AVALIAO DA METODOLOGIA ANALTICA PARA DETERMINAO DE -CAROTENO EM MACARRO FORTIFICADO1

Maricilda R. PEREIRA2, J. AMAYA-FARFAN3, D.B. RODRIGUEZ-AMAYA3

RESUMO O -caroteno sinttico pode ser adicionado tecnologicamente ao macarro na forma de soluo oleosa, emulses dispersveis em gua ou sob a forma de esferas coloidais, com a finalidade de melhorar a sua cor e valor vitamnico. Todavia, a inexistncia de uma metodologia confivel e especificamente testada para a extrao e dosagem do caroteno em macarro enriquecido dificulta a avaliao da possvel relevncia nutricional da medida. O presente trabalho compara dois mtodos de extrao para produtos secos (LIVINGSTON, 1986 [mtodo I] e RITTER & PURCELL, 1981 [mtodo II]) e um para verduras e frutas (RODRIGUEZ-AMAYA et

al., 1976 [mtodo III]), quanto eficincia de extrao do -caroteno no macarro cru e cozido. A matria-prima utilizada foi um lote de macarro produzido com quantidade conhecida de -caroteno, na forma de suspenso oleosa a 30%. Os resultados mostraram uma taxa de recuperao para caroteno de 89 e 84% pelos mtodos III e I, respectivamente, enquanto que o mtodo II apresentou recuperao de apenas 44%. Conclue-se que, tanto os mtodos I e III podem ser usados para quantificar o -caroteno em macarro enriquecido. Por outro lado, a separao dos produtos de degradao do caroteno permite calcular o valor vitamnico real do macarro cru e cozido. A superestimao dos valores vitamnicos, quando tais produtos no foram excludos, foi de 24% para o macarro cru e 25% para o cozido. Palavras-chave: -caroteno, valor vitamnicoA, corante, macarro.

SUMMARY EVALUATION OF THE ANALYTICAL METHODOLOGY FOR THE DETERMINATION OF -CAROTENE IN FORTIFIED PASTA. Synthetic -carotene can

be technologically added to macaroni either in the form of an oily solution, water-dispersible emulsions or colloidal beadlets with the objective of improving its color and vitamin-A value. The lack of a reliable and tested methodology specifically for the extraction and quantification of -carotene in enriched pasta prevents accurate evaluation of the possible nutritional significance of this measure. The present work compares two methods of extraction for dry products (LIVINGSTON, 1986 [method I] and RITTER & PURCELL, 1981 [method II]) and one for fruits and vegetables (RODRIGUEZ-AMAYA et al., 1976 [method III]), with respect to their extraction efficiency of -carotene from both raw and cooked spaghetti. The raw material used for the experiment was a lot of spaghetti made with a known amount of -carotene in the form of an oily 30% suspension. Results showed that percent recoveries for the carotene were 89 and 84 for methods III and I, respectively, whereas with method II only 44% recovery was attained. It can be concluded that both methods I and III can be used to determine -carotene in enriched spaghetti. In addition, separation of the carotenoid degradation products is necessary for calculating the real vitamin A value in both raw and cooked pasta. Overestimation of the vitamin A values if degradation products were not separated was 24 for the raw and 25% for

the cooked spaghetti. Key words: -carotene, vitamin-A value, colorant, spaghetti fortification

1 - INTRODUO
A natureza da amostra uma considerao importante na escolha da metodologia analtica a ser utilizada na determinao de carotenides provitamnicos A. No caso de amostras secas, a extrao uma das principais fontes de erro. Para este tipo de amostras tem sido proposta uma hogeneizao em liquidificador, seguida de agitao com gua e etanol, antes da sua extrao com ter de petrleo (9). Outro mtodo (7) prope um processo de agitao a frio em substituio da extrao e saponificao a quente sugerida no mtodo da AOAC (1), como alternativa para a extrao de xantofilas de plantas secas. J um terceiro mtodo (10), desenvolvido para frutas e verduras frescas, consiste em homogeneizar a amostra diretamente com acetona e filtrar em funil Buchner repetidas vezes, at se obter extrato incolor. RODRIGUEZ-AMAYA (11) recomenda que, independente do mtodo a ser escolhido, alguns requisitos devem necessariamente ser preenchidos: O mtodo deve separar ou remover os carotenides no provitamnicos interferentes, separar as provitaminas e quantific-las individualmente. As anlises devem ser cuidadosas e rpidas, uma vez que a cadeia polinica insaturada do -caroteno muito sensvel ao oxignio, luz e ao calor. Alm disso, as caractersticas estruturais da molcula se modificam na presena de lcalis e

cidos; logo, as amostras e extratos de carotenides devem sempre ser protegidos da luz e estocados por tempo mnimo, na ausncia de oxignio (em vcuo ou em atmosfera de N2 ou Ar) e sob congelamento (3). O macarro colorido com -caroteno pode ser considerado como fortificado ou nutrificado. Atualmente, na comercializao usa-se o qualificativo de "vitaminado", quando de fato, o produto recebe a provitamina em quantidades que, segundo o rtulo, devem fornecer entre 2000 e 4000 UI de vitamina A por kg. Sendo que a fortificao de alimentos industrializados se apresenta como um dos meios de combate deficincia de vitamina A, reconhecida em certas regies do territrio brasileiro, de interesse nutricional e tecnolgico avaliar a eficcia desta tcnica aplicada ao macarro. A avaliao deve incluir a monitorao da quantidade do nutriente adicionado, desde a fabricao at o preparo e consumo a nvel domstico, para o qual necessrio contar com um mtodo analtico com preciso e exatido que o faam confivel. Apesar dessa necessidade, na literatura no foi encontrada uma metodologia analtica especfica para a determinao de -caroteno em massas alimentcias enriquecidas. Existe um trabalho sobre a estabilidade do -caroteno em massas vitaminadas (12), mas no foi encontrada descrio da metodologia ou referncia e validao da mesma. Nesse trabalho concluiu-se que o -caroteno exercia apenas uma funo de corante. O objetivo do presente trabalho foi comparar trs mtodos de extrao existentes e estabelecer um procedimento analtico completo para a determinao exata e precisa da provitamina A em macarro.

2 - MATERIAL E MTODOS
2.1 - Material Dois tipos de espaguete foram utilizados para o estudo: um de tipo comercial e outro produzido em laboratrio, com farinha de trigo especial (Braswey S.A., Ind.e Com.), acrescida de suspenso oleosa a 30% de -caroteno (lote 204016, fornecido pela Hoffmann-La Roche, Ltd.), em quantidade suficiente para uma concentrao final de 4,75 mg/kg de produto. A suspenso comercial do pigmento foi pesada e diluda em leo de soja (24C) para 1,9mg de -caroteno/ml de leo e, finalmente preparado premix, contendo 9,5mg, por 100g. 2.2 - Fabricao A elaborao do macarro compreendeu os seguintes passos: mistura do premix farinha, hidratao e homogeneizao, extruso e moldagem, seccionamento, secagem, embalagem. A farinha foi hidratada at 30% de umidade, como recomendado por BANASIK (2). O trabalho da massa foi realizado no misturador do extrusor, o qual era composto de um eixo duplo de ps entrepostas. A massa era conduzida ao cilindro de extruso sob a ao de rosca sem-fim, com o uso de vcuo. A moldagem foi determinada por orifcios de 3mm de dimetro, recobertos com Teflon. Aps a moldagem, o espaguete foi recortado no comprimento de 50cm e estendido sobre grades de bastes de madeira. Para efetuar a secagem, as grades foram introduzidas em secador de paredes de madeira e portas de acrlico, com circulao forada de ar e temperatura (45C) e umidade (95 a 65%) controladas. O espaguete produzido foi embalado em sacos de polietileno (0,2mm) e recobertos com papel alumnio por dois dias, quando se iniciaram as anlises. 2.3 - Avaliao do macarro

Tempo de cozimento, aumento de peso, aumento de volume e perda de slidos solveis foram parmetros observados para determinar a qualidade do macarro produzido no laboratrio (8). Para o tempo de coco de 11 min., at atingir o ponto "al dente", o macarro mostrou um aumento mdio de peso de 185,5%, aumento mdio de volume de 356% e perda mdia de slidos de 13,8%. Excetuando a perda de slidos solveis, que foi acima do esperado, a qualidade geral do macarro pode ser considerada boa (4). 2.4 - Mtodos de extrao do -caroteno Foram avaliados os trs mtodos de extrao, abaixo descritos, a fim de definir as suas eficincias. 2.4.1 - Mtodo I (LIVINGSTON, 1986 [8]) Este mtodo consiste na saponificao e extrao simultnea a frio. Com a ajuda de agitador magntico, as amostras cruas e cozidas foram saponificadas com KOH a 40% (1ml:1g), extradas com hexano-acetona-etanol (10:7:6) e mantidas sob agitao durante uma hora. Aps essa operao, gua foi adicionada (0,5ml/g, somente para amostras cruas), o sistema agitado por 30min, adicionado o hexano e agitado por mais 5min. A barra magntica foi removida e adicionou-se 20ml de Na2SO4 a 10%, em gua, com agitao vigorosa durante 1min. O extrato foi mantido no escuro por 1hr, filtrado em funil Buchner e lavado vrias vezes com gua destilada em funil separatrio. A seguir, o extrato foi evaporado, at prximo da secura, efetuando-se ento a transferncia para ter de petrleo e aferindo-se o volume em pequenos bales volumtricos. 2.4.2 - Mtodo II (RITTER & PURCELL,

1981 [9]) No mtodo II, as amostras foram agitadas, com 50ml de gua e, a seguir, com 50ml de etanol em liquidificador de copo de ao inoxidvel, por aproximadamente quinze segundos, cada vez. No caso do macarro cozido, a adio de gua foi omitida. Transferncia quantitativa para funil separatrio de 500ml foi obtida com a mistura gua-lcool (1:1). A extrao se deu por agitao desta mistura com ter de petrleo (cerca de 80ml), sendo a fase gua-lcool colocada num outro funil separatrio, onde a extrao foi repetida at no se obter mais extrato colorido. Os extratos em ter de petrleo foram reunidos e lavados por trs vezes com gua destilada. O extrato global foi seco com sulfato de sdio anidro, concentrado em rotoevaporador e o volume acertado em balo volumtrico. 2.4.3 - Mtodo III (RODRIGUEZ-AMAYA et al., 1976 [10]) Aps 30min de hidratao da amostra crua (1,5ml de gua/g), procedeu-se extrao, com acetona em liquidificador de copo de ao inoxidvel. O homogeneizado filtrado em funil de Buchner e a extrao repetida at o resduo e o filtrado se mostrarem incolores. A partio para ter de petrleo foi realizada a seguir em funil de separao. Por fim, o extrato foi concentrado em rotoevaporador e seu volume aferido em balo volumtrico. 2.5 - Cromatografia em Coluna Clssica Com o objetivo de separar os produtos de degradao do caroteno, os extratos obtidos pelos trs mtodods foram cromatografados em coluna clssica (aberta). A coluna,

contendo mistura homognea de MgO/Hiflosupercel (1:2), foi empacotada com o auxlio de vcuo. As amostras foram primeiramente eludas com ter de petrleo, depois com ter etlico em ter de petrleo a 4%, para separar a frao caroteno e, a seguir, com concentraes crescentes de acetona em ter de petrleo (8, 15, 20, 30, 40 e 100%), para separar as demais fraes. As fraes eludas, contendo acetona, foram lavadas trs vezes em funil separatrio para remoo da acetona, concentradas e completados os seus volumes. 2.6 - Quantificao do -caroteno A quantificao do extrato total foi feita, em primeira instncia, supondo que se tratasse de todo-trans--caroteno; isto , utilizando-se a absortividade especfica de 2592, em ter de petrleo (5) e a absorvncia no comprimento de onda mximo do espectro visvel (espectrofotmetro Beckman DU70). 2.7 - Cromatografia em Camada Delgada e Reaes Especficas As bandas isoladas, reduzidas a volume mnimo, foram aplicadas em placas de slica-gel 60 (Merck, 0,25mm de espessura), preparadas no laboratrio e ativadas a 110C, por 1 hora. A fase mvel utilizada foi metanol a 3% em benzeno. Os produtos epoxidados foram reconhecidos, na camada delgada, pela mudana de colorao da mancha de amarelo ou laranja, para azul ou verde, aps exposio da placa a vapores de HCl (6). Para confirmar a configurao cis ou trans das fraes, foi empregada a reao de fotoisomerizao (5), pela adio de algumas gotas de soluo de iodo e exposio luz por 5min. O carotenide originalmente todo-trans, mostrar um deslocamento do mximo espectral para comprimento de onda mais baixo, por razo da isomerizao para a forma cis. O contrrio ocorre se o carotenide j for da forma cis.

2.8 - Taxa de Recuperao do -caroteno e Anlise Estatstica A porcentagem de perda foi apurada como a diferena entre a quantidade de pigmento extrada do premix menos a extrada do macarro fabricado em laboratrio, dividida pela quantidade no premix e multiplicada por 100. As determinaes foram realizadas usando-se os trs mtodos descritos, sendo que o valor usado para o premix no incluiu aquele obtido com o mtodo II. A anlise estatstica dos dados foi realizada com o auxlio dos softwares SAS e S-Plus. Comparao das mdias foi obtida pelo teste de Duncan.

3 - RESULTADOS E DISCUSSO
Com o objetivo de testar a eficincia de extrao dos trs mtodos, foi feita uma avaliao preliminar em macarro comercial fortificado, no estado cru. Considerando que os trs mtodos no poderiam ser testados simultaneamente, dado o nmero de amostras a serem analisadas num reduzido tempo, decidiu-se comparar I contra III e I contra II, em ocasies diferentes. Estes esto apresentados na Tabela 1. Alm do mtodo II extrair menor quantidade de carotenide total, evidente pela Tabela 1, que a mdia da frao ( foi sensivelmente inferior s obtidas com os outros dois mtodos. A frao -caroteno teve sua identidade confirmada pelos seguintes parmetros: espectro de absoro, valor de RF na camada delgada e pela estabilidade da cor aps o teste para epoxicarotenides.

O teor mdio de -caroteno encontrado no premix foi de 7,50,1 mg/100g, pelo mtodo I, e 7,1 0,2 mg/100g, utilizando o mtodo III. Pelos valores individuais das repeties, foi possvel notar o relativo grau de homogeneidade do premix, do qual 100g foram utilizados para a elaborao de 2kg de macarro em laboratrio. Para determinar as quantidades extradas e a recuperao do pigmento no macarro, cru e cozido, cada um dos trs mtodos foi utilizado, sendo que somente os resultados dos mtodos I e III foram considerados satisfatrios para estabelecer o ttulo do premix. A Tabela 2 mostra os teores de carotenide total e -caroteno encontrados no macarro elaborado em laboratrio, no estado cru. A anlise estatstica dos resultados apresentados na Tabela 2 indica que os valores obtidos pelo mtodo II so significativamente menores, sendo que os obtidos pelos mtodos I e III so equivalentes, pelo teste de Duncan

(P<0,05).

Situao anloga foi observada quando os mtodos foram aplicados ao macarro cozido (Tabela 3), com a diferena de que o mtodo III extraiu quantidades maiores do que o mtodo I, sem que entretanto, a diferena tenha sido significativa.

Para o macarro cru, os mtodos I e III apresentaram as maiores taxas de recuperao (84 e 89%, respectivamente; Tabela 4). Deve ser levado em conta o fato desta recuperao incluir, no somente a perda inerente ao mtodo, mas tambm quaisquer perdas associadas ao processamento do macarro. Apesar da dificuldade de separar a recuperao do mtodo de extrao das perdas inerentes ao processamento, considera-se que a avaliao da metodologia mais adequada se aplicada a

um produto de composio conhecida. De qualquer forma, as recuperaes analticas obtidas para os mtodos I e III foram aparentemente satisfatrias.

O valor vitamnico A do macarro foi calculado de duas formas: utilizando tanto o teor total de carotenides, como a frao -caroteno (Tabela 2). Considerando o teor total de carotenides, isto , incluindo produtos de degradao sem valor vitamnico, a superestimao incorrida, para o produto cru, foi de 24, 10 e 20%, pelos mtodos I, II e III, respectivamente. J para o macarro cozido (Tabela 3), o clculo do valor vitamnico pelo teor total de carotenides, resulta em superestimao de 25% por ambos os mtodos I e III. Pelo mtodo II, a extrao to baixa que a diferena entre os carotenides totais e a frao -caroteno no foi perceptvel. Pelas caractersticas espectrais e de colorao das manchas correspondentes aos produtos de degradao, pode afirmar-se que esses so respectivamente cis-ismeros e epoxicarotenides.

4 - CONCLUSO
Da comparao de metodologias para a dosagem de caroteno em macarro enriquecido, pode-se concluir que: os mtodos I (7) e III (10) mostraram-se igualmente eficientes (taxas de recuperao de 84 e 89%, respectivamente),

podendo ser indistintamente usados para analisar o macarro cru e cozido. O mtodo II (9), sugerido originalmente para produtos secos, mostrou-se insatisfatrio. 2. recomendvel efetuar a separao cromatogrfica dos produtos de degradao para evitar uma superestimao de aproximadamente de 20 a 25% no valor vitamnico A do macarro enriquecido.

5 - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
(1) A.O.A.C. Official Methods of Analysis. Association of Official Analytical Chemists. Arlington, VA, 14th ed, p835-6, 1984. (2) BANASIK, O.J. Pasta processing. Cereal Foods World, v.26, n.4, p166-169, 1981. (3) BRITTON, G.; YOUNG, A.J. Methods for isolation and analysis of carotenoids. In: BRITTON, G.; YOUNG, A.J., eds. Carotenoids in photosynthesis. London:Chapman & Hall, 1993. cap. 10, p.409-455. (4) CIACCO, C.F.; CHANG, Y.K. Massas: tecnologia e qualidade. Campinas:Editora da UNICAMP-cone, 127p., 1986. (5) DAVIES, B.H. Carotenoids. In:GOODWIN, T.W. Chemistry and biochemistry of plant pigments. London:Academic Press, 1976. v.2, p.38-165. (6) GROSS, J.; GABAI, M.; LIFSHITZ, L. Carotenoids in juice of shamouti orange. Journal of Food Science, v.36, p.466-473, 1971. (7) LIVINGSTON, A.L. Rapid analysis of xanthophyll and carotene in dried plant materials. Journal of the Association of Official Analytical Chemists, v.69, n.6, p.1017-1019, 1986. (8) PIZZINATTO, A; MAGNO, C.P.R.; CAMPAGNOLLI, D.M.F.; VITTI, I.P.; LEITO, R.F.F. Avaliao tecnolgica de

produtos derivados de farinhas de trigo (po, macarro, biscoito). Centro de Tecnologia de Farinhas e Panificao, Instituto de Tecnologia de Alimentos (ITAL), Campinas, SP, 1993. 54pp. (9) RITTER, E.De; PURCELL, A.E. Carotenoid analytical methods. In: BAUERNFEIND, J.C., Carotenoids as colorants and vitamin A precursors. Technological and nutritional applications. Florida: Academic Press, 1981. cap.10, p.815923. (10) RODRIGUEZ-AMAYA, D.B.; RAYMUNDO, L.C., LEE, T.C.; SIMPSON, K.L.; CHICHESTER, C.O. Carotenoid pigment changes in ripening Momordica charantia fruits. Annals of Botany, v.40, p.615-624, 1976. (11) RODRIGUEZ-AMAYA, D.B. Critical review of provitamin A determination in plant foods. Journal of Micronutrient Analysis, v.5, p.191-225, 1989. (12) SABINO, M.; INOMATA, E.I.; PREGNOLATO, W. Estabilidade do -caroteno em massas alimentcias vitaminadas. Revista do Instituto Adolfo Lutz, v.39, n.1, p.5559, 1979.

AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem CAPES pela bolsa de ps-graduao concedida ao primeiro autor e FAPESP pelo auxlio financeiro.

Recebido para publicao em 19/06/97. Aceito para publicao em 10/03/98. 2 Aluna de mestrado. 3 Professor da Faculdade de Engenharia de Alimentos, UNICAMP.