Equipe:

Jéssica Furtado
Victor Teixeira
Juliana Noronha

Prática de Biofísica
Espectrometria de Massas

Biotecnologia

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 1. Introdução

A espectrometria de massa é uma ferramenta indispensável para a

determinação da massa de moléculas em geral. Nessa técnica, moléculas em
fase gasosa previamente ionizadas são introduzidas em um campo elétrico
e/ou magnético, apresentando diferentes percursos através desse campo em
função de suas razões massa por carga (m/z), propriedade que permite a
dedução de suas massas com altíssima precisão.

Há vários modelos de espectrômetros de massa, cada um com

características próprias. As principais variações estão presentes nas fontes de
ionização e nos analisadores de massa.
As principais fontes de íons são: matrix-assisted laser desorption/ionization
mass spectrometry (MALDI-MS) e electro-spray ionization mass spectrometry
(ESI-MS).
Na fonte do tipo MALDI, as proteínas são misturadas a uma matriz que
absorve luz ultravioleta. A matriz contendo as amostras é bombardeada por
curtos pulsos de laser, absorvendo energia do laser e transferindo,
posteriormente, esta energia para os analitos. Este mecanismo de
transferência de energia da matriz para os analitos ainda não está totalmente
desvendado. Os íons carregados, agora em fase gasosa, são direcionados
diretamente através de um campo elétrico para o analisador de massas.
Na fonte do tipo ESI, macromoléculas em solução são passadas
diretamente para a fase gasosa. A solução contendo os analitos é introduzida
ao espectrômetro através de uma agulha mantida em alto potencial elétrico
(cerca de 3 kV), dispersando a solução em uma fina bruma de microgotas
carregadas. O solvente que envolve as macromoléculas evapora rapidamente
causando uma explosão da gota em reação à densa distribuição de cargas na
superfície das microgotas. Com a evaporação total do solvente as
macromoleculares carregadas são introduzidas ao analisador na fase gasosa.
As cargas acrescentadas durante a passagem pela agulha dão carga adicional
as macromoléculas, ou seja, cada molécula tende a ser carregada por dois ou
mais íons. Dessa forma, cada pico visualizado no espectro é resultado de uma
razão m/z, na qual cada molécula é carreada por um número diferente de
cargas (prótons, no caso de análise em modo positivo).

A espectrometria de massa também pode ser usada para seqüênciar

polipeptídios curtos. Para isso utiliza-se uma técnica chamada de tandem MS

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ou MS/MS. Em análises do tipo MS/MS, os íons formados são induzidos à
fragmentação por alta energia. Os dois principais processos de fragmentação
são a fragmentação induzida por colisão (Collision Induced Fragmentation -
CID) e o decaimento pós-fonte (Post Source Decay - PSD). Em ambas as
análises as amostras são injetadas em um aparelho que é composto
basicamente por dois analisadores de massa em série. O primeiro analisador
de massa é usado para selecionar um íon especifico recebido pela fonte de
ionização. Na fragmentação do tipo CID, este íon é direcionado para a câmara
de colisão, onde a amostra é fragmentada pelo impacto de alta energia com um
gás inerte (o argônio, por exemplo). Na fragmentação por decaimento pós-fonte
(PSD), que é realizada apenas em fonte do tipo MALDI, a matriz contendo o
analito é bombardeada por pulsos de laser de alta energia induzindo a
formação de íons meta-estáveis, ou seja, com alta energia interna que se
fragmentam ao longo do tubo de vôo. O segundo analisador de massa mede,
então, as razões m/z de todos os fragmentos carregados oriundos da câmara
de colisão, gerando um espectro bastante complexo. Na fragmentação de uma
cadeia polipeptídica, a diferença entre picos adjacentes identifica o resíduo
aminoácido que foi perdido em cada caso, revelando então a seqüência do
peptídeo investigado. Os fragmentos obtidos podem ser formados pela
clivagem no lado N-terminal (íons b) ou no lado C-terminal (íons y),
dependendo da localização da carga no fragmento molecular.

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2. Objetivos

A realização desta prática teve como objetivo revisar alguns

conceitos como massa média e massa monoisotópica, bem como,
realizar o seqüenciamento de uma cadeia polipeptídica através do uso
da espectrometria de massas.

3. Parte Experimental
No primeiro experimento, houve a ionização da mioglobina de cavalo
para determinação da massa molecular. Foi preparada uma solução de
10 ρMol da proteína de interesse em uma solução com 50 % de
acetonitrila e 0,2 % de ácido fórmico. A solução foi centrifugada e
infundida no equipamento através da fonte de ionização e seu espectro
foi obtido.

No segundo experimento, foi preparada uma solução de 200 fMol de

Fibrinopeptídeo B humano em um solução contendo 50 % de acetonitrila
e 0,2 % de ácido fórmico. A solução foi centrifugada e infundida no
equipamento através da fonte de ionização para que por meio de seu
espectro o peptídeo pudesse ser seqüenciado.

4. Resultados e Discussão
Acerca dos dados obtidos foram propostos os seguintes
questionamentos:

Com base no espectro obtido no primeiro experimento, calcular a massa

molecular da proteína em estudo. Tal valor refere-se à massa média ou
a massa monoisotópica? Justificar as respostas e descrever a diferença
entre as duas medidas.

Calcular a massa molecular da proteína em estudo.

Com base no espectro obtido através do segundo experimento,

determinar a sequência do peptídeo.

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Com base no primeiro espectro obtido (acima), constatamos a obtenção
das massas monoisotópicas (relações massa/carga que possuem o
mesmo número de prótons, entretanto, divergem nesta relação em
virtude da presença de isótopos dos átomos que compõem as
moléculas analisadas). A massa média seria a média da relação
massa/carga destas massas monoisotópicas.

Para se encontrar a massa da proteína deve-se descobrir,

primariamente, a carga desta proteína (n).

Para isto, podemos utilizar a relação:

N2 = (M1 – H)/ (M2 – M1)

Utilizando o íon 893,1649 como referência 2 e o íon 846,5631 como

referência 1, temos:

N2 = (848,5631 – 1)/ (893,1649 – 848,5631)

N2 = +19

Se a relação m/z é igual a 893,1649 e a carga é igual a +19, temos:

m/z = 893,1649
m = 893,1649 X 19
m = 16970,1331 Da

Com base no segundo espectro obtido, pode-se determinar a sequência

da cadeia polipeptídica, utilizando-se as massas monoisótópicas dos

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 aminoácidos disponíveis na literatura. Para esta determinação, devemos
encontrar a diferença de massa/carga dos picos obtidos e comparar
com a dos aminoácidos.

A sequência obtida foi:

N-D-N-E-E-G-F-F-S-A-C.

5. Conclusão

A partir dos resultados observados, conclui-se que é possível determinar

a massa molecular de uma proteína através do seu espectro de massa,
bem como, obter a sequência de aminoácidos de um peptídeo utilizando
a espectrometria de massa como ferramenta.

6. Referências Bibliográficas

a) DOS SANTOS, D.M. Caracterização do veneno de Lycosa

erythrognatha e purificação de uma fração com atividade antibacteriana
e inseticida. Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil. 2004.
b) PAVIA, D. L., et al. Introduction to Spectrometry. 4ª. Belmont :
Brooks/Cole, 2009
c) BIBIANA, M.S. Fundamentos em Análise Proteômica - Espectrometria
de Massas Sequencial (PSD-MS). 2004.