra no lúmen do tilacóide.
Devido ao pH ser aqui relativamente
mais baixo, o NH3 tem tendência para
captar um protão, transformando-se em
NH4+.
Este sai do tilacóide e entra no estroma do cloroplasto, onde o pH é mais alto e
aí o NH4+ perde o protão e converte-se em NH3. Este NH3 entra no tilacóide e sai
de lá protonado (na forma de NH4+), ou seja desfaz-se o gradiente
19
electroquímico de pH e não ocorre síntese de ATP.
Excesso de Azoto
• Quando há muito N disponível, ocorre um crescimento vegetativo excessivo;
as células dos caules expandem, dando origem a caules frágeis, com
tendência a cair com chuva forte ou vento (caso típico da acama dos
cereais).
• Aplicações excessivas de N podem retardar a maturação e tornar as plantas
susceptíveis a doenças (particularmente a fungos) e a pragas de insectos.
Esses problemas são especialmente graves se houver falta de outros
nutrientes, como K.
• Excesso de N diminui a qualidade da cultura, resultando em frutos e
vegetais com cor e sabor indesejáveis e baixos níveis de açúcar e vitaminas.
A produção de flores em plantas ornamentais é reduzida em favor da
folhagem abundante.
• Excesso de N também pode causar a sua acumulação na forma de nitratos
que são tóxicos para animais que os ingiram. Condições ambientais
inibidoras do crescimento, como seca, dias escuros e nebulosos ou
temperaturas frias, podem aumentar a acumulação de nitrato nos tecidos
porque a sua conversão em proteína é retardada.
• A lixiviação do N em excesso é um grande problema de poluição da água,
principalmente nos lençóis freáticos e estuários a jusante (eutrofização).
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Excesso de Azoto
Excesso de
N em arrozal
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Teor elevado de nitratos em hortaliças de folha
Os nitratos acumulam-se nos vacúolos, em condições de baixa

assimilação como forma de regulação osmótica da célula.
Para reduzir o teor de nitratos em hortaliças de folha:
• Fazer a cultura em condições de elevada radiação PAR
• Fazer a colheita durante o período da tarde
• Utilizar NH4+ e inibidores de nitrificação
• Reduzir a aplicação de N no final da cultura
• Utilizar cultivares com actividade mais elevada da nitrato-redutase
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Legislação europeia relativa às quantidades máximas

de nitratos permitidas em hortaliças de folha
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Teor elevado de nitratos em hortaliças
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Teor elevado de nitratos

em hortaliças
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Teor elevado de nitratos em hortaliças de folha
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Deficiência de azoto
• Sintomas de clorose são o
resultado directo da
deficiência de N. Uma ligeira
tonalidade vermelho-claro
também pode ser observada
nas veias e pecíolos.
• As folhas mais velhas mudam gradualmente do tom verde
característico para um verde muito mais claro. À medida que a
deficiência progride, essas folhas mais velhas tornam-se
uniformemente amarelas (cloróticas) e sob extrema deficiência
ficam branco-amareladas. O amarelecimento é uniforme em toda
a folha, incluindo as veias.
• As folhas jovens perto do ápice permanecem verde-pálido e
tendem a apresentar dimensões mais reduzidas. A ramificação
também diminuí.
• A recuperação de plantas deficientes em N, quando este é
aplicado, é imediata (dias) e de efeito espectacular. 28
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Efeito da carência de
azoto em milho painço
Efeito da carência de
azoto numa
experiência com
tomateiro
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Deficiência de azoto
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Assimilação do nitrato e
do amónio
Redução do nitrato
• Características da nitrato redutase (NR)
• Localização da NR
• Regulação da expressão e da actividade da NR
Redução do nitrito
• Características, localização e regulação da nitrito
redutase (NiR)
Assimilação do amónio
• O ciclo GS-GOGAT: função, localização e regulação
da glutamina sintetase (GS) e da glutamato sintase
(GOGAT) 31
Assimilação do nitrato
• As raízes absorvem nitrato através de um sistema de simporte H+ /
NO3–. Este é assimilado em compostos orgânicos após ter sido
reduzido a nitrito e este a amónio.
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Assimilação do nitrato
Transporte do nitrato através da membrana das
células da raíz e diferentes destinos celulares:
• translocação através do xilema,
• redução no citoplasma e assimilação no plastídeo,
• acumulação no vacúolo.
33
Quantidades relativas de nitratos e outros compostos

azotados no xilema de várias espécies vegetais
Em muitas espécies, quando as raízes
recebem pouca quantidade de nitrato,
este é reduzido principalmente aí.
À medida que o fornecimento de nitrato
aumenta, aumenta também a proporção
que é translocado para a parte aérea e só
aí assimilado.
Mesmo em iguais condições de
fornecimento de nitrato o balanço entre
metabolização do nitrato nas raízes e
partes aéreas depende da espécie.
No capricho-de-carneiro (Xanthium strumarium), o metabolismo do nitrato
processa-se só na parte aérea enquanto que no tremoço (Lupinus albus), a
maioria do nitrato é metabolizado na raíz.
Normalmente, as espécies de zonas temperadas dependem mais da
metabolização do N nas raízes do que aquelas de zonas tropicais ou
subtropicais.
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Nitrato redutase (NR)
Modelo do dímero da NR:

Os três domínios de ligação cujas
sequências polipeptídicas são
semelhantes em eucariotas:
Complexo molibdénio (MoCo)
Heme
FAD
O NADH liga-se na região FAD-binding de

cada subunidade e inicia a transferência de
2 electrões do grupo carboxyl (C-terminal),
para a região N-terminal. O nitrato é
reduzido no complexo MoCo, vizinho da
zona N-terminal. 35
Regulação da expressão da NR
O nitrato, a luz e a concentração de hidratos de carbono influenciam a
transcrição da NR:
A – A transcrição do mRNA da NR é induzida pela adição de nitrato,
tendo sido detectado 40 min após a adição de 15 mM de nitrato em
raízes e folhas, após o que diminuiu em raízes e continuou a aumentar
em folhas.
B - Na presença de nitrato as concentrações de mRNA apresentam um
ciclo diurno.
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Regulação da expressão e da actividade da NR

O nitrato, a luz e a concentração de hidratos de carbono influenciam a
transcrição e a tradução da NR:
Em plântulas de cevada o mRNA da NR foi detectado 40 min após a
adição de nitrato, atingindo níveis máximos às 2h. Já a actividade da NR
aumentou gradualmente, indicando uma síntese mais lenta da
proteína.
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Modelo da regulação da NR por

fosforilação/desfosforilação
e ligação reversível da proteína
NIP
Um local de fosforilação por serina

é responsável pela
ativação/inativação da NR. Após
fosforilação, o motivo de serina é
reconhecido por uma proteína
inibidora da NR (NIP). A ligação de
NIP ocorre na presença de catiões
A luz, hidratos de
divalentes (Mg2+).
carbono e outros
fatores ambientais
PhosphoNR:NIP estimulam uma
O posicionamento de NIP NR inactive fosfatase que
impede a passagem dos desfosforila os
electrões do domínio resíduos de serina
heme-Fe para o domínio da NR e assim,
MoCo e para o NO3- activam-na.
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Modelo da regulação da NR por fosforilação/desfosforilação

e ligação reversível da proteína 14-3-3
A NR é fosforilada por cinases num resíduo de serina no domínio hinge 1

A NR fosforilada ainda está activa mas a ligação de dímeros 14-3-3 inactivam-na.
A NR nestes complexos com a proteína 14-3-3 é mais facilmente degradada que a NR livre e
não é um substrato para fosfatases.
Se a NR for libertada do complexo 14-3-3 o fosfato de regulação pode ser removido pela
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fosfatase PP2A.
Efeito de vários factores na regulação da transcrição,

actividade e degradação da NR
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Regulação da expressão e da actividade da NR
SINAL EFEITO
GLUTAMINA INIBE A TRANSCRIÇÃO
CARÊNCIA DE AZOTO INIBE A TRANSCRIÇÃO
NITRATO ESTIMULA A TRANSCRIÇÃO
RITMO CIRCADIANO REGULA A TRANSCRIÇÃO CONFORME A
ALTURA DO DIA
CITOCININAS ESTIMULA A TRANSCRIÇÃO
SACAROSE ESTIMULA A TRANSCRIÇÃO
LUZ ESTIMULA A TRANSCRIÇÃO E A ACTIVIDADE
ESCURO INIBE A TRANSCRIÇÃO E A ACTIVIDADE
ALTA [CO2] ESTIMULA A ACTIVIDADE
BAIXA [CO2] INIBE A ACTIVIDADE
OXIGÉNIO INIBE A ACTIVIDADE
ANÓXIA ESTIMULA A ACTIVIDADE
41
A Nitrito Reductase (NiR) converte Nitrito em Amónio
Os cloroplastos e os plastídeos das raízes contêm diferentes formas da enzima mas

ambas são compostas por um polipéptido com dois grupos prostéticos: um cluster de
ferro-enxofre (Fe4S4) e um heme especializado. Estes grupos atuam em conjunto para
ligar o nitrito e reduzi-lo diretamente a amónio sem acumulação de compostos
azotados de estados redox intermédios.
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Localização intracelular das enzimas

responsáveis pela assimilação do azoto
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Localização intracelular das enzimas envolvidas na assimilação

do azoto, desde o nitrato aos aminoácidos, numa célula
vegetal: NR, NiR, GS e GOGAT
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Assimilação e reciclagem de amónio:

GDH vs GS-GOGAT
Durante muito tempo pensou-se que bactérias e plantas superiores

assimilavam amónio em glutamato através da via GDH, como fazem
certos fungos e leveduras.
No entanto, em bactérias ficou claro em 1970 que uma via alternativa
de assimilação de amónio deve estar a funcionar quando o amónio
está presente em concentrações muito baixas.
Esta via envolve a ação da glutamina sintetase (GS) [EC 6.3.1.2] e uma
glutamina:2-oxoglutarato amidotransferase dependente de NADPH
(GOGAT) [EC 1.4.1.13] ou glutamato sintase.
Assim, a falta de N leva a desrepressão e ativação de GS (com alta
afinidade para o NH3) e desrepressão de GOGAT e leva à repressão de
GDH (que tem uma afinidade relativamente baixa para o NH3).
A disponibilidade elevada de amónio leva à repressão e desativação de
GS e indução de GDH.
45
• Ambas as vias, GDH e GS-GOGAT, produzem 1 mole de glutamato a partir de 1

mole de NH3, 2-oxoglutarato e NADPH. Mas note-se que a via GS-GOGAT é
energeticamente mais cara do que a via GDH, consumindo 1 ATP.
Evidências da coexistência das duas vias em microoganismos:
• Sabe-se que Escherichia coli apresenta as duas vias como alternativas para a
síntese de glutamato. A via GS-GOGAT é essencial para a síntese de glutamato em
condições de baixas concentrações de amónio e para a regulação do pool de
glutamina, e é usada quando a célula não está sob limitação de energia. A via
GDH é utilizada na síntese de glutamato quando a célula tem fornecimento de
energia limitado mas quantidade suficiente de amónio e fosfato.
• A cianobactéria Synechocystis sp. utiliza a via GS-GOGAT como a principal via de
assimilação de amónio, mas a presença de GDH parece oferecer uma vantagem
seletiva sob condições de crescimento não exponenciais.
Esta duplicação de vias pode ser comum a bactérias, cianobactérias, algas,
leveduras e fungos. 46
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A via da GS-GOGAT
Após a descoberta da glutamato sintase (GOGAT) em bactérias, procurou-se
uma enzima com atividade semelhante em plantas. em 1974 foi descoberta uma
sintase de glutamato dependente de ferredoxina [EC 1.4.7.1] em tecidos
fotossintéticos de plantas superiores, e ainda no mesmo ano, uma "sintetase de
glutamato" dependente de NADH em tecidos vegetais não fotossintéticos.
• A via da GS-GOGAT leva à formação de glutamina e glutamato.

• É necessário um co-fator redutor para a reação: as plantas usam a
ferredoxina nos tecidos verdes e o NADH em tecidos não
fotossintéticos.
47
Conversão do NH4+ em aminoácidos

As células vegetais evitam a
toxicidade do amónio pela
sua rápida conversão em
aminoácidos.
Esta conversão necessita da
ação de duas enzimas, a
glutamina sintetase (GS)
e a glutamato sintase
(GOGAT).
A via GS/GOGAT consome ATP mas

consegue assimilar o amónio
eficientemente quando a sua concentração
é baixa – isto porque o valor do Km da GS
para o NH4+ é muito baixo.
O ATP gasto pela via GS/GOGAT é o preço
que as células que possuem esta via “têm
de pagar” para conseguirem assimilar o
NH4+ presente em baixas concentrações.
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Actividade relativa das isoformas GS1 e GS2 da GS

Isoformas da GS
A GS plastidial é a
isoforma principal em
folhas
• GS1: Citosol (gene: GLU1)

• GS2: Cloroplasto (gene: GLU2)
Regulação pela luz da

expressão dos genes GLU1 e
GLU2 de duas isoformas da
GOGAT
49
Modelo para a regulação da transcrição do gene

GS2 pela luz e fotoassimilados:
A luz ativa a transcrição de GS2 diretamente,
através do fitocromo, ou indiretamente, através
da produção de fotoassimilados.
A capacidade de a sacarose induzir a
transcrição de GS2 é contrariada por
aminoácidos, que a inibem.
Assim, as plantas regulam a assimilação do
azoto inorgânico em aminoácidos.
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Monitorização in situ da transcrição das isoformas

de GS
• A-D: GS2 expressa maioritariamente em tecidos fotossintéticos
• E-H: GS1, expressa maioritariamente no floema
Tecidos fotossíntéticos
Floema 51
Tal como a GS também a GOGAT apresenta duas isoformas, a Fdx- e a

NADH-: A Fdx-GOGAT é a principal forma presente em folhas e
representa 95-97% da atividade total da GOGAT em folhas. A NADH-
GOGAT está presente em quantidades ínfimas em folhas mas é a
isoforma predominante em tecidos não fotossintéticos como raízes.
52
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O que acontece em
mutantes sem Fdx-
GOGAT (mutantes gls)?
Estes mutantes apresentam

um fenótipo clorótico
quando crescem em
atmosfera normal (0.03%
CO2) mas quando postos
numa atmosfera que inibe a
fotorrespiração, com 1%
CO2, apresentam o fenótipo
normal.
A Fdx-GOGAT tem um papel

na assimilação de NH4+
proveniente da assimilação
do nitrato mas também na
assimilação do NH4+ que
resulta da fotorrespiração.
53
O amónio pode ser assimilado por uma via

alternativa à GS-GOGAT: a GDH
• A enzima glutamato desidrogenase (GDH) cataliza uma reação
reversível que sintetiza glutamato ou desamina glutamato, usando
NAD(P)H como agente redutor.
• A forma dependente de NADH existe nas mitocôndrias enquanto a
forma que utiliza o NADPH está localizada nos cloroplastos de tecidos
fotossintéticos.
• As formas de GDH são bastante abundantes mas não podem substituir
a via GS–GOGAT na assimilação de amónio, sendo a sua função
principal a de desaminar o glutamato, promovendo a sua oxidação de
forma a fornecer esqueletos de carbono suficientes para o
funcionamento eficaz do ciclo TCA.
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GS-GOGAT é a principal via de assimilação de amónio

em plantas
• Quase completa inibição da assimilação NH4 pela ação da metionina sulfoximina
15 +
(MSX), que é um inibidor da glutamina sintetase (GS).

• A análise de 15NH4+ em Lemna minor é consistente com a incorporação de 15N
principalmente em glutamina, seguida por transferência para glutamato através da
ação da GOGAT e da GS, desde que se presuma que o ciclo GS-GOGAT é
compartimentalizado no cloroplasto e que um segundo local de síntese de
glutamina ocorre no citoplasma.
• O mutante gdh1-null de milho exibe cerca de 5% da atividade enzimática total de
GDH relativamente a plantas wild type. Embora este mutante exiba uma taxa total
ligeiramente reduzida de assimilação de 15NH4+, quando se fornece MSX, há um
bloqueio total da assimilação de 15NH4+ em plantas mutantes e wild type. A
contribuição da GDH para a assimilação líquida de amónio é pequena em
comparação com a que é catalisada pelo ciclo GS-GOGAT.
• Mutantes de Arabidopsis e cevada para a GS ou a GOGAT exibem uma assimilação
de amónio marcadamente afetada, especialmente sob condições
fotorrespiratórias.
Considerações de cinética enzimática também sugerem um papel para a via GS-
GOGAT na assimilação de amónio em situações de baixas concentrações de
amónio nos tecidos. A GS tem uma afinidade muito maior para o amónio que a
55
GDH e é vista como um “scavenger” de amónio em bactérias e em plantas.
O azoto nos aminoácidos
•Transaminação
•Aspargina e glutamina
•Relação entre metabolismo do C e do N
•Biossíntese de aminoácidos
•Ciclo fotorrespiratório do azoto 56
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Aminoácidos
• Em geral, os aminoácidos essenciais são aqueles com estruturas mais

complicadas e formados por vias metabólicas mais complexas,
enquanto que os aminoácidos não-essenciais têm biossíntese mais
simples, a partir de precursores que estão normalmente presentes
em todas as células.
• A deficiência em um ou mais aminoácidos essenciais na dieta de um
organismo origina, tipicamente, um balanço de azoto negativo, isto é,
o azoto total excretado pelo organismo excede o que é absorvido,
indicando degradação das proteínas dos tecidos para fornecer o (ou
os) aminoácido(s) que falta(m) para a síntese de novas proteínas
prioritárias ou essenciais à sobrevivência do organismo. Os restantes
aminoácidos que compõem essas proteínas acumulam-se e sofrem
catabolismo – daí a excreção do azoto e o balanço de azoto negativo.
57
Resumo dos processos responsáveis pela

assimilação de N mineral nas folhas
O nitrato translocado das raízes no xilema entra no citoplasma de uma célula
do mesofilo por um simporte NO3- - H+. Ali é reduzido a NO2- pela nitrato
redutase (NR). O nitrito é translocado para o estroma do cloroplasto junto com
um H+. No estroma, o NO2- é reduzido a NH4+ pela nitrito redutase (NiR) e este
é convertido em glutamato através da ação sequencial da glutamina sintetase
(GS) e da glutamato sintase (GOGAT). De novo no citoplasma, o glutamato é
transaminado em aspartato pela aspartato aminotransferase (Asp-AT).
Finalmente, a asparagina sintetase (AS) converte o aspartato em asparagina.
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05/05/2020
Reações de transaminação transferem azoto

Uma vez assimilado em glutamina e glutamato, o azoto é incorporado
noutros aminoácidos através de reações de transaminação. As enzimas
que catalisam essas reações são conhecidas como aminotransferases. Um
exemplo é a aspartato aminotransferase (Asp-AT), que catalisa a seguinte
reação:
• o grupo amina do glutamato é transferido para o átomo carboxil do

aspartato.
• O aspartato é um aminoácido que participa no shuttle malato-aspartato
para transferir equivalentes redutores da mitocôndria e do cloroplasto
para o citosol e no transporte de C do mesófilo para a bainha dos feixes
no metabolismo C4 de fixação de carbono. 59
60
30
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• Todas as reações de transaminação requerem piridoxal fosfato (PLP,
forma ativa da vitamina B6) como cofator.
• As aminotransferases encontram-se no citoplasma, cloroplastos,
mitocôndrias, glioxissomas e peroxissomas.
• Uma prova do papel significativo das aminotransferases localizadas
nos cloroplastos na biossíntese de aminoácidos é o facto de folhas de
plantas (ou cloroplastos isolados) expostos a dióxido de carbono
marcado radioativamente (14CO2) incorporarem rapidamente o 14C
em glutamato, aspartato, alanina, serina e glicina.
61
A asparagina e a glutamina fazem a ligação

entre os metabolismos do carbono e do azoto
• A asparagina, descoberta em 1806, como uma
substância cristalina que se isolava em estratos de
espargos, foi o primeiro aminoácido a ser
identificado. Logo nessa altura foram feitas
experiência que verificaram que o teor de
asparagina aumentava em condições de escuridão.
• Isto explica o elevado teor de asparagina dos
espargos “brancos”.
• Recentemente foi confirmado que a escuridão
estimula a transcrição dos genes envolvidos na
síntese da asparagina em várias espécies,
confirmando a primeira descoberta de que a luz
reprime a sua síntese.
62
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• A asparagina tem funções de precursor proteico, e também é um
composto chave para o transporte e armazenamento de azoto devido
à sua estabilidade e alta relação azoto-carbono (2 N / 4 C na
asparagina, versus 2 N / 5 C na glutamina ou 1 N / 5 C no glutamato).
• A principal via para a síntese de asparagina envolve a transferência
do azoto da amida da glutamina para a asparagina
63

• A asparagina sintetase (AS), a enzima que catalisa essa reação,
está presente no citosol de folhas e raízes e em nódulos fixadores
de azoto.
64
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• Tal como acontece em E coli, em algumas plantas, particularmente
quando apresentam níveis potencialmente tóxicos de amoníaco, o
amónio pode substituir a glutamina como fonte do grupo amida.
• Um exemplo disto são as raízes do milho, onde a AS tem um Km mais
favorável à utilização de amónio do que de glutamina.
65

• Altos níveis de luz e hidratos de carbono são condições que
estimulam a GS2 e a Fd-GOGAT plastídicas e inibem a expressão de
genes que codificam a AS e a sua atividade. Assim, favorecem a
assimilação de azoto em glutamina e glutamato, compostos que são
ricos em carbono e participam da síntese de novos materiais
vegetais.
• Por outro lado, as condições de energia limitada inibem a GS e a
GOGAT, estimulam a AS e, assim, favorecem a assimilação de azoto
em asparagina, um composto que é rico em azoto e suficientemente
estável para transporte a longa distância ou armazenamento a longo
prazo.
A regulação oposta dessas vias concorrentes ajuda a equilibrar o

metabolismo de carbono e azoto nas plantas.
66
33
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67
Biossíntese dos aminoácidos

A glutamina e o glutamato Intermediários do ciclo
são as fontes de azoto para glicolítico, do ciclo do
todos os aminoácidos e ácido cítrico e do ciclo das
outras moleculas que pentoses fostato fornecem
contenham azoto. os esqueletos carbonados
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Biossíntese dos aminoácidos
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Organização dos precursores metabólicos

que fornecem o esqueleto carbonado
As fontes de esqueletos carbonados são

intermediários dos ciclos:
...glicolítico
...do ácido cítrico
...das pentoses fosfato
A glutamina e o glutamato são as fontes de

N para todos os aminoácidos e outras
moléculas que contenham azoto.
70
35
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Os 20 aminoácidos proteícos são agrupados em 6 famílias de acordo

com os metabolitos que lhes fornecem o esqueleto carbonado
71
Os 20 aminoácidos proteicos são agrupados em 6 famílias de acordo

com os metabolitos que lhes fornecem o esqueleto carbonado
As fontes de esqueletos carbonados são intermediários dos ciclos:

...glicolítico
...do ácido cítrico
...das pentoses fosfato 72
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As vias principais de incorporação do N em aminoácidos. Estes servem

de precursores à biossíntese de outros aminoácidos.
Serine
73
A família do α-Cetoglutarato ou Glutamato
O 2-oxoglutarato, um intermediário do ciclo do ácido cítrico, é o precursor da síntese do

glutamato e dos outros membros desta família, a glutamina, a prolina, a arginina e, nos
fungos e em Euglena, também a lisina. A Prolina é glutamato cíclico.
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Regulação da síntese e
degradação de prolina
A via mais comum de síntese
de prolina é a que deriva do
glutamato.
A ornitina também pode

servir de precursor, através
de duas vias: a da ornitina
δ-aminotransferase e a da
ornitina α-
aminotransferase.
75
Regulação da síntese e degradação de prolina

P5CS P5CR
PD
prolina
P5CS: ∆1-pirrolina-5-carboxilato-sintetase
seca, stresse salino, ABA
P5CR: ∆1-pirrolina-5-carboxilato-redutase: sem regulação
prolina
PD: prolina desidrogenase
seca, stresse salino, ABA
76
38
05/05/2020
Regulação da síntese e degradação de prolina

A regulação da acumulação de prolina em plantas dá-se ao nível enzimático e ao
nível da expressão génica.
Regulação da via derivada do glutamato
• A enzima ∆1-pirrolina-5-carboxilato-sintetase (P5CS) é o passo que sofre
regulação em plantas, ao contrário da ∆1-pirrolina-5-carboxilato-redutase
(P5CR), que não sofre regulação.
• A sobre-expressão da P5CS aumenta a quantidade de prolina produzida,
proporcionalmente ao aumento da atividade da enzima.
• A P5CS sofre inibição de feedback pela prolina acumulada.
• A regulação da P5CS é sensível a condições ambientais que possam afetar a
concentração de prolina livre. Verifica-se acumulação de mRNA de P5CS em
situações de seca, stresse salino e tratamento com ABA. Os níveis de prolina livre
aumentam 24h após os mesmos tratamentos, entre 4 e 8X. Quando os stresses
aplicados terminam, os níveis de mRNA e de prolina voltam a descer.
• A prolina desidrogenase, que cataliza a conversão de prolina em P5C (o primeiro
passo da degradação da prolina) é regulada negativamente pelos mesmos sinais
que regulam positivamente a P5CS.
Regulação da via derivada da ornitina
• A ornitina δ-aminotransferase sofre regulação oposta à P5CS, sendo o seu
mRNA degradado em condições de stresse salino e falta de azoto. A sua
expressão é induzida em condições de azoto em abundância.
O P5C pode ser sintetizado a partir de glutamato ou de ornitina e a

importância relativa de cada via depende das condições ambientais. 77
A família do 3-Fosfoglicerato ou da Serina
A principal via de produção de serina e glicina é a fotorrespiração.

O 3-fosfoglicerato, um intermediário da glicólise, é o precursor
dos aminoácidos da família da serina, que incluem, além deste
aminoácido, a glicina e a cisteína.
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A família da Serina
A principal via de produção de serina e
glicina é a fotorrespiração. Apesar desta
ser a via principal, existem evidências
de síntese de serina a partir de 3-
fosfoglicerato nos cloroplastos.
79
A família do Oxaloacetato ou do Aspartato
• O oxaloacetato, um intermediário do ciclo do ácido cítrico, fornece o

esqueleto carbonado para a síntese dos seis aminoácidos da família
do aspartato: aspartato, asparagina, lisina (em bactérias e plantas,
mas não em fungos), metionina, treonina e isoleucina.
• A isoleucina é, muitas vezes, incluída na família do piruvato, porque
quatro das cinco enzimas que participam na sua biossíntese são
comuns às enzimas da via de síntese da valina.
• A metionina obtém o seu enxofre a partir da cisteína.
80
40
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A via do Aspartato
Três via conduzem diretamente do
ácido aspártico aos amino ácidos
lisina, metionina e treonina.
A treonina é um precursor da
isoleucina.
A metionina é um intermediário
na síntese de etileno e de
poliaminas.
O aspartato fornece o
esqueleto carbonado
da treonina, sendo a
sua formação, a via
“principal”.
81
• O aspartato é ativado por fosforilação pela aspartato

quinase (AK)
• O aspartato-4-fosfato sofre duas reduções reguladas por
NADPH, catalizadas pela aspartato semialdeido
desidrogenase e pela homoserina desidrogenase.
• A homoserina resultante é fosforilada pela homoserina
quinase e a treonina sintase cataliza a hidrólise do fosfato e
a modificação do grupo hidroxil para produzir treonina.
82
41
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A via do aspartato e a nutrição animal
• Os aminoácidos derivados do aspartato são indispensáveis nas dietas

de animais não ruminantes.
• Algumas dietas unicamente vegetais são deficientes num ou noutro
destes aminoácidos essenciais, levando a problemas de saúde.
• Deve-se complementar as dietas ingerindo misturas de cereais e de
leguminosas.
• Do mesmo modo que os humanos, os animais de quinta não podem
subsistir com dietas unicamente de cereais. Por exemplo, o milho,
amplamente usado para alimentação animal, é muito pobre em
aminoácidos, em especial lisina. Por oposição, a soja é rica em lisina
mas pobre em metionina. O suplemento das dietas animais à base de
milho ou soja, com lisina, metionina ou treonina aumenta a taxa de
crescimento animal, mas encarece a sua produção.
83
Mecanismos de regulação na via do aspartato

• Linhas vermelhas: inibição induzida
pelo produto
• Linha verde: aumento de atividade
induzida pelo produto
• Linha roxa: diminuição da
quantidade de enzima presente,
induzida pelo produto
• AK aspartato quinase
• DHDPS dihidropicolinato sintetase
• HSDH homoserina desidrogenase
• HSK homoserina quinase
• CγS cistationa gama sintase
• TS treonina sintase
84
42
05/05/2020
Mecanismos de regulação na via do Aspartato
• Regulação da aspartato quinase (AK), a enzima que inicia o processo:

• As plantas possuem várias classes de AK, com sequências distintas e
propriedades alostéricas diferentes. Existem pelo menos 3 formas de
atividade diferentes:
• AK-I, inibida pela presença de lisina e induzida por S-adenosil
metionina (SAM)
• AK-II e AK-III são sensíveis a inibição por treonina.
Ao impedir a atividade da AK, a síntese dos três produtos finais da via
fica comprometida (metionina/SAM, lisina e treonina).
85
Plantas wild type em meio

suplementado apenas com lisina e Plantas mutantes que são insensíveis a
treonina: morte por falta de esta mistura tóxica de aminoácidos (Lys +
metionina devido à inibição da AK Thr). Estas plantas têm uma forma
por Lys + Thr. mutante de AK que é insensível à
inibição por Lys (AK*Lys). Estas plantas já
são capazes de sintetizar metionina
quando suplementadas com Lys + Thr.
86
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A dihidropicolinato sintase (DHDPS) regula a acumulação de Lys nas plantas:

A inibição por feedback Plantas mutantes
da DHDPS controla a insensíveis a inibição por
formação de Lys a partir feedback da DHDPS não
do aspartato-4- param de produzir Lys
semialdeido. apesar desta se acumular
em grandes quantidades.
87
A família do Piruvato
• O piruvato, o produto final da glicólise, fornece os esqueletos

carbonados para a síntese da alanina e valina e quatro dos seis
átomos de carbono da leucina.
• Além disso, o piruvato contribui com dois carbonos para a síntese da
isoleucina e, em média, com 2,5 átomos para a síntese da lisina nas
plantas e bactérias.
• Como referido anteriormente, a isoleucina, um membro da família do
aspartato, é frequentemente incluída na família do piruvato.
88
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A família do fosfoenolpiruvato e eritrose -4-fosfato

ou família aromática
Fenilalanina, tirosina e triptofano são sintetizados a partir

do fosfoenolpiruvato, um intermediário da glicólise, e da
eritrose-4-fosfato, um intermediário da via das pentoses
fosfato. Estes aminoácidos são sintetizados por uma via
metabólica ramificada divergente, em que o corismato é o
principal ponto de ramificação.
89
A família aromática
Para além das suas funções nas proteínas,
a fenilalanina, o triptofano e a tirosina são
precursores da síntese de numerosos
compostos primários e secundários.
Exemplos: auxinas (ácido-3-indole-
acético), pigmentos (antocianinas),
fitoalexinas, alcaloides bioativos e lenhina.
Cerca de 20% do carbono

fixado pelas plantas é
canalizado para esta via
comum (maioritariamente
para produção de lenhina)
90
45
05/05/2020
91
1. Condensação do PEP, intermediário da glicólise, e

da eritrose-4-fosfato, intermediário da via das
pentoses fosfato, catalisada pela DHAPS (3-desoxi-D-
arabino-heptulosonato 7-fosfato sintase).
As DHAPSs de plantas e bactérias são semelhantes
mas as de plantas não sofrem inibição-feedback
pelos aminoácidos produzidos. Pelo contrário, são
ativadas por triptofano.
2. A 3-desidroquinato sintase cataliza o primeiro
passo de ciclização. A sua atividade requer Co2+ e
NAD+ como cofatores.
3. /4. Estes 2 passos, atividade de 3-desidroquinato
desidratase e de chiquimato desidrogenase,
juntam-se numa enzima bifuncional em plantas, em
que a segunda atividade é 10% menor que a
primeira.
5. A chiquimato quinase fosforila o chiquimato no 3-
hidroxil. A reação é inibida pelo chiquimato 3-fosfato
e por ADP.
6. A 5-enolpiruvilchiquimato-3-fosfato (EPSP)
sintase (EPSPS) catalisa a produção reversível de
EPSP e fosfato a partir de PEP e chiquimato 3-
fosfato. É a enzima mais bem estudada da via, pois é
aquela que é o local de ação do herbicida glifosato.
7. A corismato sintase catalisa a eliminação de
fosfato 1,4-trans do EPSP para obter corismato. Esta
reação tem a peculiaridade de necessitar de flavina
nucleótido como cofator (FMNH2), que se associa
normalmente a reações redox, o que não é o caso.
92
46
05/05/2020
• A fenilalanina e a tirosina são sintetizadas a partir de

arogenato em plantas, contrariamente ao que ocorre em
Saccharomyces cerevisae e E. coli onde o intermediário é o
4-hidroxifenilpiruvato. Ou seja, aqui o passo de
transferência da amina é o penúltimo passo e não o
último.
93
A corismato mutase (CM) é a enzima principal desta via e cataliza o rearranjo

da cadeia lateral enolpiruvil do corismato para produzir prefenato.
As plantas possuem 2 isoformas, reguladas de modo diferente: CM1 localiza-se
nos cloroplastos e é a enzima principal na síntese dos AAs aromáticos, sendo
inibida pelos seus produtos, Tyr e Phe e ativada por Trp. Já a CM2 não é
regulada por nenhum AA aromático, e, ao contrário de todas as outras enzimas
destas vias, é citosólica. Isto aponta para a possibilidade de esta enzima não
estar envolvida na síntese de AAs mas funcionar no metabolismo do corismato
de alguma outra forma.
94
47
05/05/2020
O glifosato
• O glifosato (N- (fosfonometil) glicina) é um herbicida CP4-EPSPS
sistémico não seletivo, absorvido pelas folhas, usado
para controlar infestantes. Este herbicida atua sobre a 5-
enolpiruvil-chiquimato-3-fosfato sintetase (EPSPS).
Algumas culturas foram geneticamente modificadas
para serem resistentes. O glifosato foi vendido pela
primeira vez pela Monsanto sob o nome comercial de
Roundup.
• O glifosato é um análogo aminofosfónico do aminoácido glicina e o nome é
uma contração de glicina, fosfo e -ate. Foi identificado como tendo
atividade herbicida em 1970 por John Franz, que trabalhava na Monsanto.
• Alguns microrganismos possuem uma versão da EPSPS resistente à
inibição por glifosato. A versão utilizada nas culturas geneticamente
modificadas foi isolada da estirpe CP4 de Agrobacterium (CP4-EPSPS),
resistente ao glifosato. O gene CP4-EPSPS foi clonado e transferido para
soja, e em 1996, as plantas geneticamente modificadas foram
disponibilizadas comercialmente. Isso melhorou muito a capacidade de
controlar infestantes nos campos de soja, uma vez que o glifosato pode ser
pulverizado nos campos sem prejudicar a cultura. Em 2005, em 87% dos
campos de soja dos EUA foram usadas variedades resistentes ao glifosato.95
O glifosato O glifosato mata as plantas ao inibir

a 5-enolpiruvil-chiquimato-3-fosfato
sintetase (EPSPS), que catalisa a
reação de chiquimato-3-fosfato e o
fosfoenolpiruvato para formar 5-
enolpiruvil-chikimato-3-fosfato
(EPSP). O EPSP é subsequentemente
desfosforilado em corismato, um
precursor essencial de aminoácidos
aromáticos em plantas (fenilalanina,
tirosina e triptofano). A via do
chiquimato não está presente nos
animais, que obtêm aminoácidos
aromáticos através da dieta.
Como consequência da inibição
desta via, a síntese proteica é
alterada, o que conduz à morte da
planta.
A EPSPS é o único alvo fisiológico do
glifosato em plantas e mais
nenhuma enzima que utilize PEP é
inibida por ele.
96
48
05/05/2020
Bases genéticas para a resistência ao glifosato

Até 1996 não se observou nenhuma infestante com resistência ao glifosato no
campo, mas desde então, a introdução de culturas transgénicas tolerantes ao
glifosato levou à evolução de um número cada vez maior de infestantes
resistentes como resultado do aumento do uso do herbicida, particularmente
durante o crescimento pós-emergente das culturas.
• Os mecanismos de resistência já estudados em detalhe mostram que não há
uma única alteração genética responsável mas várias “soluções” alternativas:
1 - Algumas plantas desenvolveram resistência parcial ao glifosato através de
alterações num aminoácido do gene da EPSPS. As mutações trocam a prolina na
posição 106 por serina ou treonina, resultando numa EPSPS com alguma
resistência ao glifosato.
2 - Outras plantas exibem uma translocação reduzida de glifosato para os
tecidos meristemáticos.
3 - Outras plantas evoluíram por aumento do número de cópias do gene que
codifica a EPSPS. A atividade da enzima EPSPS de plantas resistentes e
suscetíveis é igualmente inibida pelo glifosato, no entanto, os genomas de
plantas resistentes podem conter entre 5 e 160 vezes mais cópias do gene
EPSPS do que os genomas de plantas suscetíveis. Nestas plantas, a expressão de
EPSPS é positivamente correlacionada com o número de cópias de EPSPS no
genoma. Os genes amplificados não estão agrupados em clusters, mas
distribuídos aleatoriamente por todos os cromossomas.
4 - Outras plantas rapidamente bombeiam o herbicida para os vacúolos, 97
impedindo o seu contacto com o cloroplasto.
A família da Ribose 5-Fosfato ou da Histidina

A histidina é sintetizada a partir do
fosforibosilpirofosfato numa sequência de reações
com vários intermediários imidazole. Por oposição à
grande redundância de genes nas vias de síntese de
outros aminoácidos, aqui a maioria das enzimas é
codificada por genes de cópia única. Esta simplicidade
aparente torna a histidina o alvo de investigação para
o desenvolvimento de herbicidas, especialmente
porque a sua síntese não ocorre em animais.
A histidina regula a síntese de vários outros
aminoácidos, a quelação e transporte de metais e a
reprodução e crescimento de plantas.
98
49
05/05/2020
Ciclo fotorrespiratório do azoto

Na fotorrespiração, vários compostos circulam em conjunto através de dois
ciclos.
No primeiro, o carbono sai do cloroplasto em duas moléculas de glicolato e
regressa numa molécula de glicerato.
No segundo, o azoto sai do cloroplasto numa molécula de glutamato e retorna
numa molécula de amónio (juntamente com uma molécula de α-cetoglutarato).
Assim, duas moléculas de fosfoglicolato (4 átomos de carbono), perdidas do
ciclo de Calvin pela oxigenação de RuBP (ribulose-1,5-bisfosfato), são
convertidas numa molécula de 3-fosfoglicerato (3 átomos de carbono) e um
CO2.
75% do carbono perdido pela atividade oxigenásica da RuBisCO é recuperado
pelo ciclo de carbono fotossintético oxidativo C2 e regressa ao ciclo de Calvin.
Por outro lado, o azoto orgânico total permanece inalterado porque a
formação de azoto inorgânico (NH4+) na mitocôndria é equilibrada pela síntese
de glutamina no cloroplasto. Similarmente, o uso de NADH no peroxissoma
(pela hidroxipiruvato redutase) é equilibrado pela redução de NAD+ na
mitocôndria (pela glicina descarboxilase).
99
Ciclo fotorrespiratório do azoto

Duas moléculas de glicolato (4C) são
transportadas do cloroplasto para o
peroxissoma onde são convertidas
em glicina, que é exportada para a
glutamina sintetase
mitocôndria e transformada em
serina (3C) com a libertação de
CO2(1C).
A serina é transportada para o
peroxisoma e transformada em
glicerato. Este último vai para o
cloroplasto onde é fosforilado em 3-
fosfoglicerato e incorporado no ciclo
de Calvin. O N inorgânico (amónio)
libertado pela mitocôndria é
capturado pelo cloroplasto para a
incorporação em aminoácidos
usando esqueletos apropriados (α-
cetoglutarato). A seta vermelha
marca a assimilação de amónio em
glutamato, catalisada pela GS.
A captação de oxigénio no
peroxissoma suporta um curto ciclo
de oxigénio acoplado a reações
oxidativas.
100
Fluxo de carbono, azoto e oxigénio: preto, rosa e azul.
50
05/05/2020
Estequiometria
relativamente ao amónio
2 NH4+ por cada oxigenação da Rubisco
1 NH4+ por cada oxigenação da Rubisco

101
O amónio resultante do catabolismo dos aminoácidos
O problema:
• Os animais não o podem armazenar;
• E não se pode acumular, porque é
tóxico….
Porque é que é tóxico?
• Porque desacopla as cadeias de
transporte de eletrões.
Como?
Membrana impermeável ao H+, mas permeável ao NH4+ e ao NH3: Se [NH4+] no
interior aumenta, a forma NH3 predomina no exterior devido ao pH alto.
Então, o NH3 atravessa a membrana e entra. Devido ao pH ser mais baixo no interior,
o NH3 tem tendência para captar um protão, transformando-se em NH4+.
O NH4+ sai para o exterior, onde o pH é mais alto e aí o NH4+ perde o protão e
converte-se em NH3. Este NH3 volta a entrar, desfazendo o gradiente de pH e não
ocorre síntese de ATP. 102
51
05/05/2020
Morte por excesso de amónio

• O Basta, um herbicida potente, tem como substância
ativa a fosfinotricina (ou glufosinato), um análogo estrutural do
ácido L-glutâmico.
• A fosfinotricina é um inibidor da glutamina sintetase (GS), uma
enzima que participa no ciclo GS/GOGAT e que é responsável pela
assimilação da grande quantidade de amónio produzido na
fotorrespiração. Ao inibir a GS, o amónio acumula-se e mata as
plantas pelo mecanismo atrás indicado.
• Há uma bactéria do solo, a Streptomyces hygroscopicus, que codifica
uma enzima, a fosfinotricina acetiltransferase (PAT) que metaboliza
a fosfinotricina. Um grupo de investigadores da empresa Hoechst
produziram plantas transgénicas com o gene que codifica a PAT desta
bactéria. Foi, assim, possível obter plantas (ex. tabaco) que
expressam o gene da PAT. Ao serem pulverizadas com o herbicida
Basta, estas plantas transgénicas conseguem metabolizar a
fosfinotricina, não sendo mortas, ao contrário de todas as outras ao
103
seu redor.
Fontes primárias e secundárias de NH4+
104
52
05/05/2020
Fixação biológica do
azoto
Fixação do azoto atmosférico

Nitrogenase
Implicações na fertilização azotada
105
106
53
05/05/2020

• A redução de azoto a amónio, conhecida como fixação de azoto , é
vital para a agricultura:
N2 + 3H2 → 2NH3
• Enquanto o processo industrial de Haber-Bosch requer temperaturas
de aproximadamente 500 °C e centenas de atmosferas de pressão
para ultrapassar a energia de ativação, algumas bactérias podem
realizar esta reação à temperatura do solo e à pressão atmosférica.
• O complexo de nitrogenase encontrado nessas bactérias é
responsável por fixar mais de 1011 kg de azoto por ano.
107
108
54
05/05/2020
Fixação do azoto atmosférico: bactérias livres e

simbióticas
• Algumas bactérias podem converter o azoto atmosférico em amónio.
• A maioria desses procariotas fixadores de azoto tem vida livre no
solo. Alguns formam associações simbióticas com plantas superiores
nas quais o procariota fornece diretamente à planta hospedeira azoto
fixado em troca de outros nutrientes e hidratos de carbono.
• Estas simbioses ocorrem em nódulos que se formam nas raízes da
planta e contêm as bactérias fixadoras de azoto. O tipo mais comum
de simbiose ocorre entre plantas da família Leguminosae e bactérias
do solo dos géneros Azorhizobium, Bradyrhizobium, Photorhizobium,
Rhizobium e Sinorhizobium (coletivamente chamados rhizobia).
• Outro tipo comum de simbiose ocorre entre várias espécies de
plantas lenhosas, como os amieiros e as bactérias do solo do género
Frankia.
• Outros tipos ainda envolvem a erva sul-americana Gunnera e feto
aquático Azolla, que formam associações com as cianobactérias
Nostoc e Anabaena, respetivamente.
109
Fixação do azoto atmosférico necessita de

condições anaeróbias
• O oxigénio inativa irreversivelmente as nitrogenases, enzimas que
estão envolvidas na fixação de azoto. Assim, este tem que ser fixado
em condições anaeróbias.
• Deste modo, os organismos que fixam azoto funcionam naturalmente
em condições anaeróbias ou conseguem criar um ambiente
anaeróbio interno apesar da presença de oxigénio na vizinhança.
110
55
05/05/2020
O complexo da Nitrogenase fixa o N2

• A fixação biológica de azoto, tal como a fixação industrial, produz
amoniaco a partir do azoto molecular. A reação é:
N2 + 8e– + 8H+ + 16ATP → 2NH3 + H2 + 16ADP + 16Pi
• A redução de N2 para 2NH3 envolve uma transferência de seis
eletrões e está acoplada à redução de dois protões para produzir H2.
• O complexo enzimático da nitrogenase pode ser separado em dois
componentes - a proteína Fe e a proteína MoFe - e nenhuma delas
possui atividade catalítica por si só.
111
O complexo da Nitrogenase fixa o N2

• A proteína Fe é a mais pequena das duas e
tem duas subunidades idênticas de 30 a 72
kDa cada, dependendo do organismo.
Cada subunidade contém um cluster ferro-
enxofre (4 Fe e 4 S2–) que participa nas
reações redox envolvidas na conversão de N2
em NH3. A proteína Fe é irreversivelmente
inativada pelo O2 com tempos típicos de semi proteína Fe
vida de 30 a 45 segundos exposta ao ar.
• A proteína MoFe tem quatro subunidades
com peso molecular total de 180 a 235 kDa,
dependendo do organismo.
Cada subunidade contém dois clusters Mo–
Fe–S. A proteína MoFe também é inativada
pelo O2 com uma semi vida de 10 minutos
quando exposta ao ar. proteína MoFe
112
56
05/05/2020
Na reação geral de redução de azoto, a ferredoxina serve como dador de

eletrões para a proteína Fe, que por sua vez hidrolisa o ATP e reduz a
proteína MoFe. A proteína MoFe pode então reduzir numerosos substratos,
embora em condições naturais reaja apenas com N2 e H+.
113

• Em cianobactérias, estas condições são criadas em células
especializadas, os heterocistos. Os heterocistos são células de
paredes espessas que se diferenciam quando as cianobactérias
filamentosas são privadas de NH4+. Essas células não possuem o
fotossistema II, o fotossistema que liberta oxigénio, de modo que não
produzem oxigénio. Os heterocistos parecem representar uma
adaptação específica para a captação de azoto, pois existem em todas
as cianobactérias que apresentam este processo.
114
57
05/05/2020

• As cianobactérias que não possuem heterocistos podem fixar azoto
apenas sob condições anaeróbias, como aquelas que ocorrem em
campos inundados.
• Nos países asiáticos, as cianobactérias fixadoras de azoto , tanto do
tipo heterocisto com do tipo não-heterocístico, são os principais
meios para manter uma oferta adequada de azoto no solo dos
arrozais.
• Esses microrganismos fixam azoto
quando os campos são inundados e
morrem quando os campos secam,
libertando o azoto fixado no solo.
115

• Outra fonte de azoto disponível nos arrozais irrigados é a Azolla, que
se associa à cianobactéria Anabaena. A associação Azolla – Anabaena
pode fixar até 0,5 kg de azoto atmosférico por hectare por dia, uma
taxa que é suficiente para produções moderadas de arroz.
116
58
05/05/2020

necessita de condições anaeróbias
As bactérias de vida livre que são capazes de fixar Azotobacter
azoto podem ser aeróbias, facultativas ou anaeróbias:
• Acredita-se que bactérias aeróbias fixadoras de
azoto, como Azotobacter, mantenham condições
reduzidas de oxigénio (condições microaeróbias) por
meio de altos níveis de respiração.
• Outras, como Gloeothece, fotossintetizam
normalmente durante o dia, libertando O2 e fixam Gloeothece
azoto durante a noite.
• Organismos facultativos, que são capazes de crescer
sob condições aeróbias e anaeróbias, geralmente
fixam azoto apenas sob condições anaeróbias.
• Para bactérias anaeróbias fixadoras de azoto, o Rhodospirillum
oxigénio não representa um problema, porque está
ausente no seu habitat. Estes organismos anaeróbios
podem ser fotossintéticos (como Rhodospirillum) ou
não fotossintéticos (como Clostridium).
117
Clostridium
A fixação simbiótica do azoto ocorre em

estruturas especializadas
Os organismos procariotas simbióticos fixadores de
azoto residem em nódulos, órgãos especiais do
hospedeiro que encapsulam as bactérias fixadoras
de azoto.
No caso de Gunnera, esses órgãos são glândulas
tronco já existentes e que se desenvolvem
independentemente do simbionte.
No caso de leguminosas e plantas com actinorrizas,
as bactérias fixadoras de azoto induzem a planta a
formar nódulos radiculares. Nódulos de rizóbio em soja
As gramíneas também podem desenvolver relações
simbióticas com organismos fixadores de azoto , mas
nessas associações não são produzidos nódulos
radiculares. Em vez disso, as bactérias fixadoras de
azoto colonizam tecidos de plantas ou ancoram nas
superfícies das raízes, principalmente em torno da
zona de alongamento e dos pêlos radiculares.
118
Nódulos de Frankia em amieiro
59
05/05/2020
O caso da simbiose Gunnera-Nostoc

Glândulas desenvolvidas
na base dos pecíolos das
folhas, na zona de
inserção com o caule. As
plantas foram propagadas
em meio sem azoto
durante 1 mês.
Crescimento de plantas de G.
manicata em meio limitado em
azoto e sem N. punctiforme
simbiótico (direita) ou com
Desenvolvimento de glândulas em plantas de G. simbiose (esquerda) durante dois
manicata. Esquerda: glândulas em plantas que meses. A posição das setas indica
cresceram com 10 mM nitrato; Direita: glândulas de as glândulas.
plantas que cresceram com 0.1 mM nitrato. 119
Leguminosas e plantas actinorrízicas
• Leguminosas e plantas actinorrízicas

regulam a permeabilidade dos nódulos
ao oxigénio de modo a manter níveis
que consigam manter a respiração, mas
que não sejam suficientes para inativar
a nitrogenase.
• A permeabilidade ao oxigénio aumenta
com luz e diminui em condições de
seca ou após exposição a nitrato. O
mecanismo de regulação da
permeabilidade ainda não é conhecido.
120
60
05/05/2020
A leg-hemoglobina (legHb)
• As bactérias que fixam azoto em simbiose, em troca do
amónio que produzem para a leguminosa hospedeira, a
planta fornece-lhes elevada quantidade de energia para a
reação. No entanto, a nitrogenase tem um problema com a
toxicidade do oxigénio.
• Aqui o hospedeiro também resolve a situação, fornecendo
leg-hemoglobina, uma proteína de ligação ao oxigénio.
A legHb é uma hemoproteína

existente nos nódulos radiculares
fixadores de azoto das leguminosas.
A legHb está presente no citoplasma das células do

nódulo em concentrações muito elevadas (700 µM em
nódulos de soja) e dá aos nódulos uma cor rosada. 121
A leg-hemoglobina (legHb)
• É produzido por leguminosas como resposta
à colonização das raízes pelas bactérias fixadoras
de azoto, os rizóbios, como parte da interação
simbiótica entre planta e bactéria: raízes não
colonizadas por Rhizobium não sintetizam legHb.
• Os dois papéis fisiológicos atribuídos à legHb são:
 Transporte de oxigénio para as bactérias dentro do nódulo;
 Certificar-se de que o oxigénio está numa forma ligada de
modo que não possa inibir a nitrogenase dentro das
bactérias.
• A holoproteína (proteína + cofactor heme) é um produto da planta
e da bactéria em que a apoproteína (a parte de globina) é
produzida pela planta e o heme é produzido pela bactéria.
• A legHb tem uma elevada afinidade pelo oxigénio (com um Km de
cerca de 0.01 µM), cerca de dez vezes superior à cadeia β da
hemoglobina humana.
122
61
05/05/2020
O estabelecimento da simbiose necessita de

uma troca de sinais
• A simbiose entre leguminosas e rizóbios não é obrigatória.
• As plântulas de leguminosas germinam sem associação com rizóbios e
podem permanecer desassociadas durante todo o seu ciclo de vida.
• Os rizóbios também ocorrem como organismos de vida livre no solo.
• Sob condições de limitação de azoto, no entanto, os simbiontes associam-se
após uma “comunicação” por troca de sinais.
• Esta sinalização, o subsequente processo de infeção e o desenvolvimento de
nódulos fixadores de azoto envolvem genes específicos tanto no hospedeiro
como nos simbiontes.
• Os genes específicos para nódulos e que existem nas plantas são genes de
nodulina (Nod); Os genes de rizóbio que participam da formação de nódulos
são os genes de nodulação (nod).
• Os genes nod são classificados como genes nod comuns ou genes nod
específicos do hospedeiro.
• Os genes nod comuns - nodA, nodB e nodC – existem em todas as estirpes de
rizobio; os genes nod específicos do hospedeiro - como nodP, nodQ e nodH;
ou nodF, nodE e nodL - diferem entre as espécies rizobiais e determinam
quais os seus hospedeiros. Apenas um dos genes nod, o gene nodD é
expresso constitutivamente.
123
Factores Nod produzidos pelo rizóbio

• O primeiro momento da formação da relação simbiótica entre rizóbio e
hospedeiro é a migração das bactérias para as raízes da planta hospedeira.
• Esta migração é uma resposta quimiotática mediada por moleculas
voláteis, especialmente (iso)flavonóides e betaínas, secretados pelas
raízes. Esses compostos ativam a proteína NodD rizobiana, que induz a
transcrição dos outros genes nod. A região do promotor de todos os genes
nod, exceto o nodD, contém uma sequência altamente conservada
chamada nodbox. A ligação do NodD ativado ao nodbox induz a
transcrição dos outros genes nod.
• Os genes nod ativados pela proteína NodD codificam proteínas de
nodulação, a maioria das quais estão envolvidas na biossíntese de fatores
Nod.
• Os factores Nod são moléculas sinalizadoras
constituídas por oligossacáridos de lipoquitina.
124
62
05/05/2020
Iniciação e desenvolvimento de um nódulo
Início do nódulo:
(1) a raiz excreta
substâncias;
(2) essas substâncias
atraem o rizóbio e
estimulam-no a
produzir fatores de
divisão celular;
(3) as células do córtex da
raiz dividem-se para
formar o meristema
do nódulo primário.
125
raízes de soja
Iniciação e desenvolvimento de um nódulo
Infeção e formação de nódulos:

(4) As bactérias ligam-se aos pelos
radiculares;
(5) A divisão celular das células no
periciclo próximo dos polos do xilema é
estimulada;
(6) o filamento de infeção forma-se e
estende-se para dentro à medida que o
meristema do nódulo primário e o
periciclo continuam a dividir-se;
(7) as duas massas de células em
divisão fundem-se num único grupo
enquanto o filamento de infecção
continua a crescer;
(8) o nódulo alonga e diferencia-se,
incluindo a conexão vascular à estela da
raiz. As bactérias atingem as células do
centro.
126
raízes de soja
63
05/05/2020
Formação do nódulo
• Dois processos - infecção e organogénese do nódulo - ocorrem
simultaneamente durante a formação do nódulo.
• Durante o processo de infeção, os rizóbios que estão ligados aos pelos
radiculares libertam fatores Nod que induzem o enrolamento das células
dos pelos radiculares (A e B). O rizóbio fica fechada no pequeno
compartimento formado pelo enrolamento.
• A parede celular dos pelos radiculares degrada-se nessas regiões,
também em resposta aos fatores Nod, permitindo que as células
bacterianas tenham acesso direto à superfície externa das membranas
plasmáticas das células da planta em contacto com a bactéria.
127
• O passo seguinte é a formação do filamento de infeção (C), uma
extensão tubular interna da membrana plasmática que é produzida pela
fusão de vesículas membranares derivadas de aparelhos de Golgi no
local da infecção. O filamento cresce pela fusão das vesículas
membranares até o final do tubo.
• No córtex da raiz, perto do xilema, as células corticais desdiferenciam-se
e começam a dividir-se, formando uma área distinta dentro do córtex, o
primórdio do nódulo, a partir do qual o nódulo se desenvolve.
• Vários compostos sinalizadores de efeito positivo ou negativo,
controlam a posição dos primórdios de nódulos. A uridina difunde-se
para o cortex do protoxilema e estimula a divisão celular.
• O etileno é sintetizado na zona do
periciclo, difunde-se para o cortex , e
bloqueia a divisão celular na zona do
floema.
128
64
05/05/2020
• O filamento de infecção contendo as
bactérias em proliferação alonga-se
através das camadas de células
radiculares e corticais, na direção do
primórdio do nódulo.
• Quando o segmento de infeção
atinge as células especializadas
dentro do nódulo, funde-se com a
membrana plasmática da célula
hospedeira, libertando células
bacterianas (D).
• A ramificação do filamento de
infeção dentro do nódulo permite
que as bactérias infectem muitas
células (E e F).
129
Amidas e ureídos são as formas de azoto

transportadas no xilema
• O rizóbio produz azoto na forma de amoníaco, que por ser tóxico, necessita
de ser rapidamente convertido em formas orgânicas nos nódulos radiculares
antes de ser transportado para a parte aérea através do xilema.
• As leguminosas fixadoras de azoto podem ser divididas em exportadores de
amidas ou exportadores de ureidos, com base na principal via de transporte
no xilema. As amidas (principalmente os aminoácidos asparagina ou
glutamina) são exportadas pelas leguminosas de regiões temperadas, como
ervilha (Pisum), trevo (Trifolium), fava (Vicia) e lentilha (Lens).
• Os ureidos são usados por leguminosas de origem tropical, como soja
(Glycine), feijão (Phaseolus), amendoim (Arachis) e feijão verde (Vigna). Os
três principais ureídeos são alantoína, ácido alantóico e citrulina. A alantoína
é sintetizada em peroxissomas a partir do ácido úrico e o ácido alantóico é
sintetizado a partir de alantoína no retículo endoplasmático. O local da
síntese de citrulina a partir do aminoácido ornitina ainda não foi
determinado.
130
65
05/05/2020
Leguminosas, agricultura e fertilização azotada…

Tratado de História Natural, Plínio o Velho,
(cerca de 80 dc): a aplicação de vários tipos
de estrume em cada cultura/época de
crescimento é descrita, nomeadamente,
estrume de cavalo para campos de milho,
enquanto em pastagens se deve usar
estrume de cavalo após ingestão de grandes
quantidades de cevada, pois aumenta a
produção de gramíneas…. No entanto, a
estrumação mais eficiente de todas é
quando se usa plantas de Lupinus de uma Centeio e milho fósseis
cultura e se incorporam no solo para a encontrados em locais agrícolas
cultura seguinte… com 8000 anos apresentam
níveis de azoto consistentes com
Símbolo chinês Símbolo chinês que fertilização com estrume.
para soja se pensa significar
a relação entre soja
nodulada e
crescimento das
plantas 131
Leguminosas, agricultura e fertilização

azotada…
O uso de fertilização para melhorar as características do
solo parece ser transversal à maioria das culturas, de
acordo com vários registos fósseis, pictóricos e escritos. Os
agricultores faziam rotações de culturas e aplicavam estrume ou
minerais (rocha moída) com pouco rigor quantitativo até aos secs.
XVIII-XIX, quando se iniciaram estudos da composição química dos
solos e das necessidades minerais das plantas.
No início do sec XIX, o azoto era já aplicado como fertilizante em larga
escala, na forma de estrume (guano) e nitratos minerais. No entanto,
o uso de azoto para fertilizantes tinha que competir com as
necessidades para fabrico de explosivos e pólvora.
Em 1860 surgiu uma das primeiras receitas de soluções nutritivas que
contém os nutrientes necessários ao crescimento das plantas,
formulada por Julius Von Sachs, obtida após estudar plantas em
condições controladas e após extensas análises químicas de
132
composição mineral das plantas.
66
05/05/2020
Leguminosas, agricultura e fertilização

azotada…
• A produção de amoníaco, inicialmente um sub-produto da queima de
carvão, foi transformada em 1913 pelo trabalho de Fritz Haber e Carl
Bosch, na Alemanha, que desenvolveram um método prático e simples de
produzir NH3 a partir de N2 e de H2 na presença de um catalizador de Fe, a
elevadas temperaturas e pressões.
• A reação do azoto atmosférico com hidrogénio é na verdade exotérmica
(∆Hf ◦para o NH3 (g) é -46.1 kJ mol-1), mas a energia de ativação da reação
é muito alta devido à ligação tripla do N2.
N2 + 3H2 → 2NH3
• À temperatura ambiente, a reação é favorecida mas muito lenta e a
temperaturas elevadas o equilíbrio favorece os reagentes e não os
produtos. O processo industrial de Haber-Bosch que retira o hidrogénio
do metano para produzir NH3 é um compromisso, que usa pressões de
150 a 400 atmosferas, temperaturas de 400-650 °C e catalizadores
metálicos. O amoníaco é removido à medida que é formado.
133
134
67
05/05/2020
Leguminosas, agricultura e fertilização azotada…

• As práticas agrícolas baseadas em inputs de fertilizantes azotados na forma
de amoníaco exigem a utilização de grandes quantidades de combustíveis
fósseis (normalmente metano), o que implica gastos económicos e
ambientais muto elevados.
• A fixação industrial de azoto consome 5 % da produção mundial de gás
natural para obter 80 X 1012 g ano-1 de azoto, equivalente a metade da
quantidade de azoto que é fixado por procariotas.
135
68

AulasT28&T29 Azoto

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05/05/2020

Aulas T-28, T-29 e T-30

Capítulo III - Metabolismo do azoto,

• Introdução ao metabolismo primário de compostos de azoto e enxofre.

•Ciclos biogeoquímico e biológico do azoto

Formas de azoto inorgânico disponíveis e utilizadas pelas plantas:

Taxas anuais de fixação de N2 (Teragrama,Tg 1012 g = 106 ton)

Formas de azoto inorgânico disponíveis para

Principais formas de azoto inorgânico disponíveis para

•N2 Os organismos que fazem a fixação biológica do azoto contêm um

Principais formas de azoto inorgânico disponíveis para

•NO3- Trata-se de uma forma de azoto que pode ser absorvida e

pode ser definida como o processo pelo qual o azoto passa de

Ciclos de N na atmosfera à medida que passa da forma gasosa a iões

Importância dos compostos biológicos de azoto

Locais de síntese proteica na célula vegetal.

Importância dos compostos de

Importância dos compostos biológicos com azoto

Alguns compostos de azoto como

RUBISCO: exemplo de uma

Nomes dos aminoácidos, abreviaturas com três letras ou

Para se manterem competitivas face aos microorganismos, as

Nas elevadas concentrações que são

Nitrato em excesso pode ser tóxico

As plantas podem armazenar

estroma, lumen, espaço

Amónio em excesso pode ser tóxico (cont.)

Teor elevado de nitratos em hortaliças de folha

Os nitratos acumulam-se nos vacúolos, em condições de baixa

Legislação europeia relativa às quantidades máximas

Teor elevado de nitratos em hortaliças

Teor elevado de nitratos

Teor elevado de nitratos em hortaliças de folha

Quantidades relativas de nitratos e outros compostos

Nitrato redutase (NR)

Modelo do dímero da NR:

O NADH liga-se na região FAD-binding de

Regulação da expressão e da actividade da NR

Modelo da regulação da NR por

Um local de fosforilação por serina

Modelo da regulação da NR por fosforilação/desfosforilação

A NR é fosforilada por cinases num resíduo de serina no domínio hinge 1

Efeito de vários factores na regulação da transcrição,

Regulação da expressão e da actividade da NR

A Nitrito Reductase (NiR) converte Nitrito em Amónio

Os cloroplastos e os plastídeos das raízes contêm diferentes formas da enzima mas

Localização intracelular das enzimas

Localização intracelular das enzimas envolvidas na assimilação

Assimilação e reciclagem de amónio:

Durante muito tempo pensou-se que bactérias e plantas superiores

• Ambas as vias, GDH e GS-GOGAT, produzem 1 mole de glutamato a partir de 1

• A via da GS-GOGAT leva à formação de glutamina e glutamato.

Conversão do NH4+ em aminoácidos

A via GS/GOGAT consome ATP mas

Actividade relativa das isoformas GS1 e GS2 da GS

• GS1: Citosol (gene: GLU1)

Regulação pela luz da

Modelo para a regulação da transcrição do gene

Monitorização in situ da transcrição das isoformas

Tal como a GS também a GOGAT apresenta duas isoformas, a Fdx- e a

Estes mutantes apresentam

A Fdx-GOGAT tem um papel