Contagem celular – utilização de um

hematocitómetro

Biologia Molecular da Célula

1º Ano de Bioquimica
Ano Letivo 2020/2021
Docente: Manfred Josef Kaufmann
Discente: Edward Sousa
6 dezembro de 2020
 INTRODUÇÃO
As câmaras de contagem, comumente conhecidas por câmaras de
Neubauer, Fuchs Rosenthal ou ainda hematocitómetro são dispositivos de
contagem que permitem a determinação de concentrações de células numa
solução homogénea. Inicialmente desenvolvidas para a contagem de células
sanguíneas; hoje mantên o mesmo objetivo: determinar o número de células em
um volume específico de uma solução; porém tornou-se mais abrangente e
possui diversas aplicações nas áreas biológicas. Estes instrumentos são
padronizados, ou seja, possui grelhas de contagem tipo Neubauer, as quais
possuem uma área específica em milimetros quadrados (mm²); estes valores
de área variam em função da quadrícula a ser utilizada na contagem:

Figura 1 - Câmara de contagem tipo Neubauer (esquerda); quadrículas

pequenas (azul, referidas como Q.P.) e quadrícula média (amarela, referida
como Q.M.)

As quadrículas usadas na investigação foram as quadrículas pequenas e

médias que possuem, respetivamente áreas de 0,0025 mm² e de 0,0025 mm²
x 16. Ainda é necessário considerar que os hematocitómetros possuem um valor
de profundidade, apartir do qual será possível calcular o volume utilizado nas
contagens; este valor de profundidade corresponde a 0,1000 mm² (como
indicado na parte superior da cápsula).

Figura 2 – Hematocitómetro indicando a sua profundidade (0,1000 mm) e a área de cada

quadrícula pequena (0.0025mm²).

Com a finalidade de evitar derramamentos de solução, as cápsulas de

Neubauer incluem sempre uma lamela de vidro própria, que não deve ser usada
nem lavada separadamente do instrumento. Para a utilização correta desta
lamela, coloca-se superiormente sobre a cápsula e aplica-se por capilaridade
algumas gotas da solução de interesse com uma pipeta de Pasteur, tentando
sempre encher uniformemente as quatro ranhuras que o instrumento possui
(figura 3). Uma vez enchida com a solução, observa-se diretamente no
microscópio ótico.

Figura 3 – Método de enchimento das ranhuras do hematocitómetro por capilaridade.

A contagem de células através do método do hematocitómetro será mais

precisa quanto maior for o número de células contadas, de acordo com a
seguinte expressão conhecida como a distribuição de Poisson:

2𝑥√𝑛𝑥100% 200%
± = ±
𝑛 √𝑛
Onde n corresponde ao número total de células contadas num ensaio. Para
a realização da contagem foi necessário escolher um número de células que
permitissem uma estimativa fiável da concentração da solução; entre 400 e 500
células foram contadas pois permitiam uma contagem menos morosa e um
limite de confiança de 10/9%, como observada na seguinte figura (figura 4).

Figura 4 – À esquerda, tabela da relaçao entre o número de células contadas e os limites de

confiança (ao nível de significância de 95%). À direita, gráfica da relação entre o número de
células contadas e os limites de confiança (ao nível de significância de 95%).
 É possível então calcular o valor corrigido da concentração de células
(referido como erro ±cél/ml) num determinado volume atráves do produto entre
esse valor de concentração e o valor do erro calculado divido entre 100. Por
exemplo: se o valor da concentração for de 1,2x10^6 e o valor do erro de 9,95%;
1,2x10^6 x 0,0995 = 1,19x10^5).

MATERIAIS E MÉTODOS
O objetivo do presente trabalho laboratorial foi a determinação da
concentração (em células/mL) de uma solução aquosa contendo entidades da
alga Nannochloropsis gabitana; a escolha desta alga justifica-se pelo facto
dela ser uma espécie relativamente imóvel, o que facilita a sua contagem. As
análises foram realizadas por vários investigadores dividos em quatro turmas
diferentes, na disciplina Biologia Molecular da Célula, do 1º ano de
Bioquimica da Universidade da Madeira; os valores da média e os desvíos
padrão das concentrações obtidas pelas respetivas turmas foram registadas na
parte do tratamento de resultados do presente trabalho com a finalidade de
compará-las.
Para as observações, foi utilizada uma solução aquosa da alga
Nannochloropsis gabitana, a solução observada em PL1 e PL2 foi diferente
da solução usada por PL3 e PL4. Foi usada a técnica de enchimento das
ranhuras do hematocitómetro indicada na introdução do presente trabalho; logo,
foi colocado no microcópio ótico com uma ampliação de 400x. Para evitar
dupla contagem, foram contadas as células nas linhas superiores e nas
linhas à esquerda e omitidas as células que se encontravam nas linhas
inferiores e nas linhas à direita. Após da contagem e do registo dos resultados,
realizou-se o mesmo procedimento para um segundo análise; para tal foi
necessário limpar a cápsula e a sua respetiva lamela com agua destilada.
Alguns investigadores realizaram mais do que duas contagens

TRATAMENTO DE RESULTADOS
Tabela 1 – Tabela da média das concentrações corrigidas; os máximos e os mínimos
de cada observação e o desvio padrão.

PL1 (20 PL2 (16 PL3 (15 PL4 (18

observações) observações) observações) observações)
Data de hora Manhã da Tarde da Manhã da Tarde da
de realização sexta-feira, sexta-feira segunda-feira segunda-feira
04/12/2020 04/12/2020 30/11/2020 30/11/2020
Média das
concentrações 2,6𝑥106 1,7𝑥106 1,2𝑥106 9,08𝑥105
corrigidas
(células/mL)
Mínimo 1,1𝑥106 1,1𝑥106 5,08𝑥105 5,63𝑥105
(células/mL)
Máximo 8,9𝑥106 2,7𝑥106 3,2𝑥106 1,6𝑥106
(células/mL)
 Desvio padrão 1,86𝑥106 4,45𝑥105 8,22𝑥105 3,27𝑥105

Para PL1 os valores da média das concentrações corrigidas, o mínimo, o

máximo e o desvio padrão são respetivamente
𝟐, 𝟔𝒙𝟏𝟎 células/mL; 𝟏, 𝟏𝒙𝟏𝟎 células/mL; 𝟖, 𝟗𝒙𝟏𝟎 células/mL e 𝟏, 𝟖𝟔𝒙𝟏𝟎𝟔 .
𝟔 𝟔 𝟔

Para PL2 os mesmos valores eram respetivamente 𝟏, 𝟕𝒙𝟏𝟎𝟔 células/mL;

𝟏, 𝟏𝒙𝟏𝟎𝟔 células/mL; 𝟐, 𝟕𝒙𝟏𝟎𝟔 células/mL e 𝟒, 𝟒𝟓𝒙𝟏𝟎𝟓 .
Para PL3 os valores da média das concentrações corrigidas, o mínimo,
o máximo e o desvio padrão são respetivamente 𝟏, 𝟐𝒙𝟏𝟎𝟔 células/mL;
𝟓, 𝟎𝟖𝒙𝟏𝟎𝟓 células/mL; 𝟑, 𝟐𝒙𝟏𝟎𝟔 células/mL e 𝟖, 𝟐𝟐𝒙𝟏𝟎𝟓 . Para PL4 os mesmos
valores eram respetivamente 𝟗, 𝟎𝟖𝒙𝟏𝟎𝟓 células/mL; 𝟓, 𝟔𝟑𝒙𝟏𝟎𝟓 células/mL;
𝟏, 𝟔𝒙𝟏𝟎𝟔 células/mL e 𝟑, 𝟐𝟕𝒙𝟏𝟎𝟓.
É possível verificar que entre PL1 e PL2 e entre PL3 e PL4 existe uma
diminuição na concentração das células/mL para a mesma amostra.
Inicialmente, seria esperado encontrar um aumento nas populações devido à
divisão celular; mas os resultados obtidos contrariam a hipótese esperada. Isto,
pode ter sido devido a diversos fatores que limitavam a divisão celular da alga,
como a falta de alimento no meio, valores de temperatura não adequados,
pH, pouco oxigénio no meio ou então, devido a erros sistemáticos e
aleatórios na execução do método utilizado para a contagem.

CONCLUSÃO
O método do hematocitómetro mostrou ser uma técnica fiável não só para
realizar contagens apróximadas do número de células numa amostra; mas
também para a observação de fenómenos de crescimento ou diminuição de
ditas populações em curtos períodos de tempo. Este facto é de imensa
importãncia para diversas tarefas relacionadas com a microbiologia; no cultivo
de células por exemplo, é idóneo pois permite distinguir os tipos de células
em estudo e também uma avaliação da viabilidade celular; os fenômenos de
descréscimos das populações celulares envidenciadas no presente trabalho são
ainda, bons indicadores de condições inapropriádas para a manutenção destes
cultivos. Pela sua simplicidade e acessibilidade, o investigador considerou o
método do hematocitómetro como uma boa introdução na área de contagens
celulares; este trabalho serve então como exemplo e incentivo para
pretendentes na área cientifica, específicamente na área da biologia molecular
e da microbiologia.

REFERÊNCIAS
 Desconhecido, 2017, Como é realizada a contagem de células?,
encurtador.com.br/bcfqS, acedido em 05/12/2020.
 Desconhecido, Calcular a média de um grupo de números,
encurtador.com.br/uFOP8, acedido em 06/12/2020.
 Kaufmann, M., 2020, Contagem celular - utilização de um
hematocitómetro, Funchal.
 Seppe, J., 5.2 - Distribuição de Poisson, encurtador.com.br/nvP57,
acedido em 06/12/2020.