Biologia Microbiana

Preparao de meios de cultura

Pesar constituintes Dissolver

(1 a 1 com agitao; aquecer se necessrio)

(se necessrio)

Ajustar pH

Adicionar agar Autoclavar Cozer Distribuir em tubos Autoclavar Solidificar em posio inclinada Solidificar em posio vertical

Distribuir em tubos ou frascos

Filtrao = 0.45 m

Autoclavar

Plaquear

Meios slidos

Meios lquidos

Embora existam numerosos meios de cultura os seus ingredientes essenciais so relativamente pouco numerosos. Constituintes essenciais para uma bactria heterotrca (E. coli): sais inorgnicos, fontes de carbono e azoto tipicamente glucose e (NH4)2SO4, tampo e um agente quelante como por exemplo o citrato ou EDTA . Meios de cultura: (i) composio qumica denida; (ii) complexos de composio qumica no denida baseados em hidrolizados proteicos; estes meios contm uma mistura de produtos de degradao de protenas como a casena. Os principais mtodos de hidrlise so: (a) hidrlise cida (HCl) - hidrlise completa de protenas parcialmente puricadas, como a casena e a gelatina; (b) hidrlise enzimtica pela pepsina, pancreatina, tripsina ou papana. A digesto enzimtica produz hidrolizados parciais (Peptona, Triptona) que geralmente so mais ecientes para o crescimento do que os hidrolizados totais ou a mistura de aminocidos. As culturas tendem a modicar o pH durante o crescimento, estas alteraes podem ser minimizadas incluindo um tampo no meio. Agente solidicante: Agar - polissacrido que forma um gel com a gua (ponto de fuso 100C, solidica a 40 - 45C), resiste digesto pela maioria dos microrganismos. NOTA: o agar hidrolizado em soluo cida aps autoclavagem. Mtodos de esterilizao: 1 - Calor: (a) calor hmido: (i) autoclave; (ii) tindalizao (aquecimento a 100C 10 min - morte das clulas vegetativas - incubao durante algumas horas a 30C para germinao dos esporos - o ciclo repete-se 2 a 3x); (iii) fervura; (iv) pasteurizao - aquecimento a temperaturas <100C; (b) calor seco -estufa. 2 - Desinfectantes qumicos 3 - Filtrao 4 - Irradiao

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Dimetro Colnias Morfologia Pigmentao Consistncia Opacidade Textura Forma Elevao Margem
Morfologia da colnia

Cocos Bastonetes Clulas Morfologia

- microscopia -

Cocobacilos Isolados Cadeias Pares Ttradas Endsporos Cpsulas

Caractersticas microscpicas Morfologia celular

Dimenso: varivel; podem formar uma colnia de tamanho limitado, independentemente do perodo de incubao; outras espalham-se superfcie do agar. Pigmentao: a colorao varivel. Consistncia: seca, pulverulenta, hmida, viscosa. Opacidade: opaca, translcida, iridiscente. Textura: lisa, rugosa, granular, radiada, concentricamente zonada. Forma: punctiforme, circular, elptica, tripartida. Elevao: plana, elevada, convexa, estratificada. Margem: inteira, filamentosa, ciliada, lobada Os endsporos bacterianos so estruturas de resistncia - clulas vegetativas de paredes espessadas formadas durante a esporulao, que so resistentes radiao, agentes qumicos, temperaturas extremamente elevadas, dessecao (Bacillus e Clostridium). Cpsula: camada de polissacridos(por vezes protenas) protege a clula bacteriana, muitas vezes associada com bactrias patognicas porque serve como uma barreira contra a fagocitose.

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Clulas - suspenses
Contagem de clulas totais

cfu por l vol. =

cfu contadas superfcie contada (mm2)* x profundidade da cmara (0,1 mm) x diluio

1 mm

* = n contados x 1/400

1 mm

cfu/l =

clulas contadas n contados x 1/400 x 0,1 x 10-D cfu contadas n contados x 4000 x 10D = N x 4 x 103 x 10D cfu/ml = N x 4 x 106 x 10D

Vcamra = 1 x 1 x 0,1 = 0,1 mm3

400 quadrados pequenos (25

x 16

Vcontagem = 0,1/400 mm3 = 1/4 x 106 mL

O nmero total de clulas geralmente determinado com o auxlio de uma cmara de contagem calibrada que observada ao microscpio. Uma cmara tpica tem uma depresso central, cuja superfcie est dividida em quadrados de rea conhecida.Uma gota da suspenso bacteriana colocada nesta superfcie e coberta com uma lamela espessa. 9 quadrados - 1 quadrado = 1 mm2 - volume total = 0,9 mm3.

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Clulas - suspenses Clulas totais

Escala de McFarland

McFarland Scale 1 2 3 4

No. Bacteria (x106/ml) 300 600 900 1200 1500 1800 2100 2400 2700 3000
McFarland Standards are tubes labelled 1 through 10 and filled with suspensions of Barium salts.

McFarland Standard No. 1.0% Barium chloride (ml) 1.0% Sulphuric acid (ml) Approx. cell density (1X108ml) % Transmittance* Absorbance* *Wavelength of 600 nm

0.5 0.05 9.95 1.5 74.3 0.132

1 0.1 9.9 3.0 55.6 0.257

2 0.2 9.8 6.0 35.6 0.451

3 0.3 9.7 9.0 26.4 0.582

4 0.4 9.6 12.0 21.5 0.669

5 6 7 8 9 10

Correlao com: - peso fresco - peso seco - clulas/ml - cfu/ml

McF 0.5 Ec 0.5 SF

Escala de McFarland - padres de turbidez: BaCl2 1% e H2SO4 1% em diferentes propores de modo a formar suspenses turvas de BaSO4. O nmero de clulas de uma supenso bacteriana pode ser determinado em aproximao, por comparao com os padres da escala de McFarland.

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1 7 6

4
Puricao por esgotamento do inculo

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PREPARAO DE UM ESFREGAO BACTERIANO

1 H2O + bactrias

2 Espalhar a mistura H2O-bactrias

4 3 Secar ao ar Fixar pelo calor

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G+ G1

Esfregao

Violeta Cristal = 1 min

C O L O R A O de G R A M

G+ G-

lcool 95% at sair todo corante

Lavar

Lavar

Safranina = 1 min

Lugol = 1 min

Lavar
5 10

Lavar

Secar c/ papel

11

As clulas so xadas pelo calor e coradas com um corante bsico, O violeta cristal, que cora as clulas de azul; as preparaes so depois tratadas com lugol que permite que o iodo penetre nas clulas e forme um complexo insolvel em gua com o violeta cristal. Este complexo posteriormente eliminado com uma lavagem com alcool a 95% ou acetona, que solubilizam o complexo iodo-violeta cristal. Aps o tratamento com o solvente apenas as bactrias gram + permanecem coradas, possivelmente devido sua espessa parede celular, que no permevel ao solvente. As clulas so ento tratadas com um contracorante (safranina ou cido fucsinico), para permitir a visualizao das clulas gram - que se encontram descoradas. As clulas gram - aparecem coradas de vermelho e as gram + de azul (violeta).

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CARCTER GRAM (Teste de KOH 3%)

1 KOH 3% + bactrias

2 Misturar KOH 3% + bactrias

3 Gram negativa teste KOH 3% (+)

3 Gram positiva teste KOH 3% (-)

A parede das bactrias gram + resistente soluo alcalina e por isso no ocorre lise celular. A parede das bactrias gram - no resistente soluo alcalina e por isso ocorre lise celular; o DNA reage com o KOH e h formao de um o viscoso

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TESTE DA CATALASE H2O2

palitos

1
Perxido de hidrognio + bactrias

2
Misturar H2O2 + bactrias

3
catalase positiva (+)

3
catalase negativa (-)

2 H2O2

catalase

2 H2O + O2

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TESTE DA OXIDASE
palitos TMPD

1 papel de filtro + tetrametil parafenilenodiamina dihidrocloreto + bactria

2 Misturar bactrias + TMPD contra papel de filtro

3 oxidase positiva (+) Clulas c/ colorao violeta (resultado imediato) Oxidao do TMPD Reduo do citrocromo c

3 oxidase negativa (-)

Esfregao Bacillus sp.

Papel de filtro Verde malaquite

3
+

C O L O R A O de E N D S P O R O S

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Safranina = 1 min

Lavar

Secar c/ papel

5 min s/ ferver

Lavar

Cobre-se o esfregao com papel de ltro (para evitar a evaporao do corante) saturado com verde malaquite (corante para endsporos - no tem anidade para as clulas vegetativas). Aquece-se chama 5 min sem deixar secar o papel de ltro para auxiliar a penetrao do corante nos endsporos.