Robles ThamirisCandreva D

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
Faculdade de Ciências Aplicadas/FCA
THAMIRIS CANDREVA ROBLES
INFLUÊNCIA DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA SOBRE A COMPOSIÇÃO DA

MATRIZ EXTRACELULAR DURANTE A CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS EM
CAMUNDONGOS FAT-1
INFLUENCE OF THE INFLAMMATORY RESPONSE ON THE COMPOSITION OF

THE EXTRACELLULAR MATRIX DURING THE WOUND HEALING IN FAT-1 MICE
Limeira
2021
THAMIRIS CANDREVA ROBLES
INFLUÊNCIA DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA SOBRE A COMPOSIÇÃO DA

MATRIZ EXTRACELULAR DURANTE A CICATRIZAÇÃO DE FERIDAS EM
CAMUNDONGOS FAT-1
Tese apresentada à Faculdade de Ciências

Aplicadas da Universidade Estadual de
Campinas como parte dos requisitos exigidos
para a obtenção do título de Doutora em
CIÊNCIAS DA NUTRIÇÃO E DO ESPORTE
E METABOLISMO, na área de CIÊNCIAS
NUTRICIONAIS E METABOLISMO
Orientadora: PROFª. DRA. HOSANA GOMES RODRIGUES
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À

VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA
PELA ALUNA THAMIRIS CANDREVA
ROBLES, E ORIENTADA PELA PROFA.
DRA. HOSANA GOMES RODRIGUES
Limeira
2021
FOLHA DE APROVAÇÃO
Data da defesa: 18/06/2021
Titulação: Doutora em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo, na Àrea de

Nutrição.
Comissão examinadora:
Profa. Dra. Hosana Gomes Rodrigues – Presidente
Profa. Dra. Maria Cláudia Gonçalves de Oliveira Fusaro
Prof. Dr. Fernando Moreira Simabuco
Profa. Dra. Daniela Carlos Sartori
Prof. Dr. Luiz Osório Silveira Leiria
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca, encontra-se

no processo de vida acadêmica da aluna Thamiris Candreva Robles.
DEDICATÓRIA
Ao meu marido, meu parceiro de vida, pelo incentivo e apoio diário.
Obrigada por caminhar comigo e vibrar por cada conquista.
Aos meus pais, pelo amor e pelos esforços imensuráveis, que sem eles, eu
não teria chegado até aqui. Espero que este trabalho represente um dos
frutos que vocês plantaram em minha vida.

AGRADECIMENTOS
À Deus pela vida e por me permitir realizar o doutorado com saúde,

discernimento e proteção.
À minha família por acreditar em mim, por me motivar e fazer de tudo para que
eu pudesse concluir este trabalho. Vocês são minha base de amor e meu refúgio nos
momentos difíceis.
Aos meus amigos, a aqueles que convivem comigo e aos que mesmo distantes
estão sempre em meus pensamentos e me ajudando de alguma forma a vivenciar meus
sonhos.
À minha orientadora Hosana, a qual é responsável pelo meu crescimento

profissional em todos estes anos de trabalho. Agradeço a ela pela oportunidade e por confiar
em mim. Seus ensinamentos foram e são essenciais para a pessoa, mulher, professora,
nutricionista e cientista que sou e, para o que eu mais quiser e almejar me tornar um dia. Que
possamos ensinar e aprender juntas a diante.
Ao meu laboratório Labnutre, pelos vínculos formados, pelas horas dedicadas à

experimentos, apresentações, discussões e também pelos momentos de distração, escuta,
compreensão e de muita colaboração. Agradeço em especial à Jéssica, Beatriz, Roberta e
Inara. Sem vocês tudo seria mais difícil e com certeza a execução deste projeto seria limitada.
Agradeço ao departamento de bioquímica e biologia tecidual, em especial ao

professor Sílvio, por toda a parceria, aprendizado e disposição na execução dos experimentos
e análises de resultados. Meu respeito e minha gratidão pelo ser humano, professor e
pesquisador que é. A conclusão deste projeto eu devo a você.
Ao laboratório de Imunoinflamação e ao laboratório Labdime, pelo espaço e

materiais disponibilizados.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; Processo:

2017/26366-2) e às demais agências de fomento: CAPES, CNPq e FAEPEX, pela
contribuição financeira com todo o meu grupo de pesquisa.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento

de Pessoal de Nível Superior Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
EPÍGRAFE
“Renda-se como eu me rendi
Mergulhe no que você não conhece como eu mergulhei
Não se preocupe em entender,
viver ultrapassa qualquer entendimento”
(Clarice Lispector)
RESUMO
A cicatrização de feridas cutâneas é um processo fisiológico essencial à sobrevivência de todo

organismo vivo. Este processo é composto por três fases sequenciais e sobrepostas:
inflamação, formação do tecido de granulação e remodelamento da matriz extracelular
(MEC). Alteração em qualquer uma destas fases influencia o reparo tecidual final. Ácidos
graxos poli-insaturados das famílias ômega-3 (ω-3) e ômega-6 (ω-6) são incorporados nas
membranas celulares, modulam respostas inflamatórias e, consequentemente a cicatrização.
Recentemente, demonstramos que camundongos transgênicos FAT-1, capazes de produzir
ácidos graxos ω-3 endogenamente, aumentaram a incorporação de ácido docosapentaenoico
(DPA) e ácido docosahexaenoico (DHA) na pele, obtendo uma redução de 50% da razão ω-
6/ω-3. Nestes animais, verificou-se aumento da inflamação nos estágios iniciais do processo
de reparo tecidual e aumento da área da ferida até o 14º dia de análise. Entretanto, em 21 dias
pós-lesão, as feridas de ambos os grupos: FAT-1 e seu controle wild type (WT), estavam
igualmente fechadas. Assim, no presente trabalho, avaliamos se estas alterações inflamatórias
modularam as últimas fases do processo de reparo, nas quais uma nova MEC é formada. A
MEC é responsável pela reconstituição estrutural e funcional do tecido, dando suporte para
interações celulares, além de oferecer propriedades biomecânicas. Os camundongos FAT-1
apresentaram aumento da razão pró-inflamatória (IL-1β/IL-10 e TNF-α/IL-10) e da marcação
de vimentina, fibronectina e elastina durante a fase intermediária (10 dias pós-lesão), em
relação ao grupo WT. Em conjunto, os camundongos FAT-1 elevaram a expressão gênica de
colágeno tipo I, III e IV, bem como, aumentaram a deposição de fibras elásticas e reticulares
na fase final do processo e cicatrização (21 dias pós-lesão), o que favoreceu ao ganho de
resistência à tração e capacidade de alongamento específico (elasticidade) no tecido reparado.
O aumento da produção de macromoléculas da MEC pelos camundongos FAT-1 foi também
confirmado em fibroblastos isolados da pele destes animais. Os fibroblastos derivados dos
animais transgênicos exibiram maior concentração de componentes citoplasmáticos e
extracelulares, como a deposição de fibronectina. Estes resultados evidenciam uma função
anabólica dos ácidos graxos ω-3, correlacionada à maior deposição de MEC e melhora das
funções biomecânicas no tecido cicatricial dos animais FAT-1.
Palavras-chave: Inflamação, ômega-3 e matriz extracelular.

ABSTRACT
The cutaneous wound healing is a physiological process essential for the survival of every
living organism. This process consists of three sequential and overlapping phases:
inflammation, formation of granulation tissue and remodelling of the extracellular matrix
(ECM). Alteration in any of these phases influences the tissue repair. Polyunsaturated fatty
acids from the omega-3 (ω-3) and omega-6 (ω-6) families are incorporated into cell
membranes, modulate inflammatory responses and, consequently, the healing. We recently
demonstrated that FAT-1 transgenic mice, capable of producing ω-3 fatty acids endogenously,
increased the incorporation of docosapentaenoic acid (DPA) and docosahexaenoic acid
(DHA) in the skin, obtaining a reduction of 50% in the ω-6/ω-3 ratio. In these animals, there
was an increase in inflammation in the early stages of the tissue repair process and an increase
in the wound area until the 14th day of analysis. However, at 21 days post-injury, the wounds
of both groups: FAT-1 and its wild type control (WT), were similarly closed. Thus, in the
present study, we evaluated whether these inflammatory changes modulated the last stages of
the repair process, in which a new ECM is formed. ECM is responsible for the structural and
functional reconstitution of the tissue, supporting cellular interactions, in addition to offering
biomechanical properties. FAT-1 mice showed an increase in the pro-inflammatory ratio (IL-
1β/IL-10 and TNF-α/IL-10) and in the marking of vimentin, fibronectin and elastin during the
intermediate phase (10 days post-injury), in relation to the WT group. Together, the FAT-1
mice increased the type I, III and IV collagen gene expression, as well as increased the
deposition of elastic and reticular fibers in the final phase of the healing process (21 days
post-injury), which favored to the gain of tensile strength and specific elongation capacity
(elasticity) in the repaired tissue. The increase in the production of ECM macromolecules by
FAT-1 mice, was also confirmed in fibroblasts isolated from the skin of these animals.
Fibroblasts derived from transgenic animals exhibited a higher concentration of cytoplasmic
and extracellular components, such as fibronectin deposition. These results show an anabolic
function of ω-3 fatty acids, correlated with greater deposition of ECM and improvement of
biomechanical functions in the healed tissue of FAT-1 animals.
Keywords: Inflammation, omega-3 and extracellular matrix.

LISTA DE FIGURAS E ANEXOS
Figura 1. Fases do processo de cicatrização de feridas........................................................21
Figura 2. Resposta celular durante a fase de coagulação do processo de cicatrização de

feridas.......................................................................................................................................22
Figura 3. Eventos durante o processo de cicatrização de feridas.......................................26
Figura 4. Estrutura da Matriz Extracelular (MEC)............................................................30
Figura 5. Conversão de ácidos graxos ω-6 em ω-3 pelo gene fat-1.....................................34
Figura 6. Análise da razão ω-6/ω-3.......................................................................................34
Figura 7. Análise macroscópica do fechamento da ferida...................................................36
Figura 8. Mediadores inflamatórios, atividade da MPO e histologia do tecido

cicatricial..................................................................................................................................36
Figura 9. Reorganização do colágeno....................................................................................37
Figura 10. PCR array específico para cicatrização de feridas............................................38
Figura 11. Etapas do procedimento de genotipagem...........................................................43
Figura 12. Genotipagem.........................................................................................................44
Figura 13. Indução da ferida cutânea dorsal........................................................................45
Figura 14. Detalhamento das dimensões para o ensaio de tração e da máquina de

tração........................................................................................................................................51
Figura 15. Quantificação de mediadores inflamatórios......................................................55
Figura 16. Expressão gênica de componentes estruturais e via celulares associadas à

MEC.........................................................................................................................................60
Figura 17. Imuno-histoquímica do tecido cicatricial de 10 dias pós-lesão.........................65
Figura 18. Análise histológica de componentes da MEC....................................................73
Figura 19. Análise da resistência e elasticidade tecidual.....................................................77
Figura 20. Análise da deposição de MEC por fibroblastos isolados da pele.....................81
Anexo 1. Comitê de ética........................................................................................................98

Anexo 2. Curso capacitatório de legislação e procedimentos para utilização de
animais...................................................................................................................................100
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Sequência dos primers sense e anti sense dos genes avaliados............................49
Tabela 2. Valores de limite de resistência à tração (LRT) e deformação da região de

borda e de ferida.....................................................................................................................75
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AA: Ácido araquidônico
ALA: Ácido alfa-linolênico
Angp-1: Angiopoetina 1
B: Borda
C. elegans: Caenorhabditis elegans
Col: Colágeno
Col1a1: Colágeno tipo I, alfa-1
Col3a1: Colágeno tipo III, alfa-1
Col4a3: Colágeno tipo IV, alfa-3
COX: Ciclooxigenase
CP: Corpo-de-prova
CS: Sulfato de condroitina
CSF2: Fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos
CXCL-1: Ligante 1 de quimiocina CXC
CXCL-2: Ligante 2 de quimiocina CXC
D: Derme
DAMPs: Padrões moleculares associados a danos
DHA: Ácido docosahexaenoico
DIMS: Dietas imunomoduladoras
DPA: Ácido docosapentaenoico
DS: Sulfato de dermatana

E: Epiderme
EGF: Fator de crescimento epidérmico
EGFR: Receptor do fator de crescimento epidérmico
EPA: Ácido eicosapentaenoico
EROs: Espécies reativas de oxigênio
F: Ferida
FGF: Fator de crescimento de fibroblastos
FvW: Fator de von Willebrand
GAGs: Glicosaminoglicanos
GLA: Ácido gama-linolênico
H&E: Hematoxilina e eosina
H2O2: Peróxido de Hidrogênio
H2SO4: Ácido sulfúrico
HA: Ácido hialurônico
HB-EGF: Fator de crescimento epidérmico ligado a heparina
HP: Heparina
HS: Sulfato de heparana
ICAM: Moléculas de adesão intercelular
IL-10: Interleucina-10
IL-1β: Interleucina-1 beta
Itg: Integrina
Itga1: Integrina alfa-1

JNK: c-Jun N-terminal quinase
KS: Sulfato de queratana
LA: Ácido linoleico
LOX: Lipoxigenase
LRT: Limite de resistência à tração
MEC: Matriz extracelular
MET: Microscopia eletrônica de transmissão
MMP-1a: Metaloprotease de matriz-1a
MMP-9: Metaloprotease de matriz-9
MMPs: Metaloproteases
Mpa: Mega Pascal
MPO: Mieloperoxidase
NF-kB: Fator nuclear kappa B
PAI-1: Inibidor-1 do ativador de plasminogênio
PAMPs: Padrões moleculares associados a patógenos
pb: Pares de base
PBS: Tampão fosfato-salino
PC: Fosfatidilcolina
PCR: Reação em cadeia de polimerase
PDGF: Fator de crescimento derivado de plaquetas
PE: Fosfatidiletanolamina
PFA: Paraformaldeído
PGs: Proteoglicanos
Plau: Ativador do plasminogênio tipo uroquinase

Plaur: Receptor do ativador de plasminogênio tipo uroquinase
SD: Desvio padrão da média
SEM: Erro padrão da média
Serpine-1: Inibidor de serina (ou cisteína) proteinase, clade E, membro 1
SPMs: Specialized pro-resolving mediators
STAT3: Transdutor de sinal e ativador de transcrição 3
TBS: Solução salina tamponada com Tris
TE: Tris-EDTA
TG: Tecido de granulação
TGF-α: Fator de crescimento transformante alfa
TGF-β: Fator de crescimento transformante beta
TIMP-1: Inibidor de metaloprotease-1
TIMPs: Inibidores de metaloproteases
TLR: Receptores do tipo Toll
TNF-α: Fator de necrose tumoral alfa
VCAM: Moléculas de adesão celular vascular
VEGF: Fator de crescimento endotelial vascular
Wnt5a: Membro 5a da família do sítio de integração Wingless-type MMTV
WT: Wild type
α-SMA: Alfa actina de músculo liso
ω-3: Ômega-3
ω-6: Ômega-6
LISTA DE SÍMBOLOS
%: porcentagem
±: mais-menos
×: vezes
µ: micro
α: alfa
β: beta
Δ: delta
ω: ômega
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO...................................................................................................................20
1.1. Processo de cicatrização de feridas cutâneas............................................................20
1.2. Crosstalk entre inflamação e MEC.............................................................................27
1.3. Ácidos graxos poli-insaturados e cicatrização de feridas........................................31
1.4. Camundongos FAT-1..................................................................................................33
2. HIPÓTESE DO PRESENTE TRABALHO.....................................................................40
3. OBJETIVOS........................................................................................................................41
3.1. Objetivo Geral.............................................................................................................41
3.2. Objetivos Específicos...................................................................................................41
4. MATERIAIS E MÉTODOS..............................................................................................42
4.1. Animais e tratamento..................................................................................................42
4.2. Genotipagem................................................................................................................42
4.3. Indução das feridas cutâneas.....................................................................................44
4.4. Análise histológica do tecido cicatricial.....................................................................45
4.5. Quantificação de mediadores inflamatórios.............................................................46
4.6. Análise imuno-histoquímica do tecido cicatricial.....................................................46
4.7. Análise da expressão gênica........................................................................................47
4.8. Análise da resistência à tração da pele......................................................................50
4.9. Cultura primária de fibroblastos...............................................................................51
4.10. Caracterização da cultura primária de fibroblastos..............................................52
4.11. Análise da deposição de MEC por microscopia eletrônica de transmissão

(MET)..................................................................................................................................53
5. ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................................................54
6. RESULTADOS....................................................................................................................55
6.1. Camundongos FAT-1 apresentaram aumento da razão pró-inflamatória durante
a fase intermediária do processo de cicatrização............................................................55
6.2. Camundongos FAT-1 aumentaram a expressão de colágeno..................................56
6.3. Camundongos FAT-1 apresentaram aumento de componentes da MEC durante a

fase intermediária do processo de cicatrização...............................................................60
6.4. Camundongos FAT-1 exibiram aumento de fibras elásticas e de fibras reticulares

durante a última fase do processo de cicatrização..........................................................65
6.5. Camundongos FAT-1 apresentaram melhora das propriedades biomecânicas

durante a última fase do processo de cicatrização..........................................................73
6.6. Fibroblastos isolados da pele de camundongos FAT-1 aumentaram a deposição de

MEC.....................................................................................................................................77
7. DISCUSSÃO........................................................................................................................82
8. CONCLUSÃO.....................................................................................................................87
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..............................................................................88
10. ARTIGOS PUBLICADOS...............................................................................................96
11. ANEXOS............................................................................................................................98
11.1. Comitê de ética...........................................................................................................98
11.2. Curso capacitatório de legislação e procedimentos para utilização de

animais...............................................................................................................................100
20
1. INTRODUÇÃO
1.1. Processo de cicatrização de feridas cutâneas
A pele é o maior órgão do corpo e possui funções críticas, essenciais à

sobrevivência [1]. Dentre as inúmeras funções, a pele atua como uma interface entre os
órgãos internos e o ambiente externo, protegendo o organismo da desidratação, de danos
físicos e/ou mecânicos, de infecções microbianas, da radiação ultravioleta e de temperaturas
extremas [2-3]. Com isto, a pele está susceptível a lesões, impactando significativamente na
saúde do indivíduo [3].
Em humanos e demais mamíferos, a pele é constituída por três camadas:

epiderme, derme e hipoderme. A epiderme é a camada externa, formada por queratinócitos
em diferentes fases de diferenciação, os quais mantém a impermeabilidade adequada do
tecido cutâneo. A derme é o tecido conjuntivo propriamente dito, rico em matriz extracelular
(MEC), vasculatura e mecanorreceptores, sendo responsável em fornecer propriedades
biomecânicas, nutrientes e imunidade à pele. A hipoderme ou tecido adiposo subcutâneo está
abaixo da derme e atua como uma reserva de energia e uma fonte constante de fatores de
crescimento para a derme [3]. Especificamente, cada camada da pele é caracterizada por tipos
celulares imunes transitórios como neutrófilos, macrófagos, linfócitos e mastócitos, os quais
mantêm-se em constante vigília quanto aos danos. Assim, quando a pele é lesionada, estas
células são ativadas de forma coordenada, para que haja o correto reparo tecidual [3].
Em uma condição de lesão, a pele pode ser reparada através dos processos de
regeneração ou de cicatrização. A regeneração caracteriza-se pela substituição específica do
tecido, enquanto que a cicatrização restaura o tecido com formação de cicatriz ou fibrose [4].
Apesar destas importantes diferenças conceituais, os termos regeneração e cicatrização são
utilizados como sinônimo na literatura e no presente trabalho.
O reparo tecidual é um processo dinâmico fundamental e evolutivamente

conservado [5], caracterizado por três fases sequenciais e sobrepostas, as quais envolvem:
inflamação, formação do tecido ou proliferação e remodelamento ou maturação [6-7] (Figura
1).
21
Figura 1. Fases do processo de cicatrização de feridas. Casado-Diaz A.;

et al (2020). O processo de cicatrização de feridas é composto pela fase inflamatória,
pela fase intermediária proliferativa e pela fase final de remodelamento. A inflamação
tem sua resposta máxima em 24 horas após a lesão e tem principalmente a participação
de neutrófilos e macrófagos. A fase proliferativa tem início em 24 horas, com resposta
máxima em 5 dias após a lesão e pode prolongar-se por até 1 mês, sendo caracterizada
pela deposição de matriz extracelular (MEC), angiogênese e reepitelização. A última
fase de remodelamento se inicia aproximadamente no quinto dia após a lesão e pode se
extender por 1 ano, quando a MEC é reestabelecida.
Durante o estado de homeostase da pele, as plaquetas circulam próximas à

parede do vaso. No entanto, agentes antitrombóticos, como o óxido nítrico e as
prostaciclinas, liberados pelas células endoteliais, impedem a ligação das plaquetas ao
revestimento endotelial e a agregação plaquetária [3]. Contudo, imediatamente após a
lesão tecidual, a exposição do colágeno inicia a cascata de coagulação [2-3]. Células
lesionadas liberam rapidamente vasoconstritores que causam contratura reflexa do
músculo liso e interrupção temporária do sangramento. A ruptura dos vasos sanguíneos
expõe a matriz subendotelial, na qual plaquetas se ligam usando receptores, integrinas e
glicoproteínas acopladas à proteína G em sua superfície. O fator de von Willebrand
22
(FvW) liberado pelas plaquetas também se liga à esta matriz, fortalecendo o tampão
plaquetário. Finalmente, as vias extrínseca e intrínseca, da cascata de coagulação,
ativam o fator X, que resulta na clivagem do fibrinogênio em fibrina. A fibrina
reticulada então, se liga ao tampão plaquetário, formando o trombo que interrompe a
hemorragia no local e, fornece uma matriz provisória para o processo de cicatrização em
andamento [3] (Figura 2). Neste momento, uma variedade de citocinas e fatores de
crescimento são liberados, mediando a comunicação e a sinergia de diferentes tipos
celulares [4].
Figura 2. Resposta celular durante a fase de coagulação do processo de

cicatrização de feridas. Rodrigues M.; et al (2019). (A) agentes antitrombóticos
liberados pelas células endoteliais, impedem a agregação plaquetária no estado basal.
(B) células endoteliais lesionadas liberaram vasoconstritores que interrompem o
sangramento. (C) as plaquetas se ligam a matriz subendotelial, através de receptores
23
acoplados à proteína G, integrinas, glicoproteínas e do fator de von Willebrand (vWF).

(D) as vias extrínseca e intrínseca ativam o fator X, que cliva o fibrinogênio em fibrina,
a qual se liga ao tampão plaquetário formando o trombo.
Concomitantemente, a fase inflamatória dá-se início e seu processo é

essencial para que as fases subsequentes do processo de cicatrização de feridas, assim
como o próprio tecido reparado, sejam eficazes [8-9].
A fase inflamatória é dividida em fase inicial e em fase tardia, sendo a

primeira, caracterizada por eventos pró-inflamatórios que favorecem a inflamação e, a
segunda, por eventos resolutivos que cessam a inflamação [10]. Desta forma, o
desequilíbrio na razão de mediadores pró/anti-inflamatórios em respectiva fase da
inflamação, mantém o tecido cicatricial em estado inflamatório prolongado, retardando
o fechamento da ferida e o reestabelecimento saudável de tecido novo [10-11].
Durante a fase inicial da inflamação, células residentes, tais como

queratinócitos, macrófagos, células dendríticas e mastócitos, são expostas à sinais de
perigo exógenos e endógenos, comumente classificados em padrões moleculares
associados a patógenos (PAMPs) ou a danos (DAMPs) [12]. Os PAMPs ligam-se à
receptores do tipo toll (TLR), constitutivamente expressos em células imunes e, esta
ligação desencadeia eventos de sinalização que ativam os sistemas de defesa
antimicrobiana e estimulam a produção de citocinas pró-inflamatórias. Já os DAMPs,
também conhecidos como alarminas, são moléculas endógenas liberadas por células
hospedeiras danificadas. Muitas alarminas são proteínas nucleares ou localizadas em
outro compartimento intracelular onde normalmente não são expostas a células
inflamatórias. No entanto, quando ocorre dano celular, estas moléculas são liberadas no
espaço extracelular, sendo reconhecidas por receptores na superfície das células
inflamatórias (e outros tipos celulares que expressam o receptor). Além de serem
liberadas por células danificadas, as alarminas também podem ser secretadas por células
imunes ativadas, aumentando a inflamação. Recentemente foi elucidado que a
interleucina-33 (IL-33) é uma alarmina altamente expressa na pele após a lesão,
possuindo funções pró-cicatrizantes, através da regulação de células endoteliais,
queratinócitos e macrófagos. Assim, a IL-33 atua perpetuando a inflamação inicial e
influenciando a angiogênese e o fechamento da ferida [12].
Em resposta aos sinais inflamatórios agudos, os neutrófilos são os primeiros

tipos celulares a serem recrutados para o local lesionado, sendo responsáveis por
24
fagocitarem patógenos, liberarem substâncias antimicrobianas como espécies reativas

de oxigênio (EROs), eicosanoides, peptídeos catiônicos e proteinases, além de
produzirem citocinas pró-inflamatórias, tais como: interleucina-1 beta (IL-1β),
interleucina-6 (IL-6) e o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e, quimiocinas como o
ligante 1 de quimiocina CXC (CXCL-1) e o ligante 2 de quimiocina CXC (CXCL-2),
que irão ampliar a inflamação [8]. Não somente os neutrófilos, mas demais leucócitos
são recrutados através destes mediadores pró-inflamatórios, que induzem à expressão de
moléculas de adesão nas células endoteliais, dentre as quais destacam-se as E-selectinas
e as moléculas de adesão intercelular (ICAM) e celular vascular (VCAM), essenciais
para a aderência das células à parede do endotélio [2,8].
Aproximadamente três dias após a lesão tecidual, monócitos são recrutados,

onde no tecido se diferenciam em macrófagos, iniciando a fase inflamatória tardia.
Macrófagos são células do sistema imune que possuem heterogeneidade fenotípica,
favorecendo a existência de uma extensa variedade destes tipos celulares [13]. Estas
células exibem seu fenótipo através de sinais inflamatórios do microambiente no qual se
encontram, que as ativam e polarizam. Contudo, embora haja diversos fenótipos de
macrófagos, estas células são comumente classificadas de forma generalizada, como
sendo pró-inflamatórias ou resolutivas [10,13]. Assim, durante a inflamação tardia do
processo de cicatrização de feridas, macrófagos resolutivos fazem-se fundamentais, uma
vez que secretam interleucina-10 (IL-10), a principal citocina resolutiva, neutralizando
mediadores pró-inflamatórios e, portanto, encerrando a inflamação [10].
Com o início da fase proliferativa, o fator de crescimento endotelial vascular

(VEGF) associado ao fator de crescimento de fibroblastos (FGF), induzem à
proliferação de células endoteliais e à formação de novos vasos (angiogênese),
essenciais para a produção de uma nova MEC, a qual permite adequada oferta de
oxigênio, nutrientes e migração de células imunocompetentes ao tecido em
reconstituição [14]. O FGF, junto a outros fatores de crescimento, também favorece a
infiltração de fibroblastos, os quais sintetizam componentes estruturais e contribuem
para o fechamento da ferida. Nesta etapa, há predominância da síntese de colágeno tipo
III, disposto de forma uniaxial. Adicionalmente, células epiteliais são estimuladas, afim
de reepitelizar o local, com a polarização e migração de queratinócitos, que irão
restaurar a barreira epitelial [14-15].
Finalmente, a fase de remodelamento tecidual inicia-se entre duas e três

semanas após a lesão e pode perdurar por um ano ou mais. O objetivo principal desta
25
fase consiste na degradação, ressíntese e reorganização do colágeno. Com o fechamento

da ferida, as enzimas metaloproteases de matriz (MMPs), degradam o colágeno tipo III
de forma coordenada, através da ação dos inibidores de metaloproteases de matriz
(TIMPs), evitando assim, uma degradação excessiva [14,16]. Ao mesmo tempo, o fator
de crescimento transformante beta (TGF-β) e o FGF estimulam a síntese de colágeno
tipo I, caracterizado por fibras mais espessas e de organização multiaxial, resultando em
maior resistência tecidual [14,16] (Figura 3).
26
Figura 3. Eventos durante o processo de cicatrização de feridas.

Adaptado de Silva JR.; et al (2018). Os estágios iniciais da cicatrização de feridas
incluem coagulação e ativação de células inflamatórias, as quais produzem mediadores
inflamatórios (IL-1β, TNF-α, IFN-γ, CXCL-2) e espécies reativas de oxigênio. O
estágio proliferativo envolve a proliferação de fibroblastos, angiogênese e deposição de
colágeno tipo III. A fase de remodelamento inclui restauração da barreira e contração da
ferida por miofibroblastos.
27
1.2. Crosstalk entre inflamação e MEC
A correta cicatrização de feridas necessita da eficiência de todas as fases que

compõe o processo, sendo a interrupção em uma destas etapas, resultante do
desenvolvimento de feridas crônicas não cicatrizadas [17]. Entretanto, a transição da
fase inflamatória tardia para a fase de formação do tecido ou proliferação é a mais
crítica. Durante a fase inflamatória tardia, eventos imunológicos e fisiológicos ocorrem,
para que haja a produção de uma nova e permanente MEC, que dará origem ao tecido
conjuntivo [18].
Os tecidos conjuntivos estabelecem e mantém a forma do corpo, conferindo

importante papel biomecânico, através do conjunto de macromoléculas depositadas em
grandes quantidades pelas células do tecido e organizadas ao redor de si mesmas, as
quais definem a MEC. Embora a composição e as propriedades da MEC alterem com a
idade, ambiente ou doença, os principais componentes extracelulares da MEC
permanecem qualitativamente iguais. Estes componentes podem ser divididos em 3
classes: moléculas estruturais formadoras de fibras, moléculas estruturais não-fibrosas e
proteínas matricelulares que não funcionam estruturalmente, mas modificam as
interações célula-MEC [19].
A MEC é constituída principalmente por moléculas formadoras de fibras, as

quais fornecem uma estrutura complexa de proteínas rígidas. Dentre as proteínas
fibrosas, as fibras colágenas correspondem a 75% do peso seco da pele e fornecem
resistência à tração mecânica e elasticidade [20]. Na pele humana, o colágeno tipo I
representa 80% a 90% do colágeno total, enquanto o tipo III representa 8% a 12% e o
tipo V representa <5% [20].
As fibras elásticas são outro elemento fibroso que compõe a MEC. Elas
consistem em microfibrilas (fibrilinas, fibulinas, glicoproteínas associadas a
microfibrilares e proteínas de ligação a TGF-β latentes) e elastina amorfa [20]. Dentre
as inúmeras funções, as microfibrilas fornecem suporte à deposição apropriada de
tropoelastina, para a posterior ação das enzimas lisil-oxidases, promovendo as reações
de “cross-linking” entre estes monômeros, formando, então, o polímero insolúvel e
amorfo de elastina. Na pele, as fibras elásticas adotam uma arquitetura característica
altamente ordenada, com microfibrilas ricas em fibrilina orientadas perpendicularmente
na derme papilar e fibras elásticas de grande diâmetro na derme reticular, compostas
principalmente de elastina [20].
28
Embora as fibras colágenas ofereçam elasticidade à pele, as fibras elásticas

são as principais responsáveis [21]. A elasticidade, refere-se à capacidade de um
material ter resiliência, ou seja, se deformar reversivelmente sem perda de energia. Em
relação à pele, as fibras elásticas retornam à sua configuração normal após ser esticada
ou deformada e, portanto, possuem alta resiliência [20-21].
Outro significado para elasticidade é a capacidade de complacência ou de

ser deformado com pouca força [20-21]. Assim, as proteínas elásticas devem ter baixa
rigidez. A combinação de alta resiliência, grandes deformações e baixa rigidez é
característica de proteínas do tipo borracha, como a elastina, por exemplo. A elastina
funciona em associação com o colágeno nos tecidos conjuntivos de vertebrados, onde a
elasticidade reversível é necessária (pele e cartilagem) [21]. Além disso, a elastina é um
componente importante das artérias, onde sua elasticidade e capacidade de armazenar
energia permitem que as artérias suavizem o fluxo pulsátil de sangue, diminuindo o pico
de pressão arterial e o trabalho mecânico do coração [21].
Demais proteínas elásticas possuem propriedades diferentes e funções

também distintas. As fibras colágenas dificilmente podem ser descritas como elásticas
na pele [21]. O colágeno possui uma capacidade excepcional de armazenamento de
energia, porém são altamente rígidos e apresentam baixa extensibilidade. Entretanto, o
aspecto que o estabelece como uma proteína elástica é a resiliência, mesmo que baixa
[21]. Em tecidos conjuntivos como o da pele, o colágeno é frequentemente organizado
em paralelo com a elastina e, nessas circunstâncias, a elasticidade do tecido se deve
principalmente à elastina. Contudo, a essencialidade do colágeno refere-se à sua
disposição como uma rede de fibras onduladas de reforço que ficam alinhadas na
direção do estiramento. Quando esticada, esta rede limita a deformação do tecido e evita
a ruptura, promovendo resistência à tração da pele [21].
Conjuntamente às moléculas formadoras de fibras, a fibronectina também

possui papel crítico na estabilidade e organização da MEC. A fibronectina é uma
glicoproteína dimérica que existe em uma forma solúvel encontrada no plasma e uma
forma insolúvel encontrada na MEC. Devido aos seus muitos domínios de ligação, as
fibrilas de fibronectina da MEC têm a capacidade de interagir com células
(principalmente fibroblastos), outras fibrilas de fibronectina e demais proteínas
estruturais, como a rede colágena, por exemplo, tornando-a imprescindível em lesões de
tecidos [22].
29
Além dos componentes fibrosos, a MEC é também formada por moléculas

estruturais não formadoras de fibras, as quais incluem os glicosaminoglicanos (GAGs) e
os proteoglicanos (PGs), que são amorfos e incorporam os elementos da matriz fibrosa e
celular na derme. Embora representem apenas 0,2% do peso seco da derme, absorvem
água até 1000 vezes o seu volume e têm funções na regulação da ligação à água e na
compressibilidade da derme [20].
Os GAGs são grandes polissacarídeos lineares e são abrangentes na MEC.

Existem seis tipos de GAGs, incluindo: sulfato de condroitina (CS), sulfato de
dermatana (DS), sulfato de queratana (KS), sulfato de heparana (HS), heparina (HP) e
ácido hialurônico (HA) [20]. Exceto o HA, os GAGs são geralmente associados a uma
proteína para formar um PG. O HA não é sulfatado e não se liga a proteínas para formar
PGs. Em vez disso, ele se liga a proteínas contendo domínio de ligação de HA [20].
Como as cadeias de GAG contêm numerosos grupos carboxila e sulfato carregados
negativamente, elas podem ter papéis importantes na manutenção do conteúdo de água
no tecido. A reticulação de HA com proteínas de matriz, como a rede de colágeno,
resulta na formação de estruturas supermoleculares e aumenta a rigidez do tecido [20].
Os PGs são macromoléculas hidrofílicas compostas de uma parte proteica

ou “core” proteico associado a GAG ancorados covalentemente. Os PGs são essenciais
para manter a resistência mecânica da pele [20]. Dentre os PGs, a decorina, o biglicano
e o versicam são os mais abundantes na pele humana. A decorina e o biglicano são
proteínas centrais do DS, enquanto o versicam é uma proteína central do CS [20].
Também presentes na MEC estão as proteínas matricelulares, um grupo de

proteínas locais secretadas que, embora não contribuam significativamente para a
estrutura mecânica da MEC, modificam as interações célula-matriz. Incluídas entre as
proteínas matricelulares estão a osteopontina, osteonectina, tenascina-C, fibulinas e a
família CCN [22]. Ao contrário da maioria dos componentes da MEC que estão
constantemente presentes na pele normal e posteriormente reproduzidos na ferida, as
proteínas matricelulares podem estar ausentes na pele saudável e expressas
temporariamente apenas após a ferida na pele [22].
Posterior a lesão tecidual, a MEC é danificada e uma matriz provisória de

fibrina é formada no interior da ferida pela cascata de coagulação. Esta matriz é
constituída principalmente de fibrinogênio e contém fibronectina plasmática [23-24].
Durante o processo de reparo, a matriz de fibrina é gradualmente degradada pelas
30
células imunológicas que migram para o coágulo e é substituída por uma matriz à base
de colágeno, com uma proporção excessiva de colágeno tipo III (cerca de 20% a 25%)
em comparação com a pele saudável [25]. Outras proteínas, tais como: fibronectina,
tenascina-C e ácido hialurônico, também se encontram aumentadas. Durante a
subsequente fase de remodelamento a longo prazo, a rede de fibras elásticas é
restabelecida e a matriz se reorganiza para alcançar uma composição mais próxima da
MEC [23-25] (Figura 4).
Figura 4. Estrutura da Matriz Extracelular (MEC). Briquez PS.; et al

(2015). (Superior) Localização de diferentes MEC presentes no tecido da pele.
(Inferior) Representações esquemáticas das principais moléculas da MEC que
compõem a matriz intersticial (A) e a lâmina basal (B) da pele saudável e, o coágulo de
fibrina (C) e o tecido de granulação (D) durante a cicatrização de feridas na pele. As
estrelas em vermelho indicam as moléculas da MEC que possuem alta afinidade por
fatores de crescimento.
Em relação à composição da MEC, os fibroblastos produzem a maioria dos

componentes da MEC, enquanto que estas mesmas moléculas atuam simultaneamente
para modificar a função do fibroblasto. Nesse sentido, a interação do fibroblasto com a
MEC é uma forma de regulação autócrina, crucial no processo de reparo tecidual.
Embora os fibroblastos sejam responsáveis pela produção e tensionamento precoce do
colágeno da MEC, eles também são consideravelmente afetados por ele. A
31
diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos contráteis pode ser estimulada por

alterações mecânicas na MEC, devido a lesões prévias. Tanto o estiramento, quanto a
frouxidão tecidual, podem mesmo que independente da sinalização do TGF-β, alterar a
orientação dos fibroblastos em relação a MEC e regular a expressão de alfa actina de
músculo liso (α-SMA), um dos marcadores consistentes com a diferenciação em
miofibroblastos [22].
Inerente à presença de macrófagos durante a resposta inflamatória tardia, a

transição fenotípica para macrófagos M2 de caráter mais anti-inflamatório ou
resolutivo, permite a produção aumentada de TGF-β1, VEGF, PDGF (fator de
crescimento derivado de plaquetas) e FGF, diretamente associados à ativação dos
fibroblastos e síntese da MEC [26]. Especialmente o TGF-β1, estimula a ativação de
fibroblastos quiescentes para miofibroblastos diferenciados com função contrátil,
importantes para a produção de constituintes estruturais e o fechamento da ferida [27].
Ao final da cicatrização, os macrófagos resolutivos também se fazem essenciais para a
produção de MMPs e TIMPs e, portanto, para o remodelamento da MEC. Desta forma,
a transição fenotípica destas células é crítica para a resolução da inflamação e para o
equilíbrio do reparo tecidual [28].
São inúmeros os estudos que demonstram a correlação da resposta

imunológica com o desenvolvimento de feridas não cicatrizadas. Concomitantemente,
feridas crônicas são usualmente resultado de inflamação excessiva. Assim, o controle da
resposta inflamatória parece ser uma alternativa terapêutica eficiente para acelerar e
melhorar o processo de cicatrização de feridas.
1.3. Ácidos graxos poli-insaturados e cicatrização de feridas
Durante mais de 100 anos, a nutrição tem sido reconhecida como um fator
importante no processo de cicatrização de feridas [29]. O uso da nutrição como terapia,
fez surgir o conceito de imunonutrição. Este conceito tem conduzido à suplementação
de substâncias denominadas nutrientes imunomoduladores, que incluem: arginina,
glutamina, cisteína, nucleotídeos, ácidos graxos, fibras, zinco e vitaminas A, C, D e E,
em condições de saúde e/ou doença [30]. Estes nutrientes influenciam a resposta
inflamatória por possuírem ação direta ou indireta no sistema imunológico, via ativação
de células como linfócitos e macrófagos, produção de moléculas vasodilatadoras,
antioxidantes e hormônios, inibição da função neutrofílica e estímulo a vias
32
intracelulares anti-inflamatórias [30]. Assim, uma série de estudos e revisões têm

avaliado o papel das dietas imunomoduladoras (DIMS) ou seus componentes no reparo
tecidual [30].
Ácidos graxos poli-insaturados das famílias ômega-6 (ω-6) e ômega-3 (ω-

3), têm sido alvo de pesquisas relacionadas a doenças de caráter inflamatório, por serem
considerados nutrientes moduladores deste processo [31]. Os ácidos graxos da família
ω-6 incluem: ácido linoleico (LA), gama-linolênico (GLA) e araquidônico (AA), entre
outros. Já os principais ácidos graxos da família ω-3 incluem: ácido alfa-linolênico
(ALA), ácido eicosapentaenoico (EPA) e o ácido docosahexaenoico (DHA) [32].
Comumente, a dieta ocidental é rica em ácidos graxos ω-6, devido à

abundância de LA presente nos óleos de milho, girassol e cártamo [32]. Com isto, os
ácidos graxos ω-3 representam apenas uma pequena porcentagem da ingestão diária de
gordura e são obtidos a partir de duas fontes alimentares principais: plantas e peixes.
Nozes, linhaça e óleos vegetais de canola, contêm o ácido graxo ω-3 ALA, que é um
precursor dos ácidos graxos EPA e DHA. Entretanto, a conversão de ALA em EPA e
DHA no organismo é ineficiente [32]. A fonte alimentar mais concentrada de EPA e
DHA é o peixe gordo, como por exemplo: atum, salmão, sardinha, entre outros [32].
Após o consumo, os ácidos graxos ω-6 e ω-3 são incorporados nas membranas
celulares, onde modulam a função de proteínas de membrana, a sinalização celular e a
expressão gênica. Os ácidos graxos ω-3 competem com os ácidos graxos ω-6 para
serem incorporados e, quando os ácidos graxos ω-6 predominam nas membranas
celulares, mediadores pró-inflamatórios como tromboxanos, prostaglandinas e
leucotrienos das classes 2 e 4, são produzidos através da ação das enzimas
ciclooxigenase (COX) e da 5-lipoxigenase (LOX-5). Por outro lado, a presença de
ácidos graxos ω-3 induz a produção de prostaglandinas e leucotrienos da série 3 e 5, os
quais têm características menos inflamatórias [32-33]. Além disso, a metabolização do
EPA e DHA é capaz de atuar na resolução da inflamação, através de mediadores
especializados pró-resolução (Specialized pro-resolving mediators - SPMs),
classificados como resolvinas, protectinas e maresinas. Os SPMs têm potencial de
estimular eventos celulares importantes na resolução da inflamação, tais como: inibir a
ativação e o recrutamento de células inflamatórias e reduzir a expressão de citocinas
pró-inflamatórias nestas células [34]. Assim, o controle da inflamação pelos ácidos
graxos poli-insaturados ω-6 e ω-3, deve-se à capacidade de alterarem a permeabilidade
de membrana, à produção de eicosanoides, os quais se ligam a fatores de transcrição e, à
33
própria ligação do ácido graxo a receptores acoplados a proteína G, como o receptor

GPR120, que possui maior afinidade aos ácidos graxos ω-3 [33].
Na cicatrização de feridas, a modulação da inflamação e a influência no
reparo tecidual pelos ácidos graxos ω-6 têm sido estabelecidas. Estudos demonstraram
que a administração oral de LA acelerou a fase inflamatória e a angiogênese em ratos
diabéticos e saudáveis [35-36]. Entretanto, os efeitos dos ácidos graxos ω-3 durante o
processo de reparo da pele são menos claros. Apesar dos efeitos anti-inflamatórios dos
ácidos graxos ω-3 serem delineados em diversas doenças, na cicatrização de feridas,
nosso grupo demonstrou que camundongos suplementados com óleo de peixe rico em
EPA, tiveram um prejuízo na organização do colágeno durante o processo de
cicatrização [37]. Adicionalmente, humanos suplementados com EPA+DHA tiveram
produção aumentada de citocinas pró-inflamatórias e atraso no fechamento da ferida
[38]. Em contrapartida, o uso tópico de DHA em ratos acelerou a cicatrização cutânea
[39] e, em humanos, a suplementação de ambos EPA+DHA, promoveu a reepitelização
e a redução de marcadores inflamatórios [40].
As diferenças entre estes achados podem estar associadas às concentrações

biodisponíveis destes ácidos graxos, uma vez que cada ácido graxo exerce um efeito
fisiológico particular, em determinada condição clínica, necessitando de mais estudos
envolvendo ácidos graxos ω-3 e seu papel no reparo tecidual de feridas cutâneas.
1.4. Camundongos FAT-1
Buscando uma alternativa fidedigna para se avaliar as funções específicas

de ácidos graxos ω-3 e a proporção ω-6/ω-3, em diferentes órgãos ou tecidos, Kang JX
e colaboradores, desenvolveram o camundongo transgênico denominado FAT-1, no qual
foi inserido o gene fat-1, proveniente do nematódeo Caenorhabditis elegans (C.
elegans) [41]. O gene fat-1 codifica a enzima Δ-3 (delta-3) desaturase, a qual introduz
uma dupla ligação na posição ω-3 na cadeia de hidrocarbonetos do ω-6, possibilitando a
conversão de ácidos graxos ω-6 em ácidos graxos ω-3 endogenamente [41-42] (Figura
5).
34
Figura 5. Conversão de ácidos graxos ω-6 em ω-3 pelo gene fat-1.

Adaptado de Kang JX (2007). A enzima Δ-3 (delta-3) desaturase introduz uma dupla
ligação na posição ω-3 na cadeia de hidrocarbonetos do ω-6.
Devido a uma adaptação evolutiva, o gene fat-1 deixou de existir em

diversas espécies, favorecendo a prevalência da incorporação de ácidos graxos ω-6 nos
tecidos [41]. Assim, a utilização dos camundongos transgênicos FAT-1 vem sendo de
extrema importância em estudos destinados ao entendimento da imunomodulação
exercida pelos ácidos graxos ω-3 e da razão ω-6/ω-3 ideal sobre o processo
inflamatório, em diferentes modelos, tais como: obesidade [43-44], neuroinflamação
[45-46], pancreatite [47-49], câncer [50-52], colite [53], osteoartrite [54] e hepatite [55].
Com isto, optamos por avaliar o processo de cicatrização de feridas cutâneas nestes
camundongos.
Em recente estudo publicado pelo nosso grupo, demonstramos que os

camundongos FAT-1 apresentaram aumento na incorporação de ácidos graxos ω-3 na
pele, principalmente de ácido docosapentaenoico (DPA) e DHA, o que resultou em
redução de 50% da razão ω-6/ω-3 (Figura 6A) [56]. A nível sistêmico, foi também
observado no soro dos animais transgênicos redução de AA (40%) e elevada
concentração de DHA, ALA e EPA, resultando em uma razão ω-6/ω-3 inferior em
comparação com o grupo WT (cerca de 33% menor) (Figura 6B) [56].
35
Figura 6. Análise da razão ω-6/ω-3. Adaptado de Candreva T.; et al

(2019). Tecidos de pele não cicatriciais de camundongos WT e FAT-1, foram coletados
no momento da indução da ferida. A análise da razão ω-6/ω-3 foi realizada, através da
quantificação de ácidos graxos ω-6 e de ácidos graxos ω-3, nas frações lipídicas de
fosfatidilcolina (PC) e fosfatidiletanolamina (PE), por ensaio de cromatografia gasosa
(A). O soro de camundongos WT e FAT-1, foi coletado 3 dias após a indução da ferida
para análise da composição lipídica sistêmica (B). Os resultados foram apresentados
como média ± SD. Diferenças significativas entre os grupos WT e FAT-1 foram
consideradas para p<0.05 (*), p<0.01 (**) e p<0.001 (***). n > 5 animais/grupo.
Conjuntamente no estudo publicado, demonstramos que, embora em 21 dias

pós-lesão, as feridas de ambos os grupos (WT e FAT-1) estavam igualmente fechadas,
os camundongos FAT-1 apresentaram uma maior área da ferida até o 14º dia de análise
(Figura 7), bem como, alterações inflamatórias em comparação com os animais
controles. Estas alterações não foram significativas no estado basal e durante a
inflamação inicial (1 dia pós-lesão), porém durante a inflamação tardia (3 e 5 dias pós-
lesão), os animais FAT-1 exibiram um perfil não resolutivo (Figura 8A, B e C). Neste
momento, os animais transgênicos aumentaram a atividade da mieloperoxidase (MPO)
(Figura 8D) e a produção de mediadores pró-inflamatórios (IL-6, TNF-α, CXCL-1,
CXCL-2 e TIMP-1), com redução de IL-10. Verificamos também, presença de edema e
elevada infiltração de células inflamatórias na ferida de 5 dias dos camundongos FAT-1,
o que corrobora com a predominância de inflamação nestes animais (Figura 8E). Ao
final do fechamento completo da ferida (21 dias pós-lesão), através de análises
histológicas qualitativas, os animais transgênicos exibiram um alinhamento uniaxial do
tecido, associado à organização do colágeno, enquanto que os animais controles
demonstraram uma orientação multiaxial das fibras colágenas (Figura 9) [56].
1 4 d ia s
*** 4 **
120
WT
Á r e a d a f e r id a ( % )
Á r e a d a f e r id a ( % )
F A T -1
3
***
80
** 2
40
1
*
**
0 0
0 1 3 5 12 14 WT F A T -1
d ia s
36
Figura 7. Análise macroscópica do fechamento da ferida. Adaptado de

Candreva T.; et al (2019). As feridas cutâneas de animais WT e FAT-1 foram
acompanhadas no momento da indução da ferida e nos dias 1, 3, 5, 12 e 14 dias pós-
ferida. A análise quantitativa da área das feridas foi realizada pelo programa ImageJ. Os
resultados foram apresentados como média ± SD. Diferenças significativas entre os
grupos WT e FAT-1 foram consideradas para p<0.05 (*), p<0.01 (**) e p<0.001 (***).
n > 8 animais/grupo.
Figura 8. Mediadores inflamatórios, atividade da MPO e histologia do

tecido cicatricial. Adaptado de Candreva T.; et al (2019). Tecidos cicatriciais de 1
(A), 3 (B) e 5 (C) dias pós-lesão foram coletados de animais WT e FAT-1 para
37
quantificação de mediadores inflamatórios pelo método de ELISA. A concentração final

foi normalizada pela proteína tecidual, através do método de Bradford. (D) A atividade
da MPO foi avaliada nos tecidos de 1, 3, 5 e 12 dias pós-lesão. Os resultados foram
apresentados como média ± SD. Diferenças significativas entre os grupos WT e FAT-1
foram consideradas para p<0.05 (*) e p<0.01 (**). (E) Cortes histológicos corados com
eosina e hematoxilina (H&E) evidenciam a epiderme (E), derme (D) e o tecido de
granulação (GT) na região de transição borda-ferida do tecido cicatricial de 5 dias pós-
lesão, de animais WT e FAT-1 (escala: 100 µm; objetiva de 10x). As inserções I e II
(imagens com zoom; objetiva de 20x) do grupo WT representam a organização e
alinhamento (*) do tecido com poucas células inflamatórias. Por outro lado, no grupo
FAT-1, as inserções I e II evidenciam intensa inflamação com presença de células
inflamatórias (**) e edema (***) (escala: 200 µm). n > 5 animais/grupo.
Figura 9. Reorganização do colágeno. Candreva T.; et al (2019). Tecidos

cicatriciais de 21 dias pós-lesão foram coletados de camundongos WT e FAT-1. Os
tecidos foram corados com Sirius Red e hematoxilina. A aquisição das imagens foi feita
na região de transição borda-ferida, com (imagens à direita) e sem (imagens à esquerda)
polarização. Barra de escala: 200 e 100 µm (imagens ampliadas). n > 3 animais/grupo.
A partir destes achados, nos perguntamos se a inflamação presente nos

camundongos FAT-1 poderia influenciar a deposição de MEC na ferida destes animais.
Para isto, realizamos previamente um experimento de PCR array específico para
cicatrização de feridas cutâneas, no qual verificou-se que dos 84 genes avaliados, 22
38
tiveram sua expressão modulada pelos camundongos transgênicos. Dentre estes genes,
destacam-se os que estão associados à MEC, tais como: os genes da família das
integrinas (Itg), do colágeno (Col) e do fator de crescimento epidérmico (EGF), assim
como, o membro 5a da família do sítio de integração Wingless-type MMTV (Wnt5a), a
metaloprotease de matriz-1a (MMP-1a), o inibidor de serina ou cisteína proteinase,
clade E, membro 1 (Serpine-1), o receptor do ativador de plasminogênio tipo
uroquinase (Plaur) e a angiopoetina-1 (Angpt-1) (Figura 10).
Figura 10. PCR array específico para cicatrização de feridas. Tecidos de

pele cicatriciais de camundongos WT e FAT-1, foram coletados 3 dias após a indução
da ferida. As barras azuis representam os genes positivamente expressos, enquanto que
as barras vermelhas representam os genes negativamente expressos. n = 3
animais/grupo.
As integrinas são uma família de receptores de superfície celular, que

permitem a aderência da célula aos componentes da MEC, conectando o ambiente
extracelular ao citoesqueleto intracelular e ativando vias de sinalização intracelulares
[57]. O Wnt5a pertence à via não canônica de Wnt e medeia os processos normais de
desenvolvimento, incluindo auto-renovação, proliferação, diferenciação, migração,
adesão, polaridade celular e reorganização do citoesqueleto. Já foi demonstrado, que a
39
sinalização via Wnt5a modulou a expressão de integrinas, bem como, a sua fixação à
fibronectina [58].
Paralelamente, o ativador do plasminogênio tipo uroquinase (Plau) via seu

receptor (Plaur) converte o plasminogênio em plasmina, uma forte enzima proteolítica
que cliva componentes da MEC. A expressão de Plau/Plaur possui um padrão
semelhante à de Serpine-1, também conhecido como inibidor-1 do ativador de
plasminogênio (PAI-1) [59]. Serpine-1 possui funções críticas para a cicatrização,
dentre as quais a sua expressão aumentada inibe a degradação normal de MEC,
contribuindo para o acúmulo de MEC e, em casos extremos, para fibrose [60]. Além
disto, foi demonstrado que níveis elevados de Serpine-1 inibiram a sinalização via Wnt,
prejudicando a angiogênese, a morfogênese do folículo piloso e a regeneração tecidual
[61].
Em conjunto, sabe-se que a Angpt-1 é um regulador essencial do

desenvolvimento dos vasos sanguíneos. O VEGF e as angiopoetinas funcionam juntos
desempenhando papéis independentes durante o desenvolvimento vascular e a
embriogênese. O VEGF atua precocemente durante a formação dos vasos, enquanto que
a Angpt-1 atua mais tarde durante o remodelamento, maturação e estabilização dos
vasos. Adicionalmente, a Angpt-1 interage com diversas células, tais como neutrófilos,
células endoteliais e fibroblastos, por meio de integrinas, para mediar a sobrevivência,
adesão e migração celular [62].
Embasados nos resultados que obtivemos até o momento, acreditamos que o

aumento da incorporação de ácidos graxos ω-3 na pele, modificou a deposição de MEC
e, portanto, as propriedades biomecânicas do tecido. Acreditamos ainda, que estes
efeitos são consequência da predominância de mediadores pró-inflamatórios durante os
estágios iniciais do processo de cicatrização de feridas.
40
2. HIPÓTESE DO PRESENTE TRABALHO
O aumento da incorporação de ácidos graxos ω-3 na pele prolonga a fase

inflamatória durante os estágios iniciais e intermediários do processo de cicatrização. A
inflamação do microambiente interage com os fibroblastos, influenciando a deposição
de MEC e as propriedades biomecânicas do tecido.
41
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
O objetivo geral do presente trabalho foi avaliar a MEC e as propriedades

biomecânicas da pele, durante o processo de cicatrização em camundongos FAT-1.
3.2. Objetivos Específicos
▪ Foi quantificada a produção de mediadores inflamatórios no tecido cicatricial de

10 dias pós-lesão;
▪ Foi avaliada a expressão dos genes modulados no PCR array previamente
realizado, nos tecidos não cicatriciais (0 hora) e cicatriciais de 3, 5, 10 e 21 dias
pós-lesão;
▪ Foi avaliada a expressão gênica de componentes e vias celulares associadas à
MEC, nos tecidos não cicatriciais (0 hora) e cicatriciais de 3, 5, 10 e 21 dias pós-
lesão;
▪ Foram avaliados os componentes da MEC, no tecido cicatricial de 10 dias pós-
lesão;
▪ Foi avaliada a organização/deposição do colágeno, a deposição de fibras
elásticas e de compostos glicídicos no tecido não cicatricial (0 hora) e cicatricial
de 21 dias pós-lesão;
▪ Foi avaliada a resistência à tração da pele, no tecido não cicatricial (0 hora) e
cicatricial de 21 dias pós-lesão;
▪ Foi caracterizada a cultura primária de fibroblastos da pele, através da
quantificação de células CD45- ER-TR+;
▪ Foi avaliada a deposição de MEC in vitro.
42
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Animais e tratamento
Foram utilizados camundongos transgênicos FAT-1 e não transgênicos

C57black/6 (como controles) que possuíam o mesmo background genético que o grupo
FAT-1. Assim, os camundongos foram divididos em dois grupos: FAT-1 e wild type
(WT).
Todos os camundongos eram machos adultos (2 meses de idade) e foram

mantidos no biotério BioNutreGen da Faculdade de Ciências Aplicadas (FCA) da
Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP), em ciclo claro/escuro de 12 horas,
em temperatura aproximada de 23 ± 2ºC. Aos animais foi ofertada a dieta padrão, de
forma recorrente, sem interrupção da dieta em períodos que antecederam aos
experimentos.
Todos os procedimentos foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de

Animais (CEUA - 5238-1) e pela Comissão Interna de Biossegurança (CiBIO - 370) da
Faculdade de Ciências Aplicadas/UNICAMP (Anexo 1).
4.2. Genotipagem
Camundongos recém-desmamados foram anestesiados com Isoflurano e

uma pequena parte da cauda (0,5 cm) foi coletada. As caudas foram colocadas em
eppendorfs de 1,5 mL. Para a extração do DNA, adicionou-se à cauda, 200 µL de
proteinase K (from Tritirachium álbum, Sigma-Aldrich) diluída em tampão de lise,
incubando-a a 50°C overnight. Posteriormente, adicionou-se 200 µL de tampão de lise,
vortexando cada eppendorf por 2 minutos, deixando-os incubar em seguida por 15
minutos em temperatura ambiente. Após incubação, centrifugou-se a 10.000 rpm por 20
minutos a 4°C. O sobrenadante foi transferido para um novo eppendorf, adicionado de
500 µL de etanol 100% (gelado) e centrifugado a 6.000 rpm por 10 minutos a 4°C. O
sobrenadante foi desprezado por inversão, sendo adicionado mais 500 µL de etanol 70%
(gelado) e centrifugado novamente nas mesmas condições. Os eppendorfs foram então
deixados invertidos sobre uma estrutura plana, para retirar o excesso de etanol e secar o
pellet. Após secagem, ressuspendeu-se o pellet em 40 ou 80 µL (quantidade
proporcional ao pellet) de Tris-EDTA (TE). As amostras foram incubadas durante 30
minutos a 65°C, sendo o DNA quantificado posteriormente. Para a reação em cadeia de
43
polimerase (PCR), utilizou-se: tampão específico (2,5 µL), MgCl2 (1,5 µL), DNTP (0,5
µL), primer sense (0,5 µL) (5’ACCAACTGTGGATGCTTTCC-3’) e primer anti-sense
(0,5 µL) (5’GCATTGCTTCCCAATCCTTA-3’), Taq DNA polymerase platinum (0,1
µL) (Invitrogen, Carlsbad, CA) e água livre de RNAse (17,4 µL). Em eppendorfs de 0,1
mL, adicionou-se 23 µL do mix, mais 2 µL do DNA extraído (volume correspondente a
50 ng/µL de DNA), sendo posteriormente colocados no termociclador para a PCR
(ciclagem: 3 minutos-94ºC; 40 ciclos de 30 segundos-95ºC; 1 minuto-60ºC; 1 minutos-
72ºC; 10 minutos-72ºC; 10ºC para esfriar as amostras). Para a eletroforese, preparou-se
o gel de agarose (1,5%) com tampão TBE 1x e 2 µL de Sybr Safe DNA gel stain
(Invitrogen, Carlsbad, CA). No gel pronto, foi adicionado no primeiro poço o ladder
(100 pares de base, Invitrogen) e, em seguida, as amostras produto da PCR, previamente
diluídos com o corante 6X DNA loading dye (Thermo Fisher Scientific Baltics UAB |
V.A. Graiciuno 8, LT-02241 Vilnius, Lithuania) (10 µL de ladder ou amostra + 2 µL do
corante) (Figura 11).
Figura 11. Etapas do procedimento de genotipagem.
Na análise do gel, a primeira canaleta indica o padrão molecular com ladder

de 100 pares de base (pb), tendo o gene fat-1 amplificação em 400 pb. As canaletas 2, 3,
4, 5, 7, 8, 9, 10, 12 e 13, evidenciam a banda do gel de DNA, correspondente ao gene
fat-1, enquanto que as demais canaletas representam os camundongos WT, ausentes do
gene fat-1 e/ou fragmentos amplificados (Figura 12).
44
Figura 12. Genotipagem. A seta indica a banda do gel de DNA que

corresponde ao gene fat-1.
4.3. Indução das feridas cutâneas
Os camundongos foram anestesiados com ketamina (139,2 mg/kg de peso

corporal) e xilazina (18,4 mg/kg de peso corporal) e com um molde de 1 cm 2,
demarcou-se a pele da região dorsal, sendo esta área removida cirurgicamente e
representando o tecido não cicatricial (0 hora) de espessura total. Para a coleta do tecido
cicatricial de espessura total de demais tempos (3, 5, 10 e 21 dias pós-lesão), utilizou-se
um molde de 2 cm2, sendo este tecido removido e dividido para diferentes análises
(Figura 13).
A coleta do tecido cicatricial foi realizada uma única vez no animal, tendo
havido diferentes animais para cada tempo determinado de coleta. Os animais foram
sacrificados imediatamente após a remoção do tecido cicatricial.
45
Figura 13. Indução da ferida cutânea dorsal.
4.4 Análise histológica do tecido cutâneo
Os tecidos não cicatriciais (0 hora) e cicatriciais de 21 dias pós-lesão foram

coletados e, imediatamente fixados em solução de formaldeído 4% + tampão fosfato-
salino (PBS) 0,1M (pH 7,4) + glutaraldeído 0,5%, durante 24 horas à 8° C.
Posteriormente, as amostras foram lavadas, desidratadas e incluídas em parafina
(Paraplast-Sigma®, San Luis, Missouri, EUA). Os blocos de parafina foram então
seccionados no micrótomo a 5 µm e, em seguida, os cortes passaram pelos processos de
desparafinização, hidratação e coloração.
Os tecidos foram corados com Resorcina-Fucsina para análise da deposição

de fibras elásticas; com Reticulina (Método de Gomori) para análise da deposição de
colágeno tipo 3 e, foi realizada a Reação de Ácido Periódico e Reativo de Schiff - PAS
para análise de compostos glicídicos.
Os materiais foram documentados em Microscópio Olympus® (U-

LH100HG) com imagens representativas das estruturas histológicas registradas no
sistema de captura e análise de imagens digitais (Câmera: Olympus®/U-TVO.63XC/
T2).
46
4.5. Quantificação de mediadores inflamatórios
Os tecidos cicatriciais de 10 dias pós-lesão foram coletados e imediatamente

acondicionados em nitrogênio líquido e armazenados no freezer (-80°C). Os tecidos
foram homogeneizados (polytron -Kinematica Dispersing and Mixing Technology,
Lucerne, Switzerland) em 1 mL de PBS + inibidor de protease cOmplete™ Protease
Inhibitor Cocktail (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) e centrifugados a
2.000 rpm durante 10 minutos a 4°C, sendo o sobrenadante coletado. A produção de IL-
1β, IL-6, IL-10, TNF-α, VEGF, CXCL-1, CXCL-2, TIMP-1 e metaloprotease de
matriz-9 (MMP-9), foi avaliada, através do método de ELISA utilizando Kits Duo Set
(R&D System, Mineapolis, MN, USA).
Em placa específica para o método de ELISA, foi adicionado 50 µL/poço

do anticorpo de captura e a mesma foi incubada por 12 horas ao abrigo da luz. A placa
foi posteriormente lavada com PBS/Tween e, em seguida adicionada de 150 µL de
diluente de ELISA (PBS + albumina) e incubada por 1 hora ao abrigo da luz. Após
lavagem da placa, adicionou-se 50 µL de curva padrão e amostras, diluídas com
diluente de ELISA. Após 2 horas de incubação ao abrigo da luz, as placas foram lavadas
e, adicionadas de 50 µL do anticorpo de detecção. Posterior 2 horas de incubação ao
abrigo da luz, lavou-se as placas novamente e adicionou-se 50 µL de solução de
Streptavidina (diluição 1:200; 25 µL em 5 mL de diluente). As placas foram incubadas
ao abrigo da luz por mais 20 minutos. Em seguida, realizou-se novamente a lavagem e
adicionou-se 50 µL de substrato Solução A e B (1:1). As placas foram incubadas
novamente por 20 minutos. Ao final, adicionou-se 10 µL de solução H2SO4 (ácido
sulfúrico) 2M às placas, e estas foram lidas imediatamente no espectrofotômetro a 450
nm.
Para as análises estatísticas, os dados foram normalizados com a

concentração de proteína tecidual, quantificada pelo método de Bradford [63].
4.6. Análise imuno-histoquímica do tecido cicatricial
Tecidos cicatriciais de 10 dias pós-lesão foram coletados em tissueTek

(Meio Tissue-Tek O.C.T. Compound, FR/118mL, Sakura-4583) e criopreservados em
solução de isopentano e, imediatamente acondicionados em nitrogênio líquido e
posteriormente armazenados em freezer (-80°C).
47
As amostras foram seccionadas em criostato a 5 µm e as lâminas foram

fixadas com acetona e armazenadas a -20°C até a experimentação.
Resumidamente, realizou-se a recuperação gênica com tampão citrato de

sódio 0,01M (pH 6,0) por 10 minutos em aquecimento e, em seguida, os cortes foram
demarcados e lavados com PBS 0,1M (pH 7,4). Para bloqueio da peroxidase endógena,
as lâminas foram incubadas ao abrigo da luz por 30 minutos com solução contendo
peróxido de hidrogênio (H2O2) (1:100 em PBS). Para evitar que o anticorpo primário se
ligue por ligação covalente, os sítios inespecíficos foram bloqueados com solução
blocking buffer (BSA 1% + Triton 0,1% + glicina 50 mM + PBS) por 30 minutos. Após
o tempo de boqueio, as lâminas foram lavadas com solução working buffer (1:5
blocking buffer/PBS) e adicionadas do anticorpo primário (diluição 1:100
anticorpo/working buffer). Posterior incubação overnight à 4°C, as lâminas foram
lavadas e adicionadas do anticorpo secundário (diluição 1:250 anticorpo/working buffer)
por 1 hora ao abrigo da luz. Os cortes foram lavados com PBS e TBS (solução salina
tamponada com Tris) e incubados por até 20 minutos com solução reveladora de
peroxidase (DAB 0,4% + TBS + H2O2). Os cortes foram lavados com água e contra-
corados com hematoxilina por 10 segundos. As lâminas foram então, lavadas,
desidratadas e montadas.
Os anticorpos primários utilizados foram: anti-fibronectina (Novus

Biologicals), anti-vimentina e anti-elastina, sendo o anticorpo Goat Anti-Rabbit IgG
H&L (ab6721mg1) utilizado com secundário.
4.7. Análise da expressão gênica no tecido cutâneo
Tecidos não cicatriciais (0 hora) e cicatriciais de 3, 5, 10 e 21 dias pós-lesão

foram coletados em 400 µL de RNAlater (RNA Stabilization Reagent, Qiagen) e
armazenados à 8°C. Em seguida, os tecidos foram homogeneizados (polytron -
Kinematica Dispersing and Mixing Technology, Lucerne, Switzerland) em 500 µL de
Trizol® Reagent (Ambion by life Technologies, Carlsbad, CA) e centrifugados à
12.000g por 3 minutos à 25°C. Após centrifugação, o sobrenadante foi coletado para
consequente extração de RNA.
O RNA total do tecido foi obtido usando o Kit RNAeasy (Qiagen,

Maryland, USA) conforme descrito pelo fabricante. Resumidamente, sobre o
sobrenadante previamente coletado, adicionou-se 100 µL de clorofórmio, havendo
48
posterior centrifugação (12.000 g, 15 minutos, 25°C). O sobrenadante foi coletado e

adicionado de 300 µL de etanol 70% e, então, transferido para a coluna do kit. Após
rápida centrifugação e lavagem com RW1 (350 µL), adicionou-se na coluna do kit, 500
µL de solução RPE seguido de um spin. 500 µL de solução RPE foi adicionado
novamente seguido de nova centrifugação (12.000 g, 2 minutos, 25°C). As amostras
foram então ressuspendidas em 30 µL de água RNase−Free e centrifugadas a 8.000 g
durante 1 minuto a 25°C. O RNA obtido foi quantificado através da medida da sua
absorbância a 260 nm. A pureza do RNA foi avaliada pela razão 260/280 nm e a
integridade através de ensaio de eletroforese.
Para a síntese de cDNA, utilizou-se 2 µg de RNA (em um volume de 10 µL,

complementado com água RNase−Free se necessário) e 10 µL do kit de transcrição
reversa de cDNA de alta capacidade (High-Capacity cDNA Reverse Transcription kit
Applied Biosystems, Foster City, CA), sendo o volume final de reação de 20 µL.
Para a reação de PCR, preparou-se um mix contendo: 2,95 µL de água

RNase−Free, 5 µL de Sybr (QuantiNova Sybr Green RT-PCR kit, Hilden, Germany),
0,05 µL de ROX e 0,5 µL de cada primer (sense e anti sense) a 0,5 uM. Deste modo,
adicionou-se em duplicata para cada amostra, 9 µL deste mix e 1 µL de cDNA
previamente diluído (1 µL de cDNA + 0,5 µL de yellow dye + 3,5 µL de água
RNase−Free).
Inicialmente foram testados os controles endógenos: Ubc e B2m e, posterior

análise, determinou-se o Ubc como sendo o housekeeping. Em seguida, avaliou-se os
genes descritos na Tabela 1:
49
Tabela 1. Sequência dos primers sense e anti sense dos genes avaliados.
Gene Sequência
Desmina ATCCAGACCTTCTCTGCTCTCAA
TGTCTTTTTGGTATGGACTTCAGAAC
Fibronectina CCGGGCCTCAATCCAAA
GGAACGGCGTCCAAGAGAT
Vimentina TGGTTGACACCCACTCAAAAAG
TCTCATTGATCACCTGTCCATCTC
Col1a1 CGTCTGGTTTGGAGAGAGCAT
GGTCAGCTGGATAGCGACATC
Col1a2 GGTGGCTATGACTTTGGTTTTGA
CTTCATAGTCCTTGGGTCTGAGTGA
Col1a3 ATGGAGCAAGACAGTCTTTGAATATC
TCAGGACCCCCAATGTCATAG
Angpt-1 GCCTGAGGATGTTTTCCCGA
GAGCTGTTGGCAGATCAGGT
Serpine-1 TGCCCCACTTCTTCAAGCTC
TGGTAGGGCAGTTCCACAAC
Hbegf CCAGTTGCTACCCTGACTGG
GAAGGGCTCACTCGATCCTG
Egfr GGCTATGTCCTCATTGCCCT
GGATGGCTAAGGCATAGGTGT
Csf2 CTGGCCCCATGTATAGCTGA
TCCTCCTCAGGACCTTAGCC
Plaur CCTGCAATGCCGCTATCCTA
TAACTCCGGTTTCCCAGCAC
Stat3 TCTGTGTGACACCAACGACC
TGTTCCCCTTTGCCTCCCTT
Itga1 CTGGGTTCTGCTTTCCTCAA
ATGACTTCCAAAGCTGGCGA
Col4a3 ACGGTGTGTTCCTTGTCTCC
CCTGAAACATCATGGGGCCT
CATCTCCTCAGGCTGTCGTC
Tgf-α TCTGCCATTGGCCTTGCTAA
Col3a1 ATGGAGCAAGACAGTCTTTGAATATC
TCAGGACCCCCAATGTCATAG
Ubc ACAGACGTACCTTCCTCACCA
CCCCATCACACCCAAGAACAA
50
B2m CCCCACTGAGACTGATACATACG
CGATCCCAGTAGACGGTCTTG
4.8. Análise da resistência à tração da pele
Para realização dos ensaios mecânicos para obter os comportamentos de

tração uniaxial de corpos-de-prova (CP) produzidos a partir da região que constitui o
local da ferida e as bordas adjacentes à ferida, utilizou-se uma máquina universal
eletromecânica com controle computadorizado marca Equilam(R), modelo WDW 100E.
Para o ensaio de tração uniaxial, foram coletados tecidos não cicatriciais (0

hora) e cicatriciais de 21 dias pós-lesão. As amostras (corpos-de-prova, CP) foram
seccionadas no sentido longitudinal (crânio→caudal) e nomeadas conforme o grupo
experimental, sendo a letra “F” designada ao grupo FAT-1 e a letra “W” ao grupo WT.
Para efeito de análise e comparação dos resultados, algumas amostras foram
selecionadas, de modo que considerável reprodutibilidade (coeficiente de variância
maior que 95%) fosse alcançada.
Considerou-se para cada amostra avaliada um comprimento de 20(±1) mm x

5 (±0,5) mm (largura) e uma espessura média de 0,5 (±0,02) mm. A máquina possui um
sistema de medição da carga (força aplicada nos CPs) que tem um conversor integrado
digital-analógico. Depois de aplicada a força, a célula de carga gera uma saída de sinal
pequeno proporcional à carga de teste. Na Figura 14 tem-se uma representação
esquemática dos CPs elaborados sob consulta de norma nacional e internacional
ABNT/ASTM E8M/2004. A velocidade da trave de deslocamento da mencionada
máquina foi na ordem de 1 mm/minuto. Uma taxa de deformação aproximada de 2,5x
10-4 s-1 sob temperatura ambiente de 27oC (±2) foi utilizada para todos os ensaios
realizados. Estes ensaios foram realizados minimamente em duplicata para a
reprodutibilidade das observações pretendidas. Foram avaliados os parâmetros
mecânicos como limite de resistência à tração (LRT), em Mega Pascal (MPa), e o
alongamento específico (em porcentagem, %).
51
Figura 14. Detalhamento das dimensões para o ensaio de tração e da

máquina de tração. (A) Para o ensaio de tração foi coletada a ferida e as bordas de
cada animal (totalizando 2 cm2) e as amostras foram seccionadas no sentido longitudinal
(crânio-caudal). Foram ensaiadas separadamente 2 bordas de 2 cm x 0,5 cm e a região
da ferida de 2 cm x 1 cm. (B) Máquina de tração com amostra de pele durante o ensaio,
ao lado um paquímetro (escala de 5 cm).
4.9. Cultura primária de fibroblastos
Os animais foram anestesiados e o tecido axilar de espessura total foi

coletado em solução de PBS. Dentro da capela de fluxo laminar os tecidos foram
picotados, imersos em solução de digestão (0,1% de colagenase + DMEM + 20% soro
bovino fetal (SBF) + 1% de fungizona + 1% de antibiótico) e incubados por 1 hora à
37°C sob agitação de 200 rpm.
52
Os tecidos digeridos foram vortexados, adicionados de meio DMEM + 15%

SBF + 1% fungizona + 1% PS e centrifugados (530 g por 5 minutos a 4º C). Em
seguida, o pellet foi ressuspendido em meio (DMEM + 15% SBF + 1% fungizona + 1%
PS), filtrado e centrifugado novamente nas mesmas condições.
Ao final, na capela de fluxo laminar, o pellet foi igualmente ressuspendido e

as células foram plaqueadas em placa de 6 poços (1,5 mL/poço) e adicionadas de mais 1
mL de meio. As células foram então, mantidas em estufa a 37°C e 5% de CO2. A cada
48 horas as células foram lavadas com PBS e adicionadas de meio (DMEM + 15% SBF
+ 1% fungizona + 1% PS).
Quando atingida a confluência, as células foram tripsinizadas (TrypLE™

Express Enzyme 1X, no phenol red; Gibco) por 10 minutos em estufa, centrifugadas
(1200 rpm a 4°C durante 10 minutos) e ressuspendidas em meio. Para os experimentos
as células foram utilizadas entre a primeira e a quarta passagem.
4.10. Caracterização da cultura primária de fibroblastos
A expressão de CD45 e ER-TR na cultura de fibroblastos foi avaliada por

citometria de fluxo. 2,5x105 células foram centrifugadas (1.200 rpm a 4°C durante 10
minutos), ressuspendidas em 200 µL de PBS e centrifugadas novamente.
Posteriormente, as células foram ressuspendidas em CD45-APC-Cy7 e incubadas a 4°C
por 1 hora e 30 minutos ao abrigo da luz.
Após este período, as células foram centrifugadas nas mesmas condições,

ressuspendidas em 1 mL de PBS e passadas por nova centrifugação. As células foram
então, fixadas com 100 µL de paraformaldeído (PFA) 2% (Sigma Aldrich, Alemanha)
durante 15 minutos. Em seguida, as células foram permeabilizadas com 100 µL de triton
0,1%, centrifugadas e adicionadas do anticorpo ER-TR conjugado com PE. As células
foram mantidas com o anticorpo intracelular overnight, até o momento da leitura.
As amostras foram adquiridas no BD FACSypmhony (BD Bioscience,

Maryland, EUA) e a fluorescência determinada pelos filtros específicos para cada
fluorocromo. Ao todo foram coletados aproximadamente 100.000 eventos e os
resultados foram analisados no software FlowJo versão 10 (BD Bioscience, Maryland,
EUA), sendo considerados fibroblastos as células negativas para CD45 e positivas para
ER-TR.
53
4.11. Análise da deposição de MEC por microscopia eletrônica de transmissão

(MET)
Inicialmente as monocamadas de fibroblastos (1,5x105 células) em

lamínulas de vidro (Flexcell) foram fixadas com glutaraldeído 2,5% recém diluído em
tampão cacodilato 0,1M e CaCl2 3mM por 5 minutos à temperatura ambiente seguido
por 1 hora no gelo. Após este tempo, as amostras foram lavadas 3x por 2 minutos cada
com tampão cacodilato 0,1M e CaCl2 3mM em gelo. Em sequência, foi realizada a pós-
fixação com tetróxido de ósmio 1% em tampão cacodilato 0,1M e CaCl2 3mM e 0,8%
de ferrocianeto de potássio por 30 minutos no gelo. Amostras foram então lavadas com
água milliQ cinco vezes por 2 minutos cada em gelo e, contrastadas com acetato de
uranila 2% aquoso (filtrado antes do uso) overnight a 4°C.
No dia seguinte, as amostras foram lavadas com água milliQ cinco vezes
por 3 minutos cada em gelo e desidratadas em concentração crescente de etanol (20%,
50%, 70%, 80%, 90% e 2x 100%). Foi realizada uma etapa adicional de etanol 100% à
temperatura ambiente por 3 minutos. Em seguida, foi iniciada a embebição em resina
Epon e etanol 1:1 à temperatura ambiente por 30 minutos sob agitação e depois 4 a 5
trocas completas (1 hora cada, sendo uma delas overnight) de resina Epon pura à
temperatura ambiente. Finalmente no outro dia, foi trocada a solução de resina Epon
pura 2x e as amostras permaneceram à 60ºC em estufa controlada, por 60-72 horas para
polimerização completa.
Após polimerização e trimagem dos blocos, cortes ultrafinos de 70 nm

foram obtidos no ultra micrótomo Ultracut UCT (Leica Microsystems, Alemanha),
coletados em grades de cobre e contrastados com acetato de uranila aquoso 2% durante
20 minutos e, citrato de chumbo de Reynolds por 10 minutos. Os cortes ultrafinos foram
estudados e micrografados em MET Leo 906-Zeiss.
54
5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão (SD) da

média, para comparações entre dois grupos e, como erro padrão da média (SEM) para
comparações temporais. As comparações entre os grupos foram realizadas por teste t de
student ou 2way ANOVA seguida de post teste de Bonferroni. Para a realização das
análises estatísticas, foi utilizado o programa Prisma 7.0 (GraphPad Software, Inc., San
Diego, CA, USA). As diferenças foram consideradas significativas para p<0,05.
55
6. RESULTADOS
6.1. Camundongos FAT-1 apresentaram aumento da razão pró-inflamatória

durante a fase intermediária do processo de cicatrização
Embasados por resultados prévios de que os camundongos FAT-1

aumentaram a produção de mediadores pró-inflamatórios durante a fase inflamatória
tardia [56] (Figura 8B-E), avaliamos se este perfil inflamatório também se estendeu
sobre a fase intermediária do processo de cicatrização, quando a MEC começa a ser
depositada.
No tecido cicatricial de 10 dias pós-lesão, os camundongos transgênicos

reduziram a produção de IL-1β, IL-10 e VEGF (Figura 15). Para melhor esclarecer o
fenótipo do tecido, avaliamos a relação entre as concentrações de IL-1β/IL-10 e TNF-
α/IL-10. Como pode ser observado na Figura 15, os animais FAT-1 aumentaram as
razões IL-1β/IL-10 e TNF-α/IL-10, o que demonstra um predomínio da razão pró-
inflamatória no tecido dos animais transgênicos em relação ao grupo WT. Os demais
mediadores (IL-6, CXCL-1, CXCL-2, TIMP-1 e MMP-9) não sofreram alterações
significativas entre os grupos.
B 10 dias pós-lesão 10 dias pós-lesão
800 40000
* WT
*** 30000
pg/mg de proteína
pg/mg de proteína
FAT-1
600 20000
10000
400 2000
1500
200 *** 1000
500
0 0
CXCL-1 CXCL-2 TIMP-1 MMP-9
IL-1 IL-6 IL-10 TNF-  VEGF
10 dias pós-lesão 10 dias pós-lesão 10 dias pós-lesão

8 1.5 80
**
* 60
MMP-9/TIMP-1
6
TNF-/IL-10
IL-1 /IL-10
1.0
4 40
0.5
2 20
0 0.0 0
WT FAT-1 WT FAT-1 WT FAT-1
Figura 15. Quantificação de mediadores inflamatórios. Tecidos

cicatriciais de 10 dias pós-lesão foram coletados de animais WT e FAT-1. Os
mediadores inflamatórios: IL-1β, IL-6, IL-10, TNF-α, VEGF, CXCL-1, CXCL-2,
TIMP-1 e MMP-9 foram quantificados pelo método de ELISA. A concentração final foi
56
normalizada pela proteína tecidual, através do método de Bradford. Os resultados foram

apresentados como média ± SD. Diferenças significativas entre os grupos WT e FAT-1
foram consideradas para p<0.05 (*), p<0.01 (**) e p<0.001 (***). n > 6 animais/grupo
6.2. Camundongos FAT-1 aumentaram a expressão de colágeno
Para validar os resultados prévios do PCR array realizado e, compreender

as possíveis alterações na MEC nos camundongos FAT-1, avaliamos por PCR em tempo
real, a expressão de genes associados à componentes estruturais da MEC e genes
associados à ativação de vias celulares e à adesão célula-MEC. Os tempos de análises
foram selecionados considerando a predominância da expressão dos respectivos genes
no decorrer do processo de cicatrização.
Inicialmente, o gene Ubc foi considerado como housekeeping, uma vez que
este não sofreu modulação entre os grupos WT e FAT-1 nos tempos avaliados (Figura
16A). Através de análise temporal, quando comparados aos animais WT, os
camundongos FAT-1 apresentaram expressão elevada dos genes Col1a1, Col1a2,
Col1a3, Col3a1, Col4a3, Tgf-α e de Itga-1 em 10 dias pós-lesão (Figura 16B e 16C).
Estes resultados sugerem que os animais transgênicos possuem uma deposição precoce
aumentada de colágeno e que a relação célula-componentes da MEC esteja favorecida.
57
58
59
60
Figura 16. Expressão gênica de componentes estruturais e via celulares

associadas à MEC. Tecidos não cicatriciais (0 hora) e cicatriciais de 3, 5, 10 e 21 dias
pós-lesão foram coletados de animais WT e FAT-1. Através de análise por PCR em
tempo real, determinou-se o gene housekeeping (A), para posterior avaliação da
expressão de genes relacionados à MEC (B e C). Os resultados foram apresentados
como média ± SD (A) e como média ± SEM (B-C). Diferenças significativas entre os
grupos WT e FAT-1 foram consideradas para p<0.05 (*), p<0.01 (**) e p<0.001 (***).
n > 3 animais/grupo.
6.3. Camundongos FAT-1 apresentaram aumento de componentes da MEC

durante a fase intermediária do processo de cicatrização
Até o momento os resultados evidenciam uma modulação na MEC do tecido

cicatricial de camundongos FAT-1. Assim, pretendendo avaliar a deposição proteica de
componentes da MEC, realizamos análises de imuno-histoquímica em 10 dias pós-
lesão.
Avaliando as Figuras 17A-C verificamos que os animais transgênicos

tiveram marcação aumentada de vimentina (Figura 17A), fibronectina (Figura 17B) e
elastina (Figura 17C) em relação ao grupo WT. Estes resultados indicam que os
camundongos FAT-1 possuem uma predominância de compostos citoplasmáticos e
extracelulares que caracterizam a MEC, bem como, lhe oferece resistência à tração e
elasticidade [22]. A Figura 17D exclui quaisquer marcações inespecíficas do anticorpo
secundário.
61
62
63
64
65
Figura 17. Imuno-histoquímica do tecido cicatricial de 10 dias pós-

lesão. Tecidos cicatriciais de 10 dias pós-lesão foram coletados de animais WT e FAT-
1. Os tecidos foram marcados com anticorpos primários anti-vimentina (A), anti-
fibronectina (B) e anti-elastina (C). Utilizou-se para todas as marcações o anticorpo
secundário anti-rabbit (D). As imagens foram adquiridas na região de transição borda-
ferida, com objetiva de 100x. Barra de escala: 10 e 20 µm. n = 5 animais/grupo.
6.4. Camundongos FAT-1 exibiram aumento de fibras elásticas e de fibras

reticulares durante a última fase do processo de cicatrização
Considerando que os animais FAT-1 apresentaram aumento da expressão

gênica e proteica de macromoléculas da MEC, avaliamos se em 21 dias pós-lesão, os
tecidos cicatriciais dos camundongos transgênicos ainda exibem maior deposição de
MEC, uma vez que a ferida se encontra cicatrizada neste tempo de análise.
Através de análises histológicas, verificamos que os animais controles

exibiram menor abundância de fibras elásticas, enquanto que os animais transgênicos
exibiram uma deposição elevada de fibras elásticas de diâmetro maior e alinhadas
paralelamente ao tecido, semelhante à elastina encontrada na derme reticular (Figura
18A). Este resultado corrobora com a marcação aumentada de elastina avaliada no
tecido cicatricial de 10 dias pós-lesão, dos camundongos FAT-1 (Figura 17C).
Interessantemente, a prevalência de fibras elásticas na pele dos animais transgênicos
também foi verificada no tecido não cicatricial (0 hora), o que representa uma produção
basal elevada de fibras elásticas, em comparação ao tecido não cicatricial dos animais
WT (Figura 18B). Contudo, os resultados sugerem que esta maior deposição de fibras
elásticas no tecido basal não possui influência do perfil inflamatório, de modo que não
houveram alterações na produção de mediadores inflamatórios no tecido não cicatricial
dos animais FAT-1 [56].
Ainda os animais FAT-1, apresentaram maior abundância de fibras

reticulares em relação aos animais controles (Figura 18D). Os animais WT exibiram
menor concentração de fibras reticulares, bem como, fibras pouco delgadas e alinhadas
paralelamente ao tecido. Por outro lado, os camundongos transgênicos demonstraram
maior deposição de fibras reticulares mais espessas, formando o retículo. As fibras
reticulares são predominantemente compostas de colágeno tipo 3, que se ramificam e
fornecem sustentação e conexão ao tecido conjuntivo [22]. Assim, este resultado
66
associa-se ao aumento da expressão gênica de colágeno tipo 3 avaliada anteriormente

(Figura 16B).
Conjuntamente a estes dados, decidimos avaliar através da reação de Ácido

Periódico e Reativo de Schiff – PAS, a deposição de polissacarídeos, manifestados
como glicogênio, glicoproteínas e glicolipídeos, os quais também estão presentes na
MEC. Como demonstrado na Figura 18F, não houveram diferenças na presença destes
compostos entre ambos os grupos, porém, observa-se uma prevalência no leito da
ferida, em relação às regiões adjacentes. Isto é justificado, pela demanda aumentada de
energia em situações patológicas e/ou de estresse, como acontece com a pele quando
lesionada [64].
67
68
69
70
71
72
73
Figura 18. Análise histológica de componentes da MEC. Cortes

histológicos de tecidos cicatriciais de 21 dias pós-lesão (A) e não cicatriciais (0 hora)
(B) de animais WT e FAT-1 foram corados com resorcina-fucsina. As imagens foram
adquiridas com objetiva de 40x (escala: 50 µm), sendo priorizada a região adjacente ao
leito da ferida no tecido cicatricial (A). As setas vermelhas indicam as fibras elásticas
coradas, como evidenciada no controle experimental, realizado em tecido pulmonar (C).
A aquisição das imagens do controle experimental foi feita com objetiva de 20x
(escala:50 µm). (D-E) Cortes histológicos corados com reticulina e fotografados com
objetiva de 40x (escala: 50 µm). As setas vermelhas indicam as fibras reticulares
presentes no leito da ferida de 21 dias pós-lesão de ambos os grupos WT e FAT-1 (D) e,
no tecido nervoso utilizado como controle experimental (E). (F) Cortes histológicos do
tecido cicatricial de 21 dias pós-lesão de animais WT e FAT-1 foram corados com ácido
periódico e reativo de Schiff – PAS. A aquisição das imagens ocorreu na região de
transição borda (B) → ferida (F) com objetiva de 40x (escala: 50 µm) e, no leito da
ferida com objetiva de 10x (escala: 100 µm). n > 3 animais/grupo.
6.5. Camundongos FAT-1 apresentaram melhora das propriedades biomecânicas

durante a última fase do processo de cicatrização
A composição da MEC é determinante para fornecer elasticidade e

resistência à tração mecânica ao tecido cutâneo. Desta forma, durante o processo de
cicatrização de feridas, uma nova MEC é formada, objetivando reestabelecer as funções
basais. Entretanto, modificações na estrutura da MEC são inevitáveis ao decorrer do
reparo tecidual, afetando as funções mecânicas [14, 25].
Objetivando avaliar se as alterações na MEC, evidenciadas nos

camundongos FAT-1, influenciaram a elasticidade e resistência do tecido, fizemos um
ensaio de tração mecânica.
Sob aspectos gerais, pode-se dizer que existe considerável reprodutibilidade

nos experimentos realizados, a qual pode ser confirmada nos resultados mostrados na
Tabela 2A e 2B.
No tecido não cicatricial (0 hora), os camundongos FAT-1 apresentaram

valores de limite de resistência à tração (LRT) na ordem de 40% maiores que os animais
WT. Embora numericamente possa existir diferença entre os valores de alongamento
74
específico, existe um empate técnico deste parâmetro. Um maior valor de LRT

representa uma maior “resistência” à solicitação mecânica da pele. Assim, os animais
transgênicos têm maior resistência (aumento de 40%) que os animais controles,
exibindo similares valores de elasticidade (Tabela 2A e Figura 19A).
Surpreendentemente, ao analisarmos o tecido cicatricial de 21 dias pós-

lesão, verificamos que ambos os grupos não alteraram a resistência da pele em relação
aos valores basais, porém apresentaram valores de alongamento específico superiores
aos daqueles ensaiados no tecido não cicatricial (0 hora). Especificamente o grupo FAT-
1, apresentou maior porcentagem de deformação (5x) em comparação ao tecido não
cicatricial. Este resultado sugere que os camundongos transgênicos adquirem maior
elasticidade ao final do processo de cicatrização, quando comparados com eles mesmos
antes do processo (Figura 19C). Esta observação relaciona-se ao fato de que a pele
lesionada, desenvolve ao longo do processo de reparo tecidual, uma distribuição não
aleatória da estrutura, mas sim um alinhamento desta, a qual oferece propriedades
elásticas à pele. Isto corrobora com a análise histológica com coloração de Sirius Red,
na qual é demonstrada uma maior reorganização fasciculada das fibras de colágeno, no
tecido cicatricial de 21 dias pós-lesão, dos animais transgênicos (Figura 9) [56].
Ainda fica claro que no tecido cicatricial de 21 dias pós-lesão de ambos os

grupos WT e FAT-1, a região específica de “ferida” apresentou valores de LRT (50%) e
de alongamento específico inferiores aos valores de região de “borda”, o que era
esperado, uma vez que a "borda" não sofre lesão direta e sim, alterações fisiológicas
inerentes ao processo de cicatrização (Tabela 2B e 19B). Entretanto, quando a
comparação entre os grupos é realizada, os camundongos FAT-1 apresentam maior
resistência em relação aos animais controles (Tabela 2B e Figura 19B). Estes dados
sugerem que os camundongos FAT-1 mantêm maior resistência à tração mecânica da
pele e adquirem maior capacidade de alongamento ao longo do processo de reparo
tecidual, quando comparados ao grupo WT. Estas funções devem-se à um conjunto de
elementos adquiridos e reestruturados durante o processo de cicatrização de feridas,
pelos animais transgênicos, tais como fibras elásticas (Figuras 17C e 18A) e colágeno
(Figuras 9, 16B e 18D).
75
Tabela 2. Valores de limite de resistência à tração (LRT) e deformação da região

de borda e de ferida.
A
Amostras LRT (Mpa) Alongamento específico (%)
FAT #1 (F427) 1.44 6
FAT #2 (F427) 1.31 7
FAT #1 (F455) 0.97 5.3
Tecido não cicatricial FAT #2 (F455) 1.05 4.5
(0 hora) Média FAT -1 1.2 (±0.2) 6 (±1.5)
WT #1 (W457) 0.88 8.5
WT #2 (W457) 0.89 8
WT #1 (W458) 0.81 6.5
Média WT 0.85 (±0.4) 7.5 (±1)
N ã o c ic a t r ic ia l ( 0 h o r a ) N ã o c ic a t r ic ia l ( 0 h o r a )
1 .5 40% 10
A lo n g a m e n to e s p e c ífic o
8
L R T (M P a )
1 .0
6
(% )
4
0 .5
0 .0 0
WT F A T -1 WT F A T -1
76
2 1 d ia s p ó s -le s ã o 2 1 d ia s p ó s -le s ã o
2 .0 * 30% 40
* 20%
WT
F A T -1
1 .5 30
L R T (M P a )
60%
(% )
**
1 .0 20
0 .5 10
0 .0 0
B o rd a F e r id a B o rd a F e r id a
77
C
40
2 .0 *
* WT
30 F A T -1
1 .5
L R T (M P a )
(% )
1 .0 20
0 .5 10
0 .0 0
0 h o ra 2 1 d ia s 0 h o ra 2 1 d ia s
Figura 19. Análise da resistência e elasticidade tecidual. Tecidos não

cicatriciais (0 hora) e cicatriciais de 21 dias pós-lesão foram coletados de camundongos
WT e FAT-1. (A) exibe resultados experimentais de curva de tensão vs. deformação
para amostras não cicatriciais de ambos os grupos. (B) exibem resultados de curva de
tensão vs. deformação para animais WT e FAT-1, 21 dias pós-lesão. (C) demonstra a
comparação entre os grupos nos tempos 0 hora e 21 dias pós-lesão. Os gráficos de barra
e de linha foram apresentados como média ± SEM e diferenças significativas entre os
grupos WT e FAT-1 foram consideradas para p<0.05 (*) e p<0.01 (**). n = 2 WT e 3
FAT-1.
6.6. Fibroblastos isolados da pele de camundongos FAT-1 aumentaram a deposição

de MEC
Até o momento verificamos que os camundongos FAT-1 aumentaram a

deposição de componentes da MEC durante os estágios intermediários e finais do
78
processo de cicatrização, o que favoreceu ao ganho de resistência à tração e elasticidade

no tecido reparado. Assim, considerando que os fibroblastos são as células responsáveis
pela produção de macromoléculas que definem a MEC [22], isolamos fibroblastos da
pele de camundongos WT e FAT-1, objetivando validar os resultados aqui obtidos.
Inicialmente realizamos citometria de fluxo para quantificar a população de

fibroblastos (CD45-ER-TR+). Para isto, realizamos estratégia de gate conforme a
Figura 20A: 1. Selecionamos as células conforme tamanho (FSC-A) e granulosidade
(SSC-A); 2. Realizamos um “single cell” para exclusão de células doublets; 3.
Identificamos as células negativas para CD45 (eixo x <103); 4. A partir das células
CD45-, quantificamos as células positivas para ER-TR (eixo x >103). Como
demonstrado pela Figura 20A, podemos confirmar que a cultura primária é rica em
fibroblastos (>85%).
Com a cultura primária de fibroblastos padronizada e caracterizada,

realizamos um ensaio ultra estrutural, utilizando microscopia eletrônica de transmissão
(MET). Os dados demonstram maior deposição de MEC pelos fibroblastos derivados
dos camundongos FAT-1 (Figura 20B). Em conjunto, pode-se verificar maior
abundância de fibronectina orientadas ao longo das projeções citoplasmáticas de
fibroblastos isolados da pele dos animais transgênicos (Figura 20B), o que relaciona-se
ao aumento da marcação de fibronectina exibida no tecido cicatricial de 10 dias pós-
lesão (Figura 17B). Estes resultados corroboram com as análises in vivo, indicando que
os animais FAT-1 possuem um aumento de MEC durante o reparo tecidual, em relação
ao grupo WT.
79
80
81
Figura 20. Análise da deposição de MEC por fibroblastos isolados da

pele. (A) Estratégia de gate utilizada para identificação de fibroblastos (CD45-ER-TR+)
cultivados in vitro. (B) Microscopia eletrônica de transmissão (MET) realizada em
cultura primária de fibroblastos isolados da pele de camundongos WT e FAT-1 (escala:
1 µm). Os asteriscos representam os compostos citoplasmáticos e as setas amarelas a
deposição extracelular de fibronectina. n = 3 animais/grupo.
82
7. DISCUSSÃO
Ácidos graxos poli-insaturados, das famílias ω-6 e ω-3, modulam processos

inflamatórios ao serem incorporados na membrana celular, onde influenciam funções de
proteínas membranares, a sinalização celular e a expressão gênica [32].
Na pele, os ácidos graxos alteram a estrutura e o microambiente

imunológico, uma vez que interferem na diferenciação do estrato córneo e na produção
de eicosanoides e EROs. Assim, mediadores inflamatórios também são modulados,
afetando a resposta inflamatória e, consequentemente, a cicatrização de feridas [14].
Os ácidos graxos ω-6 e ω-3 são quimicamente diferentes e possuem funções

fisiológicas distintas [65]. Entretanto, para que o organismo mantenha um estado de
homeostasia, uma razão ω-6/ω-3 equivalente a 1:1 seria o ideal, como ocorria na pré-
revolução agrícola [66]. Deste modo, a industrialização e o crescente consumo de
alimentos ricos em ω-6, favoreceu nos últimos 150 anos o aumento desta razão para
20:1 [66]. O excesso de ω-6 e o desequilíbrio da razão ω-6/ω-3, são apontados como
responsáveis pelo desenvolvimento cada vez mais presente e comum na população,
principalmente ocidental, de doenças inflamatórias [66].
Considerando que a cicatrização de feridas é um processo fisiológico e

essencial à sobrevivência, a inflamação é uma etapa determinante. Embora tenha sido
demonstrado e comprovado em diferentes modelos de doenças inflamatórias, que o
aumento de ácidos graxos ω-6 contribui para a inflamação e piora do prognóstico, na
cicatrização de feridas cutâneas foi comprovado um efeito benéfico [32].
Especificamente o LA, que constitui 40% dos ácidos graxos presentes na pele, mostrou
acelerar o fechamento da ferida e contribuir para a angiogênese [35-36]. Por outro lado,
os ácidos graxos ω-3 são comumente caracterizados como nutrientes anti-inflamatórios
por reduzirem a inflamação e a evolução de doenças, porém na cicatrização, os estudos
são controversos [32].
Buscando avaliar a função biológica de ácidos graxos ω-3 no modelo de

cicatrização de feridas, utilizamos camundongos transgênicos denominados FAT-1,
capazes de produzir ω-3 endogenamente, a partir de ácidos graxos ω-6 [41].
Em recente trabalho publicado pelo nosso grupo de pesquisa, demonstramos

que os camundongos FAT-1 aumentaram a resposta inflamatória tanto in vivo, quanto in
vitro [56]. O aumento da inflamação ocorreu durante a fase inflamatória tardia, quando
83
a mesma deveria exibir um perfil resolutivo, para que a fase subsequente de proliferação
e de formação da MEC tivesse início.
Objetivando entender a consequência desta inflamação para com o processo

de cicatrização, avaliamos também a resposta inflamatória nas fases intermediárias e
finais, bem como, a deposição de MEC e as propriedades biomecânicas do tecido
cicatricial.
No presente trabalho, os camundongos FAT-1 apresentaram aumento da

razão pró-inflamatória durante as últimas fases (10 dias pós-lesão) (Figura 15). Os
camundongos FAT-1 reduziram a produção principalmente de IL-10 e VEGF, com
elevada razão de mediadores pró-inflamatórios, tais como IL-1β e TNF-α. A redução de
IL-10 promove a inflamação, uma vez que é responsável por minimizar a produção de
mediadores pró-inflamatórios e controlar a inflamação [67]. Por outro lado, a produção
de TNF-α é necessária para que demais células produzam quimiocinas e fatores de
crescimento [68]. Adicionalmente a produção reduzida de VEGF confirma o papel anti-
angiogênico dos ácidos graxos ω-3. Estudos demonstraram que estes ácidos graxos
podem reduzir a produção de VEGF e inibir a proliferação endotelial [69]. Em um outro
estudo envolvendo o uso tópico de ácidos graxos ω-3, a produção de VEGF foi
significativamente reduzida no tecido cicatricial de 7 dias pós-lesão [70].
Na cicatrização normal de feridas cutâneas é esperado que a fase

inflamatória dure por até 5 dias, quando estímulos nocivos se tornam ausentes. No
entanto, as respostas imunológicas continuam por todas as demais fases do processo de
reparo, através de funções de leucócitos [2].
A MEC é influenciada pela resposta inflamatória e deste modo, acreditamos

que os camundongos FAT-1 apresentam alterações na MEC, devido a inflamação ainda
presente nas demais fases.
No atual estudo, verificou-se aumento da deposição de vimentina,

fibronectina, fibras elásticas (Figuras 17 e 18A-B) e de colágeno (Figuras 16B e 18D).
A predominância destes componentes da MEC, forneceram resistência à tração e
aumento significativo de elasticidade ao final do processo de cicatrização (Figura 19).
A vimentina está presente principalmente em células mesenquimais, tais

como fibroblastos [71]. Evidências sugerem que a vimentina é altamente expressa após
a lesão tecidual e que sua deficiência atrasa o processo de cicatrização, devido à
84
migração e contração direcionais prejudicadas. A vimentina está envolvida na

mecanossensibilidade regulada pelo citoesqueleto, um recurso fundamental para a
motilidade celular controlada e para as relações célula-MEC [71].
Fisiologicamente, ao longo da vida, a pele sofre constantemente estímulos

agressivos externos (exemplo: radiação ultravioleta, lesões) e internos (exemplo: idade,
obesidade, diabetes, desidratação), que induzem à perda de resistência e elasticidade e, à
frouxidão tecidual [72]. Assim, a imunonutrição, tem tentado reestabelecer as funções
mecânicas e de hidratação da pele, na tentativa de combater ao envelhecimento precoce
e prejuízos associados à processos inflamatórios patológicos [30].
Neste estudo, demonstramos que os camundongos transgênicos aumentaram

a expressão de colágeno tipo I, III e IV (Figura 16B), assim como, a deposição de
fibras reticulares (Figura 18D). As fibras reticulares são compostas principalmente de
colágeno tipo III associadas a glicoproteínas (como a fibronectina) e formam o retículo
necessário à sustentação do tecido conjuntivo [73].
Durante o processo de cicatrização de feridas, a fibronectina é observada ao

redor dos fibroblastos e co-distribuída com as fibras reticulares, sendo abundante na
derme e na região da membrana basal. A fibronectina junto ao complexo de rede fibrilar
na superfície celular, é vital para estabelecer e manter a arquitetura dos tecidos e para
regular processos celulares, incluindo adesão, disseminação, proliferação, migração e
apoptose. É descrito que a formação da rede fibrilar de colágeno estável, depende de
uma rede de fibronectina preexistente [73]. Isto pode justificar o aumento de
fibronectina em 10 dias pós-lesão (Figura 17B) e o aumento de fibras reticulares ao
final do processo de reparo (21 dias pós-lesão) nos animais FAT-1 (Figura 18D).
Adicionalmente, verificou-se que os fibroblastos isolados dos camundongos
transgênicos aumentaram a deposição de componentes citoplasmáticos e de fibronectina
extracelular (Figura 20B), indicando que a fibronectina é uma macromolécula chave
para a deposição de MEC nestes animais e que então pode explicar o ganho de
propriedades biomecânicas.
Ao mesmo tempo, os camundongos FAT-1 exibiram aumento da deposição

de fibras elásticas, em especial, elastina (Figuras 17C e 18A-B), o que justifica a
elasticidade considerável adquirida no tecido reparado destes animais (Figura 19C).
As fibras elásticas são uma importante classe de fibras da MEC e estruturas

presentes em diversos órgãos que são submetidos à constante estresse mecânico,
85
desempenhando papel fundamental na estrutura do tecido [74]. A pele em especial, está

intimamente ligada às funcionalidades das fibras elásticas, devido às suas funções
dinâmicas. As fibras elásticas requerem expressão gênica coordenada temporal e
espacialmente, a fim de garantir a polimerização do monômero de elastina
(tropoelastina) e determinar a arquitetura final da fibra, de acordo com as necessidades
funcionais do tecido [75].
No tecido conjuntivo propriamente dito, as fibras elásticas ditas maduras são

compostas predominantemente por polímeros de elastina que se ancoram ou mesmo
constituem tramas microfibrilares. As microfibrilas parecem ter funções globais de
suporte à deposição de tropoelastina e formação das fibras elásticas maduras, sendo que
a elastogênese está vinculada à elastina amorfa [76-78]. Assim, os animais transgênicos
apresentaram maior elasticidade, devido à presença significativa de elastina durante o
processo de cicatrização (10 e 21 dias pós-lesão). Acrescenta-se ainda, que a
organização uniaxial do colágeno verificada no tecido reparado destes animais (Figura
9) [56], também justifica o ganho de elasticidade, uma vez que o ensaio tracionou o
tecido neste sentido [73].
Diversos estudos têm demonstrado a influência de ácidos graxos ω-3 nas

propriedades mecânicas e dinâmicas da pele. Humanos suplementados com óleo de
peixe exibiram aumento da deposição de colágeno e do módulo elástico da pele [79].
Em contrapartida, ratos suplementados com ácidos graxos ω-3 diminuíram a força de
tensão na ferida de 30 dias pós-lesão, sem terem alterado os níveis de colágeno. Este
prejuízo foi associado ao comprometimento da qualidade e da reticulação das fibras
colágenas [80].
Estudos mais específicos, demonstraram que o ácido graxo ω-3 EPA foi
capaz de melhorar a elasticidade da pele [81]. O uso tópico de EPA em pele humana,
reduziu o espessamento dérmico e a produção de MMPs (MMP-1 e MMP-9) em
fibroblastos dérmicos, através da inibição da via de sinalização JNK (c-Jun N-terminal
quinase). Adicionalmente, o EPA reduziu COX-2 e apresentou aumento de colágeno e
de fibras elásticas como a tropoelastina e a fibrilina-1, mediante aumento do TGF-β
[81]. Paralelamente, outro grupo de pesquisa demonstrou que o tecido adiposo presente
abaixo da derme, libera ácidos graxos livres que modulam a função de fibroblastos
dérmicos e propriedades biomecânicas da pele [82]. Verificou-se que adipócitos
maiores (presentes em condição de obesidade) liberam ácido palmítico, o qual estimula
a produção da MMP-13 e reduz a proliferação de fibroblastos, bem como a produção de
86
colágeno I e elastina, através da ativação de TLRs e, então translocação nuclear do fator

nuclear kappa B (NF-kB). Estes efeitos prejudicaram a elasticidade da pele, porém,
quando na presença do ácido graxo EPA, foram atenuados, indicando uma função
benéfica do EPA nesta condição [82].
Através de todos os resultados apresentados no presente trabalho,

verificamos que os camundongos FAT-1 possuem um aumento da razão pró-
inflamatória durante as últimas fases do processo de cicatrização, assim como, aumento
da deposição de componentes intra e extracelulares que determinam a MEC. E estas
alterações beneficiaram as propriedades funcionais da pele, como a resistência à tração
e elasticidade do tecido cicatrizado.
87
8. CONCLUSÃO
Camundongos FAT-1 apresentaram alteração na resposta inflamatória na

fase de proliferação concomitante à de remodelamento, exibindo um domínio da razão
de mediadores pró-inflamatórios. Em conjunto, elementos estruturais da MEC foram
significativamente expressos no tecido cicatricial, os quais conferiram maior resistência
à tração axial do tecido no leito da ferida e, maior capacidade de alongamento
específico (elasticidade/deformação) nas regiões adjacentes.
Assim, o estudo demonstrou que o aumento da incorporação de ácidos

graxos ω-3 na pele, bem como, a redução da razão ω-6/ω-3, favoreceu ao processo
anabólico, através da maior deposição de MEC e ganho biomecânico no tecido
cicatrizado dos camundongos FAT-1. Estes achados podem contribuir para intervenções
dietéticas em condições de lesão ou de MEC patológica.
88
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▪ FACHI, JOSÉ LUÍS ; FELIPE, JAQUELINE DE SOUZA ; PRAL, LAÍS
PASSARIELLO ; DA SILVA, BRUNA KARADI ; CORRÊA, RENAN
OLIVEIRA ; DE ANDRADE, MIRELLA CRISTINY PEREIRA ; DA
FONSECA, DENISE MORAIS ; BASSO, PAULO JOSÉ ; CÂMARA, NIELS
OLSEN SARAIVA ; DE SALES E SOUZA, ÉRICKA LORENNA ; DOS
SANTOS MARTINS, FLAVIANO ; GUIMA, SUZANA EIKO SATO ;
THOMAS, ANDREW MALTEZ ; SETUBAL, JOÃO CARLOS ;
MAGALHÃES, YULI THAMIRES ; FORTI, FÁBIO LUIS ; CANDREVA,
THAMIRIS ; RODRIGUES, HOSANA GOMES ; DE JESUS, MARCELO
BISPO ; CONSONNI, SÍLVIO ROBERTO ; FARIAS, ALESSANDRO DOS
SANTOS ; VARGA-WEISZ, PATRICK ; VINOLO, MARCO AURÉLIO
RAMIREZ . Butyrate Protects Mice from Clostridium difficile-Induced Colitis
through an HIF-1-Dependent Mechanism. Cell Reports, v. 27, p. 750-761.e7,
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▪ BURGER, BEATRIZ ; KÜHL, CAROLINA M C ; CANDREVA, THAMIRIS
; CARDOSO, RENATO DA S ; SILVA, JÉSSICA R ; CASTELUCCI,
BIANCA G ; CONSONNI, SÍLVIO R ; FISK, HELENA L ; CALDER, PHILIP
C ; VINOLO, MARCO AURÉLIO R ; RODRIGUES, HOSANA G. Oral
administration of EPA-rich oil impairs collagen reorganization due to elevated
production of IL-10 during skin wound healing in mice. Scientific Reports, v.
9, p. 9, 2019.
▪ ANTUNES, KRIST HELEN ; FACHI, JOSÉ LUÍS ; DE PAULA,
ROSEMEIRE ; DA SILVA, EMANUELLE ; FRAGA PRAL, LAÍS ;
PASSARIELLO DOS SANTOS, ADARA ; ÁUREA DIAS, GREICY ; BRISA
MALAQUIAS VARGAS, JOSÉ EDUARDO ; PUGA, RENATO ; MAYER,
FABIANA ; QUOOS MAITO, FÁBIO ; ZÁRATE-BLADÉS, CARLOS R ;
AJAMI, NADIM J ; SANTANA, MARCELLA RAMOS ; CANDREVA,
THAMIRIS ; RODRIGUES, HOSANA GOMES ; SCHMIELE, MARCIO ;
SILVA CLERICI, MARIA TERESA ; PEDROSA PROENÇA-MODENA,
97
JOSÉ LUIZ ; VIEIRA, ANGÉLICA ; THOMAS MACKAY, CHARLES R.

MANSUR, DANIEL CABALLERO, MAURICIO T. MARZEC, JACQUI LI,
JIANYING , et al. ; Microbiota-derived acetate protects against respiratory
syncytial virus infection through a GPR43-type 1 interferon response. Nature
Communications, v. 10, p. 1-17, 2019.
▪ CANDREVA, THAMIRIS ; KÜHL, CAROLINA M.C. ; BURGER,
BEATRIZ ; DOS ANJOS, MARIAH B.P. ; TORSONI, MÁRCIO A. ;
CONSONNI, SÍLVIO R. ; CRISMA, AMANDA R. ; FISK, HELENA L. ;
CALDER, PHILIP C. ; DE MATO, FELIPE C.P. ; SERNAGLIA, ERICA M. ;
VINOLO, MARCO A.R. ; RODRIGUES, HOSANA G. . Docosahexaenoic
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SOUZA, L. M. ; CANDREVA, T. ; RODRIGUES, H. G. ; TORSONI, A. S. ;
MILANSKI, M. ; TORSONI, M. A. . Maternal high fat diet consumption
reduces liver alpha7 nicotinic cholinergic receptor expression and impairs
insulin signalling in the offspring. Scientific Reports, v. 10, p. 1-10, 2020.
98
11. ANEXOS
11.1. Comitê de ética

99
100
11.2. Curso capacitatório de legislação e procedimentos para utilização de animais

Robles ThamirisCandreva D

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

Faculdade de Ciências Aplicadas/FCA

THAMIRIS CANDREVA ROBLES

INFLUÊNCIA DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA SOBRE A COMPOSIÇÃO DA

INFLUENCE OF THE INFLAMMATORY RESPONSE ON THE COMPOSITION OF

INFLUÊNCIA DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA SOBRE A COMPOSIÇÃO DA

Tese apresentada à Faculdade de Ciências

Orientadora: PROFª. DRA. HOSANA GOMES RODRIGUES

ESTE TRABALHO CORRESPONDE À

Data da defesa: 18/06/2021

Titulação: Doutora em Ciências da Nutrição e do Esporte e Metabolismo, na Àrea de

Profa. Dra. Hosana Gomes Rodrigues – Presidente

Profa. Dra. Maria Cláudia Gonçalves de Oliveira Fusaro

Prof. Dr. Fernando Moreira Simabuco

Profa. Dra. Daniela Carlos Sartori

Prof. Dr. Luiz Osório Silveira Leiria

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca, encontra-se

Ao meu marido, meu parceiro de vida, pelo incentivo e apoio diário.

Obrigada por caminhar comigo e vibrar por cada conquista.

frutos que vocês plantaram em minha vida.

À Deus pela vida e por me permitir realizar o doutorado com saúde,

À minha orientadora Hosana, a qual é responsável pelo meu crescimento

Ao meu laboratório Labnutre, pelos vínculos formados, pelas horas dedicadas à

Agradeço ao departamento de bioquímica e biologia tecidual, em especial ao

Ao laboratório de Imunoinflamação e ao laboratório Labdime, pelo espaço e

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP; Processo:

O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento

“Renda-se como eu me rendi

Mergulhe no que você não conhece como eu mergulhei

Não se preocupe em entender,

viver ultrapassa qualquer entendimento”

A cicatrização de feridas cutâneas é um processo fisiológico essencial à sobrevivência de todo

Palavras-chave: Inflamação, ômega-3 e matriz extracelular.

Keywords: Inflammation, omega-3 and extracellular matrix.

Figura 1. Fases do processo de cicatrização de feridas........................................................21

Figura 2. Resposta celular durante a fase de coagulação do processo de cicatrização de

Figura 3. Eventos durante o processo de cicatrização de feridas.......................................26

Figura 4. Estrutura da Matriz Extracelular (MEC)............................................................30

Figura 5. Conversão de ácidos graxos ω-6 em ω-3 pelo gene fat-1.....................................34

Figura 6. Análise da razão ω-6/ω-3.......................................................................................34

Figura 7. Análise macroscópica do fechamento da ferida...................................................36

Figura 8. Mediadores inflamatórios, atividade da MPO e histologia do tecido

Figura 9. Reorganização do colágeno....................................................................................37

Figura 10. PCR array específico para cicatrização de feridas............................................38

Figura 11. Etapas do procedimento de genotipagem...........................................................43

Figura 12. Genotipagem.........................................................................................................44

Figura 13. Indução da ferida cutânea dorsal........................................................................45

Figura 14. Detalhamento das dimensões para o ensaio de tração e da máquina de

Figura 15. Quantificação de mediadores inflamatórios......................................................55

Figura 16. Expressão gênica de componentes estruturais e via celulares associadas à

Figura 17. Imuno-histoquímica do tecido cicatricial de 10 dias pós-lesão.........................65

Figura 18. Análise histológica de componentes da MEC....................................................73

Figura 19. Análise da resistência e elasticidade tecidual.....................................................77

Figura 20. Análise da deposição de MEC por fibroblastos isolados da pele.....................81

Anexo 1. Comitê de ética........................................................................................................98

Tabela 2. Valores de limite de resistência à tração (LRT) e deformação da região de

AA: Ácido araquidônico

ALA: Ácido alfa-linolênico

C. elegans: Caenorhabditis elegans

Col1a1: Colágeno tipo I, alfa-1

Col1a2: Colágeno tipo I, alfa-2

Col1a3: Colágeno tipo I, alfa-3

Col3a1: Colágeno tipo III, alfa-1

Col4a3: Colágeno tipo IV, alfa-3