Kb, separando nitidamente uma molécula de 30 Kb de
outra 35 Kb.
Terceira atividade laboratorial
Eletroforese de DNA em gel de agarose
As moléculas de DNA, tal como as proteínas e muitas
outras moléculas biológicas, possuem carga elétrica. O
DNA tem carga negativa ⇨ devido aos grupos fosfato.
Pode-se aplicar a eletroforese para separar moléculas
de DNA de acordo com a razão carga/massa (separa-se
de acordo com o tamanho, migrando mais rapidamente
as moléculas de menores dimensões).
A eletroforese ocorre num campo magnético ⇨ gerado
pela diferença de potencial entre os polos positivo e
negativo de uma tina de eletroforese, no sentido do
ânodo.
A carga da molécula de DNA depende ⇨ nº de grupos
fosfatos presentes, que é proporcional ao tamanho da
molécula, a carga é constante por unidade de massa ⇨
a velocidade de migração eletroforética das moléculas
está inversamente relacionada com a sua massa
(dimensão).
↪ Um plasmídeo pequeno migra mais rapidamente no gel
do que um plasmídeo grande .
O gel de agarose é constituído por uma complexa rede
de poros, através dos quais as moléculas de DNA migram
em direção ao elétrodo positivo (cátodo).
A análise do DNA plasmídico é feita por eletroforese das
amostras em gel de agarose na presença de um
marcador de massas molecular, de acordo com o método
descrito por Meyers et al. (1976). Depois da migração o
DNA é visualizado, sob luz ultravioleta a 254 nm, devido
à fluorescência de brometo de etídio intercalado entre
as bases do DNA.
⚠A composição e a concentração do gel determinam o
tamanho dos fragmentos de DNA que é possível separar.
Exemplo:
Um gel de agarose a 0,3% (p/v) com 0,5 cm de
espessura ⇨ poros relativamente largos, permite
separar moléculas de DNA com tamanhos entre 5 e 60
Todavia usando um gel de poliacrilamida a 6% (p/v) com
0,3 mm de espessura ⇨ poros muito finos, permite
separar fragmentos de DNA de 1-300 pb, separando
moléculas com apenas um nucleótido de diferença.
Soluções de eletroforese usadas para a separação de
DNA:
• Solução tamponada tris-acetato pH próximo de 8,0 ⇨
(TAE) garantir ionização dos
• Tris-borato (TBE) grupos fosfato
Após a separação das amostras de DNA ⇨ proceder à
visualização. Para isso é usado brometo de etídio (BrEt)
na solução gel (+ rápido) ou numa solução de coloração (o
gel é mergulhado após a migração).
O BrEt intercala-se nas bases do DNA e fluoresce (sob
a luz UV) ⇨ as bandas de DNA são visíveis com um tom
laranja. Este é altamente mutagénico ⇨ cuidados com a
manipulação e com todo o material contaminado com ele.
⚠A visualização de bandas de DNA, pelo BrEt, é muito
sensível. Apesar dos riscos o composto continua a ser
usado.
Se numa eletroforese, estiverem presentes fragmentos
de vários tamanhos (ex. digestão), os tamanhos destes
fragmentos podem ser determinados.
Relação matemática que relaciona a velocidade de
migração com a massa molecular:
D = a - b ( log M )
• D - distância percorrida
• M - massa molecular
• a e b - parâmetros que dependem das condições da
eletroforese (ordenada na origem e declive da reta)
Assim, se aplicar, moléculas de DNA de massa molecular
conhecida, marcadores de massa molecular, pode-se
traçar uma reta através da equação acima. Através
desta reta, calcula-se a massa molecular de qualquer
fragmento de DNA (através da respetiva distância
migrada).
⚠ Quando não é necessário grande rigor (apenas uma
estimativa da massa molecular) usa-se um processo mais
simples e mais direto ⇨ consiste em comparar a posição
de uma banda relativamente às dos marcadores mais
próximos. Não é muito preciso, porém, este método é
muitas vezes satisfatório para o objetivo pretendido.
Na análise de moléculas de DNA circular é importante
lembrar que:
• enzima que hidrolisa apenas num local ⇨ origina um
fragmento linearizado;
• enzima que a hidrolisa em dois locais ⇨ origina dois
fragmentos, e assim sucessivamente.
Uma molécula de DNA circular não digerida ⇨ origina,
pelo menos, duas bandas:
• Forma relaxada (com interrupções, ou "nicks" numa
das cadeias), migra lentamente;
• Forma superenrolada (supercoiled) que migra mais
rapidamente ⇨ oferece menos resistência.
⚠ Por vezes, são ainda visíveis bandas superiores,
correspondentes a formas multiméricas, que resultam da
ligação e recombinação de múltiplas cópias de plasmídeos
iguais entre si.
Já hidrolisada (a molécula circular) a forma linearizada
correspondente apresentará uma migração intermédia.
↪ Apenas é possível comparar tamanhos de moléculas
(em Kb) se todas elas estiverem na forma linear. Pode-
se comparar migrações relativas das formas circulares,
mas nunca estimar o tamanho destas por comparação
com moléculas lineares de massa molecular conhecida.
Material
Marcador de massas moleculares: " Lambda DNA Hind III
Digest Aqueous Solution" (Sigma)
Plasmídeo: pUC18 (Norrander et al., 1983).
Tampões: TAE 1x Tris-acetato 0,04 M; EDTA 0,001 M.
Tampão de amostra: glicerol
50% (v/v); azul de bromofenol 0,1% (p/v)
Procedimento experimental
1. Limpe o tabuleiro e o pente (serve para no molde se
fazer os poços – onde fica o DNA) com papel
absorvente, e coloque a fita adesiva nas duas
extremidades (para ter o molde), vedando bem e
deixando, pelo menos, uma altura de 1,5 cm. Ponha o
numa superfície nivelada e coloque o pente na
posição correta.
2. Para preparar um gel médio a 0,8% (p/v) de
agarose em tampão TAE 1x (significa que está diluído
– solução de trabalho), pesar 0,8g de agarose para
um balão erlenmeyer de 250 mL e juntar a 100 mL
de tampão. Tapar o balão com parafilm furado com
uma agulha e aquecer em micro-ondas até dissolver
a agarose.
3. Assim que iniciar fervura, retirar o balão com ajuda
de um pano, agitar e arrefecer sob água corrente,
agitando sempre até suportar com a mão (cerca de
55ºC) e verter sobre o molde com o pente já
colocado.
4. Após solidificação completa da agarose retirar o
pente e a fita adesiva das duas extremidades e
imergir o gel na tina de eletroforese contendo
tampão TAE 1x.
5. Misturar as amostras de DNA (10 μL) com tampão
de amostra (não tem função de tampão, tem de
estar em volto em prata porque em contacto com a
luz degrada-se) (3 μL) e aplicar nos poços. (a
amostra e o tampão têm a mesma densidade ⇨
“não fica no poço”)
6. Proceder à eletroforese na presença do marcador
de massas moleculares (ex: 5 V.cm-1) durante1 hora.
( o DNA é separado por massa ⇨ o DNA + pequeno,
ou seja, com - pares de bases, passa mais
rapidamente pelos poros)
⚠ Liberta-se um gás (bolhas de ar), como há mais
bolhas junto do elétrodo negativo tem de ser um gás
positivo H+ como na molécula da H2O há 2 moléculas de H+
e 1 de O- ⇨ há mais bolhas do lado negativo.
7. Corar o gel por imersão numa solução de água ou
tampão com 0,5 μg.mL-1 de brometo de etídio
(corante para corar o DNA, tem a particularidade de
se intercalar entre as bases azotadas do DNA ⇨
altera o DNA) durante 5 minutos e observar sobre
luz U.V.
Corante: serve para monitorizar a corrida eletroforética.
Ác. nucleicos (DNA/RNA) A260nm
Proteínas A280nm
= 1,8
Quando a equação acima é = 1,8 significa que o DNA está
próximo do puro. Quando 1,8<x<2 há contaminação do
RNA. Quando x<1,8 há contaminação com proteínas ou
fenol.