Métodos Microbiológicos

Rápidos para
Teste de Esterilidade –
Estratégias para Validação
e aprovação junto à
ANVISA
 Histórico para Aprovação do Método
Rápido para o Teste de Esterilidade
junto a ANVISA

6 anos
1º contato
com o MR Publicação do
PISA capitulo de
Farmacêutica Metodos
-Varias reuniões da ABRASP com ANVISA; Altenativos
na FB e
- Apresentações realizadas às Vigilancias Sanitarias Locais e aprovação do
ANVISA; MR pela
ANVISA
- Participação da UFG no projeto MR;
- 5 eventos da ABRASP com o tema MR;
- Participação da ALANAC/SINDUSFARMA;
- Várias exigências feita pela ANVISA até a aprovação do MR
Porquê implementar um MR?
Do ponto de vista técnico:
• Melhorar a qualidade dos testes;

• Maior sensibilidade (Ex.: Detecção dos VMNC);

• Resultados mais rápidos (redução de estoque de MP e PA);

• Ampliar a confiabilidade (uso de softwares para captação dos

dados);

• Tomada de ações corretivas mais precocemente.

Porquê implementar um MR?
Do ponto de vista financeiro:
Tempo de esterilidade

• Rápido recolhimento do produto em eventos de contaminação;

• Redução dos requisitos de inventário;

• Aumento da utilização do almoxarifado (redução de estoque de MP

e PA);

• Oportunidade de eficiência da cadeia de suprimentos;

• Redução do lead time de liberação do produto.

TECNOLOGIAS DISPONÍVEIS
Métodos Baseados na
Métodos Baseados no Métodos Baseados na Análise dos
Crescimento Viabilidade Direta Componentes
Celulares
Microscopia de
Métodos eletroquímicos Perfil de ácidos graxos
eplifluorescencia
Espectroscopia de
Infravermelho com
Detecção da produção
Citometria de fluxo Transformata de
ou consumo de CO2
Fourrier

Espectroscopia de
Bioluminescência de Citometria de fase
Massa
ATP sólida
TECNOLOGIAS QUE PODEM SER UTILIZADAS
PARA O TESTE DE ESTERILIDADE

Bioluminescência de ATP

Celsis AKuScreen™ Milliflex Rapid Sterility Test

 TECNOLOGIAS QUE PODEM SER
UTILIZADAS PARA O TESTE DE ESTERILIDADE

Detecção da Produção e Consumo de Dióxido

de Carbono (colorimétrica/fluorescência)

Bact/Alert 3DTest BACTEC

Métodos Baseados na Viabilidade Celular
Citometria de Fase Solida +
Microscopia de Epifluorescência
 Tempo de
Principio da Tecnologia Equipamento
liberação
Celsis AKuScreen™

Bioluminescência de ATP Milliflex Rapid Sterility Test

 Método aprovado pela ANVISA em 2016; 4-5 dias

Detecção da Produção e BacT/ALERT®
Consumo de CO2
 Resultados BDaté
obtidos em BACTEC
3 horas.FX®
Citometria de Fase Solida ChemScanRDI® 3 horas

*O equipamento Scan/RDI apesar de ser o que apresenta uma resposta em menor tempo, não se aplica para
todos as formas farmaceuticas
 ETAPAS PARA
IMPLEMENTAÇÃO DO
METODO RÁPIDO PARA O
TESTE DE ESTERILIDADE
 1. Escolha da Tecnologia
- Realizar a prova de conceito: Verificar se a
tecnologia é compatível com o uso
pretendido.

- Ficar atento com relação a

representatividade da amostra x tecnologia.
 2. Seleção do produto
- O produto deve ser compatível com a
tecnologia;

- O produto a ser analisado não pode

interferir no sistema de detecção (deve ser
feita a redução da possível interferência por
meio da adição de etapas no preparo da
amostra). Ex.: uso de materiais
descartáveis, diluentes, inibidores.
3. Estudo de viabilidade
 Implementação da nova tecnologia

Equipamento Estrutura
Física
Avaliação do
custo final da
análise pelo
Mão de obra
MR e MT.
Consumíveis
especializada
 4. Documentação

Numero TÍTULO
01 Plano de Validação de Métodos Microbiológicos Rápidos
02 Protocolo de Validação do produto Cl.de Sódio 0,9%
03 Relatório de Validação do produto Cl.de Sódio 0,9%
04 Protocolo Estatístico

05 Relatório Estatístico
 4. Documentação
ANEXO TÍTULO
01 Anexo I – Avaliação Estatística
02 Anexo II – Qualificação de Desempenho I (QD I)
03 Anexo III – Qualificação de Desempenho II (QD II)
Anexo IV – Resultado da Certificação dos Níveis de Contaminação
04
das Cepas Padrão
05 Anexo V- Estudo de Viabilidade realizado pela AES/BIOMERIEUX
06 Anexo VI - Estudo de Robustez realizado pela AES/BIOMERIEUX
07 Anexo VII – Qualificações do Equipamento ChemScan RDI
08 Anexo VIII- Certificados de Reagentes/ Cepas / Meios de Cultura
09 Anexo IX- Certificado de Treinamento
10 Anexo X – Certificado de Validação do Método Rápido
5. Planejamento experimental

• Objetivo da validação

• Definição da tecnologia

• Definição do produto

• Descrição da Metodologia
5. Planejamento experimental
• Definição dos parâmetros:

Teste de esterilidade
Parâmetros qualitativos (ausência/presença)

Especificidade
Limite de Detecção
Robustez
5. Planejamento experimental
• Definição da quantidade de testes:

Quantidade de Lotes 3
Quantidade de Micro-organismos 8
Níveis de concentração 3
Replicatas 7
5. Planejamento experimental
• Volume de solução a ser amostrada/unidade
5. Planejamento experimental
• Quantidade de unidades a serem analisadas / lote
5. Planejamento experimental

• Avaliação estatística
Case de sucesso
Produto alvo:

• Solução de Cloreto de Sódio 0,9% Injetável

 Micro-organismos
Aspergillus brasiliensis NCPF 2275 (ATCC 16404)* Compendial
MICRO-ORGANISMOS
Bacillus :
subtilis NCTC 10400 (ATCC 6633)* Compendial
Candida albicans NCPF 3179 (ATCC 10231)* Compendial
Clostridium sporogenes NCTC 12935 (ATCC 11437)* Compendial
Pseudomonas aeruginosa NCTC 12924 (ATCC 9027)* Compendial
Staphylococcus aureus NCTC 10788 (ATCC 6538)* Compendial
Micrococcus luteus- “in house” ** “in house”
Staphylococcus epidermidis- “in house” ** “in house”

*Bioball MultiShot 550UFC

** Biocarga Pré-esterilização
 MÉTODO DE CITOMETRIA DE FASE SÓLIDA (CFS)

Amostra (Pool de 10 unidades)

Filtração em membrana 0,4µm – 25mm

Injeção do Inóculo Lavagem da membrana Fluido I

0,5 UFC /mL 5 UFC / mL,
2,0 UFC/mL 50 UFC/mL
Adição da Sol CSE+CSM
(Contra coloração)
Enriquecimento
(Sol. Tampão A16)
Incubação de 2
horas 30 ±2ºC
Marcação
(Sol.B16+V6)
Incubação de 45 min.
30±2ºC
Leitura no Equip. ChemScan RDI

Confirmação da Detecção pelo MEF

 MÉTODO DE FILTRAÇÃO EM MEMBRANA (FM)

Amostra (Poll de 10 unidades)

Filtração em membrana 0,45µm-50mm

Injeção do Inóculo
0,5 UFC /mL 5 UFC / mL, Lavagem da membrana Fluido I
2,0 UFC/mL e 50 UFC/mL

Incubação Incubação
Caldo Caseína-soja Fluido Tioglicolato
22,5 ± 2,5°C 32,5 ± 2,5°C

14 dias

Leitura

Fonte: BRASIL, 2010 / USP 37, 2013.

 Especificidade
1º Etapa: Avaliação do desempenho do equipamento
ChemScan RDI frente aos micro-organismos
Viáveis e Não Viáveis

8 Micro-organismos
50 UFC/mL

7 replicatas de cada 7 replicatas de cada

Micro-organismo Micro-organismo
Viável Não Viável
 Especificidade
2º Etapa: Avaliação dos micro-organismos frente ao produto
Cloreto de Sódio 0,9% no equipamento ChemScan RDI

8 Micro-organismos nas concentrações de 0,5

UFC/mL; 2,0 UFC/mL; 5,0 UFC/mL; 50 UFC/mL

7 replicatas de cada Micro-organismo para cada

concentração

3 lotes do produto
 Especificidade
3º Etapa: Avaliação do produto Cloreto de Sódio 0,9% Não
Estéril no equipamento ChemScan RDI

3 lotes do produto

7 replicatas de cada lote

 Limite de Detecção
Avaliação comparativa dos métodos de Citometria de
Fase Sólida e de Filtração em Membrana simultaneamente

8 Micro-organismos nas concentrações de 0,5

UFC/mL; 2,0 UFC/mL; 5,0 UFC/mL; 50 UFC/mL

7 replicatas de cada Micro-organismo para

cada concentração

3 lotes do produto
 Robustez
4 Micro-organismos: A. brasiliensis, S.aureus ,
B.subtilis e P.aeruginosa na concentração de
2 UFC/mL

7 replicatas de cada Micro-organismo

1 lote do produto
 Robustez
Variações

2ª) Variação do
3ª) Verificação
1ª) Diferentes volume da 4ª)Verificação
da
tempos de solução de da
estabilidade
leitura da solução de pré estabilidade
de 48 horas
membrana após marcação de 4 horas da
da Solução
o preparo: ChemSol A16 - Solução V6 +
CSM+CSE
5 minutos AES Chemunex: B16
(Sol. de
7 minutos 550 µL (Sol. de
Contra
20 minutos 530µL Marcação)
Coloração)
570µL
Monitoramento Ambiental da Sala de Testes

AR

SUPERFÍCIES

PESSOAS
 Avaliação Estatística

Modelo de
Regressão Logística
Avaliar a
sensibilidade e a
Teste de Qui-
não inferioridade
quadrado
entre os Métodos
de CFS e FM
Teste de não
inferioridade
Artigo científico