UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA: CIÊNCIAS MÉDICAS

MONITORIZAÇÃO DOS NÍVEIS DE FENILALANINA EM PACIENTES COM

FENILCETONÚRIA POR MEIO DE SANGUE IMPREGNADO EM PAPEL FILTRO:
COMPARAÇÃO DE DOIS MÉTODOS

FERNANDA MEDEIROS SEBASTIÃO

PORTO ALEGRE

2018
 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE MEDICINA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA: CIÊNCIAS MÉDICAS

MONITORIZAÇÃO DOS NÍVEIS DE FENILALANINA EM PACIENTES COM

FENILCETONÚRIA POR MEIO DE SANGUE IMPREGNADO EM PAPEL FILTRO:
COMPARAÇÃO DE DOIS MÉTODOS

FERNANDA MEDEIROS SEBASTIÃO

Orientadora: Profª Drª Ida Vanessa Doederlein

Schwartz

Dissertação apresentada como requisito parcial

para obtenção de Mestre em Medicina: Ciências
Médicas, da Universidade Federal do Rio Grande do
Sul, Programa de Pós-Graduação em Medicina:
Ciências Médicas

PORTO ALEGRE

2018
 Agradecimentos

Gostaria de agradecer a todos que direta ou indiretamente contribuíram para

realização deste trabalho, em especial:

A Ida Schwartz, que acreditou em mim e me deu esta oportunidade, obrigado

pelo apoio, ensinamentos, estímulos e incentivos para concluir este trabalho.

A todos os membros do Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo do

HCPA: A Maira Burin, pelo constante aprendizado, A Kristiane Michelin, Ana Paula
Sholz, Fernanda Bender e Fernanda Bitencourt que sempre me deram força,
carinho, amizade e foram meus pilares durante esta jornada, não tenho palavras
para agradecer tudo o que fizeram por mim. Adoro vocês!

Ao pessoal da entrada de materiais que me ajudou nas coletas Cléa, Inamara

e especialmente ao Juarez a quem agradeço muito por todos os ensinamentos e
conselhos diários.

A minha família que é a base de tudo, obrigado por todo amor e carinho que
sempre me deram. A pessoa que sou hoje devo a vocês.

Ao Marcelo, pela compreensão e parceria, obrigado por permanecer sempre

ao meu lado e ter me dado o maior presente que eu poderia ter: A nossa filha Lívia,
que ainda não chegou, mas já é muito amada por todos.

A Deus por renovar a cada momento a minha força e disposição e pelo

discernimento concedido ao longo desta jornada.
 RESUMO

Introdução: Os Erros Inatos do Metabolismo (EIM) são doenças genéticas

causadas pela atividade deficiente de uma ou mais enzimas específicas ou por
defeitos no transporte de proteínas. A fenilcetonúria (PKU) é um EIM causado pela
atividade deficiente da fenilalanina-hidroxilase (PAH) que é responsável pela
conversão de Fenilalanina (Phe) em Tirosina (Tyr). Esta doença pode ser detectada
precocemente através da Triagem Neonatal e seu diagnóstico confirmado através da
dosagem de aminoácidos por Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC). O
excesso de Phe e o consequente desbalanço de aminoácidos causam efeito tóxico
no Sistema Nervoso Central (SNC) e por consequência perda de funções cognitiva e
déficit cognitivo. O tratamento atual é feito principalmente através de dieta restrita
em Phe, suplementação de aminoácidos essenciais e acompanhamento laboratorial
e clínico. É importante lembrar que o diagnóstico e o tratamento precoce podem
levar a excelentes resultados na qualidade de vida destes pacientes.

Objetivo: O objetivo do presente trabalho foi avaliar dois métodos distintos: um

método fluorimétrico desenvolvido In House (método A) e o Kit comercial de
Fenilalanina Neonatal (Neonatal Phenylalanine Kit – Perkin Elmer®) (método B) para
detecção dos níveis de Phe em amostras de sangue impregnado em papel filtro
(SIPF) em pacientes com PKU que estão em acompanhamento no ambulatório do
Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (SGM-HCPA) e
comparar estes resultados com os resultados obtidos por HPLC, o qual é
considerado o padrão ouro para o diagnóstico e monitoramento de pacientes com
PKU.

Metodologia: Estudo transversal, prospectivo e observacional no qual foi realizada

a determinação dos níveis de Phe em amostras de SIPF de pacientes com PKU
acompanhados no ambulatório do SGM-HCPA.Os resultados obtidos foram
comparados com os níveis de Phe apresentados, na mesma amostra, pelo método
de HPLC (padrão ouro). As amostras foram obtidas a partir de sangue total
heparinizado. Após a impregnação do sangue total no papel filtro a amostra foi
centrifugada e houve a separação do plasma para a análise pelo método de HPLC.
O papel filtro ficou secando a temperatura ambiente por no mínimo 4 horas e no
máximo 24 horas. Após secagem total a amostra foi armazenada em saco plástico
com sílica em freezer -80ºC até o dia da análise.

Resultados: Foram analisadas 89 amostras de SIPF de 47 pacientes que são

acompanhados no SGM-HCPA. Dos 47 pacientes testados, 20 (42,5%) possuem a
forma clássica de PKU, 16 (34,1%) a forma leve da doença e em 11 o fenótipo não
está definido. A correlação entre o método In House (método A) e o HPLC, e entre o
Kit comercial de Fenilalanina Neonatal (método B) e o HPLC feita através da
correlação de Spearman, o coeficiente angular, interceptação em y e correlação
linear foram de 0,990, 1,0365, 3,8125, 09873 e 0,974, 1,0795, 31,98 e 0,895
respectivamente. O nível de significância das duas análises foi de p<0,05. Todas as
amostras analisadas por HPLC que eram alteradas ou normais, também se
mostraram da mesma forma com ambos os métodos testados. A análise feita
através da razão do diagrama de Bland Altman mostrou que quanto menor o valor
do HPLC, maior é a dispersão dos valores nos métodos A e B.

Conclusões: Nossos testes sugerem que amostras de SIPF nos métodos A e B são
boas alternativas para a monitorização dos níveis de Phe em pacientes com PKU,
sendo que o método A apresentou maior concordância em relação ao padrão ouro.

Palavras chave: Fenilcetonuria, Hiperfenilalaninemia; Sangue Impregnado em

Papel Filtro; Diagnóstico; Acompanhamento.
 ABSTRACT

Introduction: Inborn Errors of Metabolism (IEM) are genetic diseases caused by the
absense of activity of one or more specific enzymes or by defects in the transport of
proteins. Phenylketonuria (PKU) is an IEM caused by the deficiency of the
phenylalanine hydroxylase (PAH), enzyme that is responsible for the conversion of
Phenylalanine (Phe) into Tyrosine (Tyr). This disease can be detected early through
Neonatal Screening and its diagnosis is confirmed through the measurement of
amino acids by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). The excess of
Phe and the consequent amino acid imbalance cause toxic effect on the Central
Nervous System (CNS) and consequently loss of cognitive function and cognitive
deficit. The current treatment is mainly made through restricted diet in Phe,
supplementation of essential amino acids and laboratory and clinical follow-up. It is
important to remember that early diagnosis and treatment can lead to excellent
results in the quality of life of these patients.

Objective: The objective of the present study was to evaluate two different methods:
a fluorimetric method developed In House (method A) and the commercial Neonatal
Phenylalanine Kit (Perkin Elmer®) (method B) for the detection of Phe levels in dried
blood spots samples (DBS) in patients with PKU who are being followed up at the
ambulatory of the Medical Genetics Service of the Hospital de Clínicas of Porto
Alegre (MGS-HCPA) and compare these results with the results obtained by HPLC,
which is considered the gold standard for the diagnosis and monitoring of patients
with PKU.

Methodology: A cross-sectional, prospective and observational study in which the

determination of Phe levels in DBS samples of patients with PKU was carried out in
the MGS-HCPA outpatient clinic using two different methods: the In House (method
A) and the commercial Neonatal Phenylalanine Kit (method B). The results obtained
were compared with the Phe levels presented by the HPLC method (gold standard).
Samples of DBS were obtained from heparinized whole blood. After impregnation of
the whole blood on the filter paper the sample was centrifuged and the plasma
separated for analysis by the HPLC method. The filter paper was dried at room
temperature for at least 4 hours and at most 24 hours. After complete drying the
sample was stored in plastic bag with silica in freezer -80ºC until the day of analysis.
Results: A total of 89 DBS samples were analyzed from 47 patients who are
followed up at GMS-HCPA. The correlation between the In House (method A) and
HPLC, and between the commercial Neonatal Phenylalanine Kit (method B) and
HPLC using Spearman's correlation, slope, y-intercept and linear correlation were
0.990, 1.0365, 3.8125, 09873 and 0.974, 1.0795, 31.98 and 0.895 respectively. The
level of significance of the two analyzes was p <0.05. Of the 47 patients tested, 20
(42.5%) had the classic form of PKU, 16 (34.1%) the mild form of the disease and 11
(23.4%) were not yet genotyped. All samples analyzed by HPLC that were altered or
normal, also showed the same way with both methods tested. The analysis done
through the ratio of the Bland Altman diagram showed that the lower the HPLC value,
the greater the dispersion of the values in methods A and B.

Conclusions: Our tests suggest that DBS samples in methods A and B are good
alternatives for the monitoring of Phe levels in patients with PKU, and method A
showed greater agreement with the gold standard.

Keywords: Phenylketonuria, Hyperphenylalaninemia; Dried Blood Spots; Diagnosis;

Follow Up.
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Estratégia de busca de referências bibliográficas

Figura 2: Metabolismo da Fenilalanina

 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

BH4 – Tetraidrobiopterina
DL – Doenças Lisossômicas
EIM – Erros Inatos do Metabolismo
FM – Fórmula Metabólica
HCPA – Hospital de Clínicas de Porto Alegre
HPA – Hiperfenilalaninemia
HPLC - Cromatografia Líquida de Alta Performance
LNAA – Large Neutral Amino Acids
PAH - Fenilalanina-Hidroxilase
PAL – Fenilalanina Amônia Liase
Phe – Fenilalanina
PKU – Fenilcetonúria
PNTN – Programa Nacional de Triagem Neonatal
SGM – Serviço de Genética Médica
SIPF – Sangue Impregnado em Papel Filtro
SNC – Sistema Nervoso Central
TP – Teste do Pezinho
Tyr – Tirosina
SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................... 12
2. REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................... 12
2.1 ERROS INATOS DO METABOLISMO ............................................................ 13
2.2 HIPERFENILALANINEMIA E FENILCETONÚRIA .......................................... 14
2.3 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS ........................................................................ 16
2.4 DIAGNÓSTICO ............................................................................................... 17
2.5 TRATAMENTO ............................................................................................... 18
3. JUSTIFICATIVA .................................................................................................. 21
4. HIPÓTESES ........................................................................................................ 22
5. OBJETIVOS ........................................................................................................ 23
5.1 OBJETIVO GERAL ......................................................................................... 23
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................... 23
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS .................................................................... 24
7. ARTIGO ............................................................................................................... 27
8. CONCLUSÕES ................................................................................................... 45
9. CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................. 47
10. PERSPECTIVAS FUTURAS .......................................................................... 48
ANEXO 1 – CARTA DE APROVAÇÃO DE PROJETO ........................................... 49
ANEXO 2 - STROBE ............................................................................................... 50
1. INTRODUÇÃO
A fenilcetonúria (PKU) é uma aminoacidopatia causada pela deficiência da
enzima fenilalanina-hidroxilase (PAH), a qual conduz um acúmulo de fenilalanina
(Phe) No Brasil, a PKU pode ser detectada através do Programa Nacional de
Triagem Neonatal (PNTN) ou Teste do Pezinho (TP) que deve ser feito entre o 3º e o
5º dia de vida. Se o resultado do TP for alterado ele deve ser repetido em nova
amostra de sangue pelo método de Cromatografia Líquida de Alta Performance
(HPLC) que é considerado o Padrão Ouro no diagnóstico de PKU.

O excesso de Phe e seus metabólitos no sangue são tóxicos para o Sistema

Nervoso Central (SNC), causando perda da capacidade intelectual e déficit cognitivo
se não tratada rapidamente. No caso de confirmação do diagnóstico de PKU, o
paciente deve ser encaminhado ao serviço de referência mais próximo para
descobrir a etiologia da doença através de análises da deficiência da PAH, defeitos
do metabolismo de tetrabiopterina (BH4), análise de mutações, etc. O tratamento
atual é feito através de dieta restrita em Phe e acompanhamento clínico com
dosagens periódicas de Phe no sangue.

2. REVISÃO DA LITERATURA

Esta revisão foi focada no conhecimento de triagem neonatal, aspectos

relacionados às manifestações clínicas, o diagnóstico e o tratamento para PKU.
Como estratégia de busca as seguintes bases de dados foram incluídas: PubMed,
Science Direct, LILACS e banco de teses da CAPES no período de 1995 a 2016.
Foram realizadas buscas através dos termos “Phenylketonuria”, “Phenylketonuria
and symptoms”, “Phenylketonuria and diagnosis”, “Phenylketonuria and screening” e
“Phenylketonuria and treatment” e suas combinações apresentadas na Figura 1.

12
Figura 1 - Estratégia de busca de referências bibliográficas sobre as bases que fundamentam os objetivos
deste estudo. Este é o resultado da busca da combinação das palavras-chave.

2.1 ERROS INATOS DO METABOLISMO

Os Erros Inatos do Metabolismo (EIM) são doenças metabólicas hereditárias

causadas pela falta de atividade de uma ou mais enzimas específicas ou defeitos no
transporte de proteínas. As consequências, geralmente, podem ser o acúmulo de
substrato da enzima deficiente, a diminuição ou ausência de produtos intermediários
ou o desvio do substrato para vias metabólicas alternativas. (AMÂNCIO; SCALCO;
COELHO, 2007; ILLSINGER; DAS, 2010; GAMBELLO; LI 2018).
13
 É possível classificar essas doenças metabólicas hereditárias em três grupos,
considerando suas características fisiopatológicas e fenótipo clínico: (SAUDUBRAY;
GARCIA-CAZORLA, 2018).

Grupo 1 – Defeito no metabolismo intermediário: caracteriza-se pelo

comprometimento das vias de metabolização de pequenas moléculas. As principais
representantes deste grupo são as doenças como a PKU, a tirosinemia, a
homocistinúria, as porfirias e os distúrbios das glicinas e purinas.

Grupo 2 – Defeito na produção / utilização de energia: sintomas que, pelo

menos parcialmente, levam a deficiência na produção ou uso de energia no fígado,
miocárdio, músculo, cérebro e outros tecidos. Neste grupo estão as doenças de
depósito de glicogênio, doenças mitocondriais e defeito da β-oxidação de ácidos
graxos.

Grupo 3 – Defeito de síntese ou catabolismo de moléculas complexas: neste

grupo os sinais e sintomas são permanentes e progressivos. O grupo inclui as
Doenças Lisossômicas (DL), como a doença de Gaucher, a doença de Niemann-
Pick, as mucopolissacaridoses e as doenças peroxissomais como a síndrome de
Zellweger e a adrenoleucodistrofia.

Os EIM apresentam, geralmente, herança autossômica recessiva, com

risco de recorrência de 25% para cada gestação de pais heterozigotos. Atualmente
são conhecidos mais de 750 EIM, que individualmente são raros, mas que em
conjunto atingem pelo menos 1:800 nascidos vivos (PAMPOLS, 2010; MAK et al.,
2013; SAUDUBRAY; GARCIA-CAZORLA, 2018).

2.2 HIPERFENILALANINEMIA E FENILCETONÚRIA

A hiperfenilalaninemia (HPA) é o termo que engloba o fenótipo bioquímico

caracterizado pelo aumento persistente dos níveis séricos do aminoácido Phe. A
HPA é definida como o valor de Phe plasmática maior que 120 μmol/L (2mg/dL)
(SCRIVER; KAUFMAN, 2001; PLANA et al., 2006).

A PKU é uma aminoacidopatia causada pela deficiência da enzima PAH, que

é responsável pela transformação Phe em tirosina (Tyr) e mais raramente pode ser
14
causada devido à deficiência de seu cofator tetraidrobiopterina (BH4).
(LEHNINGER, 2004; SCRIVER, 2007; BLAU, 2010; BLAU, 2016). (Figura 2)

Figura 2 - Metabolismo da fenilalanina e a deficiência de PAH (Adaptado de Lehninger 2004)

Segundo Marsden e Levy (2006) a HPA por deficiência de PAH pode ser
dividida em PKU Clássica, PKU Atípica e HPA Não-PKU, sendo que ainda pode ser
acrescentada a HPA transitória (MARSDEN; LEVY, 2006).

 PKU Clássica: nível de Phe sanguínea > 1200 µmol/L (> 20mg/dL) em dieta
normal.
 PKU Leve: nível de Phe sanguínea entre 360 – 1200 µmol/L (6 – 20mg/dL)
em dieta normal.
 HPA Não-PKU: nível de Phe sanguínea entre 120 – 360µmol/L (2 – 6mg/dL)
em dieta normal.
 HPA transitória: devido à prematuridade, iatrogenia, doença neonatal do
fígado ou hiperfenilalaninemia materna.

Em 1998, Gulberg e colaboradores subdividiram a deficiência de PAH em

quatro categorias que se baseia principalmente na tolerância do paciente à Phe:

 PKU Clássica: caracterizada pela deficiência completa ou quase completa da

atividade da PAH. Os indivíduos afetados toleram menos que 250 – 350mg

15
 de Phe dietética ao dia, para manter um nível sanguíneo de Phe seguro de
não mais de 300 µmol/L (5mg/dL).
 PKU Moderada: os indivíduos afetados toleram 350 – 400mg de Phe
dietética ao dia, para manter um nível sanguíneo de Phe seguro de não mais
de 300 µmol/L (5mg/dL).
 PKU Leve: os indivíduos afetados toleram 400 – 600mg de Phe dietética ao
dia, para manter um nível sanguíneo de Phe seguro de não mais de 300
µmol/L (5mg/dL).
 HPA Leve: os indivíduos afetados tem concentração plasmática de Phe
menor que 600 µmol/L(10mg/dL) em dieta normal (GULBERG et al., 1998).

Segundo Blau (2016) a PKU ocupa um lugar único na história do estudo de

doenças metabólicas, não só como o EIM dos aminoácidos mais comum, como
também a primeira séria condição genética a ser tratada efetivamente (BLAU,
2016).

2.3 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS

Ao nascimento, o paciente com PKU é assintomático. Alguns sintomas podem

ser vistos no início da vida dos pacientes tais como, irritabilidade, eczema e odor
incomum (este último causado pela excreção excessiva de Phe e seus metabólitos)
(MITCHELL; TRAKADIS; SCRIVER, 2011). A manifestação mais importante nesses
pacientes é o déficit cognitivo. Na ausência de tratamento o paciente pode perder 50
pontos de QI no primeiro ano de vida. O desenvolvimento somático tende a ser
normal, contudo a estatura pode ser menor (NYHAN; OZAND, 1998; BARTUS et al.,
2018).

O excesso de Phe e seus metabólitos causam efeito tóxico nas funções

somáticas e do SNC interferindo na mielinização e na síntese proteica cerebral,
diminuindo a formação de serotonina e alterando a concentração de aminoácidos
no liquor, causando a perda de funções como a capacidade intelectual do indivíduo
portador. (ACOSTA; YANNICELLI, 2001; MONTEIRO; CÂNDIDO, 2006).

16
 O nível de Phe sanguínea está diretamente relacionado ao grau de retardo e
lesão neurológica, que também se correlacionam com a idade que o tratamento foi
iniciado. Contudo, pacientes que iniciam o tratamento precoce e adequado podem
sofrer algum déficit, especialmente relacionado à atenção e percepção. Através
disso percebe-se a necessidade da continuidade do tratamento, durante a vida
inteira, de maneira rigorosa (MARTINS et al., 2006).

Mesmo pacientes adultos que não seguem a dieta restrita em Phe podem
apresentar sintomas como, depressão, sintomas de ansiedade, agorafobia e
dificuldades psicossociais. Até mesmo aumentos transitórios dos níveis de Phe
sanguínea podem provocar déficit cognitivo transitório (MARTINS et al., 2006).

2.4 DIAGNÓSTICO

Em 1963, Guthrie e Susi publicaram a descrição de um método simples,

baseado na concentração de Phe no sangue, para detectar a PKU em recém-
nascidos. Mesmo com o passar dos anos esse método e seus derivados são
aplicados em todo mundo e modificaram a história natural da doença (SCRIVER;
KAUFMAN, 2001; HANNELIUS et al., 2005).

No Brasil a PKU pode ser detectada através do Teste do Pezinho (TP) do

Programa Nacional de Triagem Neonatal (PNTN), que foi implantado em 2001 e hoje
já é oferecido nos 27 estados. O TP deve ser realizado entre o 3° e o 5° dia de vida,
pois para que o aumento de Phe possa ser detectado é fundamental que a criança
tenha tido ingestão proteica (BRASIL, 2002).

Uma gota de sangue é coletada do calcanhar do recém-nascido e

impregnada em papel filtro e, a partir deste material, é realizado um método de
inibição bacteriana da Phe desenvolvido por Guthrie ou a determinação da
concentração de Phe. Se o resultado for alterado ele deverá ser repetido. Um
segundo teste positivo é acompanhado da análise quantitativa da concentração de
Phe e de Tyr no sangue por HPLC que é considerado o padrão ouro, confirmando a
HPA. Aumento transitório de Phe pode representar um atraso da maturação de
enzimas hepáticas que metabolizam a mesma. Por esse motivo, alguns autores

17
sugerem que seja realizado o teste de tolerância de Phe da dieta com os pacientes
com HPA (NYHAN; OZAND, 1998; SUMAILY; MUJAMAMMI, 2017).

Caso ocorra a confirmação da HPA, o caso deve ser encaminhado para

tratamento e investigações adicionais em serviços de referência (MARTINS et al.,
2006). Após comprovação do diagnóstico precoce é feito o diagnóstico diferencial
onde pode ser visto a etiologia da HPA. As análises poderão diagnosticar, por
exemplo, deficiência de PAH e os defeitos do metabolismo de BH4 (PLANA et al.,
2006; SUMAILY; MUJAMAMMI, 2017).

2.5 TRATAMENTO

Em 1953, Bickel foi o primeiro a divulgar para o mundo que através de uma
dieta restrita em Phe, os níveis sanguíneos desse aminoácido diminuem e evita-se o
dano neurológico naqueles indivíduos que tem diagnóstico precoce (PLASENCIA;
TORRES; TAMAYO, 2009). Desde então, as possibilidades de terapia vêm
crescendo e ainda hoje os trabalhos pioneiros de Bickel continuam sendo à base do
tratamento da mesma (PLANA et al., 2006). O diagnóstico conjuntamente com início
do tratamento precoce leva a excelentes resultados no prognóstico da PKU
(HOEKS; HEIJER; JANSSEN, 2009).

A dieta restrita em Phe deve ser iniciada precocemente, idealmente no

primeiro mês de vida. Assim os aspectos clínicos indesejáveis da HPA persistente
serão evitados. Os resultados são bem menos favoráveis quando o tratamento é
iniciado tardiamente (LYON; KOLODNY; PASTORES, 2006).

Como a alimentação dos pacientes com PKU acaba resultando na baixa

ingestão de proteínas de alto valor biológico, ela é geralmente complementada com
a utilização de uma fórmula metabólica (FM) que contém uma mistura de
aminoácidos livres e é isenta de Phe (BUIST et al., 1994 apud MIRA, MARQUEZ,
2000; MANTA-VOGLI; SCHULPIS, 2018).

Mesmo que o tratamento com dieta restrita em Phe e o uso da FM seja bem
sucedido, a pobre palatabilidade da mesma gera uma baixa adesão ao tratamento,

18
principalmente por adolescentes e adultos (MITCHELL; SCRIVER, 2011). Devido a
isso, algumas terapias estão sendo investigadas, tais como:

 Suplementação de Large Neutral Amino Acids (LNAA): que reduz a

concentração de Phe no cérebro, mesmo com níveis plasmáticos elevados da
mesma, através de competição por esse transportador (MITCHELL; SCRIVER,
2011).
 Administração da enzima fenilalanina amônia liase (PAL): a PAL é uma
enzima autocatalítica que não requer um co-fator. Nessa terapia a enzima PAL
converte a Phe em quantidades metabolicamente insignificantes de amônia e de
ácido trans-cinâmicos, um metabólico inofensivo que posteriormente é convertido
em ácido benzóico e rapidamente excretado na urina como ácido hipurato (KARAM
et al., 2004).
 Terapia gênica: tem sido explorada em modelos animais demonstrando
resultados positivos, porém mais estudos são necessários antes de ensaios clínicos
em humanos (MATALON et. al., 2006).
 Suplementação com BH4: a maioria dos pacientes que tiverem formas
mais amenas de HPA podem ser sensíveis a BH4, o mesmo melhorando a
tolerância à Phe da dieta (MITCHELL; SCRIVER, 2011). Sapropterin dihidrocloreto
(Kuvan®, Biomarn Pharma) é uma forma sintética oral do BH4. Ensaios clínicos de
fase II e III têm demonstrado que o Kuvan® é uma terapia segura e eficaz em
pacientes com HPA de forma leve a moderada e a alguns pacientes de forma mais
graves, aos quais respondem positivamente a testes de sobrecargas com BH4
(BURNETT et al., 2007).

O tratamento dos pacientes com PKU deve ser mantido durante o resto da
vida, uma vez que HPA na adolescência tem sido associada com distúrbios de
atenção, instabilidade de humor, degeneração da substância branca que leva a
convulsões e distúrbios de marcha (BÉLANGER-QUINTANA et al., 2011).

19
Figura 3 – Marco conceitual da Fenilalanina

20
3. JUSTIFICATIVA

O Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (SGM-

HCPA) é um centro de referência no diagnóstico e tratamento / acompanhamento de
pacientes com PKU.

Tendo em vista que os pacientes com PKU necessitam de um controle

periódico dos níveis de Phe no sangue para acompanhamento do tratamento e
manejo da dieta, e que alguns desses pacientes enviam amostras de sangue ao
laboratório uma vez que vivem em partes do estado, e que muitas vezes estas
amostras podem se degradar devido à conservação e transporte inadequado do
material, este trabalho propõe o controle periódico dos níveis de Phe em amostras
de Sangue Impregnado em Papel Filtro (SIPF) através da dosagem fluorimétrica de
um método desenvolvido In House (método A) ou do Kit comercial de Fenilalanina
Neonatal (método B), pois a amostra em questão pode ser facilmente obtida com
mínima quantidade de sangue, fácil transporte e menor risco de degradação.

21
4. HIPÓTESES

Este estudo testará a hipótese de que os métodos testados em SIPF

apresentam semelhança ao HPLC, que é o padrão ouro, e podem ser utilizados no
acompanhamento dos pacientes com PKU.

22
5. OBJETIVOS

5.1 OBJETIVO GERAL

Comparar um método desenvolvido In House (método A) e o Kit comercial de

Fenilalanina Neonatal (método B), em amostras de sangue impregnado em papel
filtro (SIPF) de pacientes com PKU acompanhados pelo SGM-HCPA, verificando
qual dos dois métodos é o mais semelhante ao HPLC e pode ser utilizado no
acompanhamento desses pacientes.

5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Analisar os níveis de Phe em amostras de SIPF de pacientes com PKU

utilizando o método fluorimétrico desenvolvido In House (método A);
 Analisar os níveis de Phe em amostras de SIPF de pacientes com PKU
utilizando o Kit comercial de Fenilalanina Neonatal (método B);
 Comparar os dois métodos verificando se há concordância dos níveis de
Phe encontrados com os níveis de Phe obtidos pele análise com o HPLC.

23
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

ACOSTA, P.B., YANNICELLI S. Ross Metabolic Formula System: Nutrition Support

Protocols, 4th ed. Columbus (OH) p.1-49 Ross Laboratories; 2001.

AMÂNCIO, F. A. M.; SCALCO, F.B.; COELHO, C. A.R. Diagnostic investigation of

inborn errors of metabolism in a university hospital. Brazilian Journal of medical
Pathology Laboratory. v. 43 (3), p. 169-174, 2007.

BARTUS, A et al. The influence of blood phenylalanine levels on neurocognitive

function in adult PKU patients. Metabolic Brain Disease. v. 33, p. 1609-1615, 2018

BÉLANGER-QUINTANA, A. et al. Up to date knowledge on different treatment

strategies for phenylketonuria. Molecular Genetics and Metabolism. v.104, p.s19-
s25, 2011

BLAU, N. Sapropterin dihydrochloride for phenylketonuria and tetrahydrobiopterin

deficiency. Expert Review of Endocrinology and Metabolism. v.5 (4), p.483-494,
2010

BLAU, N. Genetics of phenylketonuria: Then and now. Human Mutation. v.37 (6),
p.508-515, 2016.

BRASIL. Ministério da Saúde. Manual de Normas Técnicas e Rotinas

Operacionais do Programa Nacional de Triagem Neonatal, Brasília – DF, 2002

BURNETT, J.R. Sapropterin dihydrochloride (Kuvan/ Phenoptin), an orally active

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26
 - Duas amostras estavam alteradas apenas no HPLC e no método In House
(método A);
- Uma amostra estava alterada apenas no HPLC e no Kit comercial de
Fenilalanina Neonatal (método B);

Apesar de duas amostras testadas (2.2%) no método In House (método A)

(355,1 µmol/L e 573,6 µmol/L) não concordarem com o HPLC (373,8 µmol/L e 607,9
µmol/L respectivamente), o método In House (método A) foi o que melhor
representou a realidade metabólica destes pacientes, pois, no Kit comercial de
Fenilalanina Neonatal (método B), seis amostras (6.7%) das 89 testadas (343,0
µmol/L. 325,8 µmol/L. 598,4 µmol/L. 384,7 µmol/L. 831,0 µmol/L e 439,4 µmol/L) não
concordaram com o HPLC (364,5 µmol/L. 373,8 µmol/L. 613,2 µmol/L. 355,7 µmol/L.
520,0 µmol/L e 349,2 µmol/L respectivamente).

46
9. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Neste trabalho conseguimos avaliar dois métodos distintos para serem

utilizados no acompanhamento de pacientes com PKU. O método fluorimétrico
desenvolvido In House (método A) além de apresentar uma melhor correlação com o
HPLC que é considerado o padrão ouro, também mostrou melhor sensibilidade e
especificidade quando comparado ao Kit comercial de Fenilalanina Neonatal
(método B).

O uso do SIPF já faz parte da rotina dos laboratórios do SGM-HCPA tanto

para triagem como para o diagnóstico de doenças raras, através de técnicas
enzimáticas fluorimétricas e colorimétricas. A implementação de um novo método
como o padronizado neste trabalho auxiliará ainda mais o corpo clínico do hospital
no manejo do tratamento dos pacientes com PKU, além de facilitar o envio de
amostras para centros de referência.

47
10. PERSPECTIVAS FUTURAS

É importante lembrar que estudos com indivíduos hígidos, análises de

interferentes como hematócrito, uso ou não de heparina ou outro anti-coagulante,
testes de estabilidade de temperatura e coletas capilares devem ser feitos para
estabelecer valores de referência e para que possamos conhecer todas as possíveis
limitações do método.

Enfim, futuramente, esperamos poder acompanhar os pacientes com PKU

através do método desenvolvido In House além de adaptar outras técnicas para
acompanhamento de pacientes com outras aminoacidopatias como Tirosinemia e
Doença da Urina do Xarope do Bordo.

48
ANEXO 1 – CARTA DE APROVAÇÃO DE PROJETO

49
ANEXO 2 - STROBE
STROBE Statement—Checklist of items that should be included in reports of cross-sectional studies
Item On
No Recommendation page
Title and abstract 1 (a) Indicate the study’s design with a commonly used term in the 1-7
title or the abstract

(b) Provide in the abstract an informative and balanced summary of 1-7

what was done and what was found

Introduction
Background/rationale 2 Explain the scientific background and rationale for the investigation 11-19
being reported

Objectives 3 State specific objectives, including any prespecified hypotheses 22

Methods
Study design 4 Present key elements of study design early in the paper 28-29

Setting 5 Describe the setting, locations, and relevant dates, including 28-29
periods of recruitment, exposure, follow-up, and data collection

Participants 6 (a) Give the eligibility criteria, and the sources and methods of 28-29
selection of participants

Variables 7 Clearly define all outcomes, exposures, predictors, potential 28-29

confounders, and effect modifiers. Give diagnostic criteria, if
applicable

Data sources/ 8* For each variable of interest, give sources of data and details of 29-31
measurement methods of assessment (measurement). Describe comparability of
assessment methods if there is more than one group

Bias 9 Describe any efforts to address potential sources of bias 29-31

Study size 10 Explain how the study size was arrived at 28-29

Quantitative variables 11 Explain how quantitative variables were handled in the analyses. If 28-29
applicable, describe which groupings were chosen and why

Statistical methods 12 (a) Describe all statistical methods, including those used to control 28-29
for confounding

(b) Describe any methods used to examine subgroups and 28-29

interactions

(c) Explain how missing data were addressed 28-29

(d) If applicable, describe analytical methods taking account of 28-29

sampling strategy

50
 (e) Describe any sensitivity analyses 28-29

Results
Participants 13* (a) Report numbers of individuals at each stage of study—eg 31
numbers potentially eligible, examined for eligibility, confirmed
eligible, included in the study, completing follow-up, and analysed

(b) Give reasons for non-participation at each stage

(c) Consider use of a flow diagram

Descriptive data 14* (a) Give characteristics of study participants (eg demographic, 31
clinical, social) and information on exposures and potential
confounders

(b) Indicate number of participants with missing data for each

variable of interest

Outcome data 15* Report numbers of outcome events or summary measures 31

Main results 16 (a) Give unadjusted estimates and, if applicable, confounder- 31

adjusted estimates and their precision (eg, 95% confidence
interval). Make clear which confounders were adjusted for and why
they were included

(b) Report category boundaries when continuous variables were

categorized

(c) If relevant, consider translating estimates of relative risk into

absolute risk for a meaningful time period

Other analyses 17 Report other analyses done—eg analyses of subgroups and

interactions, and sensitivity analyses

Discussion
Key results 18 Summarise key results with reference to study objectives 31-33

Limitations 19 Discuss limitations of the study, taking into account sources of 31-33
potential bias or imprecision. Discuss both direction and magnitude
of any potential bias

Interpretation 20 Give a cautious overall interpretation of results considering 31-33

objectives, limitations, multiplicity of analyses, results from similar
studies, and other relevant evidence

Generalisability 21 Discuss the generalisability (external validity) of the study results 31-33

Other information
Funding 22 Give the source of funding and the role of the funders for the 33
present study and, if applicable, for the original study on which the
present article is based

51
52