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Toxicologia e Farmacologia Regulamentar 113 (2020) 104643

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Toxicologia e Farmacologia Regulatória

Página inicial do jornal:www.elsevier.com/locate/yrtph

Toxicidade oral aguda e repetida em 28 dias deChrysobalanus icacoExtrato aquoso

de folha de L.
Natália Emanuelle Ribeiroa, Pedro Silvino Pereiraa, Tatiane Bezerra de Oliveiraa,
Sandrine Maria de Arruda Limaa, Tânia Maria Sarmento Silvab, Andréa Lopes Bandeira
Delmiro Santanaa, Márcia Silva do Nascimentoa,
Rogelio Moreno Santistebanb, Álvaro Aguiar Coelho Teixeirac, Teresinha Gonçalves da Silvaa,∗
Laboratório de Prospecção Farmacológica de Produtos Bioativos (BIOFARMATOX), Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco, Recife, Pernambuco,
a

Brasil
b Departamento de Química, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Av. Prof. Manuel de Medeiros, 96, Dois Irmãos, 52171-900, Recife, PE, Brasil
c Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, Pernambuco, Brasil

ARTIGOINFO ABSTRATO

Palavras-chave: Chrysobalanus icacoL. é uma planta nativa do Brasil utilizada como fonte alimentar e tradicionalmente para o
Avaliação histopatológica tratamento de diversas doenças. O objetivo do estudo foi realizar a análise fitoquímica por UPLC-DAD-ESI-QTOF-MS/
Saponinas MS, e avaliar toxicidades orais agudas e de dose repetida doC. icacoExtrato aquoso da folha de L. (AECi). O estudo de
Chrysobalanaceae
toxicidade aguda foi realizado com dose de AECi 2.000 mg/kg, enquanto o estudo de toxicidade de dose repetida, o
Análise fitoquímica
AECi foi administrado diariamente nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg, por 28 dias. Foram observados
comportamento e mortalidade dos animais durante o período de teste e peso corporal, bem como consumo de
água e ração. Foram realizados parâmetros hematológicos, bioquímicos e exames histopatológicos. A análise
fitoquímica do AECi revelou a presença de flavonoides e taninos. Dose oral única de 2.000 mg/kg de AECi não
resultou em mortalidade ou sinais clínicos anormais. Estudos de toxicidade por dose repetida promoveram redução
do peso corporal dos animais tratados e aumento das enzimas hepáticas alanina aminotransferase (ALT) e aspartato
aminotransferase (AST) em ambos, machos e fêmeas. As análises histopatológicas mostraram alterações nos fígados dos
animais tratados com AECi. Assim, este estudo recomenda que a população tome cuidado ao utilizar esta espécie,
principalmente durante períodos prolongados.

1. Introdução Devido à explosão mundial da fitoterapia, a segurança das plantas

O uso de plantas para fins terapêuticos é uma das práticas mais antigas
da civilização e seu uso tem aumentado e ganhado popularidade nos
últimos anos.Araújo et al., 2017). Esse uso não se restringe apenas às áreas
rurais ou regiões onde a assistência médica e farmacêutica é precária, mas
também vem sendo adotado no meio urbano como forma complementar
aos medicamentos alopáticos (Lanini et al., 2012). Estudos têm demonstrado
o potencial e a eficácia das plantas medicinais no combate a diversas
doenças. A Organização Mundial da Saúde (OMS) estimou que cerca de 70 a
80% da população mundial depende de medicamentos não convencionais
em seus cuidados primários de saúde, principalmente de origem
fitoterápica.Bakoma et al., 2013). Esse conhecimento, associado a
equipamentos modernos, tem acelerado o processo de desenvolvimento de
novos medicamentos derivados de plantas (Saklani e Kutty, 2008).
medicinais tornou-se um problema de saúde pública devido à escassa
documentação científica e evidência de resultados usando protocolos de
estudos padronizados e reconhecidos (Neergheen-Bhujun, 2013). Desta
forma, a Organização Mundial da Saúde (OMS) elaborou uma série de guias
e protocolos com o objetivo de definir as metodologias de avaliação de
plantas utilizadas na medicina tradicional (OMS, 2018). Outro problema
associado às espécies medicinais e medicamentos naturais é que eles não
recebem a devida atenção nas discussões globais com relação ao potencial
sanitário e toxicológico, uma vez que as toxicidades de muitas espécies de
plantas são amplamente desconhecidas.Tilburt, 2008). No entanto, mesmo
espécies com baixa toxicidade podem causar sérios danos à saúde quando
administradas em paralelo com outros medicamentos (sintéticos ou
naturais) ou mesmo com seu uso prolongado (Macena et al., 2012).
Chrysobalanus icacoL., um arbusto de porte médio, pertence à

∗Autor correspondente. Universidade Federal de Pernambuco, Departamento de Antibióticos, Av. Prof. Prof. Artur de Sá, s/n, Cidade Universitária, 54740-520, Recife, PE, Brasil.

Endereço de e-mail:teresinha.goncalves@ufpe.br,teresinha100@gmail.com,teresinha.goncalves@pq.cnpq.br (TG da Silva).

https://doi.org/10.1016/j.yrtph.2020.104643
Recebido em 9 de outubro de 2019; Recebido no formulário revisado em 21 de fevereiro de 2020; Aceito em 12 de março de 2020
Disponível online em 19 de março de 2020
0273-2300/ © 2020 Publicado pela Elsevier Inc.
NE Ribeiro, e outros.
A família Chrysobalanaceae, conhecida como “abajuru”, “guajuru”, é
nativa das áreas costeiras dos continentes americano e africano, foi
adaptada na Ásia (Índia e Vietnã) e nas ilhas do Pacífico (Dahlgren, 1980
). Nas Américas,Chrysobalanus icacoL. está distribuída da Flórida ao Sul
do Brasil, principalmente ao longo de áreas costeiras (Feitosa et al.,
2012). OC. icacoa fruta in natura é consumida na forma de conservas e
doces (Céspedes e Valenzuela, 2015). Raízes e folhas são usadas na
medicina tradicional para o tratamento de várias doenças, como
leucorréia, hemorragias e diarreia crônica.Ferreira-Machado e outros,
2004).C. icacotambém apresentou efeitos diuréticos, hipoglicemiantes
e antiangiogênicos (Costa, 1977;Paulo e outros, 2000). Estudos
farmacológicos relataram o extrato aquoso da folha deC. icaco
apresenta propriedades analgésicas e anti-inflamatórias (Oliveira e
outros, 2014;Paulo e outros, 2000), enquanto o extrato metanólico da
folha apresentou atividade antimicrobiana (Castilho e Kaplan, 2011).
Além disso, estudos têm destacado um efeito potencial do extrato
aquoso deC. icacofolhas na prevenção do ganho de peso e acúmulo de
gordura no fígado de camundongos obesos induzidos por dieta (White
et al., 2016b, 2016a).
Apesar do uso tradicional deC. icacoe seus efeitos farmacológicos já
foram descritos na literatura, não existem relatos de sua toxicidade.
Portanto, o objetivo deste estudo foi avaliar a toxicidade aguda e de
dose repetida deC. icacoL. (AECi), devido ao seu uso na medicina
tradicional e potencial uso em fitoterapia.
2. Materiais e métodos
2.1. Material vegetal
O material botânico foi coletado no município de Itamaracá (7°46′39,29″S/
34°50′4,27″W), estado de Pernambuco, Brasil, em julho de 2017. Uma amostra da
espécie foi autenticada pelo Dr. Leidiana Lima, da Universidade Federal Rural de
Pernambuco, onde foi encontrado um exemplar de comprovante de
C. icacoL. foi depositado no herbário com número de referência 83131.
2.2. Preparação de extrato vegetal
Para obtenção do extrato aquoso, as folhas foram secas em estufa
a 40 °C e moídas em moinho de facas. O pó (50 g) foi submetido à
extração por infusão em água destilada (1000 mL) a 100 °C por 15 min.
O extrato foi então filtrado, concentrado em rotaevaporador sob
pressão reduzida e seco em liofilizado. O extrato aquoso foi
armazenado a 4 °C e solubilizado em água nas concentrações
desejadas minutos antes da realização dos experimentos.
2.3. Caracterização fitoquímica por UPLC-DAD-ESI-QTOF-MS/MS
As análises foram obtidas em espectrômetro de massa XEVO-G2XSQTOF
(Waters, Manchester, Reino Unido) que foi conectado a um sistema ACQUITY
UPLC (Waters, Milford, MA, EUA). A separação cromatográfica dos
compostos foi realizada usando uma coluna Acquity BEH C18 (50 mm × 2,1
mm di, tamanho de partícula de 1,7 μm) (Waters, Milford, 90 MA, EUA). A
temperatura da coluna foi mantida a 40 °C. A fase móvel consistindo de
água com 0,1% de ácido fórmico em água (solvente A) e acetonitrila 0,1% de
ácido fórmico (solvente B) foi bombeada a uma vazão de 0,4 mL min−1.O
programa de eluição gradiente foi o seguinte: 0–8 min, 10–20% B; 8-15 min,
20–50% B e 15–25 min, 50–100% B. O volume de injeção foi de 4 μL.
2.4. animais
Camundongos suíços machos e fêmeas (60 dias de idade) foram obtidos
do biotério do Departamento de Antibióticos da Universidade Federal de
Pernambuco (UFPE). Os animais receberam água e ração (LABINA Purina
Brasil)AD Libitume foram mantidos sob temperatura normal
2
Toxicologia e Farmacologia Regulamentar 113 (2020) 104643
(22 ± 2 °C) e umidade (60 ± 1%), sob um ciclo natural claro e escuro de
12-12 h. O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética
em Experimentação Animal da UFPE sob o número
23076,016550/2016–38.
2.5. Toxicidade aguda
O estudo de toxicidade aguda foi realizado de acordo com as diretrizes
da Organização para Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE) -
Diretriz 423 (OCDE, 2001). suíça femininamus musculuscamundongos foram
distribuídos aleatoriamente em grupos de três animais cada. Uma dose
única de 2.000 mg/kg de AECi foi administrada por gavagem a cada animal.
Os animais do grupo controle receberam água (10 mL/kg). Os animais foram
observados individualmente em campo aberto aos 5, 10, 15, 30, 60, 120 e
240 min e uma vez ao dia, por um período de quatorze dias, registrando-se
os sinais de toxicidade ou mortalidade, conforme critérios estabelecidos por
Malone e Robichaud (1962). Além disso, o peso, a ingestão de água e ração
também foram avaliados ao longo do experimento.
no dia 14ºdia, os animais foram anestesiados com cetamina (0,35
mL/kg) e xilazina (0,10 mL/kg) por via intraperitoneal. O sangue foi
coletado por punção cardíaca para análise hematológica e bioquímica.
O fígado, rim e baço foram coletados e seus pesos absolutos medidos.
O peso relativo desses órgãos foi obtido pela fórmula: massa corporal/
peso massa x 100. Esses órgãos foram então fixados em formalina
tamponada a 10% (pH 7,4) por 24 h para análise histológica. Como não
foi observada nenhuma morte na dose de 2.000 mg/kg, o experimento
foi repetido com o mesmo número de animais, conforme a diretriz 423
(OCDE, 2001).
2.6. Toxicidade oral de dose repetida em 28 dias
A toxicidade de dose repetida foi avaliada conforme proposto pela
Organização para Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE, 2008).
Camundongos Swiss albinos (60 dias de idade) foram divididos em grupos
com cinco machos e cinco fêmeas cada. Os animais foram tratados por via
oral com doses de AECi (100, 200 e 400 mg/kg) ou água (grupo controle) por
28 dias consecutivos. O grupo satélite recebeu 400 mg/kg de AECi e
permaneceu sem tratamento por mais 15 dias para detectar ocorrência
tardia, persistência ou recuperação de efeitos tóxicos. A evolução ponderal,
o consumo de ração e água dos animais foram registrados diariamente ao
longo do tratamento. Sinais de toxicidade e mortalidade foram observados
durante o período experimental. Após o período de observação, os animais
em jejum foram anestesiados com cetamina (0,35 mL/kg) e xilazina (0,10 mL/
kg) por via intraperitoneal e seu sangue foi coletado por punção cardíaca
para análises hematológicas e bioquímicas; os órgãos (fígado, rim e baço)
foram removidos, pesados e suas massas expressas em termos absolutos
(g) e relativos (g/100g de massa do animal). Posteriormente, foi realizada
análise histológica.
2.7. Análise bioquímica
Para a análise bioquímica, as amostras de sangue foram centrifugadas a
3500 rpm por 10 min para coleta de soro, então os seguintes parâmetros
foram determinados: glicose, uréia, creatinina, aspartato aminotransferase
(AST), alanina aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina (ALP) e total
Proteínas. Os ensaios foram realizados usando kits de diagnóstico
comerciais padrão da LABTEST®.
2.8. Análise hematológica
As amostras de sangue foram coletadas em tubos de EDTA. Leucócitos
(linfócitos, monócitos, granulócitos), glóbulos brancos (WBC), contagem total de
glóbulos vermelhos (RBC), hematócrito, hemoglobina, plaquetas, volume
corpuscular médio (MCV), hemoglobina corpuscular média (MCH) e concentração
média de hemoglobina corpuscular ( MCHC), glóbulos vermelhos
NE Ribeiro, e outros. Toxicologia e Farmacologia Regulamentar 113 (2020) 104643

largura de distribuição (RWD), volume médio de plaquetas (MPV). As tabela 1

determinações foram realizadas em analisador automático de Caracterização de compostos deChrysobalanus icacoextrato aquoso analisado por
hematologia celular. UPLC-DAD-QTOF-MSE.

Pico Rt (min) λmáximo [MH]-(m/z) EM2(m/z) Composto provisoriamente

2.9. análise histológica (nm) identificado

1 3.48 356 493.0642 317.0314 Miricetina 3-O-glucuronida

Após a laparotomia, os órgãos (fígado, rins e baço) foram
2 3,80 357 449.0677 316.0218 Miricetina 3-O-pentosídeo
removidos e fixados em formalina tamponada a 10% (pH 7,4) por 24 3 4.46 352 463.0875 316.0225 miricetina 3-O-ramnosídeo
horas. Após a fixação, as amostras foram lavadas em água corrente e 4 4,73 348 595.1293 477.0682 Quercetina-pentosil-
imersas em álcool 70% até a realização das análises histológicas. Os 301.0192 hexósido
5 4,94 349 595.1264 463.0947 Miricetina-ramnosil-
órgãos foram impregnados e incluídos em parafina, sendo os tecidos
316.0201 pentosídeo
seccionados na espessura de 5,0 μm e corados com hematoxilina- 6 5.05 347 675.0817 595.1271 Miricetina-ramnosil-
eosina. A análise histológica dos órgãos foi realizada em microscópio 463.0908 sulfato de pentosídeo
óptico. A análise histopatológica consistiu na observação da 316.0213
integridade tecidual, investigação de lesões como degeneração, 7 6.22 347 447.0905 301.0334 Quercetina-3-O-ramnosídeo
8 6.34 348 579.1319 447.0892 Quercetina-ramnosil-
necrose, apoptose e infiltração de leucócitos, que podem evidenciar
300.0268 pentosídeo (isômero I)
toxicidade (Traesel e outros, 2016). 9 6.62 348 579.1331 300.0263 Quercetina-ramnosil-
pentosídeo (isômero II)
2.10. análise morfométrica 10 11.47 827.4370 503.3363 Triterpeno-dihexosídeo
11 11.70 797.4258 635.3767 Triterpeno-ramnosil-
503.3338 hexosídeo (isômero I)
Através de métodos estereológicos, a proporção entre o parênquima não
12 11.89 797.4269 635.3767 Triterpeno-ramnosil-
lobular (espaço portal, veias centrolobulares e ramos das veias hepáticas) e 503.3349 hexosídeo (isômero II)
lobular (hepatócitos, sinusóides, espaço de Disse e ductos biliares) de fígados de 13 12.07 269, 363.0165 347.9923 Sufato-hidroxi-
animais experimentais foi determinada usando uma grade com 100 pontos de 341 283.0590 metoxi-flavona
14 11.614 797.4261 665.3861 Triterpeno-hexosil-
teste colocados sobre os cortes do preparo histológico corados com hematoxilina-
503.3369 pentosídeo
eosina. Foram contadas três lâminas, de forma que foram contabilizados 10 15 12h45 767.4177 635.3782 Triterpeno-dipentosídeo
campos, utilizando a objetiva 40X, totalizando 5000 pontos por grupo. 503.3356 (isômero I)
16 12h55 767.4175 503.3354 Triterpeno-dipentosídeo
(isômero II)
Para a análise morfométrica do rim, foram utilizadas três lâminas de
17 12.79 767.4167 635.3782 Triterpeno-dipentosídeo
cada grupo com dez glomérulos sendo analisados em cada lâmina. As
503.3343 (isômero II)
medidas foram restritas aos glomérulos mostrando pólos vasculares e 18 12.96 681.3818 503.3354 Trihidroxi-cinamoil-
urinários. Esse arranjo indica a seção que coincide com a região equatorial triterpeno
do glomérulo. Os glomérulos selecionados aleatoriamente foram usados 19 13.03 781.4311 619.3813 Triterpeno-pentosil-
487.3393 hexosídeo (isômero I)
para as medições. A captura da imagem foi feita com um Sony®câmera de
20 13.24 781.4348 487.3426 Triterpeno-pentosil-
vídeo, acoplada a uma Olympus®Microscópio Bx50. A morfometria foi hexosídeo (isômero II)
realizada utilizando o aplicativo Line Morphmetry, calibrado em 21 13h39 765.4028 501.3228 Trihidroxi-oxo-
micrômetros, associado ao Optimas®6.2 programa para Windows. Para triterpeno-dipentosídeo

obter a área glomerular, o cursor foi posicionado na área central do 22 13.54 695.3969 487.3409 Triterpeno-ramnosil-
glicuronídeo
glomérulo, estabelecendo uma linha circular externa, coincidindo com o tufo
23 13.64 751.4249 619.3906 Triterpeno-dipentosídeo
glomerular. A mesma metodologia foi adotada para medir a cápsula de 487.3416 (isômero I)
Bowman (Akaoka et al., 1994). Os volumes glomerulares e da cápsula de 24 13.79 751.4227 487.3409 Triterpeno-dipentosídeo
Bowman foram calculados de acordo com os critérios recomendados por (isômero II)
25 13.89 751.4211 619.3854 Triterpeno-dipentosídeo
Pagtalunan et al. (2000), onde a equação 4/3πr3, utilizada para calcular o
487.3399 (isômero III)
volume de uma esfera, em que “r” representa o raio foi utilizada para esta 26 14.02 765.4417 471.3492 Triterpeno-hexosil-
estimativa. pentosídeo (Isômero I)
27 14.13 503.3397 – Triterpeno-aglicona
2.11. Análise estatística 28 15.32 765.4403 471.3340 Triterpeno-hexosil-
pentosídeo (Isômero II)

Os resultados da toxicidade oral aguda e repetida em 28 dias foram

expressos como média ± desvio padrão (DP). As diferenças entre os grupos
foram determinadas por uma análise de variância (ANOVA) de uma via,
seguida pelo teste de Tukey. Os dados morfométricos foram analisados
pelo teste de Kruskal-Wallis, onde as médias foram comparadas pelo teste
de Wilcoxon-Mann-Whitney. A análise estatística foi realizada usando o
software GraphPad Prism 5.0 com o nível de significância estabelecido em p
< 0,05.
3. Resultados
3.1. Caracterização fitoquímica por UPLC-DAD-ESI-QTOF-MS/MS
Os compostos foram identificados provisoriamente a partir de extrato aquoso de
C. icacofolhas por UPLC-DAD-ESI-QTOF-MS/MS (tabela 1). A caracterização
química foi realizada através da análise dos espectros de UV, íons produto
(espectros MSE) e comparação com a literatura. Os constituintes químicos
predominantemente incluem terpenos, aglicona e
flavonoides glicosilados. Os flavonoides foram identificados como derivados da
miricetina e da quercetina.Pires e outros, 2016;Barbosa e outros, 2006).
O espectro mostra o perfil cromatográfico do íon de pico de base
negativa (BPI). Os picos correspondentes aos compostos1para9 mostrou
espectros de UV típicos de glicosídeos de flavonóis (grupo 3-OH substituído)
com bandas em 250-260 nm (banda II) e 345-355 nm (banda I) (Tiberti et al.,
2007) e detecção de massa, bem como a medição precisa de massa dos íons
precursores e produtos. Esses compostos detectados incluíam cinco
derivados de miricetina e quatro de quercetina.
Composto1mostrou um pico de íon molecular desprotonado emm/z 493 [MH]-
e um fragmento de íon emm/z317 [MH-ácido glucurônico]-indicando a perda da
unidade de ácido glucurônico (176 Da). O núcleo de miricetina é muito comum em
Crisobalanoespécie e tem sido utilizada como marcador químico na família
Chrysobalanaceae. A glicosilação em flavonóides pode estar em qualquer posição,
porém todos os flavonóis glicosídicos previamente identificados emC. icacosão
glicosilados na posição 3, neste sentido

3
NE Ribeiro, e outros.
o flavonoide1foi identificado como miricetina 3-O-glicuronídeo (
Barbosa e outros, 2006). Comparação de MS2dados de compostos2, 3,
5e6com flavonoide1indicam a presença de um ose com a perda do
fragmento [M-2H-açúcar]-, sugerindo um núcleo flavonóide de
miricetina. As unidades de monossacarídeos, pentose em composto2e
desoxihexose no composto3, foram determinados pela perda de 132
Da e 146 Da, respectivamente, devido à quebra da ligação glicosídica.
os compostos2e3 foram identificados como miricetina 3-O-pentosídeo
e miricetina 3-O-ramnosídeo (miricitrina), respectivamente, pois já
foram identificados na mesma espécieC. icaco(Barbosa e outros, 2006).
prestes a compor4, a perda direta do resíduo de dissacarídeo
resulta no íon aglicona [MH-açúcar]-nom/z301, sugerindo um núcleo
flavonoide da quercetina. O dissacarídeo residual, pentose mais
hexose, foi sugerido com base na perda de massa de 294 Da.
Compostos5foi identificado como miricetina-3-O-ramnosil-pentosídeo.
Esta identificação foi baseada no fragmento observado emm/z463,
correspondente à perda da unidade de pentose e o fragmento emm/z316,
indicando a perda adicional de desoxihexose. Como mostrado para o
composto6, o íon pseudomolecular [MH]–foi observado emm/z675 e o
fragmento de íon emm/z595 [MH-80]-no MS2espectros, correspondendo à
remoção deO-grupo sulfato (SO3-). Como para o composto 5, o composto6
também apresentou fragmentos representando a perda dos açúcares
pentose mais desoxihexose emm/z463 em/z316, respectivamente.
Composto13também parecia ser uma flavona sulfatada, devido à
fragmentação do íon emm/z283 [MH-80]-, correspondente à perda de
grupo e provavelmente acacetina como aglicona (Teles e outros, 2015).
3-
ENTÃO
Os flavonoides sulfatados são ésteres de esqueletos de flavonoides
conhecidos, geralmente flavonas ou flavonoides e são encontrados em
poucas famílias vegetais.Teles e outros, 2018). Embora 4'-OO ácido
-metil-5,7-diidroxi-flavona-6-sulfônico foi isolado de Licaniaarianeae
pertencente à família Chrysobalanaceae (Carvalho e Costa, 2009), este é o
primeiro relato de flavonoides sulfatados naC. icaco.
O íon molecular desprotonado [MH]-nom/z447 e o fragmento de íon em
m/z301, correspondente à perda da unidade desoxihexose, permitiu
identificar o composto7como quercetina-3-O-ramnosídeo (quercitrina).
Barbosa e outros. (2006), descreveram a presença de quercitrina emC. icaco.
Para composto8o íon molecular desprotonado [MH]-exibido emm/z579
juntamente com fragmentos emm/z447 e 300, correspondentes à aglicona
de quercetina, indicaram a perda do resíduo dissacarídeo, pentose mais
desoxihexose. Composto9parecia ser um isômero de8, desde o seu MS2
espectros eram semelhantes.
saponinas10–12e14–17foram identificados por análise de MS2
espectros e comparação com dados publicados na literatura. Estas sete
saponinas apresentaram íon aglicona [MH-açúcar]–nom/z503. Embora
nenhuma informação possa ser obtida sobre a estereoquímica da parte
glicana no MS2análise, esse fragmento pode ser atribuído ao ácido
terminólico ou seu isômero ácido madecássico, uma vez que esses ácidos já
foram identificados emC. icacoeLicania arianeae (Chrysobalanaceae),
respectivamente (Mendonça et al., 2017;Carvalho e outros, 2008). Os tipos
de açúcares (hexoses, desoxihexoses e pentoses) podem ser deduzidos
indiretamente a partir da diferença entre a massa da molécula
desprotonada correspondente e a massa do íon aglicona. Assim, a perda de
324 Da pode ser atribuída à presença de duas unidades de hexose (162 Da)
no composto10. Para composto12, o fragmento em m/z635, que
correspondeu à perda de 162 Da da molécula desprotonada, pode ser
sugerida pela perda de hexose, enquanto a perda subsequente da unidade
desoxihexose foi sugerida pela perda de 146 Da. Compostos12e11eram um
par de isômeros, pois suas fragmentações eram semelhantes. Composto14
foi provisoriamente designado como ácido terminólico ou madecássico
ligado a um dissacarídeo formado por hexose e pentose. Três isômeros de
saponinas, compostos15, 16e17, mostrou molécula desprotonada emm/z
767. Com base na perda sequencial de duas unidades de pentose (264 Da)
do íon parental, essas saponinas foram plausivelmente caracterizadas como
triterpeno-pentosil-pentosídeo. A diferença entre as três saponinas
provavelmente depende do posicionamento do açúcar
4
Toxicologia e Farmacologia Regulamentar 113 (2020) 104643
unidade ou de grupos hidroxila na aglicona.
Composto18foi proposto como trihidroxicinamoil-triterpeno com
base no [MH]-íon emm/z681 e fragmento de íon emm/z503, que é
característico da perda da porção trihidroxicinamoíla (MH-178]-
(Żuchowski et al., 2014).
Composto21mostrou molécula desprotonada emm/z765. A perda
neutra de 264 Da (duas porções pentose) rendeu o íon radical aglicona
emm/z501, que pode ser atribuído a um trihidroxi-oxotriterpeno com
esqueleto de oleanano, ursano ou tremoço.
Um ácido trihidroxi-oleanóico com íon molecular em 488 Da foi sugerido
como aglicona para compostos19, 20, 22–25por espécies de aglicona
desprotonadas, [aglicona-H]–nom/z487, formada devido à perda de
unidades de açúcar de [MH]-íon tomado como precursor.
Como mostrado para19, o [MH]–íon foi observado emm/z781, enquanto
o íon emm/z619 foi atribuído à perda de hexose e do íon emm/z 487
correspondendo à perda subsequente da fração pentose. Fragmentações
semelhantes foram obtidas para o composto20, sugerindo que eles eram
isômeros.
Composto22íon desprotonado gerado emm/z695 e fragmento emm/z
487 produzido pela perda de 208 Da da molécula desprotonada,
correlacionada com as perdas neutras de desoxihexose (146 Da), H2O (18
Da) e CO2(44 Da).Pollier et ai. (2011)observaram um padrão semelhante para
saponinas que contêm um resíduo de ácido urônico, indicando uma
clivagem cruzada do resíduo de ácido urônico.
Para composto23o íon precursor emm/z751 fragmentos de íons
produzidos emm/z619 ([MH-132]–em/z487 ([MH-132-132]-, indicando a
presença de duas pentoses. As saponinas23, 24e25foram sugeridos
como isômeros porque se comportam da mesma maneira sob MS2
fragmentação.
Compostos26e28poderiam ser saponinas de agliconas triterpênicas de
ursano, como o ácido pomólico, previamente identificadas emC. icaco (
Feitosa et al., 2012), devido à presença do íon aglicona desprotonado em m/
z471. A perda de 294 Da da molécula desprotonada pode ser sugerida pela
perda de porções hexose mais pentose.
Composto27é a aglicona presente nos compostos10, 16 e18,
provavelmente ácido terminólico ou madecássico, previamente isolado em
C. icaco(Mendonça et al., 2017;Carvalho e outros, 2008).
3.2. Toxicidade aguda
Não foram observadas alterações significativas ou desconforto após uma
única administração oral doC. icacoextrato aquoso foliar na dose de 2.000 mg/kg,
não sendo observada nenhuma morte durante os 14 dias de observação.
Camundongos fêmeas tratados com AECi não mostraram diferença no peso
corporal, ingestão de alimentos ou consumo de água quando comparados ao
grupo controle. O tratamento agudo com AECi não produziu alterações nos
parâmetros hematológicos ou bioquímicos nos grupos de animais tratados
quando comparados ao grupo controle (dados não apresentados).
A análise microscópica mostrou que o AECi causou uma pequena lesão
hepática, com congestão da veia centrolobular, hipertrofia e hiperplasia dos
hepatócitos, além de hepatócitos superativados com mais de cinco
nucléolos, observando-se discreta microesteatose pericentrilobular,
multifocal e difusa (Figura 1B). Atrofia glomerular discreta, glomerulonefrite
proliferativa, degeneração hidrópica e aparecimento de nefrose em túbulos
contorcidos foram observados no córtex renal. O AECi causou toxicidade
discreta quando administrado em dose única de 2.000 mg/kg em
camundongos (Figura 1D). Não foram observadas alterações histológicas no
baço dos animais tratados com AECi (dados não apresentados).
3.3. Toxicidade oral de dose repetida em 28 dias
Os animais tratados com o AECi nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg por 28
dias consecutivos não apresentaram óbito ou sinais de toxicidade (piloereção,
diarreia e alterações na atividade locomotora).
A administração oral de doses repetidas do AECi nas doses testadas não
comprometeu a água (mesa 2), embora haja uma diminuição significativa
NE Ribeiro, e outros. Toxicologia e Farmacologia Regulamentar 113 (2020) 104643

Figura 1.Fotomicrografia de cortes histológicos de

fígado (A–B) e rim (C–D) de camundongos suíços
fêmeas tratados com oC. icacoextrato aquoso das
folhas. ELE. Grupo controle (A–C) e EACi 2.000 mg/kg
(B–D). HHH: Hipertrofia e hiperplasia dos hepatócitos;
S: esteatose; HB: Hepatócitos binucleados; AG: Atrofia
glomerular; HTC: hidropis do túbulo contorcido.

ingestão alimentar foi observada em homens entre os 14ºe 28ºdia de
tratamento, e as fêmeas a partir do 21stdia, em todas as doses testadas (
mesa 2 eTabela 3).
Foi observada uma diminuição no peso corporal de camundongos machos e
fêmeas tratados com o AECi em todas as doses testadas, quando comparado ao
grupo controle (Tabela 4). Nos machos, essa diminuição do peso corporal ocorreu
a partir da segunda semana de tratamento e durou até o final do experimento,
enquanto nas fêmeas essa redução foi registrada na terceira e quarta semana de
tratamento.
Os animais do grupo satélite (machos e fêmeas) também apresentaram
redução no peso corporal e no consumo alimentar a partir da segunda semana de
tratamento até o final do experimento (Tabela 4). Observou-se que 14 dias após o
término da administração de AECI o peso corporal e os animais do grupo satélite
de ingestão alimentar não diferiram do grupo controle (dados não apresentados).
3.3.1. Análise hematológica
Tabela 5mostra o perfil hematológico dos animais tratados com o AECi
durante o teste de toxicidade de dose repetida. Não foram encontradas diferenças
significativas nos parâmetros analisados para os grupos de machos e fêmeas
tratados, quando comparados aos animais do grupo controle.
3.3.2. Parâmetros bioquímicos
Tabela 6mostra os parâmetros bioquímicos dos grupos controle e
tratado. Não foram observadas diferenças nos níveis de creatinina, uréia,
glicose, proteínas totais e ALP. No entanto, foi observado um aumento de
AST e ALT em ambos os sexos em todas as doses testadas, quando
comparado ao grupo controle.
A análise macroscópica dos órgãos não mostrou alterações de cor ou
textura quando comparados ao grupo controle. A administração de AECi não
alterou a massa absoluta e relativa dos órgãos de camundongos machos ou
fêmeas (Tabela 7) em relação ao grupo controle (verTabela 8).
Exame histopatológico do fígado de animais controle (machos

mesa 2
Consumo semanal de água (mL/100g de peso corporal) de animais (machos e fêmeas) tratados por via oral com oC. icacoextrato aquoso de folhas (AECi) nas doses de 100, 200 e 400
mg/kg por 28 dias consecutivos.

fêmeas

dia 7 Dia 14 Dia 21 dia 28

Ao controle 5,90 ± 0,37 6,30 ± 0,47 5,87 ± 0,61 6,16 ± 0,79

100 mg/kg 5,54 ± 0,72 6,02 ± 0,62 4,52 ± 0,79* 3,96 ± 0,54***
200 mg/kg 5,80 ± 0,42 6,04 ± 0,63 4,39 ± 0,95** 3,78 ± 0,76***
400 mg/kg 5,73 ± 0,67 5,74 ± 0,83 3,00 ± 0,52*** 3,85 ± 0,55***
Satélite 6,31 ± 0,55 5,90 ± 0,83 4,45 ± 0,77* 5,06 ± 0,66**

machos

dia 7 Dia 14 Dia 21 dia 28

Ao controle 7,26 ± 0,49 6,38 ± 0,44 6,78 ± 0,48 6,39 ± 0,37

100 mg/kg 6,65 ± 1,02 4,55 ± 0,26** 4,98 ± 0,87* 5,84 ± 0,15*
200 mg/kg 6,58 ± 0,68 4,93 ± 0,68* 5,20 ± 0,18** 5,82 ± 0,14*
400 mg/kg 6,92 ± 0,48 4,96 ± 0,70* 4,80 ± 0,08*** 5,79 ± 0,50*
Satélite 6,20 ± 0,85 5,80 ± 0,74 5,38 ± 0,71** 5,81 ± 0,45*

Os valores representam a média ± DP da ingestão alimentar (n = 5). Diferença estatística do grupo controle (ANOVA seguida pelo teste de Tukey, *p < 0,05, **p < 0,01,
* * * p < 0,001).

5
NE Ribeiro, e outros. Toxicologia e Farmacologia Regulamentar 113 (2020) 104643

Tabela 3
Consumo alimentar (g/100g de peso corporal) de animais (machos e fêmeas) tratados por via oral com oC. icacoextrato aquoso de folhas (AECi) nas doses de 100, 200 e 400 mg/kg por
28 dias consecutivos.

fêmeas

dia 7 Dia 14 Dia 21 dia 28

Ao controle 41,36 ± 0,71 42,29 ± 0,33 42,92 ± 0,21 43,07 ± 0,42

100 mg/kg 41,08 ± 0,52 42,33 ± 0,54 40,26 ± 0,83 37,96 ± 1,04
200 mg/kg 41,21 ± 0,98 42,01 ± 0,51 39,48 ± 0,33*** 39,73 ± 0,41***
400 mg/kg 41,52 ± 0,63 41,92 ± 0,47 37,49 ± 1,64*** 35,87 ± 0,28***
Satélite 41,62 ± 0,59 42,51 ± 0,85 38,54 ± 0,45*** 37,03 ± 0,62***

machos

dia 7 Dia 14 Dia 21 dia 28

Ao controle 45,83 ± 0,34 46,09 ± 0,32 45,92 ± 0,34 45,50 ± 0,46

100 mg/kg 45,96 ± 0,42 43,78 ± 0,49** 44,20 ± 0,42 43,26 ± 0,37**
200 mg/kg 45,32 ± 0,45 40,97 ± 0,32*** 41,96 ± 0,41** 43,16 ± 0,20**
400 mg/kg 45,69 ± 0,52 39,32 ± 1,52*** 39,91 ± 0,69** 39,70 ± 0,93***
Satélite 45,78 ± 0,35 39,52 ± 0,82*** 39,01 ± 0,64** 38,02 ± 0,83***

Os valores representam a média ± DP da ingestão alimentar (n = 5). Diferença estatística do grupo controle (ANOVA seguida pelo teste de Tukey, *p < 0,05, **p < 0,01,
* * * p < 0,001).

e fêmeas) encontraram uma fina cápsula externa composta por tecido
conjuntivo fibroso, um parênquima bem desenvolvido e uma malha vascular
com veias centrolobulares de vários calibres. Os hepatócitos apresentaram
morfologia poliédrica, núcleos centrais, nucléolos proeminentes e
citoplasma acidófilo. No entanto, a congestão das veias centrolobulares e
hepatócitos com citoplasma vacuolizado (Figura 2) foram observados nos
fígados dos animais dos grupos (machos e fêmeas) tratados com AECi nas
doses de 100, 200 e 400 mg/kg, além do grupo satélite.
Os rins dos animais controles (machos e fêmeas) apresentaram bem-
componentes estruturais definidos, constituindo uma cápsula fibrosa,
região cortical e medular. A cápsula de Bowman e o espaço capsular
apresentavam glomérulos bem diferenciados e bem desenvolvidos (Fig.
3A e B). Glomérulos renais com redução do espaço subcapsular e
congestão de vasos na região do córtex (Fig. 3C–J) foram observados
em rins de animais (machos e fêmeas) tratados com oC. icaco extrato
aquoso (100, 200 e 400 mg/kg) assim como o grupo satélite.
Os aspectos morfométricos do fígado revelaram redução

Tabela 4
Efeito doC. icacoextrato aquoso de folhas (EACi) em doses de 100, 200 e 400 mg/kg no peso corporal de camundongos machos (A) e fêmeas (B) tratados por via oral por 28 dias
consecutivos durante o estudo de toxicidade de dose repetida.

Parâmetros fêmeas EACi

Ao controle 100 mg/kg 200 mg/kg 400 mg/kg Satélite

WBC (103/μL) 5,98 ± 0,61 5,75 ± 0,68 5,02 ± 0,63 6,07 ± 0,49 6,56 ± 0,53
RBC total (k/μL) 5,70 ± 0,77 6,0 ± 1,77 6,68 ± 0,65 6,25 ± 0,45 6,91 ± 1,06
Hemoglobina (g/dL) 12,4 ± 1,30 12,0 ± 3,24 13,70 ± 1,30 1300 ± 0,99 12,54 ± 1,11
Hematócrito (%) 27,40 ± 3,24 28,30 ± 3,24 31,60 ± 3,52 29,40 ± 3,12 25,00 ± 4,52
Plaquetas (103/μL) 420,0 ± 94,6 512,0 ± 48,1 490,0 ± 52,6 443,0 ± 78,6 445,0 ± 78,9
MCV (fL) 48,20 ± 2,16 47,20 ± 1,48 49,00 ± 2,34 47,20 ± 3,03 51,00 ± 0,81
CHM (pág.) 21,80 ± 1,47 20,30 ± 0,96 20,90 ± 0,75 20,80 ± 1,29 22,08 ± 1,16
CHCM (g/dL) 45,30 ± 1,47 43,10 ± 2,03 42,80 ± 0,80 44,30 ± 2,13 44,38 ± 2,08
RDW (%) 12,70 ± 0,78 12,30 ± 1,19 12,40 ± 0,36 12,80 ± 0,95 12,58 ± 0,64
MPV (fL) 6,74 ± 0,90 7,16 ± 0,81 7,02 ± 0,97 6,96 ± 1,30 6,14 ± 1,09
Linfócitos (%) 79,70 ± 8,47 75,70 ± 8,19 74,10 ± 7,05 68,40 ± 6,37 77,28 ± 5,06
Monócitos (%) 8,24 ± 1,90 8,54 ± 1,24 8,84 ± 1,73 11,00 ± 1,85 8,58 ± 1,12
Granulócitos (%) 18,90 ± 0,92 21,90 ± 2,20 21,70 ± 2,10 22,90 ± 2,80 18,05 ± 2,00

Parâmetros machos EACi

Ao controle 100 mg/kg 200 mg/kg 400 mg/kg Satélite

WBC (103/μL) 6,85 ± 1,68 8,60 ± 0,76 6,90 ± 1,04 6,50 ± 0,29 6,48 ± 1,70
RBC total (k/μL) 8,22 ± 0,86 8,37 ± 0,45 7,73 ± 0,61 7,33 ± 0,86 8,67 ± 0,70
Hemoglobina (g/dL) 13,90 ± 0,36 13,50 ± 0,24 13,70 ± 0,33 13,70 ± 0,87 12,60 ± 0,57
Hematócrito (%) 42,60 ± 1,75 40,10 ± 1,43 38,60 ± 2,62 39,80 ± 3,19 43,40 ± 2,93
Plaquetas (103/μL) 727,0 ± 37,8 747,0 ± 87,7 666,0 ± 54,2 665,0 ± 66,4 626,0 ± 102,7
MCV (fL) 50,40 ± 0,54 48,60 ± 0,89 49,60 ± 0,83 51,60 ± 2,96 50,20 ± 0,83
CHM (pág.) 16,60 ± 0,96 16,20 ± 0,72 17,80 ± 1,12 18,10 ± 0,97 15,50 ± 1,32
CHCM (g/dL) 33,10 ± 1,62 33,70 ± 0,81 35,60 ± 1,87 35,00 ± 1,10 32,10 ± 4,08
RDW (%) 12,80 ± 0,71 13,4 0 ± 0,51 13,90 ± 0,96 13,60 ± 0,38 12,40 ± 0,32
MPV (fL) 6,78 ± 1,78 6,88 ± 1,23 7,18 ± 0,51 7,64 ± 1,41 7,10 ± 1,79
Linfócitos (%) 73,50 ± 6,53 71,20 ± 2,24 71,60 ± 6,87 66,90 ± 5,56 74,90 ± 5,00
Monócitos (%) 8,05 ± 1,17 6,87 ± 0,25 6,62 ± 1,40 8,80 ± 1,77 7,52 ± 0,92
Granulócitos (%) 23,20 ± 1,40 23,05 ± 1,00 23,20 ± 2,70 19,15 ± 4,50 19,54 ± 3,30

Os valores representam a média ± SD (n = 5). Diferença estatística do grupo controle (ANOVA seguida pelo teste de Tukey). VCM: Volume Corpuscular Médio; MCH: Hemoglobina
Corpuscular Média; MCHC: Concentração Média de Hemoglobina Corpuscular; RDW: Largura de distribuição das hemácias; VPM: Volume Plaquetário Médio.

6
NE Ribeiro, e outros. Toxicologia e Farmacologia Regulamentar 113 (2020) 104643

Tabela 5
Efeito doC. icacoextrato aquoso de folhas (EACi) sobre parâmetros hematológicos em camundongos tratados por 28 dias consecutivos.

Parâmetros fêmeas EACi

Ao controle 100 mg/kg 200 mg/kg 400 mg/kg Satélite

WBC (103/μL) 5,98 ± 0,61 5,75 ± 0,68 5,02 ± 0,63 6,07 ± 0,49 6,56 ± 0,53
RBC total (k/μL) 5,70 ± 0,77 6,0 ± 1,77 6,68 ± 0,65 6,25 ± 0,45 6,91 ± 1,06
Hemoglobina (g/dL) 12,4 ± 1,30 12,0 ± 3,24 13,70 ± 1,30 1300 ± 0,99 12,54 ± 1,11
Hematócrito (%) 27,40 ± 3,24 28,30 ± 3,24 31,60 ± 3,52 29,40 ± 3,12 25,00 ± 4,52
Plaquetas (103/μL) 420,0 ± 94,6 512,0 ± 48,1 490,0 ± 52,6 443,0 ± 78,6 445,0 ± 78,9
MCV (fL) 48,20 ± 2,16 47,20 ± 1,48 49,00 ± 2,34 47,20 ± 3,03 51,00 ± 0,81
CHM (pág.) 21,80 ± 1,47 20,30 ± 0,96 20,90 ± 0,75 20,80 ± 1,29 22,08 ± 1,16
CHCM (g/dL) 45,30 ± 1,47 43,10 ± 2,03 42,80 ± 0,80 44,30 ± 2,13 44,38 ± 2,08
RDW (%) 12,70 ± 0,78 12,30 ± 1,19 12,40 ± 0,36 12,80 ± 0,95 12,58 ± 0,64
MPV (fL) 6,74 ± 0,90 7,16 ± 0,81 7,02 ± 0,97 6,96 ± 1,30 6,14 ± 1,09
Linfócitos (%) 79,70 ± 8,47 75,70 ± 8,19 74,10 ± 7,05 68,40 ± 6,37 77,28 ± 5,06
Monócitos (%) 8,24 ± 1,90 8,54 ± 1,24 8,84 ± 1,73 11,00 ± 1,85 8,58 ± 1,12
Granulócitos (%) 18,90 ± 0,92 21,90 ± 2,20 21,70 ± 2,10 22,90 ± 2,80 18,05 ± 2,00

Parâmetros machos EACi

Ao controle 100 mg/kg 200 mg/kg 400 mg/kg Satélite

WBC (103/μL) 6,85 ± 1,68 8,60 ± 0,76 6,90 ± 1,04 6,50 ± 0,29 6,48 ± 1,70
RBC total (k/μL) 8,22 ± 0,86 8,37 ± 0,45 7,73 ± 0,61 7,33 ± 0,86 8,67 ± 0,70
Hemoglobina (g/dL) 13,90 ± 0,36 13,50 ± 0,24 13,70 ± 0,33 13,70 ± 0,87 12,60 ± 0,57
Hematócrito (%) 42,60 ± 1,75 40,10 ± 1,43 38,60 ± 2,62 39,80 ± 3,19 43,40 ± 2,93
Plaquetas (103/μL) 727,0 ± 37,8 747,0 ± 87,7 666,0 ± 54,2 665,0 ± 66,4 626,0 ± 102,7
MCV (fL) 50,40 ± 0,54 48,60 ± 0,89 49,60 ± 0,83 51,60 ± 2,96 50,20 ± 0,83
CHM (pág.) 16,60 ± 0,96 16,20 ± 0,72 17,80 ± 1,12 18,10 ± 0,97 15,50 ± 1,32
CHCM (g/dL) 33,10 ± 1,62 33,70 ± 0,81 35,60 ± 1,87 35,00 ± 1,10 32,10 ± 4,08
RDW (%) 12,80 ± 0,71 13,4 0 ± 0,51 13,90 ± 0,96 13,60 ± 0,38 12,40 ± 0,32
MPV (fL) 6,78 ± 1,78 6,88 ± 1,23 7,18 ± 0,51 7,64 ± 1,41 7,10 ± 1,79
Linfócitos (%) 73,50 ± 6,53 71,20 ± 2,24 71,60 ± 6,87 66,90 ± 5,56 74,90 ± 5,00
Monócitos (%) 8,05 ± 1,17 6,87 ± 0,25 6,62 ± 1,40 8,80 ± 1,77 7,52 ± 0,92
Granulócitos (%) 23,20 ± 1,40 23,05 ± 1,00 23,20 ± 2,70 19,15 ± 4,50 19,54 ± 3,30

Os valores representam a média ± SD (n = 5). Diferença estatística do grupo controle (ANOVA seguida pelo teste de Tukey). VCM: Volume Corpuscular Médio; MCH: Hemoglobina
Corpuscular Média; MCHC: Concentração Média de Hemoglobina Corpuscular; RDW: Largura de distribuição das hemácias; VPM: Volume Plaquetário Médio.

lobular e aumento do parênquima não lobular em grupos de animais cápsula foram observadas (Tabela 9).
(machos e fêmeas) tratados comC. icacoextrato aquoso e no grupo
satélite, quando comparados aos animais do grupo controle (Tabela 7). 4. Discussão

A análise morfométrica dos rins revelou aumento do diâmetro e A falta de informação sobre a eficácia e segurança das plantas
volume dos glomérulos nos animais tratados com oC. icaco extrato medicinais é um dos principais problemas no uso de preparações
aquoso ou grupo satélite quando comparado ao controle. Nenhuma medicinais tradicionais, dado o aumento do seu uso em todo o mundo (
mudança significativa no diâmetro e volume do Bowman's Araújo et al., 2017;Kohler e Baghdadi-Sabeti, 2011). modelos de animais

Tabela 6
Efeito da administração oralC. icacoextrato aquoso de folhas (AECi 100, 200 e 400 mg/kg) sobre os parâmetros bioquímicos de camundongos tratados por 28 dias consecutivos.

Parâmetros fêmeas

Ao controle 100 mg/kg 200 mg/kg 400 mg/kg Satélite

Glicose (mg/dL) 133,6 ± 4,77 138,6 ± 11,72 140,6 ± 9,99 145,0 ± 7,98 135,3 ± 9,85
Uréia (mL/dL) 49,6 ± 2,60 48,8 ± 4,71 44,6 ± 3,20 47,2 ± 3,70 49,2 ± 2,16
Creatinina (mg/dL) 0,30 ± 0,07 0,32 ± 0,04 0,32 ± 0,15 0,32 ± 0,08 0,36 ± 0,05
ALP (U/L) 96,6 ± 5,81 102,8 ± 9,44 98,0 ± 6,87 96,2 ± 8,22 98,5 ± 7,50
AST (U/L) 126,5 ± 5,78 137,8 ± 3,34* 150,8 ± 8,87* 152,2 ± 7,36* 121,8 ± 23,22
ALT (U/L) 40,4 ± 3,92 51,2 ± 3,96*** 51,5 ± 3,20*** 52,4 ± 2,5*** 43,3 ± 4,08
Proteínas totais (g/dL) 5,2 ± 0,21 5,0 ± 0,40 5,0 ± 0,40 5,2 ± 0,19 5,2 ± 0,10

Parâmetros machos

Ao controle 100 mg/kg 200 mg/kg 400 mg/kg Satélite

Glicose (mg/dL) 146,5 ± 16,36 158,2 ± 15,66 137,5 ± 18,88 157,0 ± 18,92 139,8 ± 12,35
Uréia (mL/dL) 50,2 ± 3,18 53,5 ± 2,38 50,2 ± 2,82 48,7 ± 3,95 43,5 ± 1,87
Creatinina (mg/dL) 0,32 ± 0,02 0,32 ± 0,08 0,32 ± 0,04 0,34 ± 0,08 0,40 ± 0,14
ALP (U/L) 142,8 ± 15,29 161,6 ± 16,10 168,7 ± 22,13 177,2 ± 17,5* 150,4 ± 15,78
AST (U/L) 127,2 ± 4,29 165,4 ± 12,0*** 169,3 ± 9,2*** 171,2 ± 12,8*** 119,1 ± 26,14
ALT (U/L) 42,8 ± 1,83 68,20 ± 9,88*** 62,7 ± 6,53*** 67,0 ± 3,90*** 55,0 ± 12,24
Proteínas totais (g/dL) 5,1 ± 0,38 4,9 ± 0,62 5,1 ± 0,40 4,92 ± 0,49 5,1 ± 0,23

Os valores representam a média ± DP (n = 5). AST: Aspartato aminotransferase; ALT: Alanina aminotransferase; ALP: Fosfatase alcalina. Diferença estatística do grupo
controle (ANOVA seguida pelo teste de Tukey, *p < 0,05, ***p < 0,001).

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NE Ribeiro, e outros. Toxicologia e Farmacologia Regulamentar 113 (2020) 104643

Tabela 7
Efeito da administração oralC. icacoextratos aquosos de folhas (AECi 100, 200 e 400 mg/kg) sobre a massa absoluta (g) e relativa (%) dos órgãos de camundongos tratados por 28 dias
consecutivos.

Órgão fêmeas

Ao controle 100 mg/kg 200 mg/kg 400 mg/kg Satélite

Fígado (g) 2,48 ± 0,30 2,30 ± 0,10 2,60 ± 0,30 2,5 ± 0,18 2,40 ± 0,28
Fígado (%) 5,25 ± 0,51 5,45 ± 0,06 5,79 ± 0,59 5,61 ± 0,74 5,23 ± 0,48
Rim (g) 0,25 ± 0,03 0,24 ± 0,04 0,27 ± 0,04 0,25 ± 0,03 0,20 ± 0,01
Rim (%) 0,55 ± 0,06 0,58 ± 0,09 0,64 ± 0,06 0,59 ± 0,09 0,60 ± 0,04
Baço (g) 0,24 ± 0,03 0,27 ± 0,05 0,23 ± 0,03 0,28 ± 0,04 0,23 ± 0,02
Baço (%) 0,56 ± 0,09 0,66 ± 0,17 0,52 ± 0,07 0,64 ± 0,01 0,55 ± 0,06

Órgão machos

Ao controle 100 mg/kg 200 mg/kg 400 mg/kg Satélite

Fígado (g) 2,48 ± 0,15 2,18 ± 0,17 2,09 ± 0,28 2,54 ± 0,19 2,30 ± 0,28
Fígado (%) 5,64 ± 0,48 5,51 ± 0,61 6,00 ± 0,63 6,06 ± 0,17 5,89 ± 0,24
Rim (g) 0,26 ± 0,06 0,19 ± 0,01 0,25 ± 0,04 0,24 ± 0,02 0,24 ± 0,03
Rim (%) 0,60 ± 0,15 0,50 ± 0,01 0,64 ± 0,06 0,62 ± 0,08 0,63 ± 0,07
Baço (g) 0,34 ± 0,07 0,29 ± 0,10 0,30 ± 0,10 0,32 ± 0,09 0,32 ± 0,02
Baço (%) 0,83 ± 0,21 0,81 ± 0,37 0,89 ± 0,36 0,79 ± 0,17 0,81 ± 0,35

Os valores representam a média ± DP (n = 5). Sem significância vs grupo controle, ANOVA seguida pelo teste de Tukey.

são muito importantes para avaliar a toxicidade, seja aguda ou subaguda, devido
à economia de tempo, recursos e esforços, bem como a identificação precoce de
efeitos indesejáveis, sendo estes geralmente preditivos de toxicidade em
humanos (Araújo et al., 2017;Kramer e outros, 2010).
Apesar deC. icacoespécie é amplamente utilizada tanto na alimentação quanto
na medicina tradicional para o tratamento de doenças, não foram encontrados
estudos relatando seu perfil de segurança (Agra e outros, 2007;Albuquerque e
outros, 2007). Neste estudo, vários parâmetros foram avaliados após a
administração aguda e subaguda doC. icacoextrato aquoso das folhas, a fim de
fornecer informações sobre sua toxicidade.
A análise fitoquímica por UPLC-DAD-ESI-QTOF-MS/MS identificou a
presença de terpenos, aglicona e flavonoides glicosilados no AECi. Os
flavonoides foram identificados como derivados da miricetina e da
quercetina. Esses achados corroboram com estudo realizado porBarbosa e
outros. (2006)que identificou Myricetin 3-O-glucuronida (miricitrina) e
quercitrina, entre outros derivados menores de miricetina por análise HPLC/
DAD e HPLC/MS. Além dos dez picos detectados e identificados para
flavonóides, dezesseis foram relacionados a saponinas triterpênicas não
descritas para Chrysobalanus icacoanteriormente. A maioria dos triterpenos
detectados na família Chrysobalanaceae são pentacíclicos com núcleo
molecular oleanano, ursano ou lupano.Feitosa et al., 2012).
De acordo comMichałowicz e Duda (2007), embora esses metabólitos
apresentem importantes atividades biológicas, podem causar toxicidade
hematológica e hepática, podendo causar mutagênese e carcinogênese. Os
flavonóides são compostos encontrados em plantas, vegetais, frutas, chá de
ervas e mel (Ratty e Das, 1988), sendo conhecidos por
vários efeitos, tais como: capacidade antioxidante (Alzand e Mohamed,
2012), vasodilatador (Tsuda, 2012), anti-inflamatório (Georgiev et al.,
2014), antitumoral (Le Marchand, 2002), hepatoprotetor (Hassan, 2012),
antifúngico (Nguyen e outros, 2013), hipolipidêmico (Keshari e outros,
2016) e atividades antimicrobianas (Perumalla e Hettiarachchy, 2011),
além de ser um agente antiviral (Rather e outros, 2013), entre outros.
Os testes toxicológicos realizados em animais experimentais visam fornecer
informações confiáveis sobre os efeitos tóxicos produzidos por um agente
químico, a natureza desses efeitos e as doses seguras de exposição (Krewski e
outros, 2010). OC. icacoextrato aquoso pode ser considerado como possuindo
uma baixa toxicidade de acordo com o método de classe recomendado pela OCDE
423 (OCDE, 2001), enquadrando-se na classe 5 (LD50
superior a 2000 mg/kg), uma vez que não foram registradas mortes ou sinais de
toxicidade, como alterações na ingestão hídrica e alimentar, peso corporal,
parâmetros hematológicos e bioquímicos.
Esses achados corroboram com o estudo realizado porOliveira e cols.
(2014), onde oC. icacoo extrato aquoso da casca não induziu sinais de
toxicidade na dose de 2.000 mg/kg, visto que não houve ocorrência de
morte durante o experimento, nem alterações nos parâmetros fisiológicos
observados (ganho de peso, ingestão alimentar e hídrica, parâmetros
hematológicos e macroscópicos dos órgãos aparência).
No entanto, a análise microscópica mostrou que o AECi produziu uma
pequena lesão hepática, com congestão das veias centrolobulares,
hipertrofia e hiperplasia dos hepatócitos, sobre hepatócitos ativados com
mais de cinco nucléolos, discreta, multifocal e difusa peri-centrilobular micro

Tabela 8
Efeito doC. icacoextrato aquoso foliar (EACi 100, 200 e 400 mg/kg) sobre as porcentagens de parênquima hepático lobular e não lobular dos grupos experimentais
masculino e feminino.

Grupos fêmeas

Ao controle 100 mg/kg 200 mg/kg 400 mg/kg Satélite

Parênquima lobular 89,43 ± 1,07a 83,56 ± 3,18b 80,44 ± 2,23b 79,34 ± 4,91b 78,42 ± 5,84b
Parênquima não lobular 10,57 ± 1,60b 16,44 ± 2,11a 19,56 ± 4,77a 20,66 ± 2,55a 21,58 ± 3,66a

Grupos machos

Ao controle 100 mg/kg 200 mg/kg 400 mg/kg Satélite

Parênquima lobular 93,55 ± 3,72a 82,14 ± 2,09b 81,28 ± 1,47b 79,88 ± 3,12b 80,71 ± 5,84b
Parênquima não lobular 6,45 ± 3,03b 17,86 ± 1,65a 18,72 ± 2,62a 20,88 ± 3,83a 19,29 ± 1,52a

Os valores representam a média ± DP As médias seguidas pela mesma letra nas linhas não diferiram significativamente umas das outras usando o teste de Wilcoxon-Mann-Whitney (P <
0,05).

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NE Ribeiro, e outros.
Figura 2.Fotomicrografia dos fígados de fêmeas e machos dos grupos experimentais. (A–B) controle; (C–D) 100 mg/kg; (E–F) 200 mg/kg; (G–H) 400 mg/kg e (I–J) satélite. V -
veia hepática sem congestão; Ar - veia hepática com congestão; Asterisco - Veia centrolobular congestionada; Seta curta - capilares sinusóides; Seta contínua - cadeia de
hepatócitos; Seta tracejada - hepatócitos vacuolizados. ELE
esteatose. Esses achados aqui descritos são sugestivos de desafio tóxico, porém o
órgão não apresentou processos degenerativos que indicassem efeitos deletérios
da dose de 2000 mg/kg (Figura 1DE ANÚNCIOS). De acordo comDuarte e outros.
(2015), o fígado é suscetível a diversas formas de lesões que são frequentemente
rastreadas na prática clínica e independente da causa, pode ocorrer dano direto a
essas células e suas organelas com a liberação de espécies reativas de oxigênio e
nitrogênio (ROS, RNS). Em estudos deKaneko et ai. (2008)em cães e gatos, um
aumento da atividade plasmática ou sérica de AST geralmente está associado a
danos no fígado, músculo cardíaco ou músculo esquelético.
Os camundongos machos e fêmeas que foram tratados por 28 dias tiveram
uma redução de peso corporal, para todas as doses testadas, este fato pode estar
relacionado com a presença de saponinas triterpênicas no AECI que são
responsáveis por inibir o apetite do animal e consequentemente reduzir o apetite
do animal. peso corporal, até porque os animais que ficaram sob vigilância
conseguiram restabelecer o peso corporal. Um estudo anterior confirmou que os
extratos de ervas, uma mistura deScutellariae RadixePlatycodi Radix,contendo os
ingredientes ativos baicalina e saponina foi capaz de diminuir o peso corporal em
humanos (Cho e outros, 2013). Outro trabalho relatou que a platicodina D, um
importante componente da saponina doPlatycodi Radix, inibe o acúmulo de
gordura e a adipogênese (Zhao e outros, 2005).
Alterações hematológicas e bioquímicas também podem expressar toxicidade
sistêmica de uma substância. Os parâmetros hematológicos são importantes
devido à alta sensibilidade do sistema hematopoiético a agentes tóxicos, podendo
resultar em alterações transitórias ou permanentes.Silva e outros, 2012). Como
observado emTabela 5, não foram encontradas diferenças significativas nos
parâmetros analisados, reforçando ainda mais que o AECi não foi tóxico para o
sistema hematopoiético.
Tabela 6mostra que não foram observadas diferenças nos níveis de
creatinina, uréia, glicose ou proteína total quando comparados ao grupo
controle. De acordo comSá et al. (2015), a creatinina, o biomarcador mais
utilizado para avaliação de lesão renal, é um produto residual da creatina
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Toxicologia e Farmacologia Regulamentar 113 (2020) 104643
produzido a uma taxa praticamente constante no corpo, que é livremente filtrado
pelos glomérulos e não é reabsorvido nos túbulos renais. De acordo comGowda et
ai. (2010), a uréia, principal metabólito derivado da degradação de proteínas, é
90% excretada pelos rins, sendo utilizada como marcador da função renal.
Elevações plasmáticas desses marcadores fornecem evidências de sobrecarga
renal e insuficiência renal aguda.Ding e outros, 2017).
Vários compostos tóxicos são conhecidos por se acumularem no fígado,
onde ocorre a desintoxicação (Clarke e Clarke, 1977). O dano hepático
geralmente é avaliado pela determinação das transaminases séricas (ALT e
AST) e pela medição das proteínas totais. Alterações nos níveis séricos de
transaminases (AST e ALT) e fosfatase alcalina são indicadores importantes
de lesão hepática. Vários processos patológicos podem causar distúrbios
hepáticos e, assim, elevar os níveis dessas enzimas (Giannini e outros, 2005;
Salão e Dinheiro, 2012). A aspartato aminotransferase (AST) é encontrada
em vários tecidos, como coração, músculos, rins, pâncreas e fígado, sendo
liberada no sangue quando ocorre dano tecidual (Yi Chen e outros, 2018). A
alanina aminotransferase (ALT) está presente no citosol e nas mitocôndrias
dos hepatócitos.Han e outros, 2011;Pratt e Kaplan, 2000). Quando ocorre
dano hepático, a ALT é liberada na corrente sanguínea, tornando-a um
indicador muito específico do estado do fígado. AST e ALT podem fornecer
uma avaliação quantitativa do grau de dano aos hepatócitos (Al-Habori et al.,
2002). O presente estudo mostrou que a administração repetida de AECi
(100, 200 e 400 mg/kg) aumenta os níveis séricos de transaminases em
camundongos de ambos os sexos, sugerindo que o composto pode induzir
um efeito hepatotóxico que precisa ser melhor investigado.
O tratamento com AECi não alterou o peso absoluto ou relativo dos órgãos de
camundongos machos e fêmeas. De acordo comLee e outros, (2012), o aumento
ou diminuição do peso corporal pode indicar alterações fisiológicas significativas,
como variações hormonais, distúrbios hepáticos e diminuição da absorção de
proteínas, aminoácidos e outros nutrientes. No entanto, a redução do peso
corporal pode afetar o peso dos órgãos internos (Teo et al., 2002) e é um
parâmetro simples e sensível de toxicidade após exposição a
NE Ribeiro, e outros. Toxicologia e Farmacologia Regulamentar 113 (2020) 104643

Figura 3.Fotomicrografia dos rins de fêmeas e machos dos grupos experimentais. (A–B) controle; (C–D) 100 mg/kg; (E–F) 200 mg/kg; (G–H) 400 mg/kg e (I–J) satélite. Seta
longa - glomérulos normais; ar - vasos congestionados; seta curta - glomérulos com espaço subcapsular reduzido. ELE

Tabela 9
Efeito doC. icacoextrato aquoso foliar (EACi 100, 200 e 400 mg/kg) sobre o diâmetro glomerular (GD), volume glomerular (GV), volume da cápsula de Bowman (VBC) e
diâmetro (DBC) dos rins dos grupos experimental feminino e masculino.

Grupos fêmeas

Ao controle 100 mg/kg 200 mg/kg 400 mg/kg Satélite

DG (μm) 117,27 ± 8,33b 146,11 ± 11,88a 141,14 ± 10,20a 157,01 ± 9,54a 155,70 ± 10,03a
GV (μm3) 127,34 ± 6,61b 147,99 ± 7,29a 150,00 ± 5,35a 154,72 ± 6,56a 152,59 ± 4,44a
DBC (μm) 155,21 ± 3,87a 158,15 ± 4,11a 160,23 ± 4,63a 158,45 ± 3,99a 157,09 ± 3,15a
VCB (μm3) 161,56 ± 7,52a 159,31 ± 6,09a 164,41 ± 4,92a 162,75 ± 6,25a 158,83 ± 7,12a

Grupos machos

Ao controle 100 mg/kg 200 mg/kg 400 mg/kg Satélite

DG (μm) 120,47 ± 10,1b 150,26 ± 7,51a 149,37 ± 9,11a 151,78 ± 6,23a 148,70 ± 8,03a
GV (μm3) 131,72 ± 5,24b 152,05 ± 7,43a 156,16 ± 4,33a 154,79 ± 8,44a 150,11 ± 5,88a
DBC (μm) 161,19 ± 2,11a 163,17 ± 1,05a 162,49 ± 2,06a 164,33 ± 3,25a 163,09 ± 1,15a
VBC (μm3) 162,46 ± 1,14a 164,34 ± 5,12a 165,82 ± 4,61a 164,77 ± 2,45a 165,39 ± 3,18a

Os valores representam a média ± DP As médias seguidas pela mesma letra nas linhas não diferiram significativamente umas das outras usando o teste de Wilcoxon-Mann-Whitney (P <
0,05).

10
NE Ribeiro, e outros.
agentes tóxicos (Thanabhorn e outros, 2006).
Com relação à toxicidade renal, a administração de doses repetidas do
AECi causou uma redução no espaço subcapsular dos glomérulos renais e
congestão de vasos na zona cortical (Figura 2C–J), sugerindo toxicidade
renal.
5. Conclusões
Em conclusão, no extrato aquoso deC. icacofoi identificada a presença
de terpenos, aglicona e flavonoides glicosilados. Embora o AECi nas doses
de 100, 200 e 400 mg/kg tenha causado toxicidade hepática e renal lenta
quando administrado por 28 dias consecutivos, não causou mortalidade.
Não foi estabelecida uma clara relação dose-resposta para estudos
histopatológicos e seus efeitos nos parâmetros bioquímicos, no entanto,
esses efeitos podem estar associados à presença de saponinas no extrato.
Portanto, recomendamos aos usuários desta espécie que não a utilizem por
muito tempo.
Declaração de interesse concorrente
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes
conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam parecer influenciar o
trabalho relatado neste artigo.
Reconhecimento
Agradecemos à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Nível Superior (CAPES), Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro.
Apêndice A. Dados suplementares
Dados complementares a este artigo podem ser encontrados online em
https://doi.org/10.1016/j.yrtph.2020.104643.
Financiamento
Esta pesquisa foi financiada pelas seguintes agências brasileiras:
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(CAPES), Fundação de Amparo a Ciência e Tecnologia do Estado de
Pernambuco (FACEPE) e Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq).
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