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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE BIOLOGIA

DEPARTAMENTO DE CINCIAS FISIOLGICAS

Qumica Fisiolgica - IB 309

Curso Prtico

Professores Idealizadores: Adriana Rayol Pedrenho Svio Amado da Silva Generoso Manoel Chagas Humberto Macharetti

GENERALIDADES SOBRE O CURSO PRTICO DE QUMICA FISIOLGICA


Objetivos gerais: a) Desenvolver habilidade no manuseio dos equipamentos e reagentes; b) Reconhecer a composio de fluidos biolgicos atravs de reaes qumicas; c) Quantificar determinados compostos em fludos biolgicos; d) Interpretar resultados experimentais. e) Fixar o aprendizado terico.

Consideraes importantes: a) Antes das aulas prticas importante que o aluno esteja de posse do procedimento prtico que ser elaborado. b) indispensvel o uso de jaleco no laboratrio. De preferncia para que o avental seja de algodo. c) Quando necessrio, prenda os cabelos. d) No coloque sua bolsa sobre a bancada de prtica, existe uma estante para este fim. e) No permitido fumar no laboratrio. f) No procure sentir o odor dos reagentes utilizados nas prticas. g) Ao aquecer um tubo de ensaio verifique se no haver a possibilidade do lquido espirrar na direo de seu rosto ao ferver. h) Comunique imediatamente ao professor qualquer acidente. E tenha calma. i) Faa silncio.

Caracterizao de constituintes da saliva


FUNDAMENTOS TERICOS A saliva a secreo produzida pelas glndulas salivares, das quais as principais representantes so as partidas, submaxilares e sublinguais. O ser humano produz em mdia 1,5 litros de saliva por dia, os ovinos 5 litros, os eqinos 42 litros e os bovinos 60 litros. Tanto o volume quanto a fluidez da saliva variam em funo de estmulos recebidos do sistema nervoso autnomo, sendo o parassimptico (vago) o predominante. A saliva tem duas funes principais. Ela serve como um suco digestivo e como uma via de excreo. O seu principal componente como suco digestivo a amilase salivar (ptialina) responsvel pelo desdobramento da amilase. Os principais constituintes qumicos da saliva so: gua, amilase, mucina, cloreto de sdio e bicarbonato de sdio. Encontramos ainda na saliva substncias que esto sendo excretadas e que no possuem qualquer funo na digesto tais como o sulfocianeto, o nitrito e a uria. A uria excretada na saliva tem importncia especificamente na digesto dos ruminantes uma vez que a existncia de microorganismos produtores de urase existentes no rmen permitem sua reutilizao no metabolismo dos compostos nitrogenados. Objetivos deste tpico O objetivo de nossa aula de hoje identificar a presena de mucina, cloreto, nitrito e sulfocianeto na saliva. Alm desse objetivo, nesta aula voc dever tambm aprender ou aprimorar-se nas seguintes tcnicas: 1. Medir volumes de lquidos com o auxlio de pipetas. 2. Misturar corretamente reagentes em tubo de ensaio para obter reaes qumicas. 3. Observar e relatar os resultados dos ensaios executados comparando-os com respectivos controles.

PROCEDIMENTO PRTICO Testes para a caracterizao da mucina Fundamento: A mucina o maior componente protico da saliva. Dessa forma, a positividade de testes para protena indicar a presena de mucina. Para evidenci-la vamos utilizar duas reaes, a reao da ninidrina e a reao xantoproteica. A reao da ninidrina positiva para aminocidos e seus compostos e d como produto uma colorao azul/violeta. A reao xantoproteica positiva para aminocidos aromticos (especialmente tirosina) e d como produto uma cor amarela que se intensifica por alcalinizao. Reao da ninidrina tomar em um tubo de ensaio 1 mL de saliva previamente filtrada e 1 mL de soluo aquosa de ninidrina 0,1%. Aquecer em banho-maria fervente por cerca de 10 minutos. O desenvolvimento de cor azul/violeta indica a positividade da reao. Reao xantoproteica tomar em tubo de ensaio 1 mL de saliva filtrada, adicionar 1 gota de HNO3 e trs gotas de H2SO4 concentrado. A reao positiva se revela pelo desenvolvimento de cor amarela resultante da nitrao dos aminocidos aromticos. Resfriar e adicionar NaOH concentrado suficiente para promover alcalinizao. A cor se intensifica.
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Caracterizao do cloreto O cloreto pode ser identificado pela reao com o nitrato de prata, em meio cido, dando cloreto de prata que forma um precipitado branco:
H Cl + AgNO3 AgCl + NO3
+

Colocar em tubo de ensaio 1 mL de saliva filtrada. Adicionar 5 gotas de cido ntrico diludo e 5 gotas da soluo de nitrato de prata. A reao positiva se revela pelo desenvolvimento de precipitado branco. Fazer um branco de reao utilizando gua no lugar da saliva. Caracterizao do Sulfocianeto O sulfocianeto presente na saliva resulta de detoxicao heptica do cianeto derivado da decomposio de cianidrinas (encontradas naturalmente na mandioca e em outros alimentos) pelo cido clordrico do suco gstrico. Sua presena na saliva pode ser evidenciada pela reao com o cloreto frrico que leva produo do sulfocianeto frrico, produto de cor vermelha.

3SCN + FeCl3 ( SCN ) 3 Fe + 3Cl


Como o cloreto frrico corado em amarelo, nos casos de haver pouco sulfocianeto na saliva, o mais freqente, s poderemos identific-lo fazendo a reao do branco com gua em lugar da saliva. Tomar em tubo de ensaio 1 mL de saliva filtrada, 5 gotas de cido clordrico e 5 gotas de cloreto frrico 5%. A reao positiva se revela pelo aparecimento de cor vermelha (laranja). Caracterizao do nitrito O nitrito encontrado na saliva resulta da detoxicao heptica de nitrato proveniente naturalmente de alimentos como o espinafre ou adicionado como conservante a alimentos de origem animal. Sua presena pode ser identificada por sua reao com o iodeto de potssio que ocorre com liberao de iodo. Colocar em tubo de ensaio 1 mL de saliva filtrada, duas gotas de cido sulfrico diludo (10%) e duas gotas de iodeto de potssio (10%). Desprende-se iodo que pode ser melhor observado pela adio de 1 mL de goma de amido 1% levando ao desenvolvimento de cor azul.

Caracterizao da atividade amiloltica da saliva


FUNDAMENTOS TERICOS Introduo O amido um polissacardeo constitudo por unidades D-glicose, sendo a principal reserva glicdica dos produtos alimentcios de origem vegetal. O amido, sob o ponto de vista qumico, no um produto puro, j que constitudo de 2 componentes moleculares de estruturas qumicas semelhantes mas no idnticas: a amilose - cujos resduos de glicose so unidos por ligaes -1,4, formando um polmero de cadeia linear - a amilopectina - polmero de estrutura molecular complexa cujas unidades glicosdicas encontram-se unidas por ligaes -1,4 e -1,6. O amido, em geral, contm em torno de 20% de amilose e 80% de amilopectina. Os cereais (milho, trigo, cevada, arroz), os tubrculos (batata, mandioca, inhame), alguns frutos (banana) e troncos (palmeira do sagu) so particularmente ricos em amido. A utilizao do amido na alimentao e na indstria depende, em grande parte, da suas propriedades coloidais, pois o comportamento do amido frente a gua extremamente complexo. Na clula vegetal, ele armazenado em grnulos microscpicos que no so afetados de maneira perceptvel pela gua fria e so resistentes tambm ao ataque enzimtico. No entanto, se a parede externa da clula for rompida por algum mtodo mecnico (por exemplo, moagem) e tratada com gua aquecida, os grnulos ainda intactos absorvem gua, incham e iniciam um processo de desintegrao, assim a amilose e amilopectina passam para a soluo. A uma temperatura crtica (80-85 C) o amido liberado sofre uma rpida gelatinizao com aumento substancial do volume da suspenso por conta do desenovelamento das cadeias. Esta etapa conhecida, na indstria, como cozinhamento. A suspenso coloidal formada apresenta-se como um mingau ou goma e, a frio, solidifica dando origem a gis consistentes com propriedades adesivas. O amido gelatinizado largamente empregado como agente espessante, como adesivo ou como encorpante de tecidos e papis. Se o aquecimento for mantido e temperaturas de 100C ou mais elevadas forem atingidas, o grnulo inchado totalmente desintegrado e hidratado at formar um sol coloidal. A completa desagregao do amido na gua pode ser obtida por aquecimento sob presso (120-130 C) por 2 horas. Nestas condies, a estrutura das cadeias, tanto de amilose e quanto de amilopectina desenovelada, o que a torna mais susceptvel hidrlise. Ao se diminuir a temperatura de uma disperso de amido, pode-se, em certas circunstncias, observar o fenmeno de retrogradao ou regenerao que corresponde volta para a condio de insolubilidade, com formao de agregados cristalinos, devido tendncia das cadeias de amilose, principalmente, se reassociarem. A retrogradao um fenmeno parcialmente reversvel por aquecimento do material cristalizado. No entanto, repetidos ciclos de retrogradao levam a formao de um material irreversivelmente insolvel. A degradao do amido pode ser realizada por via qumica ou enzimtica, sendo o processo conhecido como sacarificao. Ao de cidos sobre o amido A cintica de clivagem das ligaes glicosdicas por cidos depende basicamente da concentrao e do tipo de cido utilizado, assim como da temperatura do processo. A hidrlise cida do amido considerada, em linhas gerais, como aleatria porque todas as ligaes glicosdicas do amido so igualmente susceptveis clivagem, levando formao
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de -D-glicose. No entanto, existem informaes que, em condies no muito energticas, as ligaes -1,6 so 1 a 10 vezes mais resistentes ao rompimento que as ligaes -1,4 e que as ligaes mais internas resistem um pouco mais (cerca de 1,8 vezes) que os terminais redutores da molcula. A ao de cidos sobre o amido nos grnulos extremamente lenta quando comparada ao amido em suspenso, o que explica a necessidade do prvio cozinhamento para facilitar a hidrlise. Este procedimento expe as ligaes glicosdicas ao ataque de cidos, sendo que a velocidade de hidrlise pode ser acelerada pelo aumento da temperatura. Ao de enzimas sobre o amido As enzimas so protenas com atividade cataltica. Elas aceleram reaes termodinamicamente favorecidas. Os compostos transformveis pela ao da enzima recebem o nome de substrato. As enzimas so especficas em relao reao que catalisam e algumas exibem tambm alto grau de especificidade em relao ao substrato embora a maioria delas possa atuar sobre alguns poucos substratos naturais. Sabe-se que as enzimas diminuem a energia de ativao de uma reao e desta forma permitem um aumento na velocidade da reao. Tal aumento pode ser explicado em termos dos eventos qumicos que ocorrem quando da interao da enzima (E) com o substrato (S). A complementariedade entre E e S envolve interaes hidrofbicas e eletrostticas como tambm em muitos casos interaes covalentes que se formam transitoriamente. As fortes foras atrativas que se estabelecem entre a estrutura tridimensional do centro ativo (ou centro cataltico) da enzima e o substrato permitem a aproximao entre os reagentes numa orientao apropriada, o que propicia um aumento na concentrao efetiva dos reagentes. Todos estes fatores contribuem para o aumento observado na velocidade, para as altas especificidades e eficincia na liberao de produtos das enzimas. Existem vrias enzimas capazes de catalisar a hidrlise de amido (entre elas as amilases, -amilases, amiloglicosidases, amido fosforilase, isoamilase) que so amplamente difundidas na natureza e se diferenciam no s pela composio em aminocidos, como tambm pelo modo de ao, pH timo, temperatura tima e outros. Estes parmetros tambm podem variar para cada enzima segundo sua origem (animal, vegetal ou microbiana). As -amilases so encontradas virtualmente em todas as clulas vivas. A ptialina (amilase salivar) e amilopsina (amilase pancretica) so -amilases que atuam no processo digestivo. Elas podem ser obtidas com facilidade de duas fontes naturais: a saliva que contm exclusivamente amilase salivar e a urina que contm resduos das duas amilases. Normalmente a atividade amiloltica urinria muito baixa. Quando ocorrem processos inflamatrios que determinam destruio acelerada de clulas nas glndulas salivares (parotidite = cachumba) ou pancreticas (pancreatite) ocorre a liberao de grande quantidade de amilase no plasma sanguneo com consequente elevao da atividade amiloltica urinria. As -amilases so endoenzimas, visto que atuam dentro da cadeia amilcea de forma aleatria, rompendo ligaes -1,4. Em uma suspenso de amido gelatinizada, a adio de -amilase leva a uma queda rpida da viscosidade, evidenciando a fragmentao da cadeia polimrica. Cerca de 20% dos fragmentos hidrolticos encontrados nos primeiros estgios de hidrlise so constitudos de oligossacardeos de baixo PM (maltose, maltotriose, maltotetrose) formados pela quebra simultnea de vrias ligaes glicosdicas. Os 80% restantes so constitudos de oligossacardeos de PM varivel, denominados genericamente como dextrinas. O produto final da hidrlise completa da amilose pelas 5

amilases so maltose e a -D-glicose. Por outro lado, como estas enzimas no atuam nos pontos de ramificao (ligaes -1,6) os produtos finais de hidrlise da amilopectina so maltose, glicose e dextrinas ramificadas de baixo PM. A caracterizao da atividade amiloltica pode ser obtida pela evidenciao de seus produtos de hidrlise, as dextrinas. Observemos a seguinte sequncia: AMILOSE ERITRODEXTRINAS ACRODEXTRINAS MALTOSE + I2 + I2 + I2 + I2 azul vermelho incolor A sequncia descreve os produtos obtidos da reao da amilose com as amilases e as cores que os mesmos do em presena do iodo. Dessa forma, se tomarmos uma soluo de goma de amilo (amilose) e a ela adicionarmos iodo obteremos um produto azul. Se permitirmos que a goma de amilo seja hidrolisada parcialmente pela amilase obteremos a formao da eritrodextrina que, pela adio de iodo, fornece a cor vermelha. Com hidrlise em maior grau obteremos acrodextrinas e maltose que no reagem com o iodo.

So objetivos das prticas relacionadas a este tpico:


1. Descrever com suas prprias palavras a sequncia de transformaes operadas pela amilase na molcula da amilose. 2. Caracterizar a presena de produtos da atuao da amilase sobre a amilose pela observao das cores produzidas pela adio de iodo ao meio onde a enzima age. 3. Explicar detalhadamente a funo de cada um dos reagentes utilizados no mtodo cintico de determinao da atividade da amilase. 4. Executar uma reao enzimtica com tempo pr-fixado fazendo uso do cronmetro para control-lo. 5. Executar uma reao enzimtica de acordo com a concentrao da enzima. 5 Interpretar a variedade de cores obtidas nos diversos tubos nos quais se faz o teste de atividade amiloltica pelo mtodo cintico. 6 Interpretar a variedade de resultados quando submete-se a enzima a tratamento por fervura ou com HCl.

PROCEDIMENTO PRTICO Determinao da atividade da amilase salivar de acordo com o tempo de reao. 1. Material : . amido - soluo de amido 0,1% ( 0,1g/100ml) em soluo de NaCl 0,9% (salina fisiolgica) . Enzima alfa-amilase de saliva . soluo de NaCl 0,9% . soluo de Lugol (I2 + I) . soluo de TCA 5% 2. Objetivo: Testar a atividade amiloltica da saliva humana diluda com soluo salina fisiolgica (NaCl 0,9%) em diferentes tempos. A reao ser paralisada pela adio de cido tricloroactico (TCA) a 5% e o resultado observado aps a adio de lugol. 3. Procedimento: Tempo zero O testemunha de um mtodo cintico denominado tempo zero. Nele no ocorre a atuao da enzima no respectivo substrato. No teste de hoje vamos fazer o tempo zero adicionando o cido tricloroactico saliva (enzima) antes de essa ter entrado em contato com a amilose (substrato). Isso significa que a amilase ter sido desnaturada antes de entrar em contato com o substrato. Numere os tubos de 0 a 5. Esses nmeros sero apenas referncias e no representam tempos. Siga o quadro abaixo para adio dos reagentes.

Material Zero Um Dois Trs Quatro Cinco Saliva Filtrada 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Soluo Fisiolgica 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 2,9 TCA 5% 1,0 -----Goma de amido 0,1% 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 NESTE INTERVALO MARCAR O TEMPO DE REAO TCA 5% -1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 Lugol (gotas) 2 2 2 2 2 2 Para estipular o tempo, inicie com 30 segundos e provavelmente haver a necessidade de encurtar esse tempo. Observe e anote os resultados.

PROCEDIMENTO PRTICO Determinao da atividade da amilase salivar de acordo com a concentrao enzimtica. 1. Material : . amido - soluo de amido 0,1% ( 0,1g/100ml) em soluo de NaCl 0,9% (salina fisiolgica) . Enzima alfa-amilase de saliva . soluo de NaCl 0,9% . soluo de Lugol (I2 + I) . soluo de HCl 0,1M 2. Objetivo: Acompanhar a hidrlise do amido utilizando um catalisador biolgico (enzima). 3. Procedimento: . Preparar soluo da enzima coletando saliva em um tubo de ensaio e depois diluir 1:100 com soluo de NaCl 0,9%. (Pegar 0,1ml e completar o volume para 10ml com soluo salina) . Prepare uma bateria de 10 tubos e coloque em cada um deles 1ml de soluo NaCl 0,9%. . Coloque 1ml de soluo de saliva diluda no primeiro tubo, misture bem e retire 1ml da mistura feita neste tubo e transfira para o segundo tubo, procedendo da mesma forma. Repita a operao nos tubos restantes da srie. Retire 1ml da mistura do ltimo tubo e despreze. . Adicione a cada um dos tubos, 2ml da soluo de amido 0,1%. Misture. . Coloque a bateria de tubos num banho Maria a 37oC por 30 minutos e resfrie para interromper o processo enzimtico. . Revelar o resultado adicionando a cada tubo 1 a 2 gotas da soluo de Lugol e misture. . Fazer tambm um branco de reao com gua destilada substituindo a enzima. O teste considerado positivo para o amido quando apresenta cor azul intensa. Observar: a) em que tubos aparece a cor azul. b) qual(is) as cores que aparecem nos outros tubos. c) anotar os resultados e explicar o que ocorreu ao se fazer o ensaio com diferentes diluies da enzima

Repetir o ensaio acima com as variantes abaixo:


1) Ferver por 15 minutos a mistura de saliva antes de realizar o ensaio. 2) Usar como lquido diluidor no teste uma soluo de HCl 0,1M.

Anotar os resultados

Caracterizao dos constituintes da bile


FUNDAMENTOS TERICOS A bile uma secreo isotnica, viscosa, de cor amarelo-ouro, produzida pelo fgado. Ela essencial digesto e absoro de lipdeos. No ser humano o seu volume varia de 500 a 1000 mL a cada 24 horas. No co so excretados cerca de 20 mL por dia por Kg de peso corporal. Na ovelha o volume de 30 mL/Kg x dia e no coelho 150 mL/Kg x dia. A bile tambm serve como via de excreo para substncias que, por serem pouco solveis em gua, no podem ser excretadas pelos rins. Neste caso se encontram os cidos graxos, o colesterol e seus steres, sais de clcio e pigmentos biliares. Encontramos ainda na bile formas de excreo de algumas enzimas tais como a fosfatase alcalina. A elevao da atividade da fosfatase alcalina no soro indicativa da ocorrncia de obstruo biliar. Os sais biliares, em sua maioria derivados do cido gliclico (peptdeo resultante da conjugao do cido clico com a glicina) so os principais agentes detergentes da bile, responsveis pela hidrossolubilizao dos lipdeos alimentares a nvel de duodeno. O cido gliclico sofre desconjugao resultante da fermentao bacteriana no leo e o cido clico, liberado neste processo, reabsorvido e retorna ao fgado para ser reutilizado. Este processo denominado circulao ntero-heptica dos sais biliares. Os pigmentos biliares, cujo representante principal a bilirrubina, se originam do catabolismo de hemeprotenas. Sua principal fonte a hemoglobina liberada quando da lise de eritrcitos velhos nas clulas do sistema retculo endotelial. Os principais rgos nos quais encontramos estas clulas so o bao e a medula ssea eritropoitica. No fgado encontramos as clulas de Kupfer que tambm participam deste sistema. O catabolismo da hemoglobina no sistema retculo endotelial termina com a produo da bilirrubina. Esta, por ser pouco solvel em gua, carreada na corrente sangunea ligada albumina. Chegando ao hepatcito, esta bilirrubina (conhecida como bilirrubina de reao indireta) se desliga da albumina e conjugada com duas molculas de cido glicurnico para formar a bilirrubina diglicurondeo (bilirrubina de reao direta) que excretada pela bile e eliminada nas fezes:

Bilirrubina + 2UDP glicuronato UDP diglicurondio de bilirrubina + UDP glicuronilt tranferase


A conjugao da bilirrubina com compostos orgnicos polares, como cido glicurnico, outro fato que garante sua excreo com a bile e eliminao com as fezes. Isto quer dizer que se a bilirrubina fosse excretada em sua forma no conjugada seria reabsorvida pelos epitlios das vias biliares e do intestino delgado. Quando ocorre obstruo biliar alguns canalculos arrebentam por causa da hiperteno e a bilirrubina se espalha pelos tecidos provocando a ictercia. Objetivos da aula: 1. Esquematizar o processo de biossntese dos sais biliares a partir do colesterol. 2. Esquematizar o processo de biossntese dos pigmentos biliares a partir da hemoglobina. 3. Exexcutar as tcnicas reativas de Pettenkoffer e Gmelin e explicar o fundamento de cada uma. 4. Explicar a propriedade tensioativa dos sais biliares.

PROCEDIMENTO PRTICO Caracterizao de constituintes da Bile Na aula de hoje vamos fazer algumas reaes que nos permitem evidenciar a presena de esterides (colesterol e cidos biliares) e de pigmentos biliares (bilirrubina). Faremos ainda testes que nos permitiro demonstrar a propriedade tensioativa da bile. Identificao de esterides Reao de Pettenkofer Tomar em um tubo de ensaio 1 mL de gua destilada, 10 gotas de bile e 5 gotas de uma soluo de furfural. Misturar bem, batendo o tubo vrias vezes contra a palma da mo. Verter pela parede do tubo 1 mL de cido sulfrico concentrado sem agitar. O cido sulfrico por ser mais pesado vai para o fundo do tubo. Depois de alguns minutos forma-se na interface um anel de cor vermelha. Identificao de pigmentos biliares Reao de Gmelin Tomar em um tubo de ensaio 1 mL de bile no diluda e adicionar sem misturar 1 mL de cido nitroso-ntrico. Nesta tcnica deve-se tomar o cido na pipeta e introduzir a mesma no tubo com bile mantendo o bocal obturado com o dedo at que o bico toque o fundo do tubo. A partir da libera-se o bocal da pipeta suavemente e ergue-se a mesma deixando o cido nitroso-ntrico fluir lentamente. A reao positiva indicada pela formao de um anel de cor verde na interface. A cor verde depende da formao da biliverdina, resultante da oxidao da bilirrubina. Aparecem ainda anis de outras cores porque o processo de oxidao suficientemente violento para levar formao de outros produtos. Demonstrao da propriedade tensioativa Chuva de enxofre Tomar trs frascos com gua destilada. Ao segundo deles adicionar 5 gotas de detergente comercial e ao terceiro 5 gotas de bile no diluda. Misturar fazendo movimentos circulares com o frasco na mesa. Adicionar superfcie de cada frasco enxofre em p e observar o que acontece com o mesmo.

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Fundamentos de Colorimetria e Espectrofotometria


FUNDAMENTOS TERICOS As solues biolgicas possuem vrios componentes alm do solvente gua. O plasma sanguneo possui mais de mil substncias entre ons Na+, K+, Cl-, HCO3-; pequenas molculas como glicose, uria, creatinina, colesterol, polissacardeos, lipdeos complexos, polipeptdeos, protenas simples e conjugadas, hormnios, vitaminas, pigmentos, etc. Estudar a composio qualitativa e quantitativa desses sistemas indispensvel para as cincias ligadas biologia. Os mtodos biofsicos de estudo permitem separar, identificar e quantificar estes componentes. Dentre estes mtodos, encontramos a anlise por espectrofotometria. A espectrofotometria consiste em usar o espectro radiante para estudar as solues biolgicas. No procedimento bsico, um feixe de energia atravessa a soluo, e sua absoro oferece informaes sobre a qualidade e quantidade dos componentes presentes. Para as anlises espectrofotomtricas, a faixa do espectro de radiao mais utilizada vai do ultravioleta ( = 200 nm) at o infravermelho ( = 1000 nm). A faixa do visvel vai de 400 a 750 nm, onde os seres humanos experimentam uma gama de sensaes visuais denominada cores (veja Figura abaixo). Abaixo de 400 e acima de 750 nm, os seres humanos no sentem nenhuma sensao. Portanto, cor uma sensao pscofsica que associamos a um comprimento de onda predominante. Na figura 1 temos uma classificao prtica das cores, onde so cores puras, e suas combinaes podem dar o branco (cores que se anulam) ou matiz (mistura de cores). Acredita-se que o olho humano seja capaz de perceber mais de 180 a 200 matizes. O preto ausncia de todas as cores. Figura 1 Espectro visvel. No UV, nenhuma sensao. No visvel, h correspondncia entre o comprimento de onda e a cor (mais rigorosamente, entre a freqncia e a cor). No IV, novamente nenhuma sensao. Os picos para o mximo de cor so: vermelho, 680; laranja, 615; amarelo, 580; verde, 535; azul, 465; violeta, 415.

Alm do visvel, outros comprimentos de onda da energia radiante podem ser absorvidas por molculas do meio, provocando modificaes: Regio Raio x Efeito sobre a molcula (no meio) Eltrons de nveis excitados para nveis energticos mais altos. UV 100-400 nm Eltrons de nveis excitados para nveis energticos mais altos. Visvel 400-800 nm Eltrons de nveis excitados para nveis energticos mais altos. IV 800 nm-50 Vibrao molecular. Microonda 50-300 Rotao molecular. -9 OBS: nm (Nanmetro) = 10 m e (Microm) ou m (Micrmetro) = 10-6 m.
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0,1-100 nm

Uma distino importante entre cor e pigmento. Chama-se cor ao espectro de energia radiante, e pigmento a qualquer matria que d a sensao de cor. Um feixe de luz azul cor, uma manha de tinta azul pigmento. As cores somadas se anulam, dando o branco. Os pigmentos somados do o preto. Na prtica esses dois termos so agrupados como cor, mas h uma diferena: em energia e o outro matria. A luz usada em espectrofotometria chamada luz monocromtica, pois referente a um nico comprimento de onda que obtido atravs de um espectrofotmetro:

Figura 2 - Esquema do Espectrofotmetro: A fonte de luz tem seu feixe focalizado pelo colimador (C) sobre um prisma de quartzo. A luz decomposta em ultravioleta (UV), violeta (VI), azul (AZ), verde (VE), amarelo (AM), laranja (LA), vermelho (VR) e infravermelho (IV). Ume fenda seletora escolhe uma fina poro desse espectro como luz monocromtica (luz MC). A luz MC passa atravs da cubeta que contm a soluo, e parte absorvida, parte transmitida. Uma fotoclula acoplada a um galvanmetro mede a luz transmitida. A diferena a luz absorvida. O galvanmetro tem uma escala especial de 0,0 a 2,00, que indica leituras lineares (aritimeticamente proporcionais absoro da luz). As fontes de luz para ultravioleta so geralmente lmpadas de Hidrognio, ou de Deutrio. Para o visvel e infravermelho, lmpadas de tungstnio e irradiadores de cermica so usados. A decomposio da luz feita, alm de primas, por grades de difrao. Um mtodo simples de obter luz MC usar filtros, que so pedaos de vidro colorido especiais, que deixam passar a luz da sua cor. A luz MC dos filtros de qualidade inferior dos primas e grades. Existem duas razes para a utilizao da luz monocromtica: 1 Razo qualitativa: O nico modo de saber quais as cores (comprimentos de onda) que so absorvidos, passar luz MC de vrios comprimentos de onda, uma de cada vez, atravs da soluo teste (ver Figura 3). Na Figura abaixo est demonstrado que para se medir a soluo teste usada deve-se usar a luz verde, pois foi a mais absorvida (90%) pela amostra, e assim, proporcionar grande sensibilidade medida. A luz violeta e amarela so so adequadas porque so pouco absorvidas.

Figura 3 Absoro diferencial de luz monocromtica.

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possvel obter comprimentos de onda que sejam especficos para certas substncias atravs da construo de uma curva de absoro espectral (Figura 4); onde a substncia em questo (aquela que se quer determinar) colocada na cubeta, e os comprimentos de onda do UV at o IV vo sendo passados, e a absoro de cada faixa medida. Faz-se um grfico comprimento de onda x absoro. Figura 4 Curvas de absoro espectral para protenas e para cidos nuclicos, notar que o pico de absoro mxima caracterstico para cada substncia: protenas = 280 nm e cidos nuclicos = 260 nm.

2 Razo quantitativa: Quando se est medindo a luz absorvida, a passagem de energia no absorvida ir prejudicar a leitura, dando um resultado alto e falso. Assim, fundamental usar-se luz MC que seja a maior parte absorvida, para determinar a presena de uma substncia em soluo (ver Figura 5). Figura 5 Absoro da luz NO monocromtica. Foi usada a soluo teste equivalente quela da figura 3. A luz no absorvida (luz espria) 55% transmitida.

A lei de Lambert & Beer possvel, por simples comparao visual, determinar a concentrao aproximada de uma soluo colorida comparando-a com solues do mesmo soluto que tenham concentraes conhecidas. Quando dispomos de aparelhos capazes de medir a intensidade da luz transmitida pelas solues (fotocolormetros ou espectrofotmetros) podemos determinar a concentrao da soluo desconhecida pela aplicao da lei de Lambert & Beer que correlaciona a intensidade da luz transmitida com a concentrao do soluto corado. Lei de Lambert Quando a concentrao da substncia constante, a absoro depende do comprimento do trajeto ptico. Lei de Beer Quando o trajeto ptico constante, a absoro depende da concentrao. Combinando as duas leis, Absoro proporcional ao trajeto ptico e concentrao.

I = I 0 e k .c.l
I = Intensidade da luz emergente I0 = Intensidade da luz incidente e = Base do sistema de logartimos neperianos (2,718228)
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k = absortividade (constante caracterstica do soluto) O termo e-k.c.l representa o fator de proporcionalidade entre I e I0. Como o segundo membro da equao possui apenas um fator podemos concluir que os valores absolutos das intensidades no so importantes e sim a relao entre eles. Em termos prticos, podemos concluir que o fato de iluminarmos uma soluo com luz de uma intensidade maior ou menor no afeta o resultado da medida de sua concentrao. O expoente de e est afetado de sinal negativo, o que significa que, quanto maior for a concentrao do soluto, ou a espessura da soluo atravessada pela luz, tanto menor ser o valor da intensidade da luz emergente para uma determinada intensidade incidente. Como a varivel independente que desejamos medir (no caso, a concentrao) se encontra no expoente, a curva que reflete a relao entre ela e a intensidade apresenta o formato exponencial e no uma reta (ver Figura 6). Figura 6 Curva de calibrao ou curva padro: Obtida com a leitura da absoro de padres de vrias concentraes.

Modificaes na lei de Lamber & Beer Considerando que o objetivo da espectrofotometria a determinao de concentraes desconhecidas de solues de um mesmo soluto, uma tarefa repetitiva, torna-se necessrio dispor de um mtodo que permita fazer os clculos com pequeno esforo. Chamamos de interpolao a operao matemtica que permite, a partir de uma curva e do valor de uma das coordenadas de um ponto, obter a outra coordenada pela determinao do ponto onde a coordenada conhecida intercepta a curva. Algumas operaes podem ser feitas com o objetivo de simplificar o trabalho. Vejamos: 1. J que os valores absolutos das intensidades no so importantes podemos tomar a relao entre elas que expressamos na escala percentual. A funo assim definida denominada Transmitncia e expresso pela letra T.

T I = 100 I 0
2. O uso do expoente de base e complicado. A melhor soluo utilizar a base 10. Esta operao se constitui numa mudana da base do sistema de logaritmos que pode ser obtida multiplicando-se o expoente p 0,4342.

e k .c.l = 10 0, 4342.k .c.l


O produto 0,4342.k um produto de duas constantes e pode ser representado por uma s letra. Escolhemos a letra a (inicial de absortividade) para representar a medida tomada em escala decimal. A equao de Lambert & Beer pode, portanto, ser reescrita, na forma:
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T = 10 a.c.l 100
O fato de a correlao entre concentrao e transmitncia ser expressa por uma exponencial determina que a interpolao seja uma operao complicada porque envolve o uso de logaritmos diretamente expresso como segue:

T a .c .l log = log 10 100 log T 2 = a.c.l 2 log T = a.c.l

A nova funo, gerada na transformao: 2 logT recebe o nome de Absorvncia e costuma ser representada pela letra A ou por Abs. Dessa forma a equao pode ser reescrita como:

A = a.c.l

O que demonstra que a Absorvncia de uma soluo proporcional (relao linear) concentrao do soluto corado. Traado da curva padro os ensaios da colorimetria A correlao entre a concentrao de um soluto e a sua absorvncia expressa em grfico por uma curva padro (ver figura 6). Traamos a curva padro tomando vrios ensaios cujas concentraes so conhecidas com preciso (denominados ensaio padro) e um ensaio no qual no existe a substncia a ser dosada (ensaio em branco). O ensaio em branco, testemunha do mtodo colorimtrico, serve para que possamos descontar, na medida da intensidade da luz emergente, a quantidade de luz que absorvida por outras substncias que no sejam o soluto cuja concentrao desejamos medir: o vidro do frasco no qual vamos colocar a soluo (cubeta), o solvente, os restos de reagentes necessrios para o desenvolvimento da cor. Na gria laboratorial dizemos que o ensaio em branco serve pra zerar o espectrofotmetro porque quando o colocamos no aparelho de medida, ajustamos os controles para que o ponteiro indique zero da escala de absorvncia ou 100% de transmitncia. A curva obtida pela ligao dos pontos por meio de uma reta. importante observarmos que a reta traada no vai passar obrigatoriamente sobre os pontos representativos dos ensaios padro mas deve representar a tendncia mdia dos mesmos. De posse da curva padro e da medida de absorvncia de um ensaio de concentrao desconhecida podemos, por interpolao na reta determinar a concentrao do desconhecido. Uma alternativa o clculo analtico, sem o auxlio do grfico. Ele obtido pela comparao das relaes:

Ap = a.Cp.l Ad = a.Cd .l

Onde Ap e Ad representam, respectivamente as absorvncias do padro e do desconhecido. A combinao das duas equaes permite chegar relao que ser usada mais freqentemente:
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Ap Ad = Cp Cd
Objetivos: 1.Conceituar colorimetria e espectrofotometria. 2. Distinguir um fotolocormetro de um espectrofotmetro. 3. Dar o enunciado da lei de Lambert-Beer. 4. Discutir os requisitos bsicos para a execuo das tcnicas colorimtricas. 5. Conceituar: Ensaio em branco, ensaio padro e ensaio desconhecido. 6. Tendo conhecimento dos passos seguidos na execuo de um ensaio colorimtrico e da concentrao do padro, calcular a concentrao do ensaio desconhecido.

PROCEDIMENTO PRTICO Determinao do espectro de absoro de corantes e construo de curva padro

Material
Soluo de azul de bromofenol 0,01 mg/ml Soluo de metilorange 0,01 mg/ml Espectrofotmetro

Objetivos
Determinar o espectro de absoro de solues de azul de bromofenol (ABF) e de metilorange (MO). Caracterizar o comprimento de onda onde ocorre absoro mxima. Determinar o espectro de absoro de uma mistura de ABF e MO. Construir uma curva padro para cada um dos corantes nos determinados.

Procedimento
A) Determinao do Espectro de Absoro: 1. Com a soluo de ABF varrer o espectro determinando as absorvncias nos comprimentos de onda relacionados abaixo. Repetir a operao utilizando uma soluo de ABF diluda duas vezes. Utilizar gua como Branco, calibrando o aparelho em cada . (nm) AbsABF AbsABF/2 520 535 550 580 610 640

2. Com a soluo de MOF varrer o espectro determinando as absorvncias nos comprimentos de onda relacionados abaixo. Repetir a operao utilizando uma soluo de MO diluda duas vezes. Utilizar gua como Branco, calibrando o aparelho em cada .

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(nm) AbsMO AbsMO/2

415

445

460

490

520

535

3. Misturar os volumes iguais das solues de ABF e MO e determinar as absorvncias nos comprimentos de onda abaixo: (nm) AbsABF+MO 415 445 460 490 520 535 550 580 610 640

4. Lanar em grfico as leituras de absorvncia x comprimento de onda e selecionar o adequado para construo de cada curva padro. B) Construo da Curva Padro 1. Seguir o protocolo adiante utilizando solues de ABF ou MO, conforme o caso. 2. Ler as absorvncias de cada tubo no anteriormente selecionado para cada corante, utilizando o tubo B como branco da reao. 3. Preparar um tubo desconhecido com quantidades arbitrrias de corante e gua e efetuar a leitura no mesmo comprimento de onda usado. 4. Lanar em grfico absorvncia x concentrao de corante e analisar os resultados.

TUBO

ABF (ml)

H2O (ml) 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 --

Abs

Concentrao

B 1 2 3 4 5

-1,0 2,0 3,0 4,0 5,0

TUBO

MO (ml)

H2O (ml) 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 --

Abs

Concentrao

B 1 2 3 4 5

-1,0 2,0 3,0 4,0 5,0

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Curva padro de protenas do soro


FUNDAMENTOS TERICOS As protenas do soro podem ser dosadas colorimetricamente pela reao do biureto. Nesta reao tratamos a protena com sulfato cprico em meio alcalino obtendo como resultado um produto de cor violeta cuja intensidade se correlaciona com a concentrao protica. Essa reao foi denominada reao do biureto porque ela foi originalmente utilizada para identificar o biureto (dmero da uria). O mtodo de biureto um mtodo para dosar protenas to simples e exato como qualquer outro usado corretamente. Tem uma preciso de aproximadamente 4%. Qualquer composto que tenha na sua estrutura molecular pares de grupos amida ligados por nitrognio ou carbono, dar uma reao de biureto positiva. O nome da reao deriva do mais simples destes compostos, o biureto:

CONH 2 NH CONH 2
Quando o biureto tratado com uma soluo alcalina de tartarato de potssio e cobre, forma-se um complexo de cor violeta no qual os ons Cu2+ esto envolvidos por molculas de biureto. Como as molculas das protenas contm essas ligaes, elas reagem com Cu2+ para dar cor violeta. A quantidade desta cor diretamente proporcional concentrao das protenas. Quando as amostras so turvas ou muito coradas, como acontece nos soros ictricos, deve-se incluir um branco de soro para compensar a turvao ou a cor amarela. Os mtodos para dosagem das protenas devem ser executados em soro e no em plasma, uma vez que o fibrinognio existente no plasma, uma vez que o fibrinognio uma protena e constitu uma interferncia quando se dosam as protenas do soro. O soro hemolisado d resultados pouco exatos e por isso no deve ser usado. Pode-se empregar o mtodo do biureto para determinar a concentrao das protenas na maior parte dos lquidos biolgicos, mas no diretamente aplicvel urina nem ao lquido cefalorraquidiano. Embora geralmente se encontrem nesses lquidos os mesmos tipos de protenas que existem no soro, a concentrao total de protenas muito mais baixa, tornando difcil uma anlise exata. Este fato particularmente importante no caso do LCR em que a quantidade de lquido disponvel para o exame habitualmente muito pequena. A dosagem de protenas na urina ainda mais difcil, devido presena de grandes quantidades de substncias interferentes, especialmente ons inorgnicos, que precipitam quando se junta uma base. Por estas razes, os mtodos usados de rotina para a determinao de protenas totais no LCR e na urina so um pouco diferentes dos que se utilizam para soro, embora haja algumas coincidncias. Os mtodos turbidimtrico e de Folin so largamente utilizados para determinar as protenas no LCR, enquanto que para a urina usam os mtodos turbidimtrico e de fixao a corantes. A confeco da curva padro exige que inicialmente a concentrao de protenas no soro seja ajustada para a faixa de sensibilidade do mtodo. Sabemos que a concentrao total de protenas no soro de mamferos est em torno de 10g/dL, o que excede muito a sensibilidade do mtodo. Por esse motivo, o primeiro tempo do trabalho se constitui em
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uma diluio do soro de 1:10 na qual ajustamos a concentrao de protenas para a faixa adequada. No segundo tempo fazemos diluies variadas a partir do soro previamente diludo 1/10 para obter 4 padres e confeccionarmos um ensaio em branco. As leituras no espectrofotmetro so feitas em 550 nm. PROCEDIMENTO PRTICO 1. Diluio inicial do soro padro (1:10) tomar em tubo de ensaio 0,4 mL de soro (a concentrao de protenas ser fornecida na aula) mais 3,6 mL de soluo salina fisiolgica. Misturar bem. 2. Diluio do soro desconhecido (1:20) tomar em tubo de ensaio 0,1 mL do soro desconhecido e 1,9 mL de soluo salina fisiolgica. Misturar bem. 3. Confeco da curva padro partindo do soro padro diludo, obtido na operao anterior, proceder conforme a tabela abaixo: Tubo Salina (mL) 1,0 0,8 0,6 0,4 --Concentrao Reativo do Soro padro Soro (g%) Biureto diludo (mL) desconhecido diludo (mL) (mL) --4,0 0,2 -4,0 0,4 -4,0 0,6 -4,0 1,0 -4,0 -1,0 4,0

B P1 P2 P3 P4 D

4. Confeco do ensaio desconhecido tomar em tubo de ensaio 1,0 mL do soro desconhecido e 4,0 mL de reativo do biureto, conforme indicado na tabela acima. 5. Confeco do grfico Com base na concentrao do soro padro distribudo na aula, calcule a concentrao de cada um dos padres de trabalho. Aps 10 minutos, leia as absorvncias do desconhecido e de cada um dos padres em espectrofotmetro utilizando o comprimento de onda de 550 nm e complete a tabela acima. Utilizando papel milimetrado trace a curva padro. 6. Determine a concentrao do ensaio desconhecido.

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Dosagem de protenas totais e fraes no soro


FUNDAMENTOS TERICOS As protenas do soro podem ser dosadas na sua totalidade ou em fraes. O critrio mais usado para fracionar as protenas sua solubilidade em meio aquoso. Segundo este critrio, chamamos de albuminas as protenas que dissolvem bem em uma ampla faixa de salinidade, desde a gua destilada at concentraes salinas elevadas, e de globilinas as protenas que dissolvem em uma faixa mais restrita de salinidades sendo insolveis em gua destilada e precipitando em concentraes salinas baixas. Chamamos de salting-out o mtodo usado para fracionar as protenas do soro, o qual consiste na adio ao mesmo de uma quantidade de sal suficiente para insolubilizar as globulinas enquanto as albuminas permanecem em soluo. Os sais mais usados para este fim so o sulfato de amnio, o sulfato de sdio ou o cloreto de sdio. As fraes proticas obtidas por este mtodo so dosadas pela reao do biureto, conforme j foi visto na aula anterior. PROCEDIMENTO PRTICO A) Fracionamento salino 1. Num tubo de centrfuga contendo 7,5 mL da soluo de sulfato/sulfito adicionar lentamente e misturando, 0,5 mL de soro. Fechar o tubo e homogeneizar por inverso de 3 a 4 vezes. Ocorre precipitao das globulinas, o que torna a mistura com um aspecto leitoso. 2. Retirar deste tubo 2 mL da mistura dos quais 1 mL deve ser transferido para um tubo de ensaio marcado com a letra T (protenas totais). O 1 mL restante deve ser desprezado. 3. Adicionar ao mesmo tubo de centrfuga 3 mL de ter etlico, homogeneizar por inverso suave 40 vezes, durante 20 segundos e, finalmente centrifugar a 2.500 rpm durante 10 minutos. 4. Ao final da centrifugao observa-se uma fase aquosa inferior lmpida que contm as albuminas em soluo. Na sua superfcie existe uma pastilha branca contendo as globulinas precipitas e, acima dela, o restante do ter que no evaporou. 5. Inclinar o tubo para deslocar a pastilha e introduzir pela borda do mesmo uma pipeta fina (1 mL) com bocal obturado pelo dedo at que sua ponta atinja a parte inferior do mesmo. Abrir o bocal e aspirar 1 mL da fase inferior que ser transferida para o tubo marcado com a letra A (albumina). B) Preparao do padro de protenas Em outro tubo de ensaio, colocar 1,9 mL de soluo salina fisiolgica e 0,1 mL de soro padro. Homogeneizar vrias vezes por inverso. Tomar deste tubo 1 mL e transferir para o tubo marcado com a letra P (padro). C) Reao corada Tubo Salina (mL) 1,0 ---Soro padro diludo (mL) -1,0 --Soro diludo (mL) --1,0 -Fracionamento Reativo do (mL) Biureto (mL) -4,0 -4,0 -4,0 1,0 4,0
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B Padro Total Albumina

Misturar por inverso, aguardar 10 minutos para desenvolvimento da cor e ler as absorvncias em espectrofotmetro a 550 nm. D) Efetuar os clculos VALORES NORMAIS Animal Bovino Ovino Caprino Suno Eqino Co Homem Sexo M F F M/F Albumina g/dL 3,20 3,44 2,96 3,95 3,4 2,6 3,36 3,32 Globulina g/dL 3,87 4,19 2,95 2,63 4,00 4,12 1,90 2,90 Rel A/G 0,83 0,82 1,00 1,50 0,85 0,63 1,70 1,20

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Dosagem de glicose no soro


FUNDAMENTOS TERICOS A glicose, como qualquer ose, um acar redutor quente, podendo ser dosada por sua capacidade de reduzir o ionte cprico a cuproso. O fato de a glicose ser redutora quente faz com que sua dosagem s possa ser feita com o aquecimento do meio. Como o sangue rico em protenas, que desnaturam pelo calor turvando o meio, a dosagem de glicose nesse meio deve ser precedida de uma desproteinizao que afaste as protenas impedindo a ocorrncia da turvao que impede a dosagem colorimtrica. Por outro lado, como j vimos na aula anterior, o ionte cuproso se transforma em xido que, em decorrncia de sua baixa solubilidade, precipita. Uma vez que no podemos fazer colorimetria com substncias precipitadas, necessitamos de uma reao qumica complementar que promova a dissoluo do xido cuproso. No mtodo de Nelson fazemos a reao do xido cuproso formado com o cido molbdico formando o xido azul de molibdnio que ser dosado colorimetricamente. PROCEDIMENTO PRTICO Fase 1 Desproteinizao Tomar em tubo de centrfuga 1,5 mL de gua destilada e 0,1 mL de sangue. Lavar a pipeta trs vezes com a mistura. Adicionar 0,2 mL da soluo de hidrxido de brio e aguardar at que a mistura assuma a colorao acastanhada. Adicionar 0,2 mL de sulfato de zinco, agitar bem e aguardar 5 minutos para que se complete a reao. Centrifugar por 15 minutos a 3.000 rpm e separar o sobrenadante. Nessa operao ocorre uma diluio na proporo 1:20. Fase 2 Reao corada (em tubo de Folin) Na primeira etapa fazemos a reao do desproteinizado com o reativo cprico, a quente. Na segunda etapa redissolvemos o xido cuproso formado pela reao com o reativo arseno-molbdico. Tubo gua destilada (mL) 1,0 --Sol. padro Desproteinizado de glicose (mL) (mL) --1,0 --1,0 Reativo cprico (mL) 1,0 1,0 1,0

B Padro Desconhecido

Misturar por inverso, e aquecer em banho-maria fervente por 20 minutos. Resfriar em gua corrente (torneira). Adicionar em todos os tubos 1,0 mL do Reativo arseno-molbdico. Misturar bem at parar de fazer espuma. Completar com gua at a marca de 12,5 mL. Ler as absorvncias em espectrofotmetro a 500 nm. Efetuar os clculos Concentrao padro de glicose = 0,05 mg/mL

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Concentraaododesconhecido = 0,05 100 20

ABSdesconhecido mg / dl ABSpadro

OBS: A concentrao do padro multiplicada por 100 para converter de mg/mL para mg/dL e por 20 para corrigir a diluio introduzida no ato de desproteinizao.

Animal Humanos Bovdeos Adultos Caprinos Ovinos Sunos Caninos Gatos Galinhas

VALORES NORMAIS DE GLICEMIA DE JEJUM (mg/dL) 60 a 100 35 a 55 45 a 60 35 a 60 65 a 95 55 a 90 60 a 100 190 a 300

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Eletroforese de protenas do soro


FUNDAMENTOS TERICOS Podemos obter o fracionamento das protenas do soro aproveitando-nos da diferena de suas cargas eltricas superficiais. A carga eltrica de uma molcula protica varia em funo da diferena entre o pH do meio no qual ela se encontra e o seu ponto isoeltrico (por definio, ponto isoeltrico de uma protena o pH no qual a protena apresenta cargas positivas e negativas em mesmo nmero sendo, portanto, a soma de todas as cargas igual a zero). Se temos uma protena em pH igual ao ponto isoeltrico a sua carga eltrica nula. Para baixarmos o pH adicionaremos um cido que carreia prtons (H+), isso far com que a protena assuma carga positiva. Por outro lado, quando elevamos o pH adicionamos uma base que capta prtons fazendo com que a protena perca prtons e assuma carga negativa. Em suma, qualquer protena apresenta carga positiva em pH abaixo do ponto isoeltrico, nula no ponto isoeltrico e negativa acima dele. As protenas do soro apresentam pontos isoeltricos distribudos em uma faixa de pH entre 5,0 e 8,0, o que significa que em pH acima de 8,0 todas elas apresentaro cargas negativas e abaixo de pH 4,0 todas elas assumiro carga positiva. As grandezas das cargas diferem em funo da diferena entre o ponto isoeltrico e o pH do meio onde a protena se encontra. Essa relao no linear, mas podemos descrev-la declarando que quanto maior for esta diferena tanto maior ser a carga. Quando submetemos uma partcula carregada ao de um campo eltrico a mesma fica animada de um movimento que a dirige para o plo de sinal oposto ao da sua carga e cuja velocidade depende da grandeza desta carga. No caso especifico das protenas do soro submetidas eletroforese em pH 9,0, todas elas migraro para o plo positivo com velocidades tanto maior quanto mais baixo for o seu respectivo ponto isoeltrico. Na eletroforese das protenas do soro submetemos uma amostra deste soro a um campo eltrico de grandeza pr-estabelecida em pH prximo de 9,0. As protenas migram para o plo positivo com velocidades diferentes distribuindo-se em grupos. O grupo de ponto isoeltrico mais baixo (5,0) migra com maior velocidade e se identifica com o que, na salting-out identificamos pelo nome de albumina. As demais protenas (cujos pontos isoeltricos se distribuem entre 6,0 e 8,0) se separam em nmero varivel de grupos (geralmente 3) e coincidem com aquelas que no salting-out identificamos pelo nome de globulinas. Dentro deste grupo, elas so identificadas pelas letras do alfabeto grego (alfa, beta, gama) (ver Figura abaixo).

Efetroforese das protenas do soro normal. Cada uma das protenas participantes de um mesmo grupo compartilha origem e funes biolgicas. As albuminas so produzidas no fgado e tem como funes suprir os
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tecidos com material nitrogenado, carrear no plasma sanguneo substncias que so pouco solveis em gua e fazer a manuteno da presso osmtica do plasma sanguneo. As globulinas dos grupos alfa e beta tambm so produzidas no fgado e funcionam como carreadoras de lipdeos (lipoprotenas), glicdeos, metais, hormnios, protenas, etc. As globulinas do grupo gama so sintetizadas no sistema imunolgico (linfcitos) e funcionam como anticorpos. PROCEDIMENTO PRTICO 1. O sistema da eletroforese Para fazermos uma eletroforese necessitamos essencialmente de uma fonte de corrente contnua, uma cuba, um sistema de cabos para interconectar as duas unidades, uma soluo tampo de pH e concentrao convenientes e um suporte slido onde aplicaremos a amostra. Adicionalmente, necessitaremos de um corante para podermos ver o resultado da separao. A fonte de corrente continua essencial porque necessitamos manter durante todo o tempo da corrida uma corrente cujo sentido seja constante e cuja intensidade seja estvel. A corrente que nos fornecida pela companhia de iluminao pblica alternada, muda de sentido 60 vezes por segundo, alm de variar muito de intensidade. A fonte de eletroforese , basicamente um retificador de corrente alternada, semelhante ao encontrado nos carregadores de baterias de automveis, complementado por um circuito eletrnico que assegura a estabilidade da intensidade e do potencial da corrente contnua fornecida. 2. Suporte O suporte para a corrida um meio slido e poroso no qual embebemos o tampo escolhido. Vrios suportes so usados na dependncia dos objetivos da corrida: papel de filtro, acetato de celulose, goma de amilo, bloco de amilo, gel de poliacrilamida, etc. Na presente prtica estaremos trabalhando com o acetato de celulose. 3. Tampo O tampo escolhido para a presente corrida constitudo por uma mistura de TRIS 60,5 g/L, cido brico 4,6 g/L e EDTA 6,0 g/L, pH 9,0. Depois de pronto dever diludo ao meio com gua destilada. Este tampo adequado para o fracionamento de protenas do soro em suporte de acetato de celulose. 4. Condies da corrida A corrida deve ser feita durante 60 minutos com a intensidade de 125 volts. 3. Colorao e lavagem A colorao feita com o corante Poncaeu S, dissolvido em TCA (cido tricloroactico) a 3% na concentrao final de 0,2 %. A funo do cido tricloroactico fixar as protenas ao suporte (acetato de celulose) promovendo sua desnaturao. A lavagem, feita com o objetivo de remover o excesso de corante do suporte, realizada com cido actico 5%. O perfil eletrofotrico - Chamamos de perfil eletrofortico o grfico que expressa o resultado de uma corrida eletrofortica. Ele descreve as propores com que cada um dos grupos de protenas participa no total. Cada soro tem o seu perfil eletrofortico normal e perfis caractersticos de diversos tipos de enfermidades. O perfil eletrofortico um recurso til no diagnstico de doenas como o mieloma que alteram a proporo entre os diversos tipos de protenas do soro.

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Pesquisa de constituintes anormais da urina


FUNDAMENTOS TERICOS Denominamos "constituintes anormais da urina" uma srie de substncias que no aparecem na urina de animais sadios e cujo aparecimento ocasional permite identificar situaes de carter patolgico. Os principais constituintes anormais que ocorrem na urina so os seguintes: Albumina, glicose, sangue (hemoglobina ou hemcias integras), corpos cetnicos e bile (sais ou pigmentos biliares). Trs so os mecanismos que permitem explicar o aparecimento de constituintes anormais na urina: 1) Saturao (sobrecarga) dos mecanismos de reabsoro tubular -muitas substncias de interesse fisiolgico, tais como a glicose, os aminocidos e os corpos cetnicos, so filtradas sem qualquer impedimento no glomrulo e enquanto sua concentrao no filtrado se mantm dentro dos limites aceitveis, so totalmente reabsorvidas nos tbulos de sorte que no aparecem na urina. Quando sua concentrao no plasma, e no filtrado, ultrapassa o "limiar de excreo renal" (Tm), o excesso que no pode ser reabsorvido nos tbulos, eliminado na urina. 2) Presena de substncias anormais no plasma -Algumas substncias que s aparecem eventualmente no plasma no possuem mecanismos tubulares para reabsoro seletiva. Nesse caso podemos citar a hemoglobina e os sais biliares livres. Quando uma patologia especifica determina o aparecimento de grande quantidade dessas substncias no plasma, elas so filtradas e aparecem na urina por no sofrerem qualquer tipo de reabsoro tubular. 3) Ocorrncia de leso renal - Algumas substncias no aparecem na urina porque normalmente no so filtradas no rim. Esse o caso de todas as protenas plasmticas. Quando ocorre uma leso a nvel de glomrulo ou de tbulos renais o aumento da permeabilidade permite que tais susbtncias, ou mesmo clulas, passem para o fluido tubular e apaream na urina. PROCEDIMENTO PRTICO 1 - Identificao da albumina Fundamento - A albumina facilmente coagulvel pelo calor provocando turvao no meio lquido em que se encontra. Como, alm da albumina, outras substncias que tambm turvam pelo calor podem ser encontradas na urina, temos a necessidade de proceder ao diagnstico diferencial pela adio de cido actico glacial ao meio onde ocorreu a turvao. Tcnica - Tomar em tubo de ensaio urina suficiente para ench-lo at aproximadamente 80% de sua altura. Lev-lo ao bico de Bunsen e aquecer a parte superior da massa lquida at a fervura. Ocorrendo turvao adicionar algumas gotas de cido actico glacial. Resultados 1 -Ausncia de turvao -teste negativo. 2 -Ocorre turvao que persiste aps adio do cido actico glacial -albumina.
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3 -Ocorre turvao que desaparece adio do cido actico glacial -fosfato. 4 -Ocorre turvao que desaparece com formao de espuma aps a adio de cido actico glacial -carbonato.

2 - Identificao da glicose Fundamento - A glicose um acar redutor. Se aquecermos um meio onde exista a glicose na presena de um sal cprico ocorrer a reduo do ion cprico a cuproso que precipitar na forma de xido de cor amarela. O teste feito com o reagente de Benedict qualitativo que uma soluo de sulfato cprico em meio alcalino. Tcnica - Colocar em tubo de ensaio 5 mL do reagente de Benedict qualitativo e 8 gotas de urina. Misturar e levar a banho-maria fervente durante o tempo que for necessrio para a urina entrar em ebulio. Resultados 1 -O lquido permanece azul -negativo 2 -Colorao esverdeada -traos 3 -Verde sujo -0,50 a 0,75 g % 4 -Amerelo ou marrom -1 g % 5 -Vermelho ou tijolo -2 g % ou mais. 3 - Identificao dos corpos cetnicos Fundamento - Os corpos cetnicos so formados a partir do metabolismo dos lipdeos sendo os principais o cido acetilactico, o cido betahidroxibutirico (formas circulantes) e a acetona (forma de excreo). No caso especfico da cetose dos ruminantes tambm pode ocorrer o lcool isoproplico. Essas substncias se formam normalmente em nosso metabolismo e representam formas de circulao de reservas lipdicas no plasma sanguneo da mesma forma que a glicose uma forma de circulao de reservas glicdicas. Normalmente a sua concentrao to baixa que todos os corpos cetnicos filtrados so reabsorvidos nos tbulos renais. Quando, em decorrncia de um distrbio metablico, ocorre sobrecarga o excesso eliminado na urina. Os corpos cetnicos presentes na urina (especialmente a acetona) podem ser reconhecidos por uma reao de complexao com o nitroprussiato de sdio que produz cor violeta intensa. No caso presente, estamos usando o reagente de Lange que uma soluo de nitroprussiato de sdio em cido actico glacial. Tcnica -Tomar em tubo de ensaio 1 mL de urina e 5 gotas do reagente de Lange. Misturar bem. Deixar correr pela borda do tubo 1 a 1,5 mL de hidrxido de amnio concentrado. Na interface aparece um anel de cor violeta. 4. Identificao do sangue Fundamento - A evidenciao da presena de sangue (hemoglobina ou hemcias ntegras) se faz pelo aproveitamento da propriedade catalsica do grupamento heme que o habilita a decompor a gua oxigenada fornecendo gua e oxignio nascente:
heme H 2 O2 H 2 O + O

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O oxignio nascente formado na reao acima utilizado para oxidar uma substncia incolor a um produto colorido. No caso presente estamos utilizando a benzidina que, quando oxidada assume a cor azul. Tcnica -Tomar em tubo de ensaio 1 mL do reativo da benzidina, 5 gotas de urina e 2 gotas de gua oxigenada. Se o teste for positivo haver o desenvolvimento de colorao azul intensa que, com o passar do tempo muda para cor de vinho. 5 - Identificao dos pigmentos biliares (Reao de Gmelin) Fundamento - O principal dos pigmentos biliares a bilirrubina diglicurondeo que normalmente excretada na bile. Quando ocorre leso heptica este pigmento reflui para o sangue e excretado na urina onde pode ser facilmente reconhecido pelo produto esverdeado de sua oxidao pelo cido nitroso-nitrico (biliverdina). Tcnica - Tomar em tubo de ensaio 1 mL de urina. Em pipeta de 2 ml tomar 1 ml de cido nitroso/ntrico. Introduzir a pipeta no tubo e deixar escoar o cido pela parede do tubo. Se o teste for positivo aparecer um anel verde na interface. 6 - Identificao dos sais biliares (Teste de Hay) Fundamento - O teste de Hay (teste da "chuva de enxofre") se baseia na propriedade tensioativa dos sais biliares, isto na capacidade apresentada pelos sais biliares de baixar a tenso superficial da gua permitindo a penetrao de partculas que, de outra forma, ficariam retidas na superfcie. Tcnica - Deitar na superfcie de um clice com urina uma fina camada de enxofre em p e observar o comportamento das partculas. Caso no haja sais biliares as partculas permanecero flutuando na superfcie. No caso contrrio elas submergiro.

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pH e capacidade de tamponamento da urina


FUNDAMENTOS TERICOS As medidas de pH so um dos procedimentos mais importantes e mais freqentes na prtica em bioqumica. O pH afeta a estrutura e a atividade das macromolculas biolgicas, como, por exemplo, a atividade cataltica das enzimas. Quase todos os processos biolgicos so dependentes do pH; uma pequena variao do pH do meio produz uma grande variao na velocidade da maioria dos processos biolgicos que se desenvolvem neste mesmo meio. Isto verdade no apenas para muitas reaes nas quais o on H+ participante direto, mas tambm para aquelas nas quais no h um papel aparente desses ons. As enzimas que catalisam as reaes celulares e muitas das molculas sobre as quais elas agem, possuem grupos ionizveis de pKa caractersticos. Os grupos aminoprotonados (-NH3+) e os grupos carboxila dos aminocidos e os grupos fosfato dos nucleotdeos, por exemplo, funcionam como cidos fracos; o seu estado inico depende do pH da soluo na qual esto dissolvidos. Como notamos acima, as interaes inicas esto entre as foras que estabilizam a molcula de uma protena e permitem que uma enzima reconhea e ligue-se ao seu substrato. As clulas e os organismos mantm um pH citoslico constante e especfico, geralmente prximo de pH 7,0, o que mantm as biomolculas em seu estado inico timo. Em organismos multicelulares o pH dos fludos extracelulares tambm estreitamente regulado. A constncia do pH conseguida primariamente atravs da existncia de tampes biolgicos: estes so misturas de cidos fracos e sua base conjugada. que possuem a capacidade de resistir s variaes do seu pH quando s mesmas so adicionadas quantidades relativamente pequenas de cido ou base. Os principais produtos do catabolismo so: CO2, gua, uria, sais minerais cidos e cidos orgnicos. O CO2 um gs parcialmente cido pois reage com a gua formando o cido carbnico e, em virtude de poder ser eliminado pelos pulmes, denominado cido voltil. Em contraposio, os demais cidos do organismo so chamados cidos fixos. Os sais minerais cidos se originam de radicais proticos que contm enxofre ou fsforo, ou de lipdeos que possuem radicais fosfato, podendo formar cidos como o fosfrico e o sulfrico. Estes, por serem cidos fortes, devem encontrar-se no organismo na forma de sais cidos ou neutros, como por exemplo fosfato ou sulfato de sdio. Os cidos orgnicos so em geral fracos, como o cido ltico e o beta-hidroxibutrico, derivados do metabolismo de carboidratos e gorduras. Vemos pois que, devido maioria dos produtos catablicos serem cidos, o indivduo necessita de mecanismos que evitem primordialmente a queda do pH do sangue. O rim, favorecendo a excreo de radicais cidos, exerce um papel relevante na manuteno do equilbrio cido-base do organismo, juntamente com os tampes do meio intra- e extracelular e a eliminao de CO2 pelos pulmes. Devido capacidade que o rim apresenta de eliminar cidos fixos, a urina de um indivduo normal pode apresentar um pH bem menor que o de seu sangue, podendo chegar at um valor extremo de aproximadamente 4,5. A acidificao urinria ocorre essencialmente atravs de: secreo de hidrognio e reabsoro de bicarbonato; eliminao de cidos livres ou sais cidos; e excreo de sais de amnio. Entretanto, em certas condies, pode ocorrer no organismo um excesso de bases fixas, como por exemplo em caso de vmitos, com grande perda de cido clordrico, ou aps a ingesto excessiva de substncias alcalinas, como bicarbonato de sdio. Nestas situaes, o rim excreta urina alcalina, com pH prximo de 8,5, eliminando assim o excesso de base. As medidas de pH do sangue e da urina so comumente empregadas no diagnstico de doenas. O pH do plasma sanguneo de pessoas com diabetes severa, por exemplo, frequentemente menor que o valor normal de 7,4; esta condio chamada de acidose. Em
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outros estados patolgicos o pH do sangue maior do que o normal, e esta condio conhecida como alcalose. O pH de uma soluo aquosa pode ser medido aproximadamente usando-se vrios corantes indicadores, como por exemplo o litmus, a fenolftalena e o vermelho de fenol, dentre outros, os quais sofrem transformaes coloridas sempre que um prton dissocia-se da molcula dos mesmos. Abaixo temos uma tabela com o pK' e zona de pH e de cores de alguns indicadores: NOME Amarelo de metila Metilorange Azul de bromofenol Vermelho de metila Azul de bromotimol Vermelho de fenol Fenolftalena pK' 3,3 3,5 4,0 5,0 7,1 7,8 9,7 Faixa de pH e Cores vermelho 2,9 - 4,0 amarelo vermelho 3,1 - 4,4 amarelo amarelo 3,1 - 4,7 azul vermelho 4,2 - 6,3 amarelo amarelo 6,1 - 7,7 azul amarelo 7,0 - 8,6 vermelho incolor 8,2 - 10,0 vermelho

Outra forma de medir aproximadamente o pH de uma soluo aquosa atravs do uso de fitas indicadoras de pH, as quais aps serem mergulhas na soluo, so comparadas uma escala de cores. Determinaes precisas do pH em laboratrios qumicos ou clnicos so feitas com um eletrodo de vidro, o qual sensvel seletivamente concentrao de H+ e insensvel quelas de outros ctions como Na+ ou K+. Num aparelho medidor de pH o sinal eltrico emitido por este eletrodo ampliado e comparado com o sinal gerado no mesmo eletrodo por uma soluo com pH conhecido com preciso.

PROCEDIMENTO PRTICO 1) Colher quantidade suficiente de urina. 2) Em um becher, colocar 20 ml de urina. 3) Utilizar a fita indicadora universal de pH: Mergulhar rapidamente a fita na urina e comparar com a escala de cores. Anotar o valor de pH encontrado. 4) Em outro becher, colocar 20 ml de gua destilada, e num terceiro, o mesmo volume de uma soluo tampo com pH fisiolgico. 5) Adicionar nos bechers 2 a 3 gotas do corante indicador fenolftalena. 6) Adicionar a cada um dos bechers, 0,1 ml de NaOH 1N. Verificar a cor que cada soluo apresentou aps este passo. Que concluses podem ser tiradas destes resultados?

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Digesto do Leite
FUNDAMENTOS TERICOS A casena uma fosfoprotena na qual o fosfato est esterificado hidroxila e um resduo de serina. Por sua riqueza em aminocidos essenciais, possui elevado valor biolgico. a protena do crescimento animal. Apresenta-se sob trs formas diferentes: -casena, -casena e -casena como pesos moleculares que variam de 75.000 a 100.000. No seu conjunto as casenas constituem 80% da protena do leite. Deste total, 60% so de -casena, 17% de -casena e 2,4% de -casena. A casena pode ser precipitada pela adio de cido actico at pH 4,7 que seu pI. Essa precipitao facilmente obtida com leite desnatado. Alm disso a casena do leite tambm pode ser precipitada por ao do labfermento ou renina. A coagulao por auto acidificao tem como conseqncia da fermentao da lactose por bactrias do gnero Lactobacillus, cujo produto final o cido lctico. Ao atingir o ponto isoeltrico da casena por acidificao do meio como conseqncia do cido lctico formado, ocorre a precipitao da mesma formando o cogulo, fenmeno que utilizado para produzir leites fermentados do tipo do iogurte ou quefir. Na mucosa gstrica dos animais jovens existe uma enzima proteoltica, o labfermento ou renina, que age sobre a casena dependendo do Ca2+. As micelas de casena so mantidas no leite pela ao estabilizante da k-pasena. Esta quebrada por hidrlise pela renina, ativada pelo Ca2+, liberando um glicomacropeptdeo de 52 a 58 resduos de aminocidos, o que faz com que perca sua ao estabilizante e permita que a casena (, e ) se coagule na forma de paracaseinato de clcio que insolvel. A coagulao da casena do leite pelo labfermento a base da indstria do queijo, se bem que atualmente proteases de origem basteriana esto sendo j utilizadas para propsitos semelhantes.

PROCEDIMENTO PRTICO I Precipitao da casena ao ponto isoeltrico 1. Medir 100 mL de leite e diluir com 200 mL com gua destilada; homogeneizar e determinar o pH com o auxlio de pHmtro ou fita indicadora de pH. 2. Adicionar soluo de HCl 1 N gota a gota, sob agitao constante, at observar a formao de grumos de casena e novamente medir o pH (deve equivaler ao ponto isoeltrico, 4,7). 3. Verificar o efeito da adio de maior volume de cido, anotando o pH obtido (deve ocorrer a completa dissoluo da casena). 4. Juntar soluo de NaOH 1 N gota a gota, de modo a passar novamente pelo pI e at completa dissoluo dos grumos de casena, anotando igualmente o pH. 5. Organizar um grfico relacionando em ordenada os valores de pH (anotar apenas acidez, pI e alcalinidade) e em abscissa a solubilidade.

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Pesquisa de substncias estranhas no leite


FUNDAMENTOS TERICOS O leite obtido em circunstncias naturais uma emulso de cor branca, ligeiramente amarelada, odor suave e gosto adocicado. um produto secretado pelas glndulas mamrias e constitui alimento indispensvel aos mamferos nos primeiros meses de vida, enquanto no podem digerir e assimilar outras substncias necessrias sua sobrevivncia. O leite para o consumo deve ser, em natureza, um produto normal e integral, obtido em ordenha higinica, produzido por vacas ss submetidas a regime higinico apropriado. As impurezas do leite podem ser classificadas em impurezas propriamente ditas e falsificaes ou fraudes. As impurezas propriamente ditas derivam da falta de ateno e higiene, descuidos, etc., na ordenha manual, e falsificaes ou fraudes. Hoje em dia, no entanto, tais impurezas so quase totalmente eliminadas devido ordenha mecnica, que faz com que o leite seja extrado em perfeitas condies asspticas. Como impurezas propriamente ditas podem-se citar: plos e parasitas (carrapatos do animal; fragmentos insolveis, como madeira, alimento, estrume, etc. So, em geral, macroscpicas, e assim fcil perceb-las. Sua separao pode ser feita por simples filtragem em tecido branco, de malhas mais ou menos compactas. As impurezas desse tipo permanecem no tecido, isto , so retidas por ele, sendo a sua identificao rpida. Esta filtragem mais conhecida como coar o leite. Aps tal operao o leite se torna, quase sempre, apto para o consumo, depois de convenientemente esterilizado. Quanto falsificao, podemos dizer que tem duas finalidades principais: 1) Para conservar o leite, quando se empregam os chamados conservadores, que so facilmente identificados por processos qumicos; 2) Para aumentar o volume do leite ou sua densidade, como no caso da adio de amido.

PROCEDIMENTO PRTICO
Identificao de: 1. Nitratos Em um tubo de ensaio, colocar 2 mL de leite, 2 mL de cido sulfrico (D=1,825) e algumas gotas de formol a 10%. Reao: Positiva anis azuis Negativa cor inaltervel 2. Amido Colocar em um tubo de ensaio 10 mL de leite. Aquecer. Em seguida juntar 6 gotas do reativo de lugol. Reao: Positiva flocos azuis Negativa leve cor amarela uniforme (iodo) 3. Urina Pipetar 5 mL de leite e colocar num tubo de ensaio; juntar em seguida 5 mL de cido clordrico, 5 mL de etanol e 0,5 mL de cido ntrico. Reao: Positiva colorao rseo-violcea 4. Gelatina Colocar num frasco de Erlenmeyer 5 mL de leite e 5 mL de soluo de nitrato de mercrio a 5%. Agitar. Adicionar 10 mL de gua destilada. Agitar. Deixar
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em repouso por 5 minutos. Filtrar. Adicionar 10 mL de soluo saturada de cido pcrico. Reao: Positiva aparecimento de turvao ou um precipitado amarelo. 5. Sacarose Num tubo de ensaio colocar 15 mL de leite, 1 mL do reativo de Seliwanoff. Aquecer em banho-maria durante 5 minutos. Reao: Positiva colorao avermelhada. 6. Sangue Tomar 0,9 mL de leite; dilu-los em 10 mL de gua destilada e adicionar 1mL do reativo de Kastle-Meyer e 2 a 5 gotas de gua oxigenada. Reao: Positiva cor rsea ou vermelho-forte (aparecendo rapidamente ou no fim de 1 minuto) 7. Pus Para esta pesquisa prefervel empregar a prova de Behmer. Tomar 0,1 mL de leite e coloc-lo num tubo de ensaio com igual quantidade de amonaco. Depois de 1 minuto juntar uma gota de soluo de fucsina de Ziehl a 50%, e, aps alguns segundos, adicionar, muito lentamente, 10 mL de gua corrente. Reao: Positiva formao de filamentos, grumos ou mesmo um vu avermelhado, que no desfeito por leve agitao. Negativa lquido transparente e rosado. 8. Formol (conservante) Transferir para um tubo de ensaio 5 mL de leite, adicional 2 mL de cido sulfrico (1:1) e 1 mL de tricloreto de ferro a 2%. Aquecer at a ebulio com bico de bunsen. Reao: Positiva cor roxa Negativa cor amarela

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
Annino, J. S. e Giese, R. W. (1978) Qumica Clnica Princpios e Mtodos 4 Edio. Editora Monole, SP. Burtis, C. A. e Ashwood, E. R. (1998) Tietz Fundamentos de Qumica Clnica 4 Edio, Editora Guanabara Koogan, RJ. Nepomuceno, M. F. (1998) Bioqumica Experimental Roteiros Prticos Editora UNIMEP. Santos Neto, A. L.C.; Vasconcellos, A.M H.; Valle, A. B. F.; Oliveira, M. L. C.; Panek, A. D.; Ferreira Pinto, G.; Operti, M.S.; Chaloub, R.M. e Carvalho, V. L. A. C. (1988) Manual de cursos prticos em bioqumica (5 Edio) Departamento de Bioqumica IQ UFRJ. Villela, G.G.; Bacila, M. e Tastaldi (1973) Tcnicas e Experimentos de Bioqumica Editora Guanabara Koogan, RJ.

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