Replicação do DNA

Mitose / Meiose
 Ciclo celular
• A replicação do DNA
é regulada
temporalmente
• Fase S do ciclo
celular
• Checkpoints do ciclo
celular
• Ciclinas
Como acontece a síntese do
DNA?
 Meselson-Stahl experiment
• 1957
• Cresceram E. coli em meio
com N-15 e depois voltaram
pra N-14
• Purificação do DNA das
bactérias
• Três tipos de DNA
– N-15 + N-15
– N-15 + N-14
– N-14 + N-14
• Ao aquecer o N-15 + N-14 e
separar as fitas ficava claro
que uma fita continha N-15 e
outra N-14
Replicação semi-conservativa
Origens de replicação
• Locais com um
contexto de
sequência específico

• Ligam proteínas
específicas

• Quando acionadas,
essas proteínas
permitem o início da
replicação
Origens de replicação
Replicação
• DNA Polimerase III
• Sentido 5’ → 3’
• Nucleotídeos 3P
são adicionados
– Liberação de
Pirofosfato

http://207.207.4.198/pub/flash/24/menu.swf
 Primase
• Ribonucleoproteína
• Liga-se à helicase em
procariotos formando o
chamado primossomo
• Sintetiza um primer de
RNA contendo
aproximadamente 11
bases; fornece 3’ OH
• DNA polimerase lenta e
sujeita a erros
• Evita a progressão da
forquilha uma vez que a
fita líder anda mais rápido
 Micrografia, bolha de
replicação

Forquilhas de replicação
Forquilha de replicação
 Replicação das fitas
• Fita líder
– Primase age uma vez

• Fita retardada
– Primase age várias vezes
– 1967, Fragmentos de Okasaki
Okazaki R, Okazaki T, Sakabe K, Sugimoto K. Mechanism of DNA replication
possible discontinuity of DNA chain growth. Jpn J Med Sci Biol. 1967
Jun;20(3):255-60
 Primase na fita retardada
• Deslocamento da forquilha de replicação
• Primase faz primer
 Direções de
replicação na Forquilha
 Desenovelamento do DNA
• Retirada das histonas
• Proteínas de ligação a fita simples (SSBPs)
• DNA helicase
– Quebra pontes de H

• DNA topoisomerases
– Tiram a tensão
 Forquilha de replicação

Polaridade da síntese define fitas

líder e retardada (descontínua)
 DNA polimerase
• Enzimas que catalisa a reação
de síntese do DNA
• Adiciona nucleotídeos tri-
fosfato à extremidades 3’OH
livre
• Alongamento da cadeia de
DNA sempre é feito na direção
5’>3’ (endonuclease 5’>3’)
• Incapaz de fazer DNA do zero
(precisa ter extremidade 3’OH
livre)
• Possui mecanismo de
correção de erros
(exonuclease 3’>5’)
 Tipos de DNA polimerase
• DNA polimerase I
– Descoberta em 1956 (Kornberg pai)
– Função precisa descoberta apenas em 1969: remove
o primer de RNA da fita descontínua
• DNA polimerase III
– Descoberta em 1970 (Kornberg filho)
– Principal enzima que realiza a replicação em
procariotos
• DNA polimerase II
– Lenta, envolvida em reparo do DNA
 DNA Replication
• DNA Pol precisa de um
molde inicial

• Primase: gera um molde

de RNA complementar

• A DNA Pol III agora é

capaz de adicionar bases
à extremidade 3’OH
Eliminação
dos
fragmentos
de Okasaki

DNA Pol I
Visão geral

Repare na
posição do
primer de
RNA
 Reparo pela
Polimerase
• Mecanismo de verificação
(Proof-reading)

• DNA-polimerase possui
– Uma atividade de
polimerização 5’→ 3’
– Uma atividade de
exonuclease 3’→ 5’
 Reparo pela
Polimerase
• Mecanismo de verificação
(Proof-reading)

• DNA-polimerase possui
– Uma atividade de
polimerização 5’→ 3’
– Uma atividade de
exonuclease 3’→ 5’
Proofreading (revisão)
 DNA
Repair
• Checagem de
pareamento
incorreto
(eucariotos)

• Proteínas
especiais para
reparo do erro
E as extremidades dos cromossomos?
 Conclusões

Replicação semi-conservativa
Bolha de replicação avança em duas direções
Fita líder e fita retardada
Helicases e topoisomerases desenrolam o DNA
Primase faz o primer
DNA polimerase III, DNA polimerase I
DNA ligase
Telomerase
Replicação em E. coli
I
N
I
C
I
A
Ç
Ã
O
ALONGAMENT
O

Síntese
dos
fragmentos
de Okasaki
T
E
R
M
I
N
A
Ç
Ã
O
Replicação em
eucariotos
Reparo do DNA
 Mutações tautoméricas
Watson e Crick observaram o movimento de átomos de Hidrogênio nas
purinas e pirimidinas, resultando em formas menos estáveis das bases.

A pode parear com C e T pode parear com G

A-T

A-T

A-T
A-T
A-T

A*-C

G-C
 Lesões induzidas por agentes mutagênicos

Dímeros de Timina (exposição a luz UV)

Alquilação (G - 06 metilguanina - pareia com T) - nitrosaminas

Tranferência de grupamentos metila ou etila para os sítios reativos das

bases e dos fosfatos da cadeia de DNA

Adição de grupamentos químicos volumosos à molécula de DNA

(Reação com carcinógenos)
Lesões induzidas por agentes mutagênicos

Alquilação
(Guanina - 06 metilguanina)

Dímeros de Timina
Brometo de etídio
MUTAÇÕES NO HOMEM
AT por TA

HbA- ÁCIDO GLUTÂMICO

HbS- VALINA
 MECANISMOS
DE REPARO DO
DNA
 Mecanismos de reparo
Reversão direta da lesão no DNA
Fotoreativação
Reparo de bases alquiladas

Reparo por excisão

Excisão de bases
Excisão de nucleotídeos
Reparo de malpareamentos

Reparo pós-replicação
Reparo por recombinação
Reparo sujeito a erros
 Reparo por fotorreativação
Remoção dos dímeros de pirimidina formação UV

Enzima fotoliase se liga ao dímero e pela absorção de luz converte o dímero

em monômeros de pirimidina
 Reparo por fotorreativação

Fotoliase
 Reparo de bases alquiladas

O6-metilguanina-
metiltransferase

Remoção do
grupamento metila e
transferência para a
enzima

Não há meios de recuperar a enzima

metilada.
 Reparo por excisão de
bases
Desaminação da citosina em uracila

Uracil-DNA-glicosilase
AP endonuclease
DNA polimerase I
DNA ligase
 Reparo por excisão
de nucleotídeos

Proteínas UvrA, UvrB,

UvrC e UvrD: identificam,
4 nt
separam e clivam a fita de 8 nt

DNA

DNA polimerase I

DNA ligase
 Reparo pós-replicação

Não remove a lesão, mas possibilita a

continuidade da replicação.

Reparo por recombinação homóloga

 Recombinação Homóloga

• É o processo que resulta na troca

de material genético entre dois
genes homólogos
Mecanismo geral
de
recombinação
homóloga
 Reparo por
recombinação
pós-replicação
 Reparo sujeito a erros

Usado em condições extremas: perda de um

par de bases

Uma das 4 bases é inserida no local lesado,

mesmo não tendo a informação molde

Mecanismo de mutação próprio

Reparo de Despareamento
Mecanismo de reparo por excisão de
nucleotídeos em E.coli e humanos